NO321769B1

NO321769B1 - Oksygenredusert vandig opplosning av faktor VIII og fremgangsmate for fremstilling av denne.

Info

Publication number: NO321769B1
Application number: NO19954457A
Authority: NO
Inventors: Thomas Osterberg; Angelica Fatouros
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 2006-07-03
Also published as: DE69430745D1; NZ266031A; HU9503171D0; HUT73693A; CA2161350C; FI111910B; JPH08509745A; AU681883B2; AU6659794A; NO954457L; WO1994026286A1; CZ293527B6; SK138395A3; EE03118B1; SK283002B6; KR960702317A; FI955305A; CN1113655C; DK0700299T3; PT700299E

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en formulering omfattende koagulasjonsfaktor VIII med en aktivitet fra 10 til 100 000 IU/ml i en albuminfri vandig oppløsning med en redusert konsentrasjon av oksygen formuleringen omfatter også en inert gass. På denne måte kan aktiviteten av faktor VIII bibeholdes i overraskende høy grad under lagring. Aktiviteten av faktor VIII kan bibeholdes i en forlenget tidsperiode dersom det ferdige legemiddelprodukt ytterligere omfatter en inert gass og/eller et antioksidasjonsmiddel. Foreliggende formulering er i stand til å bibeholde minst 50 % av den opprinnelige aktivitet av faktor VIII etter lagring i minst 6 måneder ved en temperatur fra 2 til 10 °C og en pH i oppløs-ningen fra 6,5 til 8,5.

Oppfinnelsens bakgrunn

Stabiliteten av proteiner er et generelt problem i den farmasøytiske industri. Problemet er ofte blitt løst ved å tørke proteinet ved forskjellige tørkeprosesser, slik som frysetørking. Proteinet har deretter blitt distribuert og lagret i tørket form. Oppløsningen før tørking eller fryse-tørking, det tørkede materiale og det rekonstituerte produkt, burde alle være stabile for å unngå et vesentlig aktivitetstap under tørkeprosessen samt under lagring eller behandling.

Frysetørkeprosessen er et kostbart og tidkrevende trinn og det ville være svært fordelaktig dersom dette trinn kunne unngås ved fremstilling av et kommersielt produkt. En pasient må dessuten nødvendigvis rekonstituere det tørkede protein i et oppløsningsmiddel før bruk, hvilket kan være ubekvemt for pasienten.

Hemofili er en arvelig sykdom som har vært kjent i århundrer, men det er kun i de siste tre tiår det har vært mulig å differensiere mellom de forskjellige former; hemofili A, hemofili B og hemofili C. Hemofili A er den mest hyppige form. Den rammer kun menn med en hyppighet på 1 eller 2 individer pr. 10 000 levende fødte mannlige individer. Sykdommen er forårsaket av sterkt redusert nivå eller fravær av biologisk aktiv koagulasjonsfaktor VIII {antihemofilifaktor) som er et normalt forekommende protein i plasma. Den kliniske mani-festasjon av hemofili A er en sterk blødningstendens, og før behandling med faktor Vlll-konsentrater ble innført, var den gjennomsnittlige levealder for disse pasienter mindre enn 20 år. Konsentrater av faktor VIII erholdt fra plasma har vært tilgjengelig i ca. tre tiår. Dette har forbedret situasjonen for behandling av hemofilipasienter betraktelig og gitt dem mulighet til å leve et normalt liv.

Terapeutiske faktor Vlll-konsentrater er inntil nå

blitt preparert ved fraksjonering av plasma. Det foreligger nå imidlertid tilgjengelige metoder for produksjon av faktor VIII i cellekultur ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker, som rapportert i f.eks. J Gitschier et al. Nature 312, s. 330-37,

1984 og EP-A-160 457.

Faktor Vlll-konsentrater avledet fra humant plasma inneholder flere fragmenterte, fullt aktive faktor Vlll-former (Andersson et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 83, s. 2979-83, mai 1986). Den minste aktive form har en molekylmasse på 170 kDa og består av to kjeder på 90 kDa og 80 kDa holdt sammen ved hjelp av en metallionebro. Det refereres her til EP-A-197 901.

Kabi Pharmacia har utviklet et rekombinant faktor Vlll-produkt som tilsvarer den 170 kDa plasma faktor Vlll-form i terapeutisk faktor Vlll-konsentrater. Det trunkerte rekombinant faktor Vlll-molekyl er betegnet r-VIII SQ og produseres av kinesisk hamster-ovarie(CHO)celler i en cellekulturprosess i serumfritt medium ved begrenset gjennomgang.

Den spesifikke aktivitet av r-VIII SQ er ca. 15 000 IU VIII:C pr. mg protein.

Rekombinant faktor VIII SQ blir indikert for behandling av klassisk hemofili. Doseringen er lignende doseringen av plasmafaktor Vlll-konsentratene.

Strukturen og biokjemien av rekombinant faktor Vin-produkter generelt er beskrevet av Kaufman i Tibtech, vol. 9, 1991 og Hematology, 63, s. 155-65, 1991. Strukturen og biokjemien av r-VIII SQ er beskrevet i WO-A-91/09122.

Faktor VIII som er blitt fraksjonert fra plasma selges vanligvis som frysetørket pulver som skal rekonstitu-eres med vann.

En formulering med en lav mengde protein vil vanligvis miste aktivitet under rensing, steril produksjon, ved emballering og under administrering. Dette problem løses vanligvis ved tilsetning av humant albumin som reduserer tapet av det aktive protein betraktelig. Humant albumin fungerer som en generell stabilisator under rensing, steril produksjon og frysetørking (se oversikt av Wang et al., J. i Parenteral Sei. and Tech. vol 42, nummer 28, supplement. 1988). Anvendelsen av albumin for stabilisering av faktor VIII er kjent og benyttes for tiden i alle høyrensede faktor Vlll-produkter på markedet.

Det er imidlertid ønskelig å unngå tilsetning av humant albumin til et terapeutisk protein fremstilt ved rekombinant DNA-teknologi. Anvendelsen av humant albumin som en formuleringseksipiens begrenser dessuten ofte anvendelse av mange av de mest kraftige og sensitive analytiske metoder for proteinkarakterisering.

Mange løsninger er foreslått for stabilisering av forskjellige proteiner. EP 35 204 (Cutter) beskriver således en metode for overføring av termisk stabilitet til en protein-blanding i nærvær av en polyol. WO-A-89/09614 (Genentech) beskriver videre en stabilisert formulering av humant vekst-hormon omfattende glysin, mannitol og en buffer, og i en foretrukket utførelsesform tilsettes et ikke-ionisk overflateaktivt middel, slik som polysorbat 80. Det ikke-ioniske overflateaktive middel tilsettes for redusert aggregering og denaturering. Formuleringen har en økt stabilitet i en fryse-tørket formulering og ved rekonstituering. US-A-4 783 441 (Hoechst) beskriver også en vandig oppløsning omfattende et protein, slik som insulin og et overflateaktivt stoff.

EP 77 870 (Green Cross) beskriver tilsetning av aminosyrer, monosakkarider, oligosakkarider eller sukkeralkoholer eller hydrokarbonkarboksylsyrer for å forbedre stabiliteten av en oppløsning inneholdende faktor VIII. EP 117 064 (Green Cross) beskriver tilsetning av sukkera.lkohol eller disakkarider til en vandig oppløsning av faktor VIII for

økning av stabiliteten under varmebehandling.

WO-A-91/10439 (Octapharma) beskriver en stabil, injiserbar oppløsning av faktor VIII eller faktor IX som omfatter et disakkarid, fortrinnsvis sakkarose, og én eller flere aminosyrer, og EP 315 968 og EP 314 095 (Rorer) beskriver stabile formuleringer av faktor VIII med forskjellig ionestyrke.

US-A-4 727 027 (Diamond Scientific) angår en metode for fotokjemisk dekontaminering av vandige blandinger inneholdende biologisk aktive proteiner avledet fra blod eller blodkomponenter, for minimalisering av aktivitetstap. Metoden omfatter tilsetning av minst ett furokumarin til blandingen og bestråling av den erholdte blanding med ultrafiolett(UV) lys. Før bestrålingen kan oksygenkonsentrasjonen i den vandige blanding reduseres for å inhibere denaturering. Dette kan f.eks. oppnås ved tilsetning av oksygenfjerningsmidler, albuminer og/eller enzymsystemer og/eller gjennomstrømning med en inert gass. Oppløsninger inneholdende faktor VIII ble gjennomstrømmet med argon med eller uten askorbat i opp til 6 timer. US-A-4 727 027 nevner ingenting om lagring av oppløs-ninger i en forlenget tid, og heller ikke den mulige effekt av redusert oksygenkonsentrasjon på faktor Vlll-aktivitet ved slik lagring.

EP-A-0 212 040 (Immuno) angår virusinaktivering av faktor VIII ved oppvarming av tørt materiale i et oksygen-redusert miljø. Varmebehandlingen utføres i fravær av stabili-satorer, fordi de sistnevnte også beskytter virusene og derved reduserer effektiviteten av behandlingen. Tester utføres ved 90 °C i 30 timer. EP-A-0 212 040 nevner ingenting om problemet med dårlig stabilitet av vandige oppløsninger inneholdende faktor VIII, hvilket vanligvis er et mye vanskeligere problem å overvinne enn dårlig stabilitet av tørre produkter. Dette er fordi kjemiske endringer, f.eks. hydrolyse og deamidering, er langt mer uttalte i en oppløsning enn i tørr tilstand.

Proteiner er forskjellige med hensyn til fysisk-kjemiske egenskaper. Ved fremstilling av et farmasøytisk preparat som skal være fysiologisk akseptabelt og stabilt i lang tid, kan det ikke kun tas hensyn til proteinets egenskaper, men andre aspekter må også vurderes. Eksempler på det sistnevnte er industriell produksjon så vel som bekvem hånd-tering og trygghet for pasienten. Konsekvensene av disse aspekter er ikke forutsigelige ved testing av forskjellige formuleringer, og det foreligger ofte en entydig løsning for hvert protein.

Det ville lette anvendelsen og fremstillingen av faktor VIII hvis proteinet kunne formuleres og distribueres til pasienten i form av en stabil oppløsning uten tilsetning av albumin og med en forlenget lagringstid. Også for pasienten ville en slik løsning lette håndteringen av det ferdige legemiddelprodukt. Pasienten kunne således injisere innholdet av det ferdige legemiddelprodukt direkte uten rekonstituering.

Vandige oppløsninger inneholdende oksygensensitive kjemiske forbindelser, inkludert legemidler foruten proteiner, kan deoksygeneres som følger: Vann for injeksjon bobles med nitrogen for å redusere konsentrasjonen av oksygen. Komponenten oppløses og oppløs-ningen bobles med nitrogen og oppbevares deretter under et nitrogenteppe. Under fylling gjennomstrømmes flaskene med nitrogengass og flaskene lukkes under en strøm av nitrogen.

Det er imidlertid ikke mulig å deoksygenere en proteinoppløsning ved å boble oppløsningen med en gass. Proteinoppløsninger vil skumme kraftig og mange protein-legemidler, slik som koagulasjonsfaktor VIII, vil denaturere dersom de utsettes for en slik behandling. Det er derfor aldri tidligere foreslått at en vandig oppløsning inneholdende koagulasjonsfaktor VIII kunne lagres under en inert gass som nitrogen.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Ved foreliggende oppfinnelse er det funnet at oppløs-ninger inneholdende koagulasjonsfaktor VIII kan deoksygeneres uten proteindenaturering. Det er således overraskende funnet at koagulasjonsfaktor VIII kan stabiliseres uten albumin og at en slik vandig oppløsning med et lavt oksygeninnhold er stabil ved lagring ved f.eks. 2-8 °C.

Foreliggende oppfinnelse angår således en formulering, kjennetegnet ved at den omfatter koagulasjonsfaktor VIII med en aktivitet fra 10 til 100 000 IU/ral i en albuminfri vandig oppløsning med en konsentrasjon av oksygen på under 200 ppm, og formuleringen omfatter også en inert gass.

Faktor VIII kan enten være plasmafaktor VIII eller rekombinant faktor VIII. Når faktor VIII er rekombinant kan den enten foreligge i sin uforkortede form eller fortrinnsvis et delesjonsderivat derav. Mer foretrukket er delesjonsderi-vatet rekombinant delesjonsderivat FVIII SQ (r-VIII SQ).

Faktor Vlll-aktiviteten kan være fra 10 til

100 000 IU/ml, fortrinnsvis fra 50 til 10 000 IU/ml.

Faktor VIII anvendt i eksemplene er høyrenset, dvs. at den har en spesifikk aktivitet høyere enn 5 000 IU/mg protein, og blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse stabiliseres uten tilsetning av albumin.

Konsentrasjonen av oksygen kan enten reduseres ved å utsette den vandige oppløsning for en atmosfære av inert gass, eller ved først å redusere trykket og deretter innføre den inerte gass. Den sistnevnte prosess gjentas fortrinnsvis i flere sykluser. Ved denne metode kan oksygeninnholdet i opp-løsningen reduseres til et lavt nivå uten et vesentlig tap av faktor Vlll-aktivitet. Oksygeninnholdet i oppløsningen kan være lavere enn 200 ppm, egnet lavere enn 50 ppm, fortrinnsvis lavere enn 10 ppm og helst lavere enn 2 ppm. Innholdet av oksygen i den anvendte beholder kan reduseres på samme måte, fortrinnsvis ved å utsette beholderen for en atmosfære av inert gass.

Ferdig legemiddelprodukt angår det formulerte lege-middel i den ferdige beholder. Egnede beholdere for formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse er f.eks. ampuller, sprøyter og injeksjonsutstyr.

Oppløsningen lagres passende under en inert gass, slik som nitrogen, argon eller helium, for i vesentlig grad å opprettholde det lave oksygeninnhold. Den inerte gass er fortrinnsvis en uedel inert gass og helst nitrogen.

Det lave innhold av oksygen kan også vesentlig opp-rettholdes ved tilsetning av et antioksidasjonsmiddel til den vandige oppløsning. Oppløsningen inneholder således fortrinnsvis videre minst ett antioksidasjonsmiddel, slik som glutation, acetylcystein, metionin, tokoferol, butyl-hydroksy-toluen, butyl-hydroksyanisol eller fenolforbindelser. Fortrinnsvis er antioksidasjonsmidlet minst én forbindelse utvalgt fra glutation, acetylcystein og metionin. Kompleks-dannende midler, slik som EDTA og sitronsyre, kan ytterligere forbedre stabiliteten av faktor VIII.

Mengden av antioksidasjonsmiddel avhenger av den anvendte forbindelse. Det kan derfor generelt ikke oppgis noen konsentrasjon eller mengde. Det er imidlertid viktig at mengden av eventuelt anvendt antioksidasjonsmiddel er en farmasøytisk akseptabel mengde.

pH i oppløsningen er passende 6,5 til 8,5 og fortrinnsvis ca. 7.

Et ikke-ionisk overflateaktivt middel er fortrinnsvis til stede i oppløsningen. Det eventuelt foreliggende ikke-ioniske overflateaktive middel utvelges fortrinnsvis fra blokk-kopolymerer, slik som en poloksamer eller polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester, slik som polysorbat 20 eller polysorbat 80.

Det eventuelt tilstedeværende overflateaktive middel bør anvendes i en mengde høyere enn den kritiske micellekonsentrasjon (CMC). Se Wan og Lee, Journal of Pharm Sei, 63, s. 136, 1974. Polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreesteren anvendes således fortrinnsvis i en mengde på minst 0,01 mg/ml.

Den vandige oppløsning kan videre inneholde natrium-eller kaliumklorid, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,1 M.

Assosiasjonen av de tunge og lette kjeder av faktor VIII er avhengig av tilstedeværelsen av kalsium (eller andre divalente metallioner). Kalsium ble her tilsatt som kalsiumklorid (CaCl2), men andre salter, slik som kalsiumglukonat, kalsiumglubionat eller kalsiumgluseptat kan også anvendes, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,5 mM.

Den vandige oppløsning inneholder passende en aminosyre, slik som L-histidin, lysin og/eller arginin, i en mengde høyere enn 1 mM. Mono- eller disakkarider, slik som sukrose eller sukkeralkoholer, kan tilsettes. Fortrinnsvis inneholder

oppløsningen L-histidin og sukrose.

Den ferdige formulering omfatter fortrinnsvis en vandig oppløsning inneholdende

i) 10-100 000 IU/ml rekombinant koagulasjonsfaktor

VIII,

ii) minst 0,01 mg/ml av en polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester,

iii) natriumklorid, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,1 M,

iv) kalsiumsalt, slik som kalsiumklorid eller kalsiumglukonat, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,5 mM,

v) en aminosyre, slik som L-histidin, i en mengde høyere enn 1 mM,

vi) et mono- eller disakkarid eller en sukker-alkohol, fortrinnsvis sukrose eller mannitol.

Til denne oppløsning kan det tilsettes et antioksidasjonsmiddel i en farmasøytisk akseptabel mengde.

Formuleringen omfatter således en stabil, vandig oppløsning klar til bruk.

Oppløsningen kan fremstilles ved hjelp av en fremgangsmåte hvor koagulasjonsfaktor VIII blandes med en vandig oppløsning, eller hvor koagulasjonsfaktor VIII elueres fra det siste rensingstrinn med en vandig oppløsning. Den vandige opp-løsning inneholder passende minst ett additiv utvalgt fra et ikke-ionisk overflateaktivt middel, et antioksidasjonsmiddel, en aminosyre som L-histidin, natriumsalt, et kalsiumsalt og sukrose.

Det er mulig å lagre formuleringen omfattende faktor VIII i en albuminfri vandig oppløsning i 12 og helt opp til 24 måneder, uten vesentlig tap av faktor Vlll-aktivitet. Dette er spesielt anvendelig når faktor VIII er r-VIII SQ, fordi dataene presentert i eksemplene indikerer at r-VIII SQ er vesentlig stabilt i minst 6 måneder ved lagring under nitrogen ved 5 ± 3 °C.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse og viser stabilitetsdata for forskjellige vandige oppløsninger når de utsettes for behandling i nitrogen og argon ifølge foreliggende oppfinnelse, og i luft for sammen-

ligning.

Eksperimentelt

Materialer og metoder

Fremstilling av rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ) ble hovedsakelig utført som beskrevet i patent WO-A-91/09122, eksempler 1-3. En DHFR-manglende CHO-cellelinje (DG44N.Y.) ble elektroporert med en ekspresjonsvektor inneholdende r-VIII SQ-genet og en ekspresjonsvektor inneholdende di-hydrofolatreduktasegenet. Etter seleksjon på selektivt media ble overlevende kolonier amplifisert ved dyrking i trinnvis økende mengder metotrexat. Supernatanter fra de resulterende kolonier ble individuelt screenet for faktor Vlll-aktivitet. Et produksjonsklon ble utvalgt og denne ble deretter tilpasset til serumfri suspensjonsdyrkning i et definert medium, og til slutt ble det utviklet en fermenteringsprosess i stor skala. Supernatant oppsamles etter bestemte tidsperioder og renses ytterligere som beskrevet nedenfor.

Det klarede kondisjonerte medium ble pH-justert og applisert på en S-sepharose FF-kolonne. Etter vask ble faktor Vlll-eluert med en saltbuffer inneholdende 5 mM CaCl2-Immunabsorpsjon ble utført på et immunaffinitetsresin hvor liganden var et monoklonalt antistoff (8A4) rettet mot den tunge kjede av faktor VIII. Før applisering på kolonnen ble S-eluatet behandlet med 0,3 % TNBP og 1 % oktoxynol 9.

Kolonnen ble ekvilibrert, vasket, og faktor VIII ble eluert med en buffer inneholdende 0,05 M CaCl2 og 50 % etylen-glykol.

mAb-eluatet ble applisert på en Q-sepharose FF-kolonne, ekvilibrert med elueringsbufferen i immunaffinitets-trinnet. Etter vask ble faktor VIII eluert med 0,05 M L-histidin, 4 mM CaCl2, 0,6 M NaCl, pH 6,8.

Q-eluatet ble applisert på en gelfiltreringskolonne (Superdex 200 p.g.). Ekvilibrering og eluering ble utført med en formuleringsbuffer som gir blandingen ifølge eksemplene nedenfor.

Råmateriale av r-VIII SQ ble mottatt fra det siste rensingstrinn. Aktiviteten av faktor VIII og konsentrasjonen av de inaktive komponenter ble justert ved fortynning med en egnet buffer. Oppløsningen ble deretter sterilfiltrert (0,22 um) og deoksygenert ved å utsette oppløsningen for redusert trykk og deretter innføre den inerte gass i flere sykluser.

Aktiviteten av koagulasjonsfaktor VIII ble beregnet ved hjelp av en kromogen substratanalyse (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Mblndal, Sverige). Aktivert faktor X (Xa) dannes via den indre reaksjonsvei hvor faktor VIII virker som en kofaktor. Faktor Xa bestemmes deretter ved anvendelse av syntetisk, kromogent substrat S-2222 i nærvær av en trombin-inhibitor 1-2581, for å forhindre trombinhydrolyse av sub-stratet. Reaksjonen stanses med syre, og VIII:C, som er pro-porsjonal med frigivelsen av pNA (para-nitroanilin), bestemmes fotometrisk ved 450 nm mot en reagensblindprøve. Enheten for faktor VIII:C uttrykkes i internasjonale enheter (10), som definert ved den gjeldende internasjonale konsentratstandard (IS) etablert av WHO.

Eksempel 1

Sammenligning mellom oppløsninger lagret under luft eller nitrogen

Rekombinant faktor VIII ble fremstilt i overensstem-melse med fremgangsmåten beskrevet under eksperimentelt.

Oppløsningene ble lagret ved tre forskjellige temperaturer, hhv. 7, 25 og 30 °C.

Volumet utlevert i beholderne var 2 ml.

Det fremgår fra eksemplet at fraværet av oksygen ved 7 °C gir en akseptabel gjenvinning av VIII:C etter 6 måneder ved lagring i form av en oppløsning. Selv ved 25 eller 30 <*>C kan oppløsningen ifølge foreliggende oppfinnelse lagres uten for stort aktivitetstap. Det fremgår dessuten at stabiliteten var bedre ved pH 7 enn pH 6. ;Eksempel 2 ;Oppløsninger inneholdende et antioksidasjonsmiddel og sukrose ;Rekombinant faktor VIII ble fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet under eksperimentelt. ;Oppløsningene ble lagret ved to forskjellige temperaturer, hhv. 7 og 25 °C. ;Det utleverte volum i beholderne var 2 ml. ;TABELL 2 ;Blandingene var de følgende: ;;Begge oppløsninger ga en akseptabel stabilitet av VIII:C etter 6 måneder ved 7 °C. ;Eksempel 3 ;Sammenligning mellom oppløsninger inneholdende glutation eller askorbinsyre og lagret under luft eller nitrogen ;Rekombinant faktor VIII ble fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet under eksperimentelt. ;Oppløsningene ble lagret ved 25 °C. ;Det utleverte volum i ampullene var 2 ml. ;Etter 2 måneders lagring under nitrogen var faktor Vlll-aktiviteten bibeholdt til ca. 80 % eller mer av den opprinnelige verdi. Dette var uansett nærvær eller fravær av glutation. Glutation økte imidlertid stabiliteten betydelig når oppløsningen ble lagret med luft i toppvolumet. Askorbinsyre reduserte stabiliteten av faktor VIII. ;Eksempel 4 ;Sammenligning mellom oppløsninger med og uten glutation og lagret under luft eller argon ;Rekombinant faktor VIII ble fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet under eksperimentelt. ;Oppløsningene ble lagret ved to forskjellige temperaturer, hhv. 7 og 25 °C. ;Det utleverte volum i ampullene var 2 ml. ;Etter 6 måneders lagring under argon var faktor VIII-aktiviteten bibeholdt til ca. 65 % eller mer av den opprinnelige verdi, etter lagring ved 25 °C. Etter lagring ved 7 <*>C var den tilsvarende verdi 80 % eller høyere.

Claims

1. Formulering, 5 karakterisert ved at det omfatter koagulasjonsfaktor VIII med en aktivitet fra 10 til 100 000 IU/ml i en albuminfri vandig oppløsning med en konsentrasjon av oksygen på under 200 ppm, og formuleringen omfatter også en inert gass. 10

2. Formulering ifølge krav 1, karakterisert ved at den inerte gass er nitrogen. 15

3. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-2, karakterisert ved at den vandige oppløsning videre inneholder minst ett antioksidasjonsmiddel, slik som glutation, acetylcystein, metionin, tokoferol, butylhydroksy-toluen, butylhydroksyanisol eller fenolforbindelser. 20

4. Formulering ifølge krav 3, karakterisert ved at antioksidasjonsmidlet er minst én forbindelse utvalgt fra glutation, acetylcystein og metionin. 25

5. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at koagulasjonsfaktor VIII er uforkortet eller et delesjonsderivat angitt som r-VIII SQ. 30

6. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at konsentrasjonen av aktiv koagulasjonsfaktor VIII er 50 til 10 000 IU/ml.

7. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-6, 35 karakterisert ved at den vandige oppløsning videre inneholder et ikke-ionisk overflateaktivt middel.

8. Formulering ifølge krav 7, karakterisert ved at det ikke-ioniske overflateaktive middel er til stede i en mengde høyere enn den kritiske micellekonsentrasjon.

9. Formulering ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at det ikke-ioniske overflateaktive middel er utvalgt fra blokk-kopolymerer eller polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester.

10. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at den vandige oppløsning videre inneholder et kalsiumsalt, slik som kalsiumklorid eller kalsiumglukonat, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,5 mM.

11. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at den vandige oppløsning videre inneholder en aminosyre, slik som L-histidin, i en mengde høyere enn 1 mM.

12. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-11, karakterisert ved at den vandige oppløsning videre inneholder mono- eller disakkarider eller sukkeralkoholer, fortrinnsvis sukrose.

13. Formulering ifølge ethvert av kravene 1-12, karakterisert ved at det omfatter en vandig oppløsning inneholdende i) 10-100 000 IU/ml rekombinant koagulasjonsfaktor VIII, ii) minst 0,01 mg/ml av en polyoksyetylen-sorbitan-fettsyreester, iii) natriumklorid, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,1 M, iv) kalsiumsalt, slik som kalsiumklorid eller kalsiumglukonat, fortrinnsvis i en mengde høyere enn 0,5 mM, v) en aminosyre, slik som L-histidin, i en mengde høyere enn 1 mM, vi) et mono- eller disakkarid eller en sukker-alkohol, fortrinnsvis sukrose eller mannitol.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av en oppløsning ifølge ethvert av kravene 1-13, karakterisert ved blanding av koagulasjonsfaktor VIII med en vandig oppløsning, slik at aktiviteten er fra 10 til 100 000 IU/ml og reduksjon av oksygenkonsentrasjonen ved å utsette oppløsningen ved for en inert gassatmosfære.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av en oppløsning ifølge ethvert av kravene 1-13, karakterisert ved blanding av koagulasjonsfaktor VIII med en vandig oppløsning og reduksjon av oksygenkonsentrasjonen ved først å redusere trykket og deretter inn-føre den inerte gass, gjentatt i flere sykluser.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av en oppløsning ifølge ethvert av kravene 1-13, karakterisert ved eluering av koagulasjonsfaktor VIII fra det siste rensingstrinn med en vandig buffer-oppløsning og reduksjon av oksygenkonsentrasjonen ved å utsette oppløsningen for en inert gassatmosfære.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av en oppløsning ifølge ethvert av kravene 1-13, karakterisert ved eluering av koagulasjonsfaktor VIII fra det siste rensingstrinn med en vandig buffer-oppløsning og reduksjon av oksygenkonsentrasjonen ved først å redusere trykket og deretter innføre den inerte gass, gjentatt i flere sykluser.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av en oppløsning ifølge ethvert av kravene 14-17, karakterisert ved at den vandige oppløsning inneholder minst ett additiv utvalgt fra et ikke-ionisk overflateaktivt middel, et antioksidasjonsmiddel, en aminosyre som L-histidin, et natriumsalt, et kalsiumsalt og sukrose.