KR20140114266A - 증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ｖｉｉｉ의 신규 변이체 - Google Patents

증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ｖｉｉｉ의 신규 변이체 Download PDF

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Abstract

요약
본 발명은 혈우병 치료법의 분야 내에 있다. 본 발명은 공지된 인자 VIII 산물과 비교하여 증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 VIII의 신규 변이체에 관한 것이다.

Description

증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ＶＩＩＩ의 신규 변이체{A new variant of antihemophilic factor VIII having increased specific activity}
본 발명의 분야
본 발명은 혈액 응고 인자 및 혈우병의 분야 내에 있다. 본 발명은 공지된 인자 VIII 산물과 비교하여 증가된 특이 활성도를 갖는, 본 명세서에서 rFVIIIv3으로 명시된, 항혈우병 인자 VIII (FVIII)의 신규 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
혈액응고는 혈소판이 병변 부위에서 손상된 혈관의 잘린 벽에 부착될 때 시작된다. 그 후에, 효소로 조절된 반응의 캐스케이드(cascade)에서, 용해성 피브리노겐 분자는 효소 트롬빈에 의해 혈전에서 혈소판을 함께 유지시키는 피브린의 불용성 가닥으로 전환된다. 캐스케이드의 각 단계에서, 변이 전구체는 시리즈에서 다음 변이 전구체를 절단하는 프로테아제로 전환된다. 보조인자는 대부분의 단계에서 요구된다.
폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)에 단단히 및 비-공유결합으로 결합되는 인자 VIII (항혈우병 인자 VIII 또는 FVIII으로도 또한 불림)은 혈액 내에서 불활성 전구체로서 순환한다. 인자 VIII은 트롬빈 또는 인자 Xa에 의해 단백질 분해성으로 활성화되며, 이는 캐스케이드에서 상기 인자를 폰 빌레브란트 인자와 분리하고 상기 인자의 전응고(procoagulant) 기능을 활성화한다. 상기 인자의 활성 형태에서, 변이체 인자 VIIIa는 인자 X 활성화에 대하여 인자 IXa의 촉매 효율성을 수십배 증가시키는 보조인자이다.
인간 FVIII의 클로닝(Cloning)은 변이체가 서열 A1-A2-B-A3-C1-C2를 가진 다수의 도메인 내에서 조직화된 2332개 아미노산을 함유한다는 점을 나타냈다 (Vehar et al., 1984, Nature 312, 337-342; Toole et al., 1984, Nature 312, 342-347 및 Wood et al., 1984, Nature 312, 330-337). 대부분의 FVIII은 혈장에서 이종이합체이며, 이는 경쇄 및 다양한 중쇄 유도체를 함유한다. 이종이합체 구조는 아르기닌1648에서의 전구체의 단백질 분해성 절단 때문이며, 이는 A1-A2-B 및 A3-C1-C2를 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 야기한다. 중쇄내 이질성(heterogeneity)은 이의 카르복시-말단 B-도메인 내에 제한된 단백질분해에 의해 설명된다.
인자 X 활성화를 위한 보조-인자로서 기능하기 위하여, FVIII은 인자 Xa 또는 트롬빈에 의한 제한된 단백질분해를 필요로 한다. 이 활성화는 중쇄 상에서 위치 372 및 740 및 경쇄 상에서 위치 1689의 아르기닌에서 절단을 수반한다. 불활성 전구체와 비교하여, 활성 FVIII 보조인자는 경쇄 단편 1649-1689 및 전체 B-도메인이 부족하다는 점이 입증되었다 (Mertens et al., 1993).
인자 VIII으로 치료되지 않은, 인자 VIII 또는 인자 VIII에 대항하는 항체에서 결핍이 있는 사람들은 관절에서의 염증 반응에서부터 요절(early death)까지, 다양한 심각한 증상을 야기할 수 있는 비제어 내출혈로 고통받는다. 미국에서 총 약 10,000명의 심각한 혈우병 환자는 충분한 빈도 및 농도로 투여된다면 혈액의 정상적인 응고력을 복구할, 인간 인자 VIII의 주입으로 치료될 수 있다. 인자 VIII의 고전적 정의는, 사실, 혈우병 A를 앓는 개체로부터 유래된 혈장에서 응고 결함을 보정하는 정상적인 혈장내 존재하는 물질이다.
다양한 순도의 인간 혈장-유래 인자 VIII의 여러가지 제조물은 혈우병 A의 치료를 위해 상업적으로 이용가능하다. 이들은 바이러스에 대해 열처리 및 세제 처리된, 하지만 상당한 수준의 항원 변이체를 함유한 많은 공여자의 풀링된(pooled) 혈액으로부터 유래된 부분적으로 정제된 인자 VIII; 더 낮은 수준의 항원 불순물 및 바이러스 오염을 갖는 단일클론 항체 정제 인자 VIII; 및 재조합형 인간 인자 VIII을 포함한다.
인자 VIII의 활성도를 저해하는 항체의 발달 ("저해자" 또는 "저해 항체")은 혈우병을 앓는 환자의 관리에서 심각한 합병증이다.
동종항체는 인자 VIII의 치료학적 주입에 반응하여 혈우병 A를 앓는 환자 중 대략적으로 20%에서 발달한다. 저해자를 발달시킨, 이전에 치료되지 않은 혈우병 A를 앓는 환자에서, 상기 저해자는 주로 치료 1년 이내에 발달한다. 추가적으로, 인자 VIII을 불활성시키는 항체 (자가항체)는 이전에는 정상적인 인자 VIII을 갖던 개체에서 주로 발달한다. 저해자 역가가 충분히 낮다면, 환자는 인자 VIII의 분량을 증가시킴으로써 관리될 수 있다. 하지만, 종종 저해자 역가는 너무 높아서 인자 VIII에 의해 압도될 수 없다. 대안적인 전략은 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축 제제 (예를 들어, KONYNE (Cutter Laboratories), FEIBA (Baxter Healthcare), PROPLEX (Baxter Healthcare)) 또는 재조합형 인간 인자 VIIa를 사용하여 정상적인 지혈 동안 인자 VIII에 대한 필요성을 피하는 것이다. 추가적으로, 돼지 인자 VIII가 인간 인자 VIII보다 상당히 더 낮은 저해자와의 반응도를 갖기 때문에, 부분적으로 정제된 돼지 인자 VIII 제제 (HYATE: C (IPSEN Pharma))가 사용되었다. 인간 인자 VIII에 대한 저해 항체가 발달된 많은 환자는 돼지 인자 VIII으로 성공적으로 치료되었고 장시간 동안 이러한 치료를 용인하였다.
하지만, 공중 보건은 돼지 혈액으로부터 정제된 돼지 인자 VIII의 유용성을 제한시킨 바이러스 또는 기타 혈액-매개성 오염물의 위험요인에 관해 염려한다. 따라서 재조합형 돼지 인자 VIII 변이체가 개발되었으며, 이는 "OBI-1"로 명시되고 그리고 가령 WO 01/68109에서 설명된다. OBI-1은 부분적 B-도메인 결실 돼지 FVIII이다. 이 분자는 현재 임상 개발 중에 있다.
B-도메인 결실 인자 VIII 변이체는 인자 VIII의 전응고 및 보조인자 활성도를 유지하는 것으로 공지된다. 이에 더불어, Mertens et al. (British Journal of Haematology 1993, 85, 133-142)은 B-도메인 및 리신 713에서부터 아르기닌 740까지 중쇄 서열 스패닝(spanning)이 결핍된 재조합형 인간 인자 VIII 변이체를 설명한다.
많은 혈우병 환자는 출혈 및 결과적 변형 혈우병성 관절증을 예방하기 위해 매일 인자 VIII의 대체를 필요로 한다. 이를 고려하여, 더 강력한 인자 VIII 분자가 필요하다.
본 발명의 개요
첫번째 측면에서, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 인자 VIII (FVIII) 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 최대 27개까지 아미노산 서열이 없다. 이 27개 아미노산 서열인, NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR (서열번호:10)은 부분적으로 또는 완전히 결실 될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 최대 27까지 아미노산 서열이 없고, 여기서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 결실될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 아미노산이 결실된다. 또 다른 구체예에서, 27, 26, 또는 25개 아미노산이 결실된다. 또 다른 구체예에서 DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR (서열번호:10) 에 상응하는 27개 아미노산이 결실된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 인간 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 최대 27까지 아미노산 서열이 없고, 여기서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 결실될 수 있다. 또 다른 구체예에서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 아미노산이 결실된다. 또 다른 구체예에서, 27, 26, 또는 25개 아미노산이 결실된다. 또 다른 구체예에서, NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR (서열번호:11)에 상응하는 27개 아미노산이 결실된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR (서열번호:10)에 상응하는 27개 아미노산이 완전히 없는 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 돼지 FVIII 변이체에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR (서열번호:11)에 상응하는 27개 아미노산이 완전히 없는 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 인간 FVIII 변이체에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR (서열번호:12)에 상응하는 27개 아미노산이 완전히 없는 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 개 FVIII 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 두 번째 측면은 첫번째 측면 및 설명된 구체예에서 정의된 바와 같이 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 두 번째 측면에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 측면은 세 번째 측면에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 포유류 세포에 관한 것이다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 측면에서 정의된 바와 같은 FVIII을 생성하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 네 번째 측면에 따른 포유류 세포를 배양하는 단계; 및
b. 포유류 세포로부터 FVIII 변이체를 단리시키는 단계.
본 발명의 여섯 번째 측면은 첫 번째 측면에서 정의된 바와 같은 FVIII을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
일곱 번째 측면에서, 본 발명은 혈우병을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 FVIII 변이체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여, 그렇게 함으로써 상기 환자의 혈우병을 치료하는 단계를 포함한다.
여덟 번째 측면에서, 본 발명은 혈우병을 치료하는 데에 사용하기 위해 첫 번째 측면에 따른 FVIII 변이체에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 5개의 공지된 FVIII 산물 (비어있는 기둥) 및 신규 rpFVIIIv3 (빗금 친 기둥)을 대해 요구되는 분량 당 μg의 단백질의 양을 나타낸다. BDD=B-도메인 결실(B-domain deleted); FL=전장(full length); u=μ;
도 2 a-e는 동일한 서열의 연속이다. 도 2a-e는 인간 (호모 사피엔스(homo sapiens)), 돼지 (서스 스크로파(sus scrofa)), 쥐 (머스 머스큘러스(mus musculus)) 및 개 (카니스 파밀리아리스(canis familiaris))로부터의 인자 VIII 서열 간의 서열 배열을 나타낸다. 이 서열 배열은 인자 VIII에 대한 연구를 위한 공급원 사이트 및 혈우병 A 돌연변이 데이터베이스(Haemophilia A Mutation Database)의 홈페이지 (hadb.org.uk)인, HADB (HAMSTeRS로도 알려짐) 2010에서 가져온 것이다. 번호 매기기는 인간 서열에 따르고 서열 리스트내 서열의 아미노산 수와 동일하지는 않다. 굵은 글씨체와 이중으로 밑줄친 서열은 본 발명의 재조합형 FVIIIv3 변이체에서 없어진 서열을 도시한다. 밑줄친 서열은 B-도메인의 서열이다. 회색으로 강조된 서열은 본 발명의 부분적 B-도메인 결실 FIIIv3 서열에서 유지될 수 있는 B-도메인의 일부이다; 그리고
도 3은 실시예 5에서 설명되는 바와 같은 캘리브레이션 표준물(calibration standard)의 SEC 프로파일 및 캘리브레이션 곡선(calibration curve)의 선형 회귀의 전형적인 예를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호: 1은 돼지의 부분적 B-도메인 결실 FVIIIv3의 서열을 나타낸다;
서열번호: 2는 인간의 B-도메인 결실 FVIIIv3의 서열을 나타낸다;
서열번호: 3은 개의 B-도메인 결실 FVIIIv3의 서열을 나타낸다;
서열번호: 4는 본 발명의 부분적 B-도메인 결실 FVIII 분자에서 존재할 수 있는 돼지 FVIII B-도메인으로부터의 서열을 나타낸다 (소위 "B-도메인 연결자")
서열번호: 5는 본 발명의 부분적 B-도메인 결실 FVIII 분자에서 존재할 수 있는 인간 FVIII B-도메인으로부터의 B-도메인 연결자 서열을 나타낸다;
서열번호: 6은 본 발명의 부분적 B-도메인 결실 FVIII 분자에서 존재할 수 있는 개 FVIII B-도메인으로부터의 B-도메인 연결자 서열을 나타낸다;
서열번호: 7은 전장 돼지 FVIII의 아미노산 서열을 나타낸다;
서열번호: 8은 전장 인간 FVIII의 아미노산 서열을 나타낸다;
서열번호: 9는 전장 개 FVIII의 아미노산 서열을 나타낸다;
서열번호:10은 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호: 7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 27개 펩티드 서열을 나타낸다;
서열번호:11은 도 2에서 도시된 바와 같은 인간 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호: 8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 27개 펩티드 서열을 나타낸다; 그리고
서열번호:12는 도 2에서 도시된 바와 같은 개 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호: 9의 아미노산 708 내지 734에 상응하는 27개 펩티드 서열을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 특정한 27개 아미노산 결실을 함유한 부분적 B-도메인 결실 재조합형 돼지 인자 VIII 단백질의 변이체의 결과에 기반한다. 본 명세서에서 rpFVIIIv3으로 명시된, 이 변이체는 27개 아미노산 스트레치(stretch)를 함유한 유사 단백질, 즉 "OBI-1"라고 불리는 부분적 B-도메인 결실 재조합형 돼지 FVIII과 비교하여 증가된 특이 활성도를 갖는 것으로 나타났다. OBI-1, 이의 아미노산 서열 및 OBI-1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 가령 US 6,458,563에서 공지된다.
본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 인자 VIII (FVIII) 변이체에 관한 것이며, 여기서 FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
추가적으로, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 27개 아미노산 서열이 없고, 여기서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 결실될 수 있다. 한 가지 변이체에서, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 아미노산이 결실된다. 또 다른 변이체에서, 27, 26, 또는 25개 아미노산이 결실된다. rpFVIIIv3 변이체에서, DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR (서열번호:10)에 상응하는 27개 아미노산이 결실된다.
추가적으로, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 인간 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호:8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 27개 아미노산 서열이 없고, 여기서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개 아미노산이 결실될 수 있다. 한 가지 변이체에서, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 아미노산이 결실된다. 또 다른 변이체에서, 27, 26, 또는 25개 아미노산이 결실된다. 인간 FVIIIv3 변이체 (rhFVIIIv3)에서, NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR (서열번호:11)에 상응하는 27개 아미노산이 결실된다.
추가적으로, 본 발명은 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에 관한 것이며, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 개 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호:9의 아미노산 708 내지 734에 상응하는 27개 아미노산 서열이 없고, 여기서 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 결실될 수 있다. 한 가지 변이체에서, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 아미노산이 결실된다. 또 다른 변이체에서, 27, 26, 또는 25개 아미노산이 결실된다. 개 FVIIIv3 변이체 (rcFVIIIv3)에서, NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR (서열번호:12)에 상응하는 27개 아미노산이 결실된다.
이러한 변이체는 온전한 27개 아미노산 서열을 함유한 유사한 변이체와 비교하여 높은 특이 활성도를 갖는다. 바람직하게는, 특이 활성도가 25 % 또는 30 % 또는 35 % 또는 40 % 또는 45 % 또는 50 % 또는 55 % 또는 60 %보다 크게 증가된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이 활성도"는 인간 인자 VIII 결핍 혈장의 응고 결함을 보정할 활성도를 나타낸다. 특이 활성도는 인간 인자 VIII 결핍 혈장의 응고 시간이 정상 인간 혈장의 응고 시간과 비교되는 표준 분석에서 총 인자 VIII 변이체 밀리그램 당 응고 활성도의 유닛으로 측정된다. 고순도 FVIII 농축물에 대하여 FDA에 의해 승인된, FVIII 산물의 효능을 측정하기 위한 적합한 표준 분석은 1-단(one-stage) 응고 분석 (OSCA; 실시예 5를 참고; Langdell RD, Wagner RH, Brinkhous KM., Effect of antihemophilic factor on one-stage clotting tests: a presumptive test for hemophilia and a simple one-stage antihemophilic assay procedure, J Lab Clin Med, 1953; 41:637-47; Brand JT, Measurement of factor VIII: a potential risk factor for vascular disease, Arch Pathol Lab Med, 1993; 117:48-51; Preston FE, Kitchen S, Quality control and factor VIII assays, Haemophilia, 1998; 4:651-3; National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS USA). Determination of factor coagulant activities; Approved guideline, NCCLS Document H-48-A 1997; 17:1-36.)으로 불린다. 샘플 내 존재하는 FVIII 단백질의 양은 가령 SEC HPLC (크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 측정될 수 있다.
인자 VIII 활성도의 하나의 유닛은 1 밀리리터의 정상적인 인간 혈장에서 존재하는 활성도이다. 분석에서, 응고 형성에 대하여 더 짧은 시간일 수록, 분석되는 인자 VIII의 활성도는 더 크다. 돼지 인자 VIII은 인간 인자 VIII 분석에서 응고 활성도를 갖는다.
본 발명에서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되고 있다.
"도 2에서 도시된 바와 같은 아미노산 716 내지 742에 상응하는 아미노산 서열이 없다"는 것은 아미노산 716 내지 742, 그리고 이들 위치 사이의 아미노산이 본 발명의 FVIII의 변이체에서 결실된다, 즉 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 이 아미노산의 스트레치는 본 발명의 FVIII 변이체에는 없는 27개 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 인자 VIII 변이체는 전체적으로 본 명세서에서 "FVIII 변이체(들)" 또는 "FVIIIv3" 또는 "rFVIIIv3"으로 명시된다. 그것들은 돼지, 인간, 개, 쥐 또는 인간 또는 동물 치료법에 적합한 임의의 기타종에서 기원한 것이 될 수 있다. 도 2는 인간, 돼지, 쥐 및 개에서 기원한 FVIII 서열의 서열 배열을 도시한다.
본 발명의 FVIII 변이체에서 결실된 서열은 굵은 글씨체와 이중 밑줄로 강조된다. 이 아미노산의 스트레치는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 가령 돼지 또는 인간 서열을 이용하여 추가 종의 FVIII 서열을 배열시키고 그리고 본 특허 출원의 도 2에 따른 아미노산 716 내지 742에 상응하는 아미노산을 취함으로써 기타 종의 FVIII 변이체에 대하여 식별될 수 있다.
본 발명의 구체예는 돼지, 인간 또는 개에서 기원한 FVIII 변이체에 관한 것이다.
구체예에서, 본 발명에 따른 FVIII 변이체는 서열번호:1의 서열, 또는 서열번호:1과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한 이의 변이체를 포함한다. 10% 가변성은 아미노산의 결실된 스트레치의 바깥쪽 서열에 관한 것이라는 점, 즉 상기 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호: 7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열인, DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR (서열번호:10)이 완전하게 없다는 점이 이해된다.
추가적인 구체예에서, 본 발명의 FVIII 변이체는 서열번호:2의 서열, 또는 서열번호:2와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한 이의 변이체를 포함한다. 또한, 상기 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 인간 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호: 8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열인, 아미노산 서열 NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR (서열번호:11)이 완전하게 없다는 것으로 이해된다.
또 다른 추가적인 구체예에서, 본 발명의 FVIII 변이체는 서열번호:3의 서열, 또는 서열번호:3과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 또한, 상기 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 개 인자 VIII의 아미노산 714 내지 740 또는 서열번호: 9의 아미노산 708 내지 734에 상응하는 아미노산 서열 NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR (서열번호:12)이 완전하게 없다는 것으로 이해된다.
본 발명의 FVIII 변이체는 또한 서열번호: 7, 8 또는 9의 서열과 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
두 개의 폴리펩티드/단백질의 퍼센트 동일성을 측정하기 위해, 아미노산 서열이 최적의 비교 목적으로 배열된다 (가령, 갭(gap)은 두 번째 아미노산 서열과의 최적 배열을 위한 첫 번째 아미노산 서열의 서열내로 도입될 수 있음). 이후 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기가 비교된다. 첫 번째 서열내 위치가 두 번째 서열내 상응하는 위치로서 동일한 아미노산 잔기에 의해 차지될 때, 이후 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다 (즉, % 동일성=동일한 위치의 #/위치의 총 # (가령, (중복된 위치)×100).
두 서열 간의 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 활용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한 예시는 Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877로 변경된, Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 편입된다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이=12로 수행되어 본 발명의 핵산 분자와 상동하는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 변이체 연구는 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3으로 수행되어 본 발명의 변이체 분자와 상동하는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 배열을 얻기 위하여, 갭핑된 BLAST(Gapped BLAST)가 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 설명된 바와 같이 활용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast는 분자 간의 원거리 관계를 탐지하는 반복 연구를 수행하는 데에 이용될 수 있다. BLAST, 갭핑된 BLAST(Gapped BLAST) 및 PSI-Blast 프로그램을 활용할 때, 각각의 프로그램 (가령, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameter)가 이용될 수 있다. 서열의 비교를 위해 활용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한, 비-제한 예시는 Myers and Miller, (1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 배열 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)내로 편입된다. 아미노산 서열과 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 활용할 때, PAM120 무게 잔류 표(weight residue table), 12의 갭 길이 패널티(gap length penalty), 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다. 국부적 서열 유사성 및 배열의 영역을 식별하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448에서 설명된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위한 FASTA 알고리즘을 이용할 때, PAM120 무게 잔류 표가, 예를 들어 2의 k-투플 값(k-tuple value)으로 이용될 수 있다.
두 서열 간의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하는 것과 상관없이, 상기 설명된 것들 것 유사한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 퍼센트 동일성의 계산에서, 오직 정확한 일치만이 계산된다.
본 발명의 FVIII 변이체는 부분적으로 또는 완전하게 B-도메인이 결실될 수 있다. 이것은 전체 B-도메인이 결실되거나, 또는 B-도메인의 일부가 FVIII 변이체내에서 유지되는 것을 의미한다. B-도메인의 남아있는 (유지된) 일부는 가령 B-도메인의 20, 15, 12, 10 또는 5개 N-말단 아미노산 및 20, 15, 12, 10 또는 5개 C-말단 아미노산에서 선택되며, 이들은 서로 프레임(frame)에서 융합된다.
그러므로, 바람직하게, 본 발명의 부분적 B-도메인 결실 FVIII 변이체에서는, 대략적으로 900개 아미노산 B-도메인의 상당한 부분이 제거된다. 본 발명의 구체예에서, 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 B-도메인은 FVIII 변이체에서 잔존한다.
본 발명의 구체예에서, B-도메인의 남아있는 부분은 서열번호: 4 또는 서열번호:5 또는 서열번호: 6으로 구성되는 서열에서 선택된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 폴리펩티드/단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드(genetic code)의 공지된 관계에 따라서, RNA 또는 DNA 분자일 수 있으며 여기서 이의 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 변이체의 아미노산 서열을 위해 숙주 세포에 대하여 코딩 정보를 구현한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
"발현 벡터"는 종종, 원 구조의 DNA 요소이며, 이는 바람직한 숙주 세포에서 자발적으로 복제하거나, 또는 숙주 세포 유전자 내로 통합되는 능력을 갖고 또한 적절한 부위에서 그리고 적절한 방향으로 벡터 서열 내로 삽입된 코딩 DNA의 발현을 허용하는 특정하게 잘 공지된 특징을 갖는다. 이러한 특징은 코딩 DNA 및 기타 DNA 요소, 가령 증폭자, 폴리아데닐화 부위 등의 전사 개시를 지시하기 위한 하나 이상의 프로모터 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않으며, 모두 해당 분야에서 잘 공지된 바와 같다. 용어　"발현 벡터"는 발현되는 DNA 코딩 서열이 벡터 서열 내에 삽입되는 벡터 및 삽입 부위 내로 삽입된 임의의 코딩 DNA를 발현하는 역할을 할 수 있도록, 상기 삽입 부위에 대하여 정렬된 필수 발현 조절 요소를 갖는 벡터 둘 모두를 나타내는 데에 사용되며,　모두 해당 분야에서 잘 공지된 바와 같다. 따라서, 예를 들어, 프로모터가 부족한 벡터는 코딩 DNA와 결합된 프로모터의 삽입에 의해 발현 벡터가 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터가 될 수 있다.
본 발명의 재조합형 FVIII 변이체의 발현은 바람직하게는 포유류 세포 배양에서 수행된다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 발현 벡터를 포하하는 포유류 세포에 관한 것이다. 예를 들면, CHO (중국 햄스터 난소) 세포 및 BHK 세포 (아기 햄스터 신장 세포)는 본 발명의 맥락에서 적합한 숙주 세포인 포유류 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 본 발명의 FVIII 변이체를 생성하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 상기 설명된 바와 같은 포유류 세포를 배양하는 단계; 및
b. 포유류 세포로부터 FVIII 변이체를 단리시키는 단계.
구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
c. 제약학적 조성물 내로 적절한 부형제와 함께 인자 VIII변이체를 조제하는 단계.
인간 또는 동물 투여에 적합한 부형제는 가령 제약학적 안정화 화합물, 보존제, 전달 비히클, 및/또는 담체 비히클이다. 인자 VIII 산물을 대해 한 가지 적합한 제제는 가령 WO 03/080108에서 설명되며, 이는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 FVIII 변이체를 포함한 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 FVIII 변이체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여, 그렇게 함으로써 상기 환자의 인자 VIII 결핍을 치료하는 단계를 포함하는 인자 VIII 결핍을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 환자에서 측정 가능한 개선 또는 보호 효과를 나타나는 데에 (가령, 출혈을 막는 데에) 충분한 FVIII 변이체의 제약학적 조성물을 제공받은, FVIII 결핍을 앓는 환자의 혈장내 FVIII의 수준을 의미한다. FVIII　결핍을 앓는 환자는 전형적으로 선천적 혈우병　A　환자이지만 또한　선천적 혈우병 환자가 아닌 개체에서 그들의 FVIII에 대한 저해 항체가 자발적으로 발달하여 심각한 FVIII 결핍이 발생하는 질환인, "후천적 혈우병"으로 진단받은 이들 개체도 포함한다.
또한 본 발명은 인자 VIII 결핍을 치료하는 데에 사용하기 위한 본 발명의 FVIII 변이체에 관한 것이다.
치료는 요구되는 바와 같이, 장기간에 걸쳐 조성물의 단일 정맥내 투여 또는 주기적 또는 지속적 투여의 형태로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, FVIII 변이체의 투여는 정맥내 경로를 따른다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인자 VIII 결핍"은 결함이 있는 인자 VIII의 생성에 의해, 인자 VIII의 부적당한 생성 또는 생성이 없음에 의해, 또는 저해자에 의한 인자 VIII의 부분적 또는 완전한 저해에 의해 야기되는 응고 활성도에서의 결핍을 포함한다. 혈우병 A는 X-연결된 유전자 및 이를 인코딩하는 인자 VIII 변이체의 부재 또는 결핍에 기인하는 인자 VIII 결핍의 유형이다.
본 발명의 FVIII 변이체는 혈우병 환자에서 인자 VIII 결핍 때문에 제어되지 않는 출혈 (가령, 관절내, 두개내, 또는 위장 출혈)을 치료하는 데에 사용된다.
본 발명의 구체예에서, 인자 VIII 결핍은 혈우병 A이다.
또 다른 구체예에서, 인자 VIII 결핍은 후천적 혈우병이다.
구체예에서, 인자 VIII 결핍은 발달된 인간 FVIII 항체를 갖는 환자에서 치료된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 FVIII 변이체는 특이 활성도가 증가되었다. 따라서, 본 발명에 따른 VIII 결핍을 치료하기 위하여 FVIII 변이체의 감소량을 투여하는 것이 가능하다. FVIII 변이체의 양은 본 발명의 최대 27개까지 아미노산 결실을 함유하지 않은 FVIII 산물을 이용한 치료법과 비교하여 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 감소될 수 있다.
FVIII 변이체 치료법의 양을 감소시키는 것은 예상되는 감소된 면역원성의 이점을 갖는다, 즉 환자에게서 FVIII 대체 요법에 대항하는 저해 항체의 발생 가능성이 상당히 감소된다는 점이 예상된다.
구체예에서, 본 발명의 인자 VIII 변이체는 200 μg/분량 또는 150 μg/분량 또는 145 μg/분량 또는 140 μg/분량 또는 136 μg/분량 또는 130 μg/분량보다 크지 않은 양으로 투여된다.
이제 본 발명을 완전하게 설명하는 데에 있어서, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 그리고 과도한 실험 없이 광범위한 등가 파라미터, 농도 및 조건 내에서 본 발명이 수행될 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
본 발명이 이의 구체적인 구체예와 관련되어 설명되었지만, 추가적인 변형을 할 수 있다는 점이 이해된다. 이 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 그리고 본 발명에 관련되는 해당 분야 내에서 공지된 또는 종래의 실시 내에 있는 바와 같은 및 첨부된 청구항의 범위에 따르는 바와 같이 제시된 상기 본 명세서에서의 중요한 특징에 적용될 수 있는 바와 같은 본 개시로부터 이러한 벗어남을 포함하여 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 개조를 포함시키는 것으로 의도된다.
학술지 논문 또는 요약문, 공개된 또는 비공개된 U. S. 또는 외국 특허 출원, 발행된 U. S. 또는 외국 특허 또는 임의의 기타 참고문헌을 포함하여, 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 인용된 참고문헌에 존재하는 모든 데이터, 표, 도식 및 본문을 포함하여, 참조로서 본 명세서에 완전히 편입된다. 추가적으로, 본 명세서에서 인용된 참고문헌 내에 인용된 참고의 전체적인 내용 또한 참조로서 완전히 편입된다.
공지된 방법 단계, 종래의 방법 단계, 공지된 방법 또는 종래의 방법에 대한 참고는 본 발명의 임의의 측면, 설명 또는 구체예가 관련 기술에서 개시, 교시 또는 제시된다는 것을 어떤 방식으로든 허용하지 않는다.
구체적인 구체예의 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 매우 충분하게 나타냄으로, 다른 이들도　해당 분야의 기술 내에 지식을 적용시킴으로써　(본 명세서에서 인용된 참고문헌의 내용을 포함하여),　과도한 실험 없이,　본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어남이 없이,　이러한 특정한 구체예와 같은 다양한 적용을 위해 쉽게 변형 및/또는 개작할 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 개작 및 변형은 본 명세서에 제시된 교시 및 안내에 기반하여, 개시된 구체예의 등가물 범위의 의미 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 전문어(phraseology) 또는 전문용어(terminology)는 설명의 목적을 위함이지 제한의 목적이 아니므로 본 명세서의 전문어 또는 전문용어는 해당 분야의 통상의 기술자의 지식과 결합하여, 본 명세서에 존재하는 교시 및 안내에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1: 재조합형 돼지 부분적 B-도메인 결실 FVIII (OBI-1)의 발현 및 세 가지 변이체 단백질 (rpVIIIv1, v2 및 v3)의 단리
BHK 세포내 OBI-1의 발현을 US 6,458,563에서 설명된 바와 같이 기본적으로 수행하였다. 생성된 물질에서 세 가지 변이체를 탐지하였다 (rpVIIIv1, v2 및 v3). 상기 변이체를 단리시켰고 이온 교환 크로마토그래피로 >95% 순도까지 정제하였다. 정제를 위하여, MonoQ HR10/10 반-분취 음이온 교환 칼럼 (현재 Mono Q 10/100 GL,GE Healthcare Lifesciences # 17-5167-01)을 사용하는 AKTA 익스플로러(AKTA Explorer) 시스템 (AKTA 익스플로러 10, GE Healthcare Lifesciences # 17-5167-01)을 사용하였다. 다음 두 가지 완충액으로 구배 상에서 용리를 수행하였다:
완충액 A: 10 mM 트리스(TRIS), pH 7.0, 0.01% 폴리소르베이트 80
완충액 B: 완충액 A 및 1 M 염화 나트륨.
정제 방법의 특징은 표 1에서 요약된다.
rpFVIII 변이체 정제 방법
AKTA 방법: LoopMQ1010
유속: 4 ml/분
평형 칼럼 8 CV
로딩 유속 4ml/분
샘플 용량 40 - 1000 ml
세척 칼럼 10CV
구배
 칼럼 용량 (CV) %B
7 45
4 50
4 50
6 52
4 52
2 55
7 60
1 65
5 65
1 70
5 70
1 100
7 100
1 10
4 10
총 런(run) 59 CV
칼럼 온도 조절되지 않음
실시예 2: 변이체 3 (rpVIIIv3)은 변이체 1 및 2 보다 상당히 더 높은 특이 활성도를 가짐
1단 응고 분석 (one stage coagulation assay, (OSCA))으로 평가한 효능을 방법에 대해 SEC HPLC로 측정한 바와 같이 단백질 농도로 나눔으로써 변이체 각각의 특이 활성도를 평가하였다. 실시예 5의 "재료 및 방법"에서 설명된 바와 같이 OSCA 및 SEC HPLC 방법을 수행하였다.
결과
특이 활성도에 대한 결과는 표 2에 명시된다.
rpFVIII 의 두 가지 상이한 로트(lot)로부터 얻은 정제된 변이체 1, 2 및 3에 대한 특이 활성도 ( OSCA 방법)
SEC 에 기반한 샘플 OSCA
유닛/ ml 		% RSD * 특이 활성도
유닛/ ml 		% RSD *
V1 - 로트1 1060 1.5 11956 1.7
V2 - 로트 1 715 2.7 17267 3.3
V3 - 로트 1 216 1.2 25926 2.8
OBI-1 513 1 18150 1.3
V1 - 로트 2 980 1.2 12532 1.5
V2 - 로트 2 613 0.6 16089 1.3
V3 - 로트 2 280 2.9 19718 4.1
OBI-1 565 4.0 14427 4.4
*상대 표준편차
OSCA 분석에서 변이체 3에 대한 상당히 더 높은 특이 활성도의 관찰은 분명하고 일관성있다. OSCA 방법이 인간에서의 응고 과정에 대해 예측적이고 대표적이기 때문에, 변이체 3은 상당한 가치의 산물이라는 점이 예상된다. 효능에서의 1.5-2.0 배 증가는 환자에게 투여된 FVIII의 양을 감소시키고 따라서 면역학적 부작용의 발생을 간접적으로 감소시킬 수도 있다는 점이 예상된다.
실시예 3: rpFVIIIv3의 서열 결정
펩티드 지도 그 다음 MassLynx 4.0 (Waters Corporation, Milford, MA)을 실행하는 Q-TOF 얼티마 질량 분석기(Q-TOF Ultima Mass Spectrometer) 상에서의 LCMS (액체 크로마토그래피 질량 분석법) 및 LCMS/MS (액체 크로마토그래피 질량 분석법/질량 분석법)로 정제 v3의 서열을 결정하였다.
10,000 MWCO 여과기 (Millipore Corporation, Billerica, MA)와 아미콘(Amicon) 사의 센트리콘(Centricon) YM-10 농축기를 사용하여 < 100 μL의 용량까지 대략적으로 250 μg의 변이체 3을 농축시켰다. 샘플을 450 μL의 6 M 구아니딘 HCl/ 0.002 M EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)/0.02 M 트리스 완충액 pH 8과 혼합하였고 그리고 2.0 mL 폴리프로필렌 튜브로 이동시켰다. 1 M DTT (디티오트레이톨)을 10 mM의 최종 농도까지 샘플 각각에 첨가하였고 그리고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 감소 후에, 2 M 요오드아세트아미드를 20 mM의 최종 농도까지 튜브 각각에 첨가하였고 그리고 실온에서 추가적인 1 시간 동안 배양하였다. 감소된 및 알킬화된 샘플을 투석 카세트(cassette)로 이동시켰고 그리고 1.0 M 요소를 함유한 1 L의 50 mM 중탄산 암모늄 투석 완충액, pH 8에 대하여 1시간 동안 투석하였다. 이후 지속적인 교반을 유지하면서 1L의 투석 완충액에 대하여 실온에서 하룻밤 동안 샘플을 투석하였다. 투석 후 최종 용량은 각각 대략적으로 0.5 mL였다. 샘플을 두 개의 125 μg 분취량으로 나누었다.
투석 후, 트립신을 이용한 단백질 분해 소화에 최적인 매트릭스 안에 단백질 샘플이 함유되었다. 1:20 (w:w)의 효소 대 기질 비로 트립신을 샘플 각각에 첨가하였고 그리고 37℃에서 8시간 동안 배양하였다. 모든 샘플을 HPLC 유리병으로 이동시켰고 그리고 HPLC-MS로 분석하였다.
감소된 및 알킬화된 단백질을 Vydac C18 역상 칼럼 (Grace, Deerfield, IL) 상에 주사하였다. 샘플 주사에 앞서, 블랭크 샘플(blank sample) (이동상 A; 탈이온수 함유 0.2% (v:v) 포름산)을 분석하여 칼럼을 평형시키고 그리고 간섭 피크의 부재를 입증하였다.
양성 이온 모드에서의 전기분무 이온화 (ESI)를 이용하여 Q-TOF API-US 질량 분석기 또는 Q-TOF 얼티마 질량 분석기 (Waters Corporation, Milford, MA)에서 질량 분석법 데이터를 수집하였다. 샘플 분석에 앞서, 175 내지 1285 m/z의 범위에 걸친 Glu-피브리노겐 펩티드의 단편 이온 상에서 5차 정합성(5th order fit)을 이용하여 질량 분석기를 조정하였다. 규격에 합격하기 위한 조정을 위해, 5 ppm 미만의 펩티드 단편의 질량에 대한 RMS (제곱 평균 제곱근) 오차가 요구된다. 데이터 수집과 분석을 위해 소프트웨어 패키지 Masslynx 4.0™ SP2 및 SP4 (Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하였다.
단일 액체 크로마토그래피 (LC) 런을 사용하여 MS 및 MS/MS 데이터 둘 모두를 수집하였다. 전체 질량 분석기 (MS) 조사 스캔은 200-1950 m/z에서 수집하였다.
rpFVIII의 서열은 서열번호: 1과 상응하는 것으로 결정되었다. 이 서열은 OBI-1 서열과 비교하여 27개 아미노산 결실을 함유한다.
실시예 4: rpFVIIIv3은 기타 공지된 FVIII 산물보다 더 높은 특이 활성도를 가짐
상업적으로 이용가능한 세 가지 FVIII 산물, 즉 신시아(Xynthia)® (Wyeth Pharmaceuticals (Philadelphia, PA)로부터의 재조합형, B-도메인 결실 인간 FVIII), 코지네이트(Kogenate) FS® (Bayer Healthcare (Tarrytown, NY)로부터의 전장 인간 FVIII) 및 애드베이트(Advate)® (Baxter (Westlake Village, CA)로부터의 전장 인간 FVIII)와, 그리고 현재 임상 개발 중에 있는 OBI-1 (재조합형 부분적 B-도메인 결실 돼지 FVIII), 및 B-도메인 결실 개 인자 VIII (Denise E. Sabatino et . al ., Recombinant canine B-domain deleted FVIII exhibits high specific activity and is safe in the canine hemophilia A model, Blood, 12 November 2009, Vol. 114, No. 20, pp. 4562-4565)와 rpFVIIIv3의 특이 활성도를 비교하였다.
OBI-1 및 rpFVIIIv3의 특이 활성도는 실시예 5에서 설명된 바와 같은 방법으로 측정하였다.
결과는 표 3 및 도 1에서 도시된다. 이의 증가된 특이 활성도 때문에, 분량 당 더 낮은 양의 prVIIIv3으로 환자에게 투여될 수 있다. 분량에서의 이러한 감소는 감소된 면역원성을 야기할 것이라는 점, 즉 환자가 저해 항체를 발달시킬 가능성을 더 낮게 야기할 것이라는 점이 예상된다.
rpVIIIv3 와 비교한 바와 같은 FVIII 산물의 특이 활성도
IU/mg 단백질에서의 특이 활성도 Amt 단백질 μg/분량^
신시아 7500 400
코지네이트 FS 4000 750
애드베이트 4000 750
OBI-1 11000 273
rpVIIIv3 22000 136
개 BDD* FVIII 34000 88
^Amt 단백질 = xxxx μg/분량. rpVIII3 대해 칼럼에서 나타난 수는 분량 당 136 μg의 양이 요구될 것이라는 점을 의미한다. 1회 분량은 0% 내지 100%의 혈액 인자 VIII 수준을 올리기 위해 요구되는 양이다, 즉 특이 활성도 (XXX 유닛/mg)가 더 높을수록, 더 낮은 양 (μg에 관하여)이 요구된다. 1 mg = 1000μg이라는 점을 주목한다. 전형적인 분량이 환자 당 3000 유닛이라는 점을 고려해볼 때, 요구되는 실제 단백질의 양 = 3000/22000 = 0.136 mg = 136 μg이다.
*BDD는 B-도메인 결실을 나타내고 그리고 FL은 전장을 나타낸다.
결론적으로, 이들 결과는 FVIII 대체 요법을 위한, 현재 상업화되는, 또는 임상 개발 중에 있는 검사된 산물보다 rpVIIIv3이 상당히 더 높은 특이 활성도를 갖는다는 점을 나타낸다.
특히, rpVIIIv3에서는 존재하지만 OBI-1에서는 존재하지 않는, 27개 아미노산의 결실은 특이 활성도에서 50% 증가 (OSCA 분석으로 측정된 바와 같음)를 야기한다는 점이 매우 놀랍다.
실시예 5: 재료 및 방법
1-단 응고 분석 - OSCA - 방법
1. 분석 완충액 (10% 인자 VIII 결핍 혈장 + 오우렌의 베로날 완충액(Owren's Veronal Buffer), 리터 당, 28 mmol of 나트륨 바르비탈(barbital) 및 125 mmol의 NaCl, pH 7.35)에서 기준 표준물(Reference Standard)을 희석하여 1.0 유닛/mL의 효능을 표적한다.
2. 분석 완충액에서 확인 표준물(check standard), 활성 조절물 및 샘플을 희석하여 효능을 표적한다.
3. 시멕스(Symex) 기기 (시멕스 CA-1500, 응고 분석기, Dade Behring # B4260-1500 (Siemans Corporation, Deerfield, IL)) 내부의 적합한 웰 내에 캘리브레이션 표준물 (기준) 및 시약을 로딩한다.
4. 시멕스 기기 외부의 랙(rack) 내에 확인 표준물, 조절물 및 샘플을 로딩한다.
5. 분석 서열이 다음과 같이 기기 내부에서 자동적으로 발생한다:
a. 반응 튜브 내부에 있는 45 ul의 분석 완충액 내로 5 uL의 샘플을 희석한다.
b. 50ul의 인자 VIII 결핍 혈장을 반응 튜브에 첨가한다.
c. 부분 트롬보플라스틴 시간 시약이 활성화된 50ul의 데이드 액틴(Dade Actin) FS (1.0 X 10-4M 엘라그산 활성제내 정제된 콩 인지질, Dade Behring, Liederbach, Germany)를 반응 튜브에 첨가하고 그리고 60초 동안 배양한다.
d. 50ul의 염화 칼슘 (0.025M, Dade Behring, Liederbach, Germany)을 반응 튜브에 첨가하고 그리고 240초 동안 배양한다.
e. 300초의 최대 시간까지 응고 시간을 측정한다.
6. 이후 응고 시간은 기준 표준물 캘리브레이션 곡선에 의해 발생되는 효능과 연관된다.
크기-배제 (초) HPLC 방법
단백질 농도의 측정을 위한 크기 배제 방법을 위해 애질런트(Agilent) 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 또는 워터스 바이오얼라이언스(Waters Bioalliance) HPLC 시스템 (Waters Corporation, Milford, MA)을 전형적으로 사용하였고 그리고 사용한다. 사용되는 전형적인 크기 배제 칼럼은 GE로부터의 수퍼덱스(Superdex) 200 (수퍼덱스 200 10.300 GL, 10 X 300mm, 카탈로그 # 17-5175-01 (GE Healthcare Lifesciences, Piscataway, NJ))이었다. 일반적인 분석 프로토콜은 다음과 같다:
1. 20mM 트리스, pH 7.4와 400mM NaCl 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유한 전형적인 이동상을 제조하였다.
2. 이동상은 HPLC 시스템을 빠져 나갔고 그리고 기저선이 평형이 될 때까지 컬럼을 관찰하였다.
3. 표준물이 흘러 내려가 샘플 각각에 대해 30분의 전형적인 실행 시간(run time)을 갖는 시스템 적합성을 확립하였다.
4. 4℃의 온도 조절 챔버가 있는 자동 샘플러(auto sampler) 상에 샘플을 전형적으로 로딩하였다.
5. 10 내지 50 μl 용량의 칼럼 상에 다양한 양의 표준 샘플, 전형적으로 1, 3, 5, 10 내지 25 μg의 단백질을 함유한 공지된 농도의 캘리브레이션 표준물을 로딩하였다.
6. 전형적으로 30 내지 50 μl 용량의 칼럼 내에 비공지된 농도의 샘플을 또한 로딩하였다.
7. HPLC 시스템을 프로그램화하여 샘플을 서열 설정에 따라서 자동적으로 흘러 내리게 하였다.
8. 각각 280nm 및 340nm에서 여기(excitation) 및 방출(emission)이 있는 형광 검출에 기반하여 캘리브레이션 표준물 및 비공지된 샘플의 피크 면적을 측정하였다.
9. 캘리브레이션 표준물의 선형 회귀가 발생되었고 비공지된 샘플의 농도를 캘리브레이션 곡선에 대하여 측정하였다.
캘리브레이션 표준물의 SEC 프로파일의 전형적인 예시 및 캘리브레이션 곡선의 선형 회귀는 도 3에서 나타난다.
실시예 6: 폰 빌레브란트 인자와의 결합
폰 빌레브란트 인자 (vWF)는 인자 VIII와 복합된 다중결합 형태로서 혈장에서 순환하는 다기능적인 글리코단백질 (FVIII/vWF 복합체)이다. FVIII/vWF 복합체는 생체내 순환에서 초기 단백질분해로부터 결합 FVIII을 보호하는 역할을 한다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 FIII/vWF 복합체에서 결합의 특징을 짓는 데에 사용된다. 수퍼로스(Superose) 6 칼럼 (수퍼로스 6 10/300GL, GE Healthcare #17-5172-01, 유속 = 0.5 mL/분)이 이의 공지된 생체적합성 및 40 밀리언 달톤의 고 배제 한계에 대하여 선택되었다 (이동상 제제 완충액: 2 mM CaCl2, 10 mM 트리스 pH 7.0, 300 mM NaCl, 0.01% PSB-80, 11 mM 수크로오스, 10 mM 시트르산 삼나트륨). 폰 빌레브란트 인자 (이합체 @ ~ 500KD, 피츠제럴드 카탈로그 # 30C-CP4003U, 로트 # A09121050, 단량체 분자량= ~260kD, 농도 = 77 μg/mL) 및 rpFVIII (~ 160 KD) 간의 분자량에서의 차이는 두 종을 분해시키는 데에 충분하다.
rpFVIII의 증가하는 양을 이용한 일정한 양의 vWF의 적정으로 결합의 화학량론을 측정하였다. rpFVIII 및 vWF 사이의 복합체화 형성의 프로파일을 적절한 피크의 SEC 크로마토그램 및 적분으로부터 측정하였다. rpFVIII의 증가하는 양을 이용한 적정으로부터 복합체화의 종점을 결정하는 데에 상청액내 결과로 생긴 혼합물(resultant mixture)의 용해성 형태를 이용하였다. rpFVIII 및 vWF 사이에서 형성된 더 크고, 안정한 복합체는 정상적인 체류 시간부터 칼럼의 배제 한계까지 이동한다. 포화가 일어날 때, 비결합 rpFVIII의 증가량이 SEC 크로마토그램에서 관찰될 것이다. 변이체의 특성에서의 상이함 및 유사성을 분별하는 데에 이 방법을 사용한다.
실시예 7: 트롬빈 분해 역학
SDS - PAGE
재조합형 돼지 인자 VIII (rpFVIII) 분자는 78.5kD 분자량 경쇄 (A3-C1-C2, 765-1448) 및 86.7kD (A1-A2)부터 분자량에 이르는 중쇄로 구성된 대략적으로 160kD의 이종이합체이다. rpFVIII의 중쇄는 이질적이며 그리고 세포로부터 분비시 형성되고 PACE (짝 염기 아미노산 절단효소(Paired Basic Amino Acid Cleavage Enzyme))에서 명시된 서브틸리신 패밀리(subtilisin family)의 막 결합 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 세 개의 주요 변이체로 구성된다.
인간 인자 VIII처럼, rpFVIII은 트롬빈으로부터의 제한된 단백질분해에 의해 활성 형태로 변형된다. rpFVIII의 트롬빈 활성화는 Arg(372)-Ser(373)에서 중쇄의 절단 부위에 대해 특이적이다. Arg(805)-Ser(806)에서 경쇄에 대한 절단 영역은 765-804 (~4.4kD) 범위의 작은 40개 아미노산 펩티드 단편을 유리시킨다. 트롬빈에 의한 이들의 초기 절단의 조합은 A1 (~50kD), A2 (~40kD), 및 A3-C1-C2 (~70kD)로서 명시된 서브유닛의 이종삼합체로서 활성화 재조합형 돼지 인자 VIII를 형성한다. 절단된 rpFVIII A1 및 A3-C1-C2 서브유닛은 2가의 금속 이온-의존 연결을 보유하는 반면에, A2 서브유닛은 일차적 정전기 상호작용에 의해 A1-A3-C1-C2 이합체와 약하게 결합된다. SDS-PAGE에서, 이들 서브유닛은 세 개의 뚜렷한 밴드로서 나타난다. 세 개의 펩티드 유닛으로의 rpFVIII (2개의 펩티드 유닛)의 전환에서 효율성은 생성물의 트롬빈 활성화의 특징이다. 이 방법은 개별적인 변이체 간의 유사성 및 차이를 구별한다.
FVIII의 트롬빈 분해의 역학을 맵핑하는 데에 두 가지 기타 직교 방법을 이용할 수 있고 이용하였다. 역상 HPLC 변성을 이용할 수 있다; 피크 프로파일은 SDS-PAGE의 피크 프로파일과 유사할 것으로 예상된다. 펩티드의 원래 형태를 유지하는, 음이온 교환 크로마토그래피를 또한 사용할 수 있다.
역상 HPLC
장비:
1. HPLC 1100 시리즈: Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; 모델 번호 61312A, 일련 번호 DE10907753.
2. 포로쉘(Poroshell) 5um 2.1X75mm 칼럼: Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; 부품 번호 660750-909, 일련 번호 USVV001988.
시약:
1. 완충액 A: 물내 0.1% TFA (JT B Baker, Phillisburg, NJ; 카탈로그 번호 94700-00, 로트 번호 J23J00)
2. 완충액 B: 아세토니트릴내 0.1% TFA (JT Baker, Phillisburg, NJ; 카탈로그 번호 9017-03, 로트 번호 J38807).
절차:
1. 1 ml/분에서 99% A 및 1% B를 사용하여 60분 동안 칼럼을 평형시킨다.
2. 샘플 주사는 용량이 50 μl였다; 대조군으로서 25 μl의 기준 표준물을 사용하였다.
3. 샘플을 흘러내리게 하는 데에 사용된 방법의 예시는 표 4에 나타난다.
주사 시간(분) 유속 (ml/분) %A %B
1 0.00 2 99 1
2 2.00 2 99 1
3 3.00 2 64 36
4 3.50 2 64 36
5 4.00 2 61 39
6 5.00 2 61 39
7 5.10 2 58 42
8 6.50 2 58 42
9 6.51 2 56 44
10 7.20 2 56 44
11 7.21 2 40 60
12 8.50 2 40 60
13 8.51 2 10 90
14 9.00 2 10 90
15 9.10 2 99 1
16 10.00 2 99 1
음이온 교환 크로마토그래피
장비:
1. 얼라이언스바이오(AllianceBio) HPLC, Waters corporation, Milford, MA, USA; 모델 번호 2796; 일련 번호 M08BA1199M.
2. 프로테인(Protein) Pak Hi Res Q 5um 4.6X100mm 칼럼: Waters Corporation, Milford, MA, USA; 부품 번호 186004931, 일련 번호 502N112561VE04.
시약:
완충액 A:
10mM 트리스 염기 (1.211g/L)
2mM 염화 칼슘 (0.588g/L)
0.01% 폴리소르베이트 80 (1ml의 10% PS-80/L)
최대 1L까지 여과된 물, pH 7.0
완충액 B:
10mM 트리스 염기 (1.211g/L)
2mM 염화 칼슘 (0.588g/L)
0.01% 폴리소르베이트 80 (1ml의 10% PS-80/L)
1M 염화 나트륨 (58.44g/L)
최대 1L까지 여과된 물, pH 7.0
절차:
1. 0.5ml/분에서 70% A 및 30% B를 사용하여 60분 동안 칼럼을 평형시킨다
2. 샘플 주사는 용량이 50 μl였다; 대조군으로서 10 μl의 기준 표준물을 사용하였다.
3. 샘플을 흘러내리게 하는 데에 사용된 방법의 예시는 표 5에 나타난다.
주사 시간(분) 유속(ml/분) %A %B
1 0.01 0.5 70 30
2 0.50 0.5 70 30
3 3.50 0.5 60 40
4 5.00 0.5 60 40
5 10.00 0.5 30 70
6 10.10 0.5 1 99
7 12.00 0.5 1 99
8 12.10 0.5 70 30
9 17.00 0.5 70 30
통상의 기술자는 이들 및 기타 방법이 상기 설명된 바와 같은 재조합형 인자 VIII 단백질을 이해하기에 이르는 데에 사용될 수 있다는 점을 인식하고 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Ipsen Pharma S.A.S. <120> A new variant of antihemophilic factor VIII having increased specific activity <130> IPH 021 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1421 <212> PRT <213> sus scrofa <400> 1 Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr Arg Phe Pro 20 25 30 Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val Leu Tyr Lys 35 40 45 Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser Val Ala Arg 50 55 60 Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu 65 70 75 80 Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro 85 90 95 Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser Ser Glu Gly 100 105 110 Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys 115 120 125 Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu 130 135 140 Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu 145 150 155 160 Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala 165 170 175 Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg Thr Gln Asn 180 185 190 Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser 195 200 205 Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met Asp Pro Ala 210 215 220 Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn 225 230 235 240 Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser Val Tyr Trp 245 250 255 His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu 260 265 270 Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala Ser Leu Glu 275 280 285 Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu Met Asp Leu 290 295 300 Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His His Gly Gly 305 310 315 320 Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu Pro Gln Leu 325 330 335 Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn Leu Tyr Asp 340 345 350 Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val Ser Pro Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Ala Val Pro 385 390 395 400 Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn Ser Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys Gly Trp Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg 705 710 715 720 Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln 725 730 735 Arg Asp Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp 740 745 750 Tyr Asp Asp Ile Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp Ile 755 760 765 Tyr Gly Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr 770 775 780 Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met 785 790 795 800 Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val 805 810 815 Pro Arg Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe 820 825 830 Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu 835 840 845 Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe 850 855 860 Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser 865 870 875 880 Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val 885 890 895 Gln Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met 900 905 910 Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser 915 920 925 Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu 930 935 940 Leu Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val 945 950 955 960 Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys 965 970 975 Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys 980 985 990 His Leu Gln Met Glu Asp 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Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 9 <211> 2324 <212> PRT <213> canis familiaris <400> 9 Ala Thr Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Leu Ser Ala Leu His Ala Asp Thr Ser Phe Ser 20 25 30 Ser Arg Val Pro Gly Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser Val Thr Tyr Arg 35 40 45 Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Asp Leu Phe Asn Ile Ala Lys 50 55 60 Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu 65 70 75 80 Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Val Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro 85 90 95 Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly 100 105 110 Ala Glu Tyr Glu Asp Gln Thr Ser Gln Lys Glu Lys Glu Asp Asp Asn 115 120 125 Val Ile Pro Gly Glu Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu 130 135 140 Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Phe 145 150 155 160 Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala 165 170 175 Leu Leu Val Cys Lys Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Arg Thr Gln Thr 180 185 190 Leu Gln Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser 195 200 205 Trp His Ser Glu Thr Asn Ala Ser Leu Thr Gln Ala Glu Ala Gln His 210 215 220 Glu Leu His Thr Ile Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu 225 230 235 240 Thr Val Cys His Lys Arg Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly 245 250 255 Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu 260 265 270 Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe 275 280 285 Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe 290 295 300 Cys His Ile Pro Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys 305 310 315 320 Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu 325 330 335 Asp Lys Asp Tyr Asp Asp Gly Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val 340 345 350 Ser Phe Asp Asp Asp Ser Ser Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val 355 360 365 Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu 370 375 380 Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Ser Gly Pro Thr Pro Asn Asp Arg Ser 385 390 395 400 His Lys Asn Leu Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Lys Lys 405 410 415 Tyr Lys Lys Val Arg Phe Val Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr 420 425 430 Arg Glu Ala Ile Gln Tyr Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr 435 440 445 Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser 450 455 460 Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Asn Tyr Val Thr Pro Leu 465 470 475 480 His Thr Gly Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Met Pro 485 490 495 Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu 500 505 510 Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser 515 520 525 Ser Phe Ile Asn Leu Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro 530 535 540 Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met 545 550 555 560 Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn 565 570 575 Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Met Gln Arg Phe Leu Pro Asn Ala 580 585 590 Asp Val Val Gln Pro His Asp Pro Glu Phe Gln Leu Ser Asn Ile Met 595 600 605 His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Asn Leu Gln Leu Ser Val Cys 610 615 620 Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr 625 630 635 640 Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met 645 650 655 Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val 660 665 670 Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn 675 680 685 Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser 690 695 700 Cys Asn Arg Asn Ile Asp Asp Tyr Tyr Glu Asp Thr Tyr Glu Asp Ile 705 710 715 720 Pro Thr Pro Leu Leu Asn Glu Asn Asn Val Ile Lys Pro Arg Ser Phe 725 730 735 Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Lys Glu Lys Gln Leu Lys Ala 740 745 750 Thr Thr Thr Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys Ile Asp Leu Gln Ser Gly 755 760 765 Glu Arg Thr Gln Leu Ile Lys Ala Gln Ser Val Ser Ser Ser Asp Leu 770 775 780 Leu Met Leu Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro Arg Gly Leu Phe Leu Ser 785 790 795 800 Asp Leu Arg Glu Ala Thr Asp Arg Ala Asp Asp His Ser Arg Gly Ala 805 810 815 Ile Glu Arg Asn Lys Gly Pro Pro Glu Val Ala Ser Leu Arg Pro Glu 820 825 830 Leu Arg His Ser Glu Asp Arg Glu Phe Thr Pro Glu Pro Glu Leu Gln 835 840 845 Leu Arg Leu Asn Glu Asn Leu Gly Thr Asn Thr Thr Val Glu Leu Lys 850 855 860 Lys Leu Asp Leu Lys Ile Ser Ser Ser Ser Asp Ser Leu Met Thr Ser 865 870 875 880 Pro Thr Ile Pro Ser Asp Lys Leu Ala Ala Ala Thr Glu Lys Thr Gly 885 890 895 Ser Leu Gly Pro Pro Asn Met Ser Val His Phe Asn Ser His Leu Gly 900 905 910 Thr Ile Val Phe Gly Asn Asn Ser Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Val 915 920 925 Pro Leu Glu Leu Ser Glu Glu Asp Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ala 930 935 940 Pro Leu Met Asn Ile Gln Glu Ser Ser Leu Arg Glu Asn Val Leu Ser 945 950 955 960 Met Glu Ser Asn Arg Leu Phe Lys Glu Glu Arg Ile Arg Gly Pro Ala 965 970 975 Ser Leu Ile Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys Val Asn Ile Ser Ser Val 980 985 990 Lys Thr Asn Arg Ala Pro Val Asn Leu Thr Thr Asn Arg Lys Thr Arg 995 1000 1005 Val Ala Ile Pro Thr Leu Leu Ile Glu Asn Ser Thr Ser Val Trp 1010 1015 1020 Gln Asp Ile Met Leu Glu Arg Asn Thr Glu Phe Lys Glu Val Thr 1025 1030 1035 Ser Leu Ile His Asn Glu Thr Phe Met Asp Arg Asn Thr Thr Ala 1040 1045 1050 Leu Gly Leu Asn His Val Ser Asn Lys Thr Thr Leu Ser Lys Asn 1055 1060 1065 Val Glu Met Ala His Gln Lys Lys Glu Asp Pro Val Pro Leu Arg 1070 1075 1080 Ala Glu Asn Pro Asp Leu Ser Ser Ser Lys Ile Pro Phe Leu Pro 1085 1090 1095 Asp Trp Ile Lys Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Ser Ser Glu Gln 1100 1105 1110 Arg Pro Ser Pro Lys Gln Leu Thr Ser Leu Gly Ser Glu Lys Ser 1115 1120 1125 Val Lys Asp Gln Asn Phe Leu Ser Glu Glu Lys Val Val Val Gly 1130 1135 1140 Glu Asp Glu Phe Thr Lys Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ile Phe Pro 1145 1150 1155 Asn Asn Lys Ser Ile Phe Phe Ala Asn Leu Ala Asn Val Gln Glu 1160 1165 1170 Asn Asp Thr Tyr Asn Gln Glu Lys Lys Ser Pro Glu Glu Ile Glu 1175 1180 1185 Arg Lys Glu Lys Leu Thr Gln Glu Asn Val Ala Leu Pro Gln Ala 1190 1195 1200 His Thr Met Ile Gly Thr Lys Asn Phe Leu Lys Asn Leu Phe Leu 1205 1210 1215 Leu Ser Thr Lys Gln Asn Val Ala Gly Leu Glu Glu Gln Pro Tyr 1220 1225 1230 Thr Pro Ile Leu Gln Asp Thr Arg Ser Leu Asn Asp Ser Pro His 1235 1240 1245 Ser Glu Gly Ile His Met Ala Asn Phe Ser Lys Ile Arg Glu Glu 1250 1255 1260 Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Asn Gln Met Val Glu 1265 1270 1275 Arg Phe Pro Ser Thr Thr Arg Met Ser Ser Asn Ala Ser Gln His 1280 1285 1290 Val Ile Thr Gln Arg Gly Lys Arg Ser Leu Lys Gln Pro Arg Leu 1295 1300 1305 Ser Gln Gly Glu Ile Lys Phe Glu Arg Lys Val Ile Ala Asn Asp 1310 1315 1320 Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met Asn Tyr Leu Ala Gln Gly 1325 1330 1335 Thr Leu Thr Gln Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Arg Ala Ile 1340 1345 1350 Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Ser Met Arg Asn His Val Thr 1355 1360 1365 Ile Gln Met Asn Asp Ser Ala Leu Pro Val Ala Lys Glu Ser Ala 1370 1375 1380 Ser Pro Ser Val Arg His Thr Asp Leu Thr Lys Ile Pro Ser Gln 1385 1390 1395 His Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ser Ala Cys Asn Tyr Thr Phe 1400 1405 1410 Arg Glu Arg Thr Ser Gly Val Gln Glu Gly Ser His Phe Leu Gln 1415 1420 1425 Glu Ala Lys Arg Asn Asn Leu Ser Leu Ala Phe Val Thr Leu Gly 1430 1435 1440 Ile Thr Glu Gly Gln Gly Lys Phe Ser Ser Leu Gly Lys Ser Ala 1445 1450 1455 Thr Asn Gln Pro Met Tyr Lys Lys Leu Glu Asn Thr Val Leu Leu 1460 1465 1470 Gln Pro Gly Leu Ser Glu Thr Ser Asp Lys Val Glu Leu Leu Ser 1475 1480 1485 Gln Val His Val Asp Gln Glu Asp Ser Phe Pro Thr Lys Thr Ser 1490 1495 1500 Asn Asp Ser Pro Gly His Leu Asp Leu Met Gly Lys Ile Phe Leu 1505 1510 1515 Gln Lys Thr Gln Gly Pro Val Lys Met Asn Lys Thr Asn Ser Pro 1520 1525 1530 Gly Lys Val Pro Phe Leu Lys Trp Ala Thr Glu Ser Ser Glu Lys 1535 1540 1545 Ile Pro Ser Lys Leu Leu Gly Val Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr 1550 1555 1560 Asp Thr Gln Ile Pro Ser Glu Glu Trp Lys Ser Gln Lys Lys Ser 1565 1570 1575 Gln Thr Asn Thr Ala Phe Lys Arg Lys Asp Thr Ile Leu Pro Leu 1580 1585 1590 Gly Pro Cys Glu Asn Asn Asp Ser Thr Ala Ala Ile Asn Glu Gly 1595 1600 1605 Gln Asp Lys Pro Gln Arg Glu Ala Met Trp Ala Lys Gln Gly Glu 1610 1615 1620 Pro Gly Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys His His 1625 1630 1635 Gln Arg Glu Ile Thr Val Thr Thr Leu Gln Pro Glu Glu Asp Lys 1640 1645 1650 Phe Glu Tyr Asp Asp Thr Phe Ser Ile Glu Met Lys Arg Glu Asp 1655 1660 1665 Phe Asp Ile Tyr Gly Asp Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Arg Ser Phe 1670 1675 1680 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu 1685 1690 1695 Trp Asp Tyr Gly Met Ser Arg Ser Pro His Ile Leu Arg Asn Arg 1700 1705 1710 Ala Gln Ser Gly Asp Val Gln Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln 1715 1720 1725 Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu 1730 1735 1740 Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu 1745 1750 1755 Val Glu Asp Asn Ile Val Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg 1760 1765 1770 Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Asp Glu 1775 1780 1785 Gly Gln Gly Ala Glu Pro Arg Arg Lys Phe Val Asn Pro Asn Glu 1790 1795 1800 Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr 1805 1810 1815 Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val 1820 1825 1830 Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 1835 1840 1845 Ile Cys Arg Ser Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val 1850 1855 1860 Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Val Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 1865 1870 1875 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Leu Glu Arg Asn Cys Arg Ala 1880 1885 1890 Pro Cys Asn Val Gln Lys Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Phe 1895 1900 1905 Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Lys Asp Thr Leu Pro Gly 1910 1915 1920 Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Lys Val Arg Trp Tyr Leu Leu Ser 1925 1930 1935 Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His 1940 1945 1950 Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr 1955 1960 1965 Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser 1970 1975 1980 Gln Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu 1985 1990 1995 Gln Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Lys Lys Cys 2000 2005 2010 Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln 2015 2020 2025 Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala 2030 2035 2040 Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp 2045 2050 2055 Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile 2060 2065 2070 His Gly Ile Met Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu 2075 2080 2085 Tyr Val Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Asn Lys 2090 2095 2100 Trp His Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe 2105 2110 2115 Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn 2120 2125 2130 Pro Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 2135 2140 2145 Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Asp Phe 2150 2155 2160 Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser 2165 2170 2175 Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Ser Met Leu Ala 2180 2185 2190 Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Thr 2195 2200 2205 Asn Ala Trp Arg Pro Gln Ala Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln 2210 2215 2220 Val Asp Phe Arg Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Ile Thr Thr Gln 2225 2230 2235 Gly Val Lys Ser Leu Leu Ile Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu 2240 2245 2250 Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Asn Trp Thr Leu Phe Leu Gln 2255 2260 2265 Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Arg Asp Ser Ser Thr 2270 2275 2280 Pro Val Arg Asn Arg Leu Glu Pro Pro Leu Val Ala Arg Tyr Val 2285 2290 2295 Arg Leu His Pro Gln Ser Trp Ala His His Ile Ala Leu Arg Leu 2300 2305 2310 Glu Val Leu Gly Cys Asp Thr Gln Gln Pro Ala 2315 2320 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 10 Asp Ile Gly Asp Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Gly Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg 20 25 <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg 20 25 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 12 Asn Ile Asp Asp Tyr Tyr Glu Asp Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Thr Pro 1 5 10 15 Leu Leu Asn Glu Asn Asn Val Ile Lys Pro Arg 20 25

Claims (23)

  1. 단리된, 재조합형, 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 인자 VIII (FVIII) 변이체이되, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열이 없는, FVIII 변이체.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호: 1과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하며, 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:7의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열이 없는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:1과 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 동일성을 공유하는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:1과 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 동일성을 공유하는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:1인 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  6. 단리된, 재조합형 완전 또는 부분적 B-도메인 결실 인자 VIII (FVIII) 변이체이되, FVIII 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 인간 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열이 없는, FVIII 변이체.
  7. 제 6항에 있어서, 서열번호:1과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하며, 변이체는 도 2에서 도시된 바와 같은 돼지 인자 VIII의 아미노산 716 내지 742 또는 서열번호:8의 아미노산 714 내지 740에 상응하는 아미노산 서열이 없는, 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:2와 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 동일성을 공유하는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:2와 99.5, 99.6, 99.7, 99.8 또는 99.9% 동일성을 공유하는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호:2인 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  11. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII 변이체는 부분적으로 B-도메인이 결실되고 그리고 B-도메인의 남아있는 부분은 서열번호: 4 또는 서열번호:5로 구성된 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 12항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제 13항에 따른 발현 벡터를 포함하는 포유류 세포.
  15. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 FVIII 변이체를 생성하기 위한 방법이되, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a. 제 14항에 따른 포유류 세포를 배양하는 단계; 및
    b. 포유류 세포로부터 FVIII 변이체를 단리시키는 단계.
  16. 제 15항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    c. 제약학적 조성물 내로 적절한 부형제와 함께 인자 VIII 변이체를 조제하는 단계.
  17. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 인자 VIII 변이체를 포함하는 제약학적 조성물.
  18. 혈우병을 앓는 환자를 치료하는 방법이되, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 FVIII 변이체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여, 그렇게 함으로써 상기 환자의 혈우병을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 혈우병을 치료하는 데에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, FVIII 변이체.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 혈우병은 혈우병 A인 것을 특징으로 하는, 방법 또는 용도.
  21. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 혈우병은 후천적 혈우병인 것을 특징으로 하는, 방법 또는 용도.
  22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈우병은 발달된 인간 FVIII 항체를 갖는 환자에서 치료되는 것을 특징으로 하는, 방법 또는 용도.
  23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VIII은 200 μg/분량 또는 150 μg/분량 또는 140 μg/분량을 넘지 않는 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법 또는 용도.
KR1020137014351A 2010-11-05 2011-11-04 증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ｖｉｉｉ의 신규 변이체 KR101948337B1 (ko)

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