PL174866B1

PL174866B1 - Sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII

Info

Publication number: PL174866B1
Application number: PL94311567A
Authority: PL
Inventors: Thomas Oesterberg; Angelica Fatouros
Original assignee: Pharmacia Ab
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 1998-09-30
Also published as: DE69430745D1; EP0700299B1; AU681883B2; CN1113655C; FI955305L; EP0700299A1; RU2142290C1; SE9301581D0; ZA942251B; CN1122573A; PT700299E; NO954457D0; FI955305A0; JPH08509745A; CZ286995A3; JP3751633B2; ES2177579T3; KR100304143B1; CZ293527B6; KR960702317A

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII w roztworze wodnym o obniżonym stężeniu tlenu, dzięki czemu możliwe jest utrzymanie, podczas przechowywania, aktywności czynnika VIII na nieoczekiwanie wysokim poziomie. Aktywność czynnika VIII można zachowywać przez długi czas, jeżeli produkt końcowy stanowiący lek zawiera także obojętny gaz i/lub przeciwutleniacz. Sposoby obniżania stężenia tlenu w roztworze wodnym oraz sposoby polepszania trwałości czynnika VUI w roztworze wodnym, polegają na przechowywaniu tego roztworu w atmosferze gazu obojętnego. Dzięki niniejszemu wynalazkowi możliwe jest zachowanie co najmniej 50% początkowej aktywności czynnika VIII po przechowywaniu w ciągu co najmniej 6 miesięcy w temperaturze od 2 do 10°C, przy pH roztworu od 6,5 do 8,5.

Trwałość białek stanowi ogólny problem w przemyśle farmaceutycznym. Często rozwiązuje się go stosując wysuszenie białka z wykorzystaniem rozmaitych sposobów suszenia, takich jak liofilizacja. Białko rozdziela się następnie i przechowuje w postaci wysuszonej. Wszystkie występujące tu substancje, a więc roztwór przed suszeniem lub liofilizacją, wysuszony materiał i produkt przywrócony do postaci pierwotnej, powinny być trwałe w celu uniknięcia znaczniejszej straty aktywności w trakcie operacji suszenia jak również podczas przechowywania lub manipulowania. Suszenie metodą liofilizacji stanowi kosztowny i czasochłonny etap procesu i możliwość jego uniknięcia stanowiłaby dużą korzyść przy wytwarzaniu produktu handlowego Poza tym, pacjent musi niezbędnie rekonstytuować wysuszone białka w rozpuszczalniku przed użyciem, co może być dla niego kłopotliwe.

Hemofilia jest chorobą dziedziczną, znanąjuż od setek lat, ale dopiero w ostatnich trzech dekadach stało się możliwe rozróżnienie jej rozmaitych postaci: hemofilia A, hemofilia B i hemofilia C. Hemofilia A jest postacią występującą najczęściej. Nawiedza ona wyłącznie osobników płci męskiej i występuje z częstotliwością 1-2 osobników/10000 żywo urodzonych osob6

174 866 ników płci męskiej Chorobę powoduje silnie obniżony poziom lub brak biologicznie aktywnego czynnika krzepnięcia VIII (czynnika przeciwkrwawiączkowego), będącego białkiem normalnie występującym w osoczu. Przejawem klinicznym hemofilii A jest skłonność do silnego krwawienia i zanim wprowadzono leczenie przy użyciu koncentratów czynnika VIII, średni wiek pacjentów cierpiących na tę chorobę wynosił mniej niż 20 lat. Od mniej więcej trzech dekad dostępne są już koncentraty czynnika VIII uzyskiwane z osocza. Polepszyło to znacznie sytuację, jeśli chodzi o leczenie pacjentów cierpiących na hemofilię i dało im możliwość życia w sposób normalny. Jak dotychczas, terapeutyczne koncentraty czynnika VIII wytwarzane są za pomocą frakcjonowania osocza. Jednakże, obecnie dostępne są nowe sposoby wytwarzania czynnika VIII w hodowli komórkowej metodami rekombinantowego DNA, jak o tym donieśli, na przykład, J. Gitschier i in. [Nature, 312, 330-337 (1984)] oraz EP-A-160 457. .

Koncentraty czynnika VIII pochodzące z osocza ludzkiego zawierają szereg sfragmentowanych, w pełni aktywnych postaci czynnika VIII [Andersson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 83, 2979-2983, maj 1986]. Najmniejsza postać aktywna wykazuje masę cząsteczkową wynoszącą 170 kDa i składa się z dwóch łańcuchów, 90 kDa i 80 kDa, utrzymywanych razem mostkiem jonu metalu. Rozwiązanie to jest znane z opisu patentowego EP-A-197 901.

Firma Kabi Pharmacia opracowała produkt stanowiący rekombinantowy czynnik VIII, odpowiadający postaci czynnika VIII z osocza o 170 kDa w terapeutycznych koncentratach czynnika VIII. Skróconą cząsteczkę rekombinantowego czynnika VIII nazwano r-VIII SQ. Wytwarzany jest przez komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) metodą hodowli komórkowej w podłożu nie zawierającym surowicy w ostatnim pasażu. Aktywność swoista r-VIII SQ wynosi około 15000 jedn. m-nar VIII:C/mg białka.

Wskazane jest stosowanie rekombinantowego czynnika VIII SQ do leczenia klasycznej hemofilii. Dawkowanie jest podobne do dawkowania w przypadku stosowania koncentratów czynnika VIII z osocza. Strukturę i biochemię produktów typu rekombinantowego czynnika VIII opisał ogólnie Kaufman w Tibtech, tom 9, 1991 i Hematology, 63, 155-165 (1991) Strukturę i biochemię r-VUI SQ opisano w WO-A-91/09122.

Czynnik VIII frakcjonowany z plazmy jest zazwyczaj sprzedawany w postaci zliofilizowanego proszku, który należy rekonstytuować wodą.

Preparat zawierający małą ilość białka zazwyczaj traci swą aktywność podczas oczyszczania, przetwarzania w warunkach jałowych, pakowania i stosowania. Problem ten rozwiązuje się, na ogół, za pomocą dodania albuminy ludzkiej, która w znacznym stopniu zmniejsza stratę aktywnego białka. Albumina ludzka funkcjonuje jako ogólny stabilizator podczas oczyszczania, przetwarzania w warunkach jałowych i liofilizowania [patrz: przegląd dokonany przez Wanga i in. w J of Parenteral Sci. and Tech., 42, nr 2S, uzupełnienie (1988)]. Zastosowanie albuminy do stabilizowania czynnika VIII jest znane i używa się jej obecnie we wszystkich znajdujących się na rynku produktach zawierających wysoko oczyszczony czynnik VIII.

Jednakże, pożądane jest unikanie dodawania albuminy ludzkiej do stosowanego w lecznictwie białka wytworzonego metodą rekombinantowego DNA. Oprócz tego, użycie albuminy ludzkiej jako zarobki w preparacie często ogranicza wykorzystanie wielu najbardziej skutecznych i czułych metod analitycznych stosowanych do charakteryzowania białka.

Zaproponowano szereg rozwiązań zmierzających do zapewnienia stabilizacji rozmaitych białek. I tak, na przykład, w opisie patentowym EP 35 204 (Cutter) ujawniono sposób nadawania odporności cieplnej kompozycji białkowej w obecności poliolu. Następnie, w opisie patentowym WO-A-89/09614 (Genentech) ujawniono stabilizowany preparat ludzkiego hormonu wzrostu zawierający glicynę, mannit i bufor, przy czym w korzystnym wykonaniu wynalazku dodawany jest niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak Polysorbate 80 Środek powierzchniowo czynny dodawany jest w celu zmniejszenia agregacji i denaturacji. Preparat ten wykazuje zwiększoną trwałość tak w postaci zliofilizowanej jak i po przywróceniu postaci pierwotnej. Także w opisie patentowym US-A-4 783 441 (Hoechst) ujawniono roztwór wodny z zawartością białka, takiego jak insulina, oraz substancji powierzchniowo czynnej. W opi174 866 ester polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym korzystnie stosuje się w ilości wynoszącej co najmniej 0,01 mg/ml. Roztwór wodny może także zawierać chlorek sodowy lub potasowy, korzystnie w ilości ponad 0,1 M.

Asocjacja łańcucha ciężkiego z łańcuchem lekkim w cząsteczce czynnika VIII zależy od obecności jonów wapnia lub jonów innych metali dwuwartościowych. W niniejszym przypadku wapń wprowadzany jest w postaci chlorku wapniowego (CaCl₂), ale użyć tu można także innych soli, takich jak glukonian wapniowy, glubionian wapniowy lub gluceptan wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM.

Roztwór wodny stosownie zawiera aminokwas, taki jak L-histydyna, lizyna i/lub arginina, w ilości wynoszącej ponad 1 mM Można też dodać mono- lub disacharydy, takie jak sacharoza lub alkohole cukrowe. Korzystnie, roztwór zawiera L-histydynę i sacharozę. Końcowy produkt stanowiący lek korzystnie składa się z roztworu wodnego zawierającego: i) 10-100000 jedn. m-nar/ml rekombinantowego czynnika krzepnięcia VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, iii) chlorek sodowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,1 M, iv) sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM, v) aminokwas, taki jak L-histydyna, w ilości wynoszącej ponad 1 mM, vi) mono- lub disacharyd albo alkohol cukrowy, korzystnie sacharozę lub mannit.

Do tego roztworu można dodać przeciwutleniacz w ilości farmaceutycznie dopuszczalnej. Wytworzony tak lek jest trwałym roztworem wodnym gotowym do użycia.

Zastrzegany roztwór można wytworzyć sposobem polegającym na tym, że miesza się czynnik krzepnięcia VIII z roztworem wodnym albo eluuje się czynnik krzepnięcia VIII z etapu ostatecznego oczyszczania roztworem wodnym. Roztwór wodny korzystnie zawiera co najmniej jeden dodatek wybrany z grupy obejmującej niejonowy środek powierzchniowo czynny, przeciwutleniacz, aminokwas, taki jak L-histydyna, sól sodową, sól wapniową i sacharozę.

Wynalazek umożliwia polepszenie trwałości czynnika krzepliwości VIII w roztworze wodnym, poprzez to, że roztwór ten przechowuje się w atmosferze gazu obojętnego oraz umożliwia utrzymanie co najmniej 50%, a nawet 80% początkowej aktywności czynnika VIII po przechowywaniu w ciągu co najmniej 6 miesięcy w temperaturze od 2 do 10°C, przy pH roztworu wynoszącym od 6,5 do 8,5. Dzięki niniejszemu wynalazkowi możliwe jest przechowywanie produktu końcowego stanowiącego lek, zawierającego czynnik VIII w roztworze wodnym, w ciągu 12, a nawet 24 miesięcy, bez dostrzegalnej straty aktywności czynnika VIII. Sposób ten jest szczególnie odpowiedni do zastosowania wtedy, gdy czynnikiem VIII jest r-VIII SQ, ponieważ dane zaprezentowane w przykładach wskazują na to, że r-VIII SQ jest istotnie stabilny w ciągu co najmniej 6 miesięcy przy przechowywaniu w atmosferze azotu w temperaturze 5±3°C.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady, w których przedstawiono dane dotyczące rozmaitych roztworów wodnych poddanych obróbce w atmosferze azotu i argonu według wynalazku oraz, dla porównania, w atmosferze powietrza. Zakres ochrony patentowej nie jest ograniczony do tych tylko przykładów.

Część eksperymentalna Materiały i metody

Wytwarzanie rekombinantowego czynnika VIII SQ (r-VIII SQ) przeprowadzono zasadniczo sposobem opisanym w opisie patentowym WO-A-91/09122, przykłady 1-3. Linię komórek CHO z niedoborem DHFR (DG44N.Y.) poddano elektroporacji z udziałem wektora ekspresyjnego zawierającego gen r-VIII SQ i wektora ekspresyjnego zawierającego gen reduktazy dihydrofolianowej. Po dokonaniu selekcji na podłożach selekcyjnych, kolonie przeżywające amplifikowano za pomocą hodowli w warunkach stopniowo zwiększających się ilości metotreksatu. Supernatanty pochodzące z poszczególnych kolonii poddano indywidualnemu skriningowi pod względem aktywności czynnika VIII. Wybrano klon produkcyjny i zaadaptowano następnie do wzrostu w zawiesinie w określonym podłożu bez surowicy i w końcu opracowa10

174 866 no proces fermentacyjny prowadzony w dużej skali Po upływie określonych odstępów czasu odbiera się supematant i poddaje dalszemu oczyszczaniu sposobem poniżej opisanym.

pH sklarowanego, kondycjonowanego podłoża doprowadzono do właściwej wartości naniesiono na kolumnę S-Sepharose FF. Po przemyciu, czynnik VIII eluowano buforem solnym zawierającym 5 mM CaCk Immunoadsorpcję przeprowadzono na żywicy działającej na zasadzie immunopowinowactwa, przy czym ligandem było przeciwciało monoklonalne (8A4) przeciw ciężkiemu łańcuchowi czynnika VIII. Przed wprowadzeniem do kolumny eluat S potraktowano 0,3% TNBP i 1% Octoxynol 9.

Kolumnę zrównoważono, przemyto i czynnik VIII wyeluowano buforem zawierającym 0,05 M CaCl2 i 50% glikolu etylenowego. Eluat mAb wprowadzono do kolumny Q-Sepharose FF zrównoważonej buforem stosowanym do elucji w etapie immunopowinowactwa. Po przemyciu, wyeluowano czynnik VIII przy użyciu 0,05 M L-histydyny, 4 mM CaCk 0,6 M NaCl, pH 6,8. Eluat Q naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej (Superdex 200 p g.). Równoważenie i elucję przeprowadzono przy użyciu buforu do formułowania, w wyniku czego otrzymano kompozycję według poniższych przykładów. Z etapu ostatecznego oczyszczania otrzymano luźny materiał stanowiący r-VIII SQ. Aktywność czynnika VIII i stężenie składników nieaktywnych doprowadzono do właściwego poziomu za pomocą rozcieńczenia odpowiednim buforem. Następnie roztwór poddano sączeniu wyjaławiającemu (0,22 pm), po czym rozdysponowano i usunięto z niego tlen za pomocą obniżenia ciśnienia, a następnie wprowadzenia gazu obojętnego w kilku cyklach.

Aktywność czynnika krzepnięcia VIII oceniano badaniem z użyciem substratu chromogenicznego (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Moelndal, Szwecja). Wytworzono aktywny czynnik X (Xa) w układzie wewnątrznaczyniowym, w którym czynnik VIII działa jako kofaktor. Następnie oznacza się czynnik Xa przy użyciu syntetycznego substratu chromogenicznego, S-2222, w obecności inhibitora trombiny, 1-2581, zastosowanego w celu zapobieżenia zhydrolizowaniu substratu przez trombinę. Reakcję zatrzymuje się dodaniem kwasu i oznacza się VIE'C (którego ilość jest proporcjonalna do stopnia uwolnienia pNA (p-nitroaniliny)) metodą fotometryczną, przy 450 nm, wobec odczynnika jako ślepej próby. Jednostki VIII. C są to jednostki międzynarodowe (jedn m-nar, IU) według definicji podanej w powszechnie stosowanym International Concentrate Standard (IS), uznanym przez WHO.

Przykład 1. Porównanie roztworów przechowywanych w atmosferze powietrza z roztworami przechowywanymi w atmosferze azotu. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym w części eksperymentalnej. Roztwory przechowywano w trzech różnych temperaturach, odpowiednio, 7°C, 25°C i 30°C. Do fiolek rozdozowano po ml roztworu.

Tabela 1

Badaniu poddano kompozycje jak następuje:

	1A	1B	1C	1D	1E	1F
1	2	3	4	5	6	7
L-histydyna, mM	14,7	14,7	14,7	14,7	14,7	14,7
Chlorek sodowy, M	0,31	0,31	0,31	0,31	0,31	0,31
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7
Polisorbat, mg/ml	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23
pH	7	6	7	7	6	7

174 866

1	2	3	4	5	6	7
Przestrzeń nad roztworem	n₂	n₂	Powietrze	n₂	N2	Powietrze
VHI:C, jedn. m-nar/ml
początkowo	267	258	267	260	259	260
3 miesiące, 7°C	238	219	-	224	151	-
6 miesięcy, 7°C	217	186	158	204	84	20
1 miesiąc, 25 °C	220	-	-	232	-	-
3 miesiące, 25°C	198	-	-	186	-	-
1 miesiąc, 30°C	210	181	136	210	160	8
3 miesiące, 30°C	158	126	26	152	54	2

Z przykładu tego widać wyraźnie, że w przypadku nieobecności tlenu w temperaturze 7°C otrzymuje się możliwy do przyjęcia odzysk VIII:C po przechowywaniu roztworu w ciągu 6 miesięcy. Nawet w temperaturze 25°C lub 30°C roztwór według wynalazku można przechowywać bez nadmiernej straty aktywności. Można też zobaczyć, że trwałość była lepsza przy pH 7 niż przy pH 6

Przykład 2. Roztwory zawierające przeciwutleniacz i sacharozę. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym w części eksperymentalnej. Roztwory przechowywano w dwu różnych temperaturach, 7°C i 25°C. Do fiolek rozdozowano po 2 ml roztworu.

Tabela 2

Badaniu poddano kompozycje jak następuje *

	2A	2B
Chlorek sodowy, M	0,31	0,31
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7
Polisorbat, mg/ml	0,23	0,23
L-histydyna, mM	14,7	59
Sacharoza, mg/ml	200	200
Glutation, mg/ml	0,3	-
Acetylocysteina, mg/ml	-	3
pH	7	7
Przestrzeń nad roztworem	N2	N2
VIU:C,jedn. m-nar/ml
początkowo	105	108
3 miesiące, 7°C	99	105
6 miesięcy, 7°C	90	91
2 miesiące, 25°C	85	78
3 miesiące, 25°C	78	66

Oba roztwory wykazywały możliwą do przyjęcia trwałość VIII:C po przechowywaniu w ciągu 6 miesięcy w temperaturze 7°C.

174 866

Przykład 3. Porównanie roztworów zawierających glutation z roztworami zawierającymi kwas askrobinowy, przy przechowywaniu w atmosferze albo powietrza, albo azotu. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym w części eksperymentalnej. Roztwory przechowywano w temperaturze 25°C. Do fiolek rozdozowano po 2 ml roztworu.

Tabela 3

Badaniu poddano kompozycje jak następuje:

	3A	3B	3C	3D	3E	3F
L-histydyna, mg/ml	2,27	2,27	2,27	2,27	2,27	2,27
Chlorek sodowy, mg/ml	18,1	18,1	18,1	18,1	18,1	18,1
Chlorek wapniowy, mg/ml	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7
Polisorbat 80, mg/ml	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23
Glutation, mg/ml	0	0	0,3	0,3	0	0
Kwas askorbinowy, mg/ml	0	0	0	0	4	4
pH	7	7	7	7	7	7
Przestrzeń nad roztworem	n₂	Powietrze	n₂	Powietrze	n₂	Powietrze
VIII · C, jedn. m-nar/ml
początkowo	231	231	225	225	220	220
1 miesiąc	212	15	203	170	169	2
2 miesiące	200	6	177	113	-	-
3 miesiące	210	-	163	-	-	-

Po upływie 2 miesięcy przechowywania w atmosferze azotu, aktywność czynnika VIII została zachowana na poziomie wynoszącym około 80%, lub więcej, wartości początkowej. Nie zależało to od obecności czy nieobecności glutationu. Natomiast glutation powodował znaczne zwiększenie się trwałości w przypadku przechowywania roztworu z powietrzem nad jego powierzchnią. Kwas askorbinowy zmniejszał trwałość czynnika VIII.

Przykład 4. Porównanie roztworów zawierających glutation z roztworami nie zawierającymi glutationu, przy przechowywaniu w atmosferze powietrza lub azotu. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym w części eksperymentalnej. Roztwory przechowywano w dwóch różnych temperaturach, odpowiednio, 7°C i 25°C. Do fiolek rozdozowano po 2 ml roztworu.

Tabela 4

Badaniu poddano kompozycje jak następuje·

	4A	4B	4C	4D	4E	4F
1	2	3	4	5	6	7
L-histydyna, mg/ml	2,29	2,29	2,29	2,29	2,29	2,29
Chlorek sodowy, mg/ml	18,1	18,1	18,1	18,1	18,1	18,1
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7	3,7

174 866

1	2	3	4	5	6	7
Polisorbat 80, mg/ml	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23	0,23
Glutation, mg/ml	-	0,6	0,6	-	0,6	0,6
PH	7	7	7	7	7	7
Temperatura przechowywania, °C	25	25	25	7	7	7
Przestrzeń nad roztworem	Ar	Ar	Powietrze	Ar	Ar	Powietrze
VIII C, jedn. m-nar/ml
początkowo	234	176	234	234	176	234
1 miesiąc	213	157	133	232	172	160
2 miesiące	187	139	90	200	153	148
3 miesiące	185	138	72	207	159	131
4 miesiące	158	116	-	186	144	125
6 miesięcy	149	111	-	188	147	114
9 miesięcy	-	-	-	130	106	67

Po upływie 6 miesięcy przechowywania w atmosferze argonu, aktywność czynnika VHI została zachowana na poziomie wynoszącym około 65%, lub więcej, wartości początkowej, w przypadku przechowywania w temperaturze 25°C. Natomiast w przypadku przechowywania w temperaturze 7°C, odpowiednia wartość wynosiła 80% łub więcej.

174 866

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1 Sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII o aktywności 10-100000 IU/ml, znamienny tym, że miesza się czynnik krzepnięcia VIII z wodnym roztworem do uzyskania aktywności 10-100000 IU/ml i obniża się stężenie tlenu przez wprowadzenie roztworu do atmosfery obojętnego gazu i ewentualnie do roztworu dodaje się jeden lub więcej dodatków takich jak antyutleniacz, niejonowy środek powierzchniowo czynny, sól wapniowa, aminokwas, monosacharyd, disacharyd, alkohol cukrowy i chlorek sodowy.
2 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 200 ppm.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 50 ppm, korzystnie poniżej 10 ppm.
4 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gaz obojętny stosuje się azot.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaję się co najmniej jeden związek taki jak glutation, acetylocysteina, metionina, tokoferol, butylohydroksytoluen, butylohydroksyanizol lub inne związki fenolowe.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej glutation, acetylocysteinę i metioninę.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wysoko oczyszczony czynnik krzepnięcia VIII.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 7, znamienny tym, że stosuje się czynnik krzepnięcia VIII w postaci o pełnej długości lub w postaci delecyjnej pochodnej rekombinantowego czynnika VIII
9 Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ze stosuje się aktywny czynnik krzepnięcia VIH o stężeniu wynoszącym od 50 do 10000 IU/ml.
10. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się w ilości przewyzszającej krytyczne stężenie micelarne
11. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polioksamer (polimer blokowy oksyetylenu i oksypropylenu).
12. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polysorbate 20 (monolaurynian polioksyetyleno-20-sorbitanu) lub polysorbate 80 (monooleinian polioksyetyleno-20-sorbitanu).
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako.sól wapniową stosuje się chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako aminokwas stosuje się L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako disacharyd dodaje się sacharozę.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że miesza się i) 10-100000 jedn IU/ml rekombinantowego czynnika krzepnięcia VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, iii) chlorek sodowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM, v) aminokwas, taki jak L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM, vi) mono- lub disacharyd albo alkohol cukrowy, korzystnie sacharozę lub mannit.
17. Sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII o aktywności 10-100000 IU/ml, znamienny tym, że miesza się czynnik krzepnięcia VIII z wodnym roztworem i obniża stężenie tlenu najpierw obniżając ciśnienie a następnie wprowadzając gaz obojętny, korzystnie kilkakrotnie powtarzając cykle i ewentualnie do roztworu dodaje się jeden lub

174 866 więcej dodatków takich jak antyutleniacz, niejonowy środek powierzchniowo czynny, sól wapniowa, aminokwas, monosacharyd, disacharyd, alkohol cukrowy i chlorek sodowy.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 200 ppm.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 50 ppm, korzystnie poniżej 10 ppm
20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako gaz obojętny stosuje się azot.
21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek taki jak glutation, acetylocysteina, metionina, tokoferol, butylohydroksytoluen, butylohydroksyanizol lub inne związki fenolowe.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej glutation, acetylocysteinę i metioninę.
23. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się wysoko oczyszczony czynnik krzepnięcia VIII.
24. Sposób według zastrz. 17 albo 23, znamienny tym, że stosuje się czynnik krzepnięcia Vin w postaci o pełnej długości lub w postaci delecyjnej pochodnej rekombinantowego czynnika VIn.
25. Sposób według zastrz. 17 albo 23, znamienny tym, ze stosuje się aktywny czynnik krzepnięcia VIII o stężeniu wynoszącym od 50 do 10000 IU/ml.
26. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się w ilości przewyższającej krytyczne stężenie micelame.
27. Sposób według zastrz. 17 albo 26, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polioksamer (polimer blokowy oksyetylenu i oksypropylenu).
28. Sposób według zastrz. 17 albo 26, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polysorbate 20 (monolaurynian polioksyetyleno-20-sorbitanu) lub polysorbate 80 (monooleinian polioksyetyleno-20-sorbitanu).
29. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako sól wapniową stosuje się chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM.
30. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako aminokwas stosuje się L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM.
31. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako disacharyd dodaje się sacharozę
32. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że miesza się i) 10-100000 jedn. IU/ml rekombinantowego czynnika krzepnięcia VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, iii) chlorek sodowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM, v) aminokwas, taki jak L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM, vi) mono- lub disacharyd albo alkohol cukrowy, korzystnie sacharozę lub mannit
33. Sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII o aktywności 10-100000 IU/ml, znamienny tym, że eluuje się czynnik krzepnięcia VIII z ostatniego stopnia oczyszczania wodnym roztworem buforu i obniża się stężenie tlenu przez wprowadzenie roztworu do atmosfery gazu obojętnego i ewentualnie do roztworu dodaje się jeden lub więcej dodatków takich jak antyutleniacz, niejonowy środek powierzchniowo czynny, sól wapniowa, aminokwas, monosacharyd, disacharyd, alkohol cukrowy i chlorek sodowy.
34. Sposób według zastrz 33, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 200 ppm.
35. Sposób według zastrz 34, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 50 ppm, korzystnie poniżej 10 ppm
36. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że jako gaz obojętny stosuje się azot.

174 866
37 Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek taki jak glutation, acetylocysteina, metionina, tokoferol, butylohydroksytoluen, butylohydroksyanizol lub inne związki fenolowe.
38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej glutation, acetylocysteinę i metioninę.
39. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że stosuje się wysoko oczyszczony czynnik krzepnięcia VIII
40. Sposób według zastrz 33 albo 39, znamienny tym, ze stosuje się czynnik krzepnięcia VIII w postaci o pełnej długości lub w postaci delecyjnej pochodnej rekombinantowego czynnika VIII.
41. Sposób według zastrz 33 albo 39, znamienny tym, że stosuje się aktywny czynnik krzepnięcia VIII o stężeniu wynoszącym od 50 do 10000 IU/ml.
42. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się w ilości przewyższającej krytyczne stężenie micelarne.
43. Sposób według zastrz. 33 albo 42, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polioksamer (polimer blokowy oksyetylenu i oksypropylenu).
44. Sposób według zastrz. 33 albo 42, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polysorbate 20 (monolaurynian polioksyetyleno-20-sorbitanu) lub polysorbate 80 (monooleinian polioksyetyleno-20-sorbitanu)
45. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako sól wapniową stosuje się chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM.
46. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako aminokwas stosuje się L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM.
47. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako disacharyd dodaje się sacharozę.
48. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że miesza się i) 10-100000 jedn. IU/ml rekombinantowego czynnika krzepnięcia VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, iii) chlorek sodowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM, v) aminokwas, taki jak L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM, vi) mono- lub disacharyd albo alkohol cukrowy, korzystnie sacharozę lub mannit.
49. Sposób wytwarzania leku zawierającego czynnik krzepnięcia VIII o aktywności 10-100000 IU/ml, znamienny tym, ze eluuje się czynnik krzepnięcia VIII z ostatniego stopnia oczyszczania wodnym roztworem buforu i obniża się stężenie tlenu najpierw obniżając ciśnienie a następnie wprowadzając gaz obojętny, korzystnie kilkakrotnie powtarzając cykle i ewentualnie do roztworu dodaje się jeden lub więcej dodatków takich jak antyutleniacz, niejonowy środek powierzchniowo czynny, sól wapniowa, aminokwas, monosacharyd, disacharyd, alkohol cukrowy i chlorek sodowy.
50 Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 200 ppm
51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że stężenie tlenu obniża się poniżej 50 ppm, korzystnie poniżej 10 ppm.
52. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że jako gaz obojętny stosuje się azot
53. Sposób według zastrz 49, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek taki jak glutation, acetylocysteina, metionina, tokoferol, butylohydroksytoluen, butylohydroksyanizol lub inne związki fenolowe.
54. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że jako antyutleniacz dodaje się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej glutation, acetylocysteinę i metioninę.
55. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że stosuje się wysoko oczyszczony czynnik krzepnięcia VIII.

174 866
56. Sposób według zastrz. 49 albo 55, znamienny tym, że stosuje się czynnik krzepnięcia VIII w postaci o pełnej długości lub w postaci delecyjnej pochodnej rekombinantowego czynnika VIII
57. Sposób według zastrz. 49 albo 55, znamienny tym, że stosuje się aktywny czynnik krzepnięcia VIII o stężeniu wynoszącym od 50 do 10000 IU/ml.
58 Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się w ilości przewyzszającej krytyczne stężenie micelarne.
59 Sposób według zastrz. 49 albo 58, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polioksamer (polimer blokowy oksyetylenu i oksypropylenu).
60. Sposób według zastrz. 49 albo 58, znamienny tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny stosuje się kopolimer blokowy taki jak polysorbate 20 (monolaurynian polioksyetyleno-20-sorbitanu) lub polysorbate 80 (monooleinian polioksyetyleno-20-sorbitanu).
61. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że jako sól wapniową stosuje się chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM.
62. Sposób według zastrz 49, znamienny tym, że jako aminokwas stosuje się L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM.
63 Sposób według zastrz 49, znamienny tym, ze jako disacharyd dodaje się sacharozę
64 Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że miesza się i) 10-100000 jedn. IU/ml rekombinantowego czynnika krzepnięcia VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, iii) chlorek sodowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości wynoszącej ponad 0,5 mM, v) aminokwas, taki jak L-histydynę, w ilości wynoszącej ponad 1 mM, vi) mono- lub disacharyd albo alkohol cukrowy, korzystnie sacharozę lub mannit.