CN103298483B - 具有增加的比活性的抗血友病因子viii的新型变体 - Google Patents

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Abstract

本发明在血友病疗法的领域中。其涉及相较于已知的因子VIII产品具有增加的比活性的抗血友病因子VIII的新型变体。

Description

具有增加的比活性的抗血友病因子VIII的新型变体
发明领域
本发明在凝血因子和血友病的领域中。其涉及在本文中称为rFVIIIv3的抗血友病因子VIII(FVIII)的新变体，该变体相较于已知的因子VIII产品具有增加的比活性。
发明背景
当血小板在损伤位置附着至受伤血管的切壁(cut wall)时，凝血开始。随后，在酶促调节的反应的级联中，可溶性血纤蛋白原分子被酶凝血酶转化成血纤蛋白的不溶性链，其将血小板在血栓中保持在一起。在级联的每一个步骤中，变体前体被转化成在一系列中裂解下一个变体前体的蛋白酶。在大部分步骤中需要辅因子。
因子VIII(也称为抗血友病因子VIII或FVIII)作为无活性前体在血液中循环，紧密地非共价地结合至血管性血友病因子(von Willebrand factor)。因子VIII被凝血酶或因子Xa蛋白水解激活，所述凝血酶或凝血酶因子Xa使其与血管性血友病因子分离，并且在级联中激活其促凝血功能。活性形式的变体因子VIIIa是使因子IXa向因子X激活的催化效率增加数个数量级的辅因子。
人FVIII的克隆已显示变体包含组织在许多结构域(具有顺序A1-A2-B-A3-C1-C2)内的2332个氨基酸(Vehar等人，1984，Nature312，337-342；Toole等人，1984，Nature312，342-347和Wood等人，1984，Nature312，330-337)。大多数FVIII在血浆中是异二聚体，包含轻链和各种重链衍生物。异源二聚体结构归因于前体在精氨酸1648处的蛋白水解性裂解，从而导致分别包含A1-A2-B和A3-C1-C2的重链和轻链。重链内的异质性可通过其羧基末端B结构域内的限制性蛋白水解来解释。
为了用作因子X激活的辅因子，FVIII需要通过因子Xa或凝血酶产生的限制性蛋白水解。该激活包括在重链上的位置372和740处和轻链上的位置1689处的精氨酸处的裂解。已确定与无活性前体相比较，活性FVIII辅因子缺乏轻链片段1649-1689和完整的B结构域(Mertens等人，1993)。
未利用因子VIII治疗的在因子VIII或针对因子VIII的抗体中具有缺陷的人遭受不受控制的内出血，其可引起一系列严重症状，从关节中的炎症反应至早逝。在美国共计约10,000个严重的血友病患者可通过输注人因子VIII来治疗，如果以充足的频率和浓度施用，这可恢复血液的正常凝血能力。事实上，因子VIII的经典定义是存在于正常血浆中修正来源于患有甲型血友病的个体的血浆的凝血缺陷的物质。
几种具有不同程度的纯度的人血浆源性因子VIII的制剂可商购获得用于治疗甲型血友病。此类制剂包括来源于许多供体的混合血液的部分纯化的因子VIII，所述血液针对病毒进行了热处理和去垢剂处理但包含显著水平的抗原性变体；具有更低水平的抗原性杂质和病毒污染的单克隆抗体纯化的因子VIII；和重组人因子VIII。
抑制因子VIII的活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)的产生是血友病患者治疗中的严重并发症。
同种抗体(Alloantibody)响应因子VIII的治疗性输注在约20％的甲型血友病患者中产生。在产生抑制剂的先前未治疗的甲型血友病患者中，抑制剂通常在一年的治疗内产生。此外，使因子VIII失活的抗体(自身抗体)偶尔在具有先前正常因子VIII水平的个体中产生。如果抑制剂滴度足够低，则患者可通过增加因子VIII的剂量来治疗。然而，通常地抑制剂滴度是如此之高，以至于其不能被因子VIII压制。可选的策略是在正常止血过程中使用激活的凝血酶原复合物浓缩制剂(例如，KONYNE(Cutter Laboratories)、FEIBA(Baxter Healthcare)、PROPLEX(Baxter Healthcare))或重组人因子VIIa来绕过对因子VIII的需要。此外，由于猪因子VIII通常具有比人因子VIII显著更小的与抑制剂的反应性，因此已使用部分纯化的猪因子VIII制剂(HYATE：C(IPSEN Pharma))。已利用猪因子VIII成功地治疗了许多已产生针对人因子VIII的抑制性抗体的患者，这些患者已长期耐受这样的治疗。
然而，关于病毒或其它血液传播污染物的危险的公共卫生问题已限制了从猪血液纯化的猪因子VIII的有用性。因此开发了重组猪因子VIII变体，其被称为“OBI-1”并且描述于例如WO 01/68109中。OBI-1是部分B结构域缺失的猪FVIII。该分子目前正处于临床开发中。
已知B结构域缺失的因子VIII变体保持因子VIII的前凝血剂和辅因子活性。除此以外，Mertens等人(British Journal of Haematology1993，85，133-142)描述了缺乏B结构域和横跨赖氨酸713至精氨酸740的重链序列的重组人因子VIII变体。
许多血友病患者需要每天替换因子VIII以阻止出血和所造成的致畸形血友病性关节病(resulting deforming hemophilic arthropathy)。鉴于此，存在对更具效力的因子VIII分子的需要。
发明概述
在第一方面，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的因子VIII(FVIII)变体、缺乏多达27个氨基酸序列(对应于如图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740)的FVIII变体。该27个氨基酸序列NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQ ID NO：10)可部分或完全缺失。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏多达27个氨基酸的序列，该序列对应于如图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在另一个实施方案中，可缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26或25个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失对应于DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR(SEQ ID NO：10)的27个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏多达27个氨基酸的序列，该序列对应于如图2中描述的人因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：8的氨基酸714至740，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26或25个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失对应于NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQ ID NO：11)的27个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的猪FVIII变体，该变体完全缺乏对应于DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR(SEQ ID NO：10)的27个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的人FVIII变体，该变体完全缺乏对应于NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQ ID NO：11)的27个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的犬FVIII变体，该变体完全缺乏对应于NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR(SEQ ID NO：12)的27个氨基酸。
本发明的第二方面涉及编码第一方面中定义的多肽的多核苷酸和描述的实施方案。
在第三方面，本发明涉及包含第二方面中定义的多核苷酸的表达载体。
本发明的第四方面涉及包含第三方面中定义的表达载体的哺乳动物细胞。
在第五方面，本发明涉及用于产生第一方面中定义的FVIII的方法，其包括步骤：
a.培养根据第四方面的哺乳动物细胞；和
b.从哺乳动物细胞分离FVIII变体。
本发明的第六方面涉及包含第一方面中定义的FVIII变体的药物组合物。
在第七方面，本发明涉及治疗患有血友病的患者的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的第一方面的FVIII变体，从而治疗所述患者的血友病。
在第八方面，本发明涉及用于治疗血友病的根据第一方面的FVIII变体。
附图简述
图1显示对于5种已知的FVIII产品(空白柱)和新型rpFVIIIv3(混杂柱)所需的以μg/剂量表示的蛋白质的量。BDD＝缺失的B结构域；FL＝全长；u＝μ；
图2a-e是相同序列的连续。图2a-e显示来自人(智人)、猪(野猪)、小鼠(小家鼠)和狗(家犬)的因子VIII序列之间的序列比对。该序列比对获自HADB(aka HAMSTeRS)2010，甲型血友病突变数据库和关于因子VIII的资料来源位置的主页(hadb.org.uk)。编号按照人序列并且与序列表中的序列的氨基酸编号不相同。粗体加双下划线标示的序列描述了在本发明的重组FVIIIv3变体中失去的序列。下划线标示的序列是B结构域的序列。以灰色突出显示的序列是来自B结构域的部分，其可被保留在本发明的部分B结构域缺失的FIIIv3序列中；和
图3显示了实施例5中描述的校准标准的SEC特征谱和校准曲线的线性回归的典型实例。
序列概述
SEQ ID NO：1显示猪的部分B结构域缺失的FVIIIv3的序列；
SEQ ID NO：2显示人B结构域缺失的FVIIIv3的序列；
SEQ ID NO：3显示犬B结构域缺失的FVIIIv3的序列；
SEQ ID NO：4显示来自猪FVIII B结构域的序列，其可存在于本发明的部分B结构域缺失的FVIII分子(所谓的“B结构域接头”)；
SEQ ID NO：5显示来自人FVIII B结构域的B结构域接头序列，其可存在于本发明的部分B结构域缺失的FVIII分子中；
SEQ ID NO：6显示来自犬FVIII B结构域的B结构域接头序列，其可存在于本发明的部分B结构域缺失的FVIII分子中；
SEQ ID NO：7显示全长猪FVIII的氨基酸序列；
SEQ ID NO：8显示全长人FVIII的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9显示全长犬FVIII的氨基酸序列；
SEQ ID NO：10显示27肽序列，其对应于图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740；
SEQ ID NO：11显示27肽序列，其对应于图2中描述的人因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：8的氨基酸714至740；和
SEQ ID NO：12显示27肽序列，其对应于图2中描述的犬因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：9的氨基酸708至734。
发明详述
本发明基于部分B结构域缺失的重组猪因子VIII蛋白的变体的发现，所述变体包含特别的27个氨基酸的缺失。已显示该变体(其在本文中称为rpFVIIIv3)相较于包含27个氨基酸的区段(stretch)的类似蛋白(即称为“OBI-1”的部分B结构域缺失的重组猪FVIII)具有增加的比活性。已知OBI-1、其氨基酸序列和编码OBI-1的多核苷酸例如来自US 6,458,563。
本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的因子VIII(FVIII)变体，其中FVIII变体缺乏对应于图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740的氨基酸序列。
此外，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏对应于图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740的27个氨基酸的序列，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在一个变体中，缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个变体中，缺失27、26或25个氨基酸。在rpFVIIIv3变体中，缺失对应于DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR(SEQ ID NO：10)的27个氨基酸。
此外，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏对应于图2中描述的人因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：8的氨基酸714至740的27个氨基酸的序列，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在一个变体中，缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个变体中，缺失27、26或25个氨基酸。在人FVIIIv3变体(rhFVIIIv3)中，缺失对应于NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQ ID NO：11)的27个氨基酸。
此外，本发明涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺失对应于图2中描述的犬因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：9的氨基酸708至734的27个氨基酸的序列，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在一个变体中，缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个变体中，缺失27、26或25个氨基酸。在犬FVIIIv3变体(rcFVIIIv3)中，缺失对应于NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR(SEQ ID NO：12)的27个氨基酸。
此类变体具有相较于包含完整的27个氨基酸的序列的类似变体升高的比活性。优选地，比活性增加超过25％或30％或35％或40％或45％或50％或55％或60％。
如本文中所用，术语“比活性”是指可修正人因子VIII缺乏的血浆的凝血不良的活性。在其中将人因子VIII缺乏的血浆的凝血时间与正常人血浆的凝血时间相比较的标准测定中，将比活性测量为凝血活性的单位每毫克总因子VIII变体。被FDA接受用于高纯度的FVIII浓缩物的用于测量FVIII产品的效力的适当标准测定称为一期凝血测定(one-stageclotting assay)(OSCA；参见实施例5；Langdell RD，Wagner RH，Brinkhous KM.，Effectof antihemophilic factor on one-stage clotting tests：a presumptive test forhemophilia and a simple one-stage antihemophilic assay procedure，J Lab ClinMed，1953；41：637-47；Brand JT，Measurement of factor VIII：a potential riskfactor for vascular disease，Arch Pathol Lab Med，1993；117：48-51；Preston FE，Kitchen S，Quality control and factor VIII assays，Haemophilia，1998；4：651-3；National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS USA).Determinationof factor coagulant activities；Approved guideline，NCCLS Document H-48-A1997；17：1-36.)。存在于样品中的FVIII蛋白的量可以例如利用SEC HPLC(大小排阻高效液相色谱)来测量。
一个单位的因子VIII活性是存在于1毫升的正常人血浆中的活性。在测定中，血块形成的时间越短，则待测定的因子VIII的活性越大。猪因子VIII在人因子VIII测定中具有凝固活性。
与本发明一致，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。
“缺乏对应于图2中描述的氨基酸716至742的氨基酸序列”意指在本发明的FVIII变体中，缺失了(即不包括)氨基酸716和742以及这些位置之间的氨基酸。该氨基酸区段从而由本发明的FVIII变体所缺乏的27个氨基酸组成。
本发明的因子VIII变体在本文中总体称为“FVIII变体”或“FVIIIv3”或“rFVIIIv3”。它们可以是猪、人、犬、鼠或适用于人或动物疗法的任何其它来源的。图2描述了人、猪、鼠和犬来源的FVIII序列的序列比对。
本发明的FVIII变体中缺失的序列以粗体突出显示并且以双下划线标示。可由本领域技术人员，通过将其它物种的FVIII序列与例如猪或人序列比对，然后获取对应于按照本专利申请的图2的氨基酸716至742的氨基酸来鉴定其它物种的FVIII变体的该氨基酸区段。
本发明的实施方案涉及猪、人或犬来源的FVIII变体。
在实施方案中，根据本发明的FVIII变体包含SEQ ID NO：1的序列，或其包含与SEQID NO：1具有至少90％的同一性的序列的变体。应理解，10％的变异性涉及缺失的氨基酸区段外部的序列，即变体完全缺乏DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR(SEQ ID NO：10)(对应于图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQ ID NO：7的氨基酸714至740的氨基酸序列)。
在其它实施方案中，本发明的FVIII变体包含SEQ ID NO：2的序列，或其包含与SEQID NO：2具有至少90％的同一性的序列的变体。再次地，变体理解为完全缺乏对应于图2中描述的人因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：8的氨基酸714至740的氨基酸序列NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQ ID NO：11)。
在又其它实施方案中，本发明的FVIII变体包含SEQ ID NO：3的序列，或其包含与SEQ ID NO：3具有至少90％的同一性的序列的变体。再次地，变体理解为完全缺乏对应于图2中描述的犬因子VIII的氨基酸714至740或SEQ ID NO：9的氨基酸708至734的氨基酸序列NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR(SEQ ID NO：12)。
本发明的FVIII变体还可包含与SEQ ID NO：7、8或9的序列具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9％的同一性的序列。
为了测定两个多肽/蛋白质的同一性百分比，为了最佳的比较目的，将氨基酸序列比对(例如，可将空位引入第一氨基酸序列的序列以与第二氨基酸序列进行最佳比对)。随后比较对应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/总的位置数目(例如，(重叠位置)×100))。
两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的优选非限定性实例是在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中改进的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268的算法。这样的算法被整合至Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜寻可利用NBLAST程序，评分＝100，字长＝12来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST变体搜寻可利用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3来进行，以获得与本发明的变体分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对(为了比较目的)，可如Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast进行迭代搜寻，所述搜寻检测分子之间的远缘谱系关系(distant relationship)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限定性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS4：11-17的算法。将这样的算法整合至作为GCG序列比对软件包的部分的ALIGN程序(2.0版)中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表(weightresidue table)、为12的空位长度罚分以及为4的空位罚分。用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的另一个有用的算法是Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-2448中描述的FASTA算法。当使用FASTA算法比较核苷酸或氨基酸序列时，可以例如将PAM120权重残基表与为2的k-元组值(k-tuple value)一起使用。
两个序列之间的同一性百分比可使用类似于上述技术的技术，提供或不提供空位来进行测定。在计算百分比同一性中，仅计数完全匹配(exact match)。
本发明的FVIII变体可以是部分或完全B结构域缺失的。这意指缺失整个B结构域，或在FVIII变体中保留B结构域的部分。B结构域的剩余(保留的)部分例如选自彼此融合于读框内的B结构域的20、15、12、10或5个N末端氨基酸和20、15、12、10或5个C末端氨基酸。
因此，优选地，在本发明的部分B结构域缺失的FVIII变体中，除去约900个氨基酸的B结构域的大部分。在本发明的实施方案中，少于5％或少于4％或少于3％或少于2％或少于1％的B结构域仍然存在于FVIII变体中。
在本发明的实施方案中，B结构域的剩余部分选自由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6组成的序列。
在其它方面，本发明涉及编码上述多肽/蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是RNA或DNA分子，根据遗传密码的已知关系，其核苷酸序列体现了至宿主细胞的本发明的变体的氨基酸序列的编码信息。
在其它方面，本发明涉及包含上述多核苷酸的表达载体。
“表达载体”是通常具有环状结构的DNA元件，其具有在期望的宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中的能力，并且还具有允许在适当位点并且以适当的方向插入载体序列的编码DNA表达的某些公知特征。此类特征可包括但不限于一个或多个指导编码DNA的转录起始的启动子序列和其它DNA元件例如增强子、多腺苷酸化位点等，这在本领域全都是公知的。术语“表达载体”用于表示可使待表达的DNA编码序列插入其序列内的载体，和可使必需表达控制元件相对于插入位点这样排列以便其可用于表达插入该位点的任何编码DNA的载体，所述表达载体在本领域都是公知的。因此，例如，缺乏启动子的载体可通过插入与编码DNA组合的启动子变成表达载体。如本文中所用，表达载体还可以是病毒载体。
优选在哺乳动物细胞培养物中进行本发明的重组FVIII变体的表达。
因此，在其它方面，本发明涉及包含上述表达载体的哺乳动物细胞。例如，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)是在本发明的上下文中为适当的宿主细胞的哺乳动物细胞。
根据本发明的另一个方面，用于产生本发明的FVIII变体的方法包括步骤：
a.培养上述哺乳动物细胞；和
b.从哺乳动物细胞分离FVIII变体。
在实施方案中，方法还包括步骤
c.将因子VIII变体与适当的赋形剂一起配制成药物组合物。
适合于人或动物施用的赋形剂是例如药物稳定化合物、防腐剂、递送媒介物和/或载体媒介物。因子VIII产品的一种适当的制剂例如描述于WO 03/080108(将其通过引用并入本文)中。
在其它方面，本发明涉及包含本发明的FVIII变体的药物组合物。
本发明的其它方面涉及治疗具有因子VIII缺乏症的患者的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的FVIII变体，从而治疗所述患者的因子VIII缺乏症。
如本文中所用，术语“治疗有效量”意指足以在患者中显示可测量的改善或保护作用(例如，终止出血)的具有FVIII缺乏症的患者血浆中的FVIII水平，所述患者已接受FVIII变体的药物组合物。具有FVIII缺乏症的患者通常是先天性甲型血友病患者但也包括经诊断患有“获得性血友病”(其中非先天性血友病患者那些患者自发地对它们的FVIII产生抑制性抗体，从而产生严重的FVIII缺乏症的病症))的受试者。
本发明还涉及用于治疗因子VIII缺乏症的本发明的FVIII变体。
治疗可采取单次静脉内施用组合物或必要时在一段延长的时期中定期或连续施用的形式。优选地，FVIII变本的施用是通过静脉内途径。
如本文中所用，“因子VIII缺乏症”包括因缺陷型因子VIII的产生，因因子VIII的不足或未产生，或因抑制剂对因子VIII的部分或完全抑制而引起的凝血活性的缺乏。甲型血友病是由X连锁基因的缺乏以及其编码的因子VIII变体的不存在或不足而引起的一种类型的因子VIII缺乏症。
本发明的FVIII变体用于治疗血友病患者的因因子VIII缺乏而引起的不受控制的出血(例如，关节内、颅内或或胃肠道出血)。
在本发明的实施方案中，因子VIII缺乏症是甲型血友病。
在另一个实施方案中，因子VIII缺乏症是获得性血友病。
在实施方案中，治疗已产生人FVIIII抗体的患者的因子VIII缺乏症。
如上文中提及的，本发明的FVIII变体具有增加比活性。因此可能施用减少量的FVIII变体，以治疗根据本发明的VIII缺乏症。相较于利用不包含本发明的多达27个氨基酸缺失的FVIII产品的疗法，FVIII变体的量可减少至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％。
减少FVIII变体的量的疗法具有预期的减小的免疫原性的有利方面，即预期患者中产生针对FVIII替代疗法的抑制性抗体的概率显著减小。
在实施方案中，以不超过200μg/剂量或150μg/剂量或145μg/剂量或140μg/剂量或136μg/剂量或130μg/剂量的量施用本发明的因子VIII变体。
现已完全描述了本发明，本领域技术人员应理解，在不背离本发明的精神和范围以及无需过度实验的情况下可在宽范围的等同参数、浓度和条件内进行本发明。
虽然已结合其特定实施方案描述了本发明，但应理解其能够进行进一步改进。本申请意欲包括总体上遵从本发明的原理并且包括这样的与本公开内容的背离的本发明的任何变化、用途或改造，这在本发明所属的领域内的已知或常规实践内并且这可应用于上文中所示的基本特征(这落在所附权利要求的范围内)。
本文中引用的所有参考资料，包括期刊论文或摘要、公布的或未公布的美国或外国专利申请、发布的美国或外国专利或任何其它参考资料通过引用整体并入本文，包括在引用的参考资料中呈现的所有数据、表格、附图和文本文件。此外，本文中引用的参考资料的完整内容通过引用整体并入本文。
参考已知的方法步骤、常规方法步骤、已知的方法或常规方法绝不是承认在相关领域公开、教导或建议本发明的任何方面、描述或实施方案。
具体实施方案的前述描述如此全面地揭示了本发明的一般性质，以至于其他人在无需过度实验，在不背离本发明的一般概念的情况下，可通过应用本领域技术人员掌握的知识(包括本文中引用的参考资料的内容)容易地改进和/或改造(为了各种应用)此类具体实施方案。因此，基于本文中提供的教导和指导方针，此类改造和改进意欲在公开的实施方案的等同物的范围内。应理解，本文中的措辞或术语是为了说明目的而非限制，以便本说明书中的术语或措辞将由本领域技术人员根据本文中提供的教导和指导方针，结合本领域技术人员的知识来进行解释。
实施例
实施例1：重组猪部分B结构域缺失的FVIII(OBI-1)的表达及3种变体蛋白(rpVIIIv1、v2和v3)的分离
基本上如US 6,458,563中所述在BHK细胞中进行OBI-1的表达。在产生的材料中检测到3种变体(rpVIIIv1、v2和v3)。分离变体，通过离子交换层析将其纯化至大于95％的纯度。为了进行纯化，使用利用MonoQ HR10/10半制备型阴离子交换柱(现为Mono Q10/100GL，GE Healthcare Lifesciences#17-5167-01)的AKTA Explorer系统(AKTA Explorer10，GEHealthcare Lifesciences#17-5167-01)。利用两种下列缓冲液进行梯度洗脱：
缓冲液A：10mM TRIS，pH7.0，0.01％聚山梨酯80
缓冲液B：缓冲液A和1M氯化钠。
纯化法的特征概述于表1中。
表1：rpFVIII变体的纯化法
实施例2：变体3(rpVIIIv3)具有比变体1和2显著更高的比活性
通过将由一期凝血测定(OSCA)评估的效能除以每方法通过SECHPLC测量的蛋白质浓度来评估每一种变体的比活性。如实施例5的“材料和方法”中所述，进行OSCA和SEC HPLC法。
结果
比活性的结果示于表2中。
表2：从两个不同批次的rpFVIII获得的纯化的变体1、2和3的比活性(OSCA法)
*相对标准偏差
OSCA测定中变体3的显著更高的比活性的观察是明确和一致的。由于OSCA法对于人中凝固过程是预测性和代表性的，因此预期变体3是是具有有效值(significant value)的产品。预期效力的1.5-2.0倍的增加减少了给患者施用的FVIII的量，从而可能间接减少免疫副作用的发生。
实施例3：rpFVIIIv3的序列测定
通过肽图谱，然后通过在Q-TOF Ultima质谱仪上进行LCMS(液相色谱质谱)和LCMS/MS(液相色谱质谱/质谱)，运行MassLynx4.0(Waters Corporation，Milford，MA)来测定纯化的v3的序列。
使用具有10,000MWCO滤膜(Millipore Corporation，Billerica，MA)的Amicon，Centricon YM-10浓缩器将约250μg的变体3浓缩成小于100μL的体积。将样品与450μL的6M盐酸胍/0.002M EDTA(乙二胺四乙酸)/0.02M Tris缓冲液pH8混合，转移至2.0mL聚丙烯管中。将1M DTT(二硫苏糖醇)添加至每一个样品至10mM的终浓度，在37℃下孵育1小时。还原后，将2M碘乙酰胺添加至每一个管至20mM的终浓度，在室温下再孵育1小时。将还原的和烷基化的样品转移至透析盒(dialysis cassette)，针对1L50mM的含有1.0M尿素，pH8的碳酸氢铵透析缓冲液透析1小时。随后在维持恒定搅拌的同时将样品在室温下针对1L透析缓冲液透析过夜。透析后，终体积为各自约0.5mL。将样品分成两个125μg的等分。
透析后，将蛋白质样品包含在对于利用胰蛋白酶的蛋白水解消化是最佳的基质中。将胰蛋白酶以1∶20(w∶w)的酶底物比添加至每一个样品，在37℃下孵育8小时。将所有样品转移至HPLC小瓶，通过HPLC-MS进行分析。
将还原的和烷基化的蛋白质注射至Vydac C18反相柱(Grace，Deerfield，IL)上。在样品注射之前，分析空白样品(移动相A；含有0.2％(v∶v)甲酸的去离子水)以平衡柱子和显示干涉峰(interfering peak)的不存在。
以阳离子模式使用电喷射离子化(ESI)在Q-TOF API-US质谱仪或Q-TOF Ultima质谱仪(Waters Corporation，Milford，MA)上收集质谱数据。在进行样品分析之前，使用对覆盖175至1285m/z的范围的Glu-血纤蛋白原肽的碎片离子的五阶拟合(5th order fit)来校准质谱。为了校准以通过规范(specification)，要求肽碎片质量的RMS(均方根)误差小于5ppm。软件包Masslynx4.0TM SP2和SP4(Waters Corporation，Milford，MA)用于数据获取和分析。
使用单个液相色谱(LC)运行收集MS和MS/MS数据。从200-1950m/z收集全质谱(MS)测量扫描。
rpFVIII的序列经测定对应于SEQ ID NO：1。该序列相较于OBI-1序列包含27个氨基酸的缺失。
实施例4：rpFVIIIv3具有比其它已知的FVIII产品更高的比活性
将rpFVIIIv3的比活性与3种商购可得的FVIII产品即(重组的B结构域缺失的人FVIII，来自WyethPharmaceuticals(Philadelphia，PA))、(全长人FVIII，来自Bayer Healthcare(Tarrytown，NY))和(全长人FVIII，来自Baxter(Westlake Village，CA))以及与目前处于临床开发中的OBI-1(重组的部分B结构域缺失的猪FVIII)和B结构域缺失的犬因子VIII(Denise E.Sabatino等人，Recombinant canine Bdomain-deleted FVIII exhibits high specific activity and is safe in thecanine hemophilia A model，Blood，2009年11月12日，第114卷，No.20，第4562-4565页)相比较。
OBI-1和rpFVIIIv3的比活性通过实施例5中描述的方法来进行测定。
结果描述于表3和图1中。由于其增加的比活性，因此可给患者施用每剂量更低的prVIIIv3的量。预期剂量的减少将导致减小的免疫原性，即导致更低的患者产生抑制性抗体的概率。
表3：与rpVIIIv3相比较的FVIII产品的比活性
^Amt蛋白＝xxxxμg/剂量。对于rpVIII3栏中显示的数目表示将需要136μg/剂量的量。一个剂量是使血液因子VIII水平从0％升至100％所需要的量，即比活性(XXX个单位/mg)越高，需要的量(以μg表示)越少。要指出的是1mg＝1000μg。假定典型剂量为3000个单位/患者，则实际需要的蛋白质的量＝3000/22000＝0.136mg＝136μg。
*BDD代表B结构域缺失以及FL代表全长。
总之，这些结果显示rpVIIIv3具有比目前商业化的或处于临床开发中(以用于FVIII替代疗法)的测试产品显著更高的比活性。
具体地，高度令人惊讶地存在于rpVIIIv3而非OBI-1中的27个氨基酸的缺失导致50％的比活性的增加(如通过OSCA测定测量的)。
实施例5：材料和方法
一期凝血测定-OSCA-法
1.将参照标准于测定缓冲液(10％的因子VIII缺乏血浆+每升Owren’s Veronal缓冲液28mmol的巴比妥钠和125mmol的NaCl，pH7.35)中稀释至1.0个单位/mL的目标效力。
2.将检查标准、活性对照和样品在测定缓冲液中稀释至目标效力。
3.将校准标准(参照)和试剂上样至Symex仪内部的适当的孔中。(Sysmex CA-1500，Coagulation Analyzer，Dade Behring#B4260-1500(Siemans Corporation，Deerfield，IL))。
4.将检查标准、对照和样品上样至Sysmex仪外部的支架(rack)上。
5.测定顺序如下在仪器内部自动地进行：
a.将5uL的样品在反应管的内部稀释至45ul的测定缓冲液中
b.将50ul的因子VIII缺乏的血浆添加至反应管
c.50ul的Dade Actin FS(1.0X10-4M鞣花酸激活剂中的纯化的大豆磷脂，DadeBehring，Liederbach，Germany)激活的部分促凝血酶原激酶时间试剂添加至反应管中并且孵育60秒。
d.将50ul的氯化钙(0.025M，Dade Behring，Liederbach，Germany)添加至反应管中，孵育240秒。
e.测量凝血时间多达300秒的最长时间。
6.随后使凝血时间与通过参照标准校正曲线产生的效力相关联。
大小排阻(SEC)HPLC法
将Agilent1100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)或WatersBioalliance HPLC系统(Waters Corporation，Milford，MA)用于以及通常用于大小排阻法，以测定蛋白质浓度。使用的典型的大小排阻柱为来自GE的Superdex200(Superdex20010.300GL，10X300mm，Cat#17-5175-01(GE Healthcare Lifesciences，Piscataway，NJ))。一般的测定方案如下：
1.制备包含400mM NaCl与20mM TRIS，pH7.4和0.01％聚山梨酯80的典型流动相。
2.将流动相运行通过HPLC系统和柱子直至观察到基线的平衡。
3.运行标准以建立系统适用性，对于每一个样品使用30分钟的典型运行时间。
4.通常将样品上样至自动取样器上，控制室温度为4℃。
5.将已知浓度的包含不同量的标准样品(通常1、3、5、10和25μg的蛋白质)的校准标准以10至50μl的体积上样至柱子上。
6.也将未知浓度的样品通常以30至50μl的体积上样至柱子中。
7.HPLC系统经编程以按照设立的顺序自动地运行样品。
8.基于荧光检测(利用分别在280nm和340nm上的激发和发射)测定校准标准和未知样品的峰面积。
9.产生校准标准的线性回归，对照该校准曲线测定未知样品的浓度。
校正标准的SEC曲线和校准曲线的线性回归的典型实例示于图3中。
实施例6：与血管性血友病因子的结合
血管性血友病因子(vWF)是多功能糖蛋白，其作为与因子VIII(FVIII/vWF复合物)复合的多聚体形式在血浆中循环。FVIII/vWF复合物用于在体内循环中保护结合的FVIII免受早期蛋白水解。
大小排阻层析(SEC)用于表征FIII/vWF复合物中的结合。因其已知的生物相容性和4000万道尔顿的高排阻极限(流动相配制缓冲液：2mM CaCl2、10mM Tris pH7.0、300mMNaCl、0.01％PSB-80、11mM蔗糖、10mM柠檬酸三钠)而选择Superose6柱(Superose610/300GL，GE Healthcare#17-5172-01，流速＝0.5mL/分钟)。血管性血友病因子(二聚体@～500KD，Fitzgerald目录号30C-CP4003U，批次号A09121050，单体分子量＝～260kD，浓度＝77μg/mL)与rpFVIII(～160KD)之间的分子量的差异足以分辨两个种类。
通过利用递增量的rpFVIII滴定恒定量的vWF来测定结合的化学计量学。根据SEC层析谱和适当的峰的积分测定rpFVIII与vWF之间复合物形成的特征谱。将所得的混合物在上清液中的可溶性形式用于测定复合物形成的终点(根据利用递增量的rpFVIII进行的滴定)。rpFVIII与vWF之间形成的更大的稳定复合物从正常保留时间迁移至柱子的排阻极限。当饱和发生时，将在SEC层析中观察到递增量的未结合的rpFVIII。该方法用于区分变体性质的差异和相似性。
实施例7：凝血酶消化动力学
SDS-PAGE
重组猪因子VIII(rpFVIII)分子是约160kD的由78.5kD分子量的轻链(A3-C1-C2，765-1448)和分子量从86.7kD变化的重链(A1-A2)组成的异二聚体。rpFVIII的重链是异源的并且由3个主要变体组成，所述变体从细胞分泌后形成并且可被称为PACE(配对的碱性氨基酸裂解酶)的枯草杆菌蛋白酶家族的膜结合蛋白酶裂解。
与人因子VIII一样，通过从凝血酶限制性蛋白水解将rpFVIII转化成活性形式。rpFVIII的凝血酶激活对于Arg(372)-Ser(373)处的重链的裂解位点是特异性的。轻链在Arg(805)-Ser(806)处的裂解区释放765-804(～4.4kD)的小的40个氨基酸肽片段。这些由凝血酶产生的初始裂解的组合将激活的重组猪因子VIII形成为称为A1(～50kD)、A2(～40kD)和A3-C1-C2(～70kD)的亚单位的异三聚体。裂解的rpFVIIIA1和A3-C1-C2亚单位保留二价金属离子依赖性连接，然而A2亚单位主要通过静电相互作用与A1-A3-C1-C2二聚体较弱地缔合。在SDS-PAGE中，此类亚单位显示为3条不同的条带。rpFVIII(2个肽单位)至3个肽单位的转化的效力是产品的凝血酶激活的特征。该方法区分个体变体之间的相似性和差异。
两个其它正交法可用于对FVIII的凝血酶消化的动力学作图。可使用变性反相HPLC；预期峰特征谱与SDS-PAGE的相似。还可使用阴离子交换层析，其保留肽的天然形式。
反相HPLC
设备：
1.HPLC1100系列：Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA；型号61312A，系列号DE10907753。
2.Poroshell5um2.1X75mm柱：Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA；产品编号(Part No.)660750-909，系列号USVV001988。
试剂：
1.缓冲液A：0.1％的水中的TFA(JT B Baker，Phillisburg，NJ；目录号94700-00，批次号J23J00)
2.缓冲液B：0.1％的乙腈中的TFA(JTBaker，Phillisburg，NJ；目录号9017-03，批次号J38807)。
步骤：
1.使用99％A和1％B以1ml/分钟平衡柱子，进行60分钟。
2.以50μl的体积进行样品注射；25μl的参照标准用作对照。
3.用于运行样品的方法的实例示于表4中。
表4：
阴离子交换层析
设备：
1.AllianceBio HPLC，Waters corporation，Milford，MA，USA；型号2796；系列号M08BA1199M。
2.Protein Pak Hi Res Q5um4.6X100mm柱：Waters Corporation，Milford，MA，USA；产品编号186004931，系列号502N112561VE04。
试剂：
缓冲液A：
10mM Tris碱(1.211g/L)
2mM氯化钙(0.588g/L)
0.01％聚山梨酯80(1ml的10％PS-80/L)
多达1L的过滤水，pH7.0
缓冲液B：
10mM Tris碱(1.211g/L)
2mM氯化钙(0.588g/L)
0.01％的聚山梨酯80(1ml的10％PS-80/L)
1M氯化钠(58.44g/L)
多达1L的过滤水，pH7.0
步骤：
1.使用70％A和30％B以0.5ml/分钟平衡柱子，进行60分钟
2.以50μl的体积进行样品注射；将10μl的参照标准用作对照。
3.用于运行样品的方法的实例示于表5中。
表5：
本领域技术人员将知道并且理解这些以及其它方法可用于达到理解本文中描述的重组因子VIII蛋白。

Claims (12)

1.一种分离的且重组的猪因子VIII(FVIII)变体，所述FVIII变体的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的FVIII变体。
3.一种表达载体，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种哺乳动物细胞，其包含根据权利要求3所述的表达载体。
5.一种用于产生FVIII变体的方法，其包括步骤：
a.培养根据权利要求4所述的哺乳动物细胞；和
b.从所述哺乳动物细胞分离FVIII变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括步骤
c.将所述FVIII变体与适当的赋形剂一起配制到药物组合物中。
7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的FVIII变体。
8.根据权利要求1所述的FVIII变体在制备治疗有此需要的患者的血友病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述血友病是甲型血友病。
10.根据权利要求8所述的应用，其中所述血友病是获得性血友病。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的应用，其中所述患者已产生人FVIII抗体。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的应用，其中以不超过200μg/剂量或150μg/剂量或140μg/剂量的量施用所述FVIII变体。
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