FI118171B

FI118171B - Farmaseuttinen formulointi tekijän VIII antamiseksi ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti

Info

Publication number: FI118171B
Application number: FI963871A
Authority: FI
Inventors: Thomas Oesterberg; Jack Spira; Lars Widlund; Brita Sjoestroem; Marianne Mikaelsson
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2007-08-15
Also published as: CA2186126A1; MX9604455A; AU690666B2; EP0772452A1; NO964081D0; BR9507227A; PL316618A1; FI963871A0; US5925739A; FI963871A; PT772452E; IL113010A0; ES2182899T3; ATE222770T1; DK0772452T3; HU9602693D0; WO1995026750A1; AU2156095A; DE69527966T2; JP3939750B2

Description

118171

Farmaseuttinen formulointi tekijän VIII antamiseksi ' ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti - Far-maceutisk beredning för subkutan, intramuskular eller in-tradermal administration av faktor Vili 5

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö kohdistuu farmaseuttiseen formuloin- .£ tiin, joka on tarkoitettu ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai ihonsisäiseen antamiseen ja joka käsittää hyytymisteki- ^ a 10 jää Vili ja sen käyttöön hemofilia A:n tai B:n hoitamiseen tarkoitetun lääkkeen valmistukseen. Formulointi käsittää hyytymistekijää VIII, jonka aktiivisuus on vähintään 500 IU/ml, ja lisäainetta, joka lisää tekijän VIII hyötyosuut-ta. Tekijällä VIII suoritetut testit tuottavat terapeutti-15 sen tason aktiivista tekijää VIII verivirrassa yllättävän pitkän ajanjakson ajan ihonalaisen, lihaksensisäisen tai ihonsisäisen antamisen jälkeen. Tekijä VIII on sopivasti erittäin puhdistettu rekombinanttinen tekijä Vili ja edullisesti sen deleetiojohdannainen, jota voidaan käyttää 20 ihonalaiseen antamiseen tarkoitetun lääkkeen valmistukseen.

*;··· Keksinnön tausta • Hemofilia on perinnöllinen sairaus, joka on tunnettu vuosi- *

satoja mutta vasta viimeisten neljän vuosikymmenen aikana U

• · · ·· · 25 on ollut mahdollista erottaa sen erilaiset muodot: hemofi- ia : V % I lia A, hemofilia B ja hemofilia C. Hemofilia A on yleisin * · 1 .< • t · k muoto. Sitä sairastavat vain miehet esiintymistiheyden oi- * 1 1 *·1 1 lessa yksi tai kaksi henkilöä 10000 elävänä syntynyttä miestä kohti. Sairauden aiheuttaa voimakkaasti laskenut : 1·· 30 biologisesti aktiivisen hyytymistekijä Viliin (antihemofii- • · 1 lisen tekijän), joka on proteiini, jota on normaalisti läs- : .·. nä plasmassa, taso tai sen puuttuminen. Hemofilian kliini- • · · nen ilmentyminen on voimakas verenvuototaipumus ja ennen * · "1 kuin tekijä Vili -konsentraateilla hoito otettiin käyttöön, 35 tällaisten potilaiden keski-ikä oli alle 20 vuotta, Plas- • · !,1·; masta saadun tekijä VIII :n konsentraatteja on ollut saata- ' 7 '"j| -4' 2 118171 vissa noin kolme vuosikymmentä. Tämä on parantanut merkittävästi hemofiliapotilaiden hoitotilannetta ja suonut heille mahdollisuuden elää normaalia elämää.

..... ' Λ 5 Tiedetään yleisesti, että hemofilian A ja B vakavuus voi- ' daan jakaa kolmeen luokkaan: vakava, kohtalainen ja lievä. Kohtalaisessa hemofilia A:ssa tekijä Vili -aktiivisuuden plasmataso on veressä alueella 1-4 % normaalista plasmasta.

Lievässä hemofilia A:ssa tekijä VIII -aktiivisuuden plas- 10 mataso on veressä alueella 5-25 % normaalista plasmatasos-ta. Tekijä VIII -aktiivisuuden normaali plasmataso on määritetty 1 IU/ml:na verestä. Vakava, kohtalainen ja lievä ; hemofilia B määritetään samoilla plasmatasoilla kuin mitä edellä esitettiin tekijä VIIl:n yhteydessä. Tekijä IX -ak-15 tiivisuuden normaali plasmataso veressä on määritetty 1 Ϊ IU/ml:na verestä. Tässä viitataan Inga Marie Nilssoniin, i •

Hemophilia, Pharmacia Plasma Products, Stockholm, Ruotsi, '! s. 2-3, 1994.

20 Lääke, jossa on hyvin suuri ja epävakaa molekyyli, kuten hyytymistekijä VIII, jonka molekyylimassa on 170-300 kDa, annetaan tavallisesti suonensisäisesti, koska näiden lääk- : [ keiden hyötyosuus on tavallisesti hyvin alhainen johtuen t t i .

riittämättömästä absorptiosta ja voimakkaasta hajoamisesta, ·* *· * : V 25 jos niitä annetaan ihonlaisesti, lihaksensisäisesti tai * Ϊ,·,· ihonsisäisesti. Nain ollen natriumsitraattiin liuotettu ja : lihaksensisäisesti annettu tekijä VIII -konsentraatti tuot- ti vain 1,5 %,:n maksimaalisen kiertotason normaalista plas- matasosta (Pool et ai., New England J. Medicine, voi. 275, 30 nro 10, s. 547-548, 1966). Tutkimukset ovat paljastaneet , .* lisäksi, ettei verenkierrosta löydetyssä aktiivisuudessa ,··· ollut mitään merkittävää eroa huolimatta siitä, lisättiinkö • · » tällaista sitraattia valmisteeseen. Myöhemmässä tutkimuk- * * V sessa erittäin puhdasta tekijä VIIi:aa annettiin lihaksen- • * o 5.., 35 sisäisesti hemof Hiisille koirille ja vapaaehtoisille ih- • 4 ;·. misille (Johnson et ai., Br. J. Hematology, voi. 21 , s.

• · - t*t \ 21-41, 1971). Vaikka annokset olivat paljon suurempia kuin • t *

Pool et ai.:n käyttämät, ei koirien eikä vapaaehtoisten ihmisten plasman tekijä VIII -tasoissa esiintynyt merkittävää 3 118171 nousua. Itse asiassa vapaaehtoisten hemofiilisten ihmisten

·· 'A

plasman tekijä Vili -taso pysyi alle 1 %in normaalilta plasmatasosta, so. vakava hemofilia A vallitsi jopa antami- % sen jälkeen hyÖtyosuutta lisäävien lisäaineiden puuttuessa.

5

Erilaisia lisäaineita on ehdotettu lukuisten farmaseuttisten aineiden, mukaan lukien pienet molekyylit, kuten insuliini tai tekijän VIII peptidifraktiot, absorption parantamiseksi. WO-A-92/01 440 kohdistuu dimetyyli-B-syklodeks-10 triinin käyttöön molekyylimassaltaan noin 5800 Da olevan insuliinin limakalvon läpi antamisen parantamiseksi. Informaatiota, joka koskee pienten molekyylien kuljettamista ei-invasiivisia reittejä, ei voida siirtää suurten molekyy-lien kuljettamiseen suonensisäiseen kiertoon ihonalaisella, ' 15 lihaksensisäisellä tai ihonsisäisellä antamisella. Tämä on "% erityisesti totta, koska WO-A-92/01 440:n kohteena on valmistaa injektioita, joissa on ylimäärin (poly)peptidejä tai proteiineja. Lisäksi ennen lihaksensisäistä antamista käy- 4 tetään suolaliuosta molekyylimassaltaan 1000-20000 Da ole-20 vien tekijän VIII peptidifraktioiden liuottamiseen (Conte 4 et ai., Arznei.-Forsch./Drug Res., voi. 39 (I), no 4, s. .f a ..t 463-466, 1 989). Tässä kokeet kohdistuvat myös pieniin mole- 4? • * * *,, kyyleihin, joilla saadaan tuntematon hyötyosuus, koska te- i ♦ · * *·’’ kijä Villin peptidif raktioiden aktiivisuutta ei ole määri- • 25 tetty.

* • * • · * a • · 1 ' .V·'* V : EP-A-0 522 491 kohdistuu hyaluronihapon veteen liukenevan i lajin käyttöön yhdessä veteen liukenevan proteiinin kanssa, jossa ei ole mitään farmakologista aktiivisuutta, farmako-30 logisesti aktiiviseen polypeptidin, jonka molekyylimassa . on edullisesti alle noin 20 kDa, antamisen parantamiseksi.

t*· .·;· Verenhyytymistekijät on mainittu lukuisten polypeptidien t 4 *· joukossa. Lisäksi siinä ei ole mitään esimerkkejä, jotka »t« V osoittaisivat hyaluronihappojen mahdollisen vaikutuksen * * k 35 annettaessa mitä tahansa verenhyytymistekijää esim. injek- • ? i*. toimalla.

» *» k « • · • ♦ * JP-A-63-063624 kohdistuu kollageenin käyttöön saataessa : Ί ’ · :U . ',4/b 4 118171 aikaan hitaasti vapautuva määrittelemätön lääke annettaessa esim. ihonalaisesti. i JP-A-56-127308 kohdistuu emulsioihin, jotka sisältävät ve-5 renhyytymistekijää Vili, soijaöljyä ja fosfolipidejä. Nai- ? den emulsioiden kohteena on eliminoida konventionaaliseen parenteraaliseen antamiseen liittyvät ongelmat. Emulsiot annetaan siksi suun kautta, mikä on esitetty useissa esimerkeissä.

1 0

Tekijää VIII voidaan käyttää myös muihin terapeuttisiin .· tarkoituksiin kuin hemofilia A:n hoitamiseen. WO-A-93/241 37 kohdistuu FVIIIiaa sisältäviin formulaatioihin, jotka on tarkoitettu ihonsisäiseen tai tooppiseen antamiseen tuleh- " 15 dusta estävänä aineena. Formuloinnit on tarkoitettu paikal- i liseen antamiseen ei-hemofiilisten ihmisten kehoille eikä hemofilia A:ta sairastavien ihmisten suonensisäiseen kiertoon. Terapeuttinen vaikutus on siten paikallinen eikä sys- ; teeminen, kun hemofilia A:n lievittämiseen tarvitaan vii- =1 20 meksi mainittua.

f . "V

* · * * *

Tekijän IX, jossa ei ole lisäaineita, ihonalainen antaminen • * ϊ tunnetaan, Berrettini et ai., Am. J. Hematology, voi. 47, » *.*. no 1 , 61 -62, 1994. Tekijä IX on pienempi molekyyli kuin ** f •V 25 tekijä VIII ja sen molekyylimassa on noin 56 kDa. Ihmisen * tekijä IX siirtyi huonosti ja hyvin hitaasti verenkiertoon, :V: kun se injektoitiin hemofilia B -potilaiden ihonalaiseen : kudokseen. Tämä on yhtenevä tekijällä VIII saatujen tulosten kanssa.

30

Kaikki nykyisin kaupallisesti saatavissa olevat tekijä • · VIII- ja tekijä IX -valmisteet on tehty formuloinniksi, t * . joka on tarkoitettu suonensisäiseen antamiseen ja suurin ·»· · osa tekijä VIII -valmisteista on stabiloitu ihmisen seeru-!***: 35 min albumiinilla.

• M • « #· , Suuria ja epävakaita proteiineja annetaan siten tavallises- • · * ** '* ti suonensisäisesti siten, että lääke on saatavissa suoraan verivirtaan. Olisi kuitenkin edullista, jos lääke voitai- 5 118171 siin antaa ihonalaisesti, suonensisäisesti tai ihonsisäisesti, koska potilaan on paljon helpompi käyttää näitä an-tomuotoja. Erityisesti jos lääkettä on otettava säännölli-sesti koko elämän ajan ja hoito on aloitettava varhain, jo '-f 5 potilaan ensimmäisen elinvuoden aikana.

Keksinnön kuvaus

Suureksi yllätykseksemme havaitsimme, että tekijä VIII, joka on hyvin herkkä proteiini, voidaan antaa ihonalaisesti 10 ja päinvastoin kuin mitä aiempi kokemus osoitti, saimme aikaan aktiivisen tekijä Vili -proteiinin merkittävän absorboitumisen ja yllättävän korkean tason vereen. . C

Olemme täten kehittäneet formuloinnin, joka mahdollistaa 15 tekijä VIIi:n antamisen ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti ja josta on suurta etua kaikille tekijä "

Villin tarpeessa oleville potilaille. 4 • <Ä

Rekombinanttinen tekijä VIII SQ on indikoitu klassisen he-20 mofilian hoitoon. r-VIII SQ:n puoliintumisikä on suunnil- | , leen 12 tuntia ihmisissä, kun se annetaan suonensisäisesti.

m*· ,, Ehkäisevään hoitoon annetaan 15-40 IU/ruumiin painokiloa 4 : kohti tekijä VIII:aa kolme kertaa viikossa. < • f * * · ^ • · M · · :-¾ • V 25 Suonensisäinen injektio on tavallisesti 5-20 ml. Ihonalai- Λ v !4·.: sesti annettu injektio on 0,05-1 ml ja tekijä Villin kon- ΐ 4! : sentraatio täytyy siksi olla erittäin suuri tällaisessa 4 formulaatiossa. Tama on mahdollista saavuttaa esim. erittäin puhdistetulla rekombinanttisella tekijä Villillämme 30 formulointina lisäaineen, kuten hydrolysoidun gelatiinin, : , ,v hyaluronihapon ja/tai soij aölj yemulsion, kanssa. Täten 4

^ V S V

..· esillä olevalla keksinnöllä voi olla mahdollista saada vä- « ♦ * * *. . hintään noin 15 %in, sopivasti vähintään noin 30 %in, hyö- 4 t · · ; .

V tyosuus ihonalaisen, lihaksensisäisen tai ihonsisäisen an- ? f * it,,; 35 tamisen jälkeen verrattuna hyötyosuuteen, joka saadaan suo- *·, nensisaisen antamisen jälkeen. Valitsemalla erityisen huo- i · lellisesti esillä olevan keksinnön mukaisen formuloinnin # * * 1 · * * aineosat on mahdollista saada vähintään 50 %'.n ja 70 %>:n hyötyosuus ihonalaisen, lihaksensisäisen tai ihonsisäisen 6 118171

antamisen jälkeen verrattuna hyötyosuuteen, joka saadaan suonensisäisen antamisen jälkeen. I

Keksinnöllinen ajatus on siten sen havainnon yhdistelmä, 5 että tekijä Vili voi absorboitua verivirtaan, kuten se annetaan ihonalaisena, lihaksensisäisenä tai ihonsisäisenä farmaseuttisena formulointina ja että on mahdollista valmistaa erityinen formulointi, joka tuottaa tekijän VIII hyötyosuuden tarvittavan lisäyksen tähän tarkoitukseen.

10

Esillä oleva keksintö kohdistuu siten farmaseuttiseen formulointiin, joka on tarkoitettu ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai ihonsisäiseen antamiseen ja joka käsittää hyytymistekijä VIII:n, jonka aktiivisuus on vähintään 500 15 lU/ml, ja lisäaineen, joka lisää tekijä VIII:n hyötyosuut- ta, joka formulointi tuottaa tekijä Villin terapeuttisen . 1 tason vähintään 1,5 % normaalista plasmatasosta veressä vähintään 6 tuntia antamisen jälkeen.

20 Terapeuttinen taso tässä keksinnössä kohdistuu vähintään 1,5 %:iin normaalista tekijä VIII -aktiivisuuden plasma- .¾ tasosta veressä. Tekijä VIII -aktiivisuus veressä on sopi-vasti 2,5 % normaalista plasmatasosta ja edullisesti vähin- • · .. tään 4 %.

• · .f * «· 25 * * * ; Esillä olevan keksinnön mukaisilla formuloinneilla on mah- «·* • ·* dollista ylläpitää terapeuttisesti hyväksyttävä VIII:C- - • · · taso vähintään kuusi tuntia, sopivasti yli 12 tuntia, edul- • * · ·.· · lisesti yli 24 tuntia ja edullisemmin yli 48 tuntia. Opti- 30 moiduilla formuloinneilla on luultavasti mahdollista yllä-pitää terapeuttisesti hyväksyttävä VIII :C- -taso vähintään 96 tuntia ja jopa yli 168 tuntia. Tällä tavalla antamisti- * · · .*. heys voidaan pitää minimissä samalla kun saadaan aiottu te- ·** · rapeuttinen vaikutus. Keksinnön mukaiset koostumukset voi- * · · • · *···* 35 vat myös olla sopivia annettavaksi vaadittaessa.

• - ····* • · • · * « · • · ·£ "•V? 7 118171

Esillä oleva keksintö kohdistuu hemofilia A:n tai B:n hoitoon, jotka ovat sairauksia, jos niitä esiintyy, vallitsevat koko verojärjestelmässä. Täten menestyksellisen hoidon edellytyksenä on antaminen sellaisella tavalla, että saavu- r 5 tetaan systeeminen vaikutus. Tällainen systeeminen vaikutus .] saadaan esillä olevalla keksinnöllä vastakohtana muihin tekniikoihin, joissa halutaan paikallisia, esim. tulehdusta estäviä, vaikutuksia.

10 Tekijä Vili:aa sisältävä formulointi annetaan edullisesti ihonalaisesti.

. i

Tekijä VIII -aktiivisuus formuloinnissa on vähintään 500 IU/ml, sopivasti yli 500 ja edullisesti yli 1000 IU/ml. On .¾ yii 15 erityisen edullista, että tekijä VIII -aktiivisuus on yli 1500 IU/ml formuloinnissa ja erityisen edullisesti aktiivi-suus on 5000-100000 IU/ml. ?

Annettu tilavuus voi olla yli 0,01 ml, sopivasti 0,1-2 ml, 20 edullisesti 0,25-1,5 ml ja edullisemmin 0,5-1 ml. Tilavuus voi myös olla 0,1-1 ml.

. Tekijä Vili voi olla joko plasmasta johdettu tai valmistat- «*··· .. tu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.

• · ; ** 25 ψ m • * · *·*.* Terapeuttiset tekijä Vili -konsentraatit on tähän saakka • · · : ’.· valmistettu fraktonoimalla plasma. Kuitenkin on saatavissa * ϊ.·.ϊ menetelmiä tekijä VIII: n valmistamiseksi soluviljelmässä käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita, joita on raportoitu 30 esim. W. Wood et ai., Nature 312, s. 330-37, 1984, ja EP-A-160 457.

• ·* ····'' ·♦'·'· • ♦ • · · ·· ···:-' • · · · • * * • · • · • · · • · · · « t * • · · • ·« • · 8 118171

Ihmisen plasmasta johdetut tekijä VIII -konsenraatit sisältävät useita fragmentoituja täysin aktiivisia tekijä VIII 'M

-muotoja (Andersson et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi 'A

83, s. 2979-83, toutkokuu 1986). Ihmisen tekijä Vlli:n pie-5 nimmän aktiivisen muodon molekyylimassa on 170 kDa ja se koostuu kahdesta ketjusta, jotka ovat 90 kDa ja 80 kDa ja joita pitää yhdessä metalli-ionisilta. Tässä yhteydessä .¾ viitataan EP-A-197 901:een. Ruotsin Pharmacia AB on kehit- ^ tänyt rekombinanttisen tekijä VIII -tuotteen, joka vastaa 10 170 kDa:n plasmatekijä Vili -muotoa terapeuttisissa tekijä VIII -konsentraateissa. Typistetty rekombinanttinen tekijä VIII -molekyyli on nimeltään r-VUI SQ ja kiinalaisen hams-terin munasarjan (CHO) solut valmistavat sitä soluviljely-prosessissa seerumittomassa väliaineessa. -¾ 1 5

Rekombinanttisten tekijä VIII -tuotteiden rakenteen ja bio- tf kemian on kuvannut Kaufman, Trends in Biotechnology, voi % 9, 1991 ja Hematology, 63, s. 155-65, 1991. r-VIII SQ:n f rakenne ja biokemia on kuvattu W0-A-91/09122:ssa.

20 ·;·'

Kun tekijä VIII on rekombinanttinen, se voi olla joko täys- - 'Ϊ pitkässä muodossaan tai edullisesti sen deleetiojohdannai- λ.

t * Ϊ * nen. Edullisemmin deleetiojohdannainen on rekombinanttinen

* J

V. tekijä VIII SQ (r-VIII SQ). Deleetiojohdannaisella tarkoi- • * 9 • V 25 tetaan hyytymistekijää VIII, jossa B-domeeni puuttuu koko- *' JJ, naan tai osittain. Lisäksi tekijä VIII -molekyyli ja eri- •V tyisesti r-VIII SQ -molekyyli voi olla kemiallisesti modi- fioitu esim. pegyloinnilla, kovalenttisesti sitoutuneilla hiilihydraateilla tai polypeptideillä molekyylin stabiiliu-30 den parantamiseksi in vivo. ' t • * * .·... ;f Ψ * Käyttämämme tekijä VIII on erittäin puhdistettu, so. sen • * . spesifinen aktiivisuus on yli 5000 IU/mg proteiinia, jopa ♦ Φ ♦ li yli 12000 IU/mg ja sen on edullisesti stabiloitu albumiinia ; 35 lisäämättä.

··» ' ·« « · * 9

Tekijä Villin hyötyosuutta lisäävät lisäaineet ovat sopi- r · " * ·" * ~ vasti orgaanisia yhdisteitä per se, niiden suoloja, emul sioita tai dispersioita, jotka sisältävät orgaanisia yhdis- 9 118171 teitä per se tai niiden suoloja, esim polaaristen lipidien dispersioita, tai niiden lisäyksen mikä tahansa yhdistelmä tai jakso. Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoiset orgaaniset yhdisteet per se ovat esim. aminohappoja, pepti- :! 5 deitä, proteiineja ja polysakkarideja. Peptidit käsittävät dipeptidit, tripeptidit, oligopeptidit ja polypeptidit, kuten kollageenin ja gelatiinin. Kollageeni ja gelatiini ovat edullisesti hydrolysoituja. Polysakkaridit käsittävät esim. kitosaanit, syklodekstriinit, tärkkelyksen, hyaluro-10 nihapot, dekstraanit, sellluloosan ja mikä tahansa niiden lisäysten kombinaatiot ja/tai sekvenssin. Tärkkelys on > edullisesti hydrolysoitu. Emulsiot käsittävät öljy vedessä -emulsiot öljyn ollessa dispergoitunut faasi ja vesi öljyssä -emulsiot öljyn ollessa jatkuva faasi. Öljy voi olla 15 kasvi- tai eläinalkuperää tai synteettisesti valmistettua. j

Emulsioiden kasviöljy on sopivasti soijaöljy tai safflori-öljy tai mikä tahansa niiden yhdistelmä. Edullinen emulsio on IntralipidR, jota myy Tukholman Pharmacia, Ruotsi, ja joka sisältää lisäksi munalesitiiniä. Polaariset lipidit 20 ovat sopivasti yksi tai useampi fosfolipidi tai glykolipidi tai mikä tahansa niiden yhdistelmä. Hyaluronihappo on edul- * ' lisesti HealonR, jota myy Uppsalan Pharmacia AB, Ruotsi.

• · * *·· Dekstraani on edullisesti PromitenR, jota myy Uppsalan 1 • · : Pharmacia AB, Ruotsi.

25 9 · : Tekijä Villin hyötyosuutta lisäävät lisäaineet voidaan li-

9 9· ·. <V

sätä formulointiin ennen kuivaamista tai rekonstituoitaessa tai ne voidaan lisätä tekijää Vili sisältävään stabiiliin liuokseen tai dispersioon. Vähintään kahden mainitun lisä-30 aineen yhdistelmää voidaan myös lisätä. Lisäksi kahta tai useampaa mainittua lisäainetta voidaan lisätä jaksona.

9 9· 9*9' »* # 9 9 9 * · * V Formulointiin voidaan myös lisätä yhtä tai useampaa hyyty- misenestoainetta. Hyytymisenestoaineet voivat olla esim.

.·*·. 35 glusaminoglykaaneja, kuten hepariineja, hepariinifragment- • 9 · >t· · teja, hepariinijohdannaisia tai heparaanisulfaattia. Edul- • 9 5 ** linen glukosaminoglykaanien ryhmä on molekyylipainoltaan 9 * :. ·: pienet hepariinit (LMWH) keskimääräisen molekyylimassan 10 118171 ollessa korkeintaan noin 10000 Da, edullisemmin 2000-8000

Da. *

Esillä olevan keksinnön mukaiseen formulointiin voidaan 5 5 lisätä ennen antamista yhtä tai useampaa vesiliuosta tai -dispersiota missä tahansa seoksessa tai jaksossa, joka on vakaa vesiliuos, dispersio tai kuivassa muodossa. *

Formulointi voi myös käsittää natrium- tai kaliumkloridia 10 edullisesti määränä yli 0,1 M.

Tekijä VIII:n raskaiden tai kevyiden ketjujen yhteenliittyminen riippuu kalsiumin (tai muiden kaksiarvoisten metal- ? li-ionien) läsnäolosta. Tässä kalsium lisättiin kalsiumklo- * 15 ridina (CaCl2) mutta muita suoloja, kuten kalsiumglukonaat-tia, kalsiumglubionaattia tai kalsiumglukeptaattia, voidaan myös käyttää edullisesti määränä yli 0,5 mM.

•:£2 •Λ

Aminohappoa käytetään edullisesti järjestelmän puskuroin- Λ 20 tiin ja se suojaa myös proteiinia amorfisessa faasissa, jos formulointi pakastekuivataan. Sopiva puskuri voisi olla *"*! L-histidiini, lysiini ja/tai arginiini. L-histidiini on valittu ensisijaisesti L-histidiinin hyvän puskurikapasi- ·*;*· tanssin noin pH:ssa 7 takia.

• * 25 * · ♦ * . Ei-ionista pinta-aktiivista ainetta voi myös olla läsnä ♦ · · 'kr • · * '.m formulaatiossa ja se valitaan sitten edullisesti lohkoko- 4 * * * . . ζ polymeereistä, kuten poloksameeri- tai polyoksietyleenisor-bitaanirasvahappoesteristä, kuten polyoksietyleeni-( 20 ) - "4 30 -sorbitaanimonolauraatista tai polyoksietyleeni-(20)-sorbi- ' Ά taanimono-oleaatista. Ei-ionista pinta-aktiivista ainetta ' '•ϊ·' tulisi olla läsnä, jos sitä käytetään, edullisesti määränä, 1 • · * ·.· joka on kriittisen misellikonsentraation (CMC) yläpuolella. i • * .*:* Katso Wan et Lee, Journal of Pharm Sei, 63, s. 1 36, 1 974.

,···, 35 Polyoksietyleenisorbitaanirasvahappoesteriä käytetään edul- mtm * lisesti määränä vähintään 0,01 mg/ml. ' * · • · · • * ψ * · *· " Tähän formulointiin voidaan lisätä monosakkaridia, disak- karideja tai sokerialkoholeja, edullisesti sakkaroosia.

11 118171

Myös antioksidantteja, kuten glutationia, asetyylikyste- iiniä, tokoferolia, metioniinia, butyylihydroksitolueenia ..,, ja/tai butyylihydroksianisolia, voidaan lisätä. " 5 Kompleksointiaineita, kuten EDTAa ja sitruunahappoa, voi myös olla läsnä pieninä konsentraatioina tekijä VIII -molekyylien stabiloimiseksi, jos niissä on suurempi affiniteetti destabiloiviin metalli-ioneihin kuin kalsiumiin tai muihin kaksiarvoisiin metalli-ioneihin, jotka liittävät yhteen 10 tekijä Vili:n ketjut. Lisäksi voidaan lisätä säilöntäaineita, kuten bentsyylialkoholia, fenolia, sorbiinihappoa, pa-rabeenejä ja kloorikresolia.

Formulointi käsittää edullisesti L-histidiiniä ja sakkaroo- 1 15 siä. Natriumkloridin suhde L-histidiiniin ja sakkaroosiin pakastekuivattavaksi tarkoituetussa koostumuksessa on sopi- f vasti yli 1:1 (paino:paino) , edullisesti yli 2:1 (paino/- ,1 paino).

20 Formulointi voi käsittää i) vähintään 500 IU/ml tekijää VIII, edullisesti vähintään 1500 IU/ml rekombinanttisen tekijän VIII deleetiojohdan- . naista *« ·« · • · .. ii) vähintään 0,01 mg/ml polyoksietyleenisorbitaanirasva- • · *# . 25 happoesteriä, * · * *·’·* iii) natriumkloridia, edullisesti määränä yli 0,1 M, • · · ί iv) kalsiumsuolaa, kuten kalsiumkloridia tai kalsiumgluko- * naattia, edullisesti määränä yli 0,5 M, * · * V : v) aminohappoa, kuten L-histidiiniä, määränä yli 1 mM, 30 vi) tekijän Vili hyötyosuutta nostavaa lisäainetta. r;: « · • ·

• M

.**·. Formulointi voi olla kuivatussa muodossa, edullisesti pa- • « · kastekuivattu. Ennen antamista kuivattu tuote voidaan re- * · · · konstituoida vesiliuoksella tai dispersiolla, esim. suspen- 1 * · « *...· 35 siolla, liposomiformuloinnilla tai emulsiolla.

• · * * · • * .·. : Keksinnön mukainen formulointi voi myös olla stabiili vesi- • ^ ·# liuos, joka on valmis annettavaksi. Se voi myös olla dispersio, esim. suspensio, liposomiformulointi tai emulsio.

12 118171

Formulointi voidaan varastoida happipelkistetyssä ympäristössä, kuten patenttihakemuksessa WO-A-94/26286 seloste-taan.

5 Keksintö kohdistuu myös keksinnön mukaisen formuloinnin käyttöön ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai ihonsisäieen antamiseen tarkoitetun lääkkeen valmistamiseksi hemofilian hoitamiseksi, edullisesti rekombinanttisen tekijä Villin deleetiojohdannaisen käyttöön ihonalaiseen antamiseen tar-10 koitetun lääkkeen valmistamiseksi. Lääke voi olla stabiili vesiliuos tai -dispersio tai kuivattu. Keksintö kohdistuu f myös menetelmään hemofilian hoitamiseksi antamalla keksin-nön mukaista formulointia ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisti. 1 15 ; . ' ; ;

Esimerkeissä esitetyt tiedot osoittavat, että tekijä VIII ;i| ja erityisesti r-VIII SQ voidaan injektoida ihonalaisesti ja ottaa talteen aktiivisessa muodossa suonensisäisesti in vivo. Tämä on erittäin yllättävä havainto, koska aiemmin 20 ei ole tunnettu mitään tällaista formulointia.

'V

* • ' Suoja ei rajoitu näiden esimerkkien koostumukseen. | • · ·'·'?£ • · * m * * ϊ ϊ : Kokeet • « ' ' - ·**': 25 Materiaalit ja menetelmät > « * - • ·*» Rekombinanttisen tekijä VIII SQ:n (r-VIII-SQ) valmistus • · * suoritettiin oleellisesti siten kuin patentissa • · " '> WO-A-91/09122, esimerkissä 1-3, kuvataan. DHFR-puutteinen CHO-solulinja (DG44N.Y.) elektroporatoitiin r-VIII SQ -gee-30 nin sisältävällä ilmennysvektorilla ja dihydrofolaattire-

•V

. duktaasigeenin sisältävällä ilmennysvektorilla. Elävien f *··· pesäkkeiden selektiivisillä väliaineilla valikoinnin jäi- « · *·* keen pesäkkeet vahvennettiin kasvattamisen avulla lisäten s « * y ·';* vaiheittain metotreksaatin määriä. Saaduista pesäkkeistä / « ·. '.3·^ .***: 35 peräisin oleva supernatantti seulottiin yksiloittäin tekijä • t · ' Vili -aktiivisuudeltaan. Tuotantoklooni valittiin ja se

i* J

• · • ’* sopeutettiin seerumittomaan suspensiokasvuun määritetyssä * · * *· ” väliaineessa ja lopuksi kehitettiin suuren mittakaavan fer- mentointiprosessi. Supernatantti kerättiin tiettyjen ajan- / 13 118171 jaksojen kuluttua ja puhdistettiin edelleen jäljempänä ku-vatusti.

.il -:·41

Selkeytetyn konditionoidun väliaineen pH säädettiin ja se ··' 5 levitettiin S-Sepharose FF -pylvääseen. Pesemisen jälkeen tekijä VIII eluoitiin 5 mM CaCl2ia sisältävällä suolapus-kurilla. ..:¾

Immunoadsorptio suoritettiin immunoaffiniteettihartsilla, 10 jolla lingandi oli monoklonaalinen vasta-aine (8A4), joka on suunnattu kohti tekijän VIII raskasta ketjua. S-eluaatti käsiteltiin ennen panostamista 0,3-%:isella TNBPillä ja 1-%:isella Octoxynol 9:llä. Pylväs tasapainotettiin, pestiin ja tekijä VIII eluoitiin puskurilla, joka sisältää 0,05 m 15 CaCl2 ja 50 ¾ etyleeniglykolia. : mAb-eluaatti panostettiin Q-Sepharose FF -pylvääseen, tasapainotettiin eluointipuskurilla immunoaffiniteettivaihees-sa. Pesemisen jälkeen tekijä VIII eluoitiin 0,05 M L-his-20 tidiinillä, 0,6 M natriumkloridilla, 4 mM kalsiumkloridilla ja pH 6,8.

* 11 v • * ' • * ·> • *·· Q-eluaatti panostettiin geelisuodatuspylvääseen (Superdex ^ • * 'tit' 200 p.g). Tasapainottaminen ja eluointi suoritettiin pus- 'i i"’'; 25 kurilla, joka sisältää L-histidiiniä, natriumkloridia ja ; * * ?.

• :* kalsiumkloridia. Proteiinihuippu kerättiin ja liuos formu- « « · loitiin ennen pakastekuivaamista.

• · * Tämä r-VIII SQ -materiaali saatiin lopullisesta puhdistus-30 vaiheesta. Tekijä VIII -aktiivisuus ja inaktiivisten kom- :¾ ,'ί,Λ'ί . ponenttien konsentraatio säädettiin laimentamalla sopivalla s’| * ♦ *··· puskurilla, joka sisältää polyetyleeniglykolia (PEG). Sit- «4 *·’ ten liuos suodatettiin steriiliksi (0,22 pm), jaettiin ja « · < pakastekuivattiin.

/·· 35 • ♦ • · 9 • · Esimerkki 1 ' ·* • · ! ’ Rekombinanttinen tekijä VIII valmistettiin kohdassa Kokeet • * • * * ... < ·. *; kuvatun menetelmän mukaisesti.

14 118171 r-VIlI SQ:ta sisältävä pakastekuivattu koostumus oli seu-raava lääkepulloa kohti ja rekonstituoitiin 4 ml:aan steriiliä injektointivettä: * ·' 5 Koostumus lääkepulloa kohti: g L-histidiini, mg 31,0

Natriumkloridi, mg 70,1 ,'i !>

Kalsiumkloridi · (2 H2O), mg 2,35

Polyetyleeniglykoli (PEG 4000), mg 4,0 10 Polyoksietyleeni-(20 )-sorbitaanimono-oleaatti (Tween 80R), mg 1 VIII:C panostettu, IU/lääkepullo 4400 VIII:C rekonstituoituna liuoksena, iU/ml 1 060 -¾ 15 Urospuolisiin albinohiiriin, jotka painoivat noin 30 g ja j jotka olivat kantaa NMRI, SPF, injektoitiin ihonalaisesti -4 niskaan rekonstituoitua r-VIII SQ -liuosta. 4

Annostasolla 1000 IU/kg injektoitu tilavuus oli 9,4 mg/kg } 20 ja suuremmalla annostasolla 50000 IU/kg 5 kertaa suurempi ; 47 ml/kg. Plasebohoidossa käytettiin suolaliuosta 9,4 ml/- | ·:··: kg. '--f * *

» · .·, V

: *' .

3-5 minuuttia ennen verinäytteiden ottamista hiiret nuku- i **,*. 25 tettiin intraperitoneaalisesti MebumalR (pentobarbitaali) « l * . / vet* 60 mg/ml:lla« Injektoitu tilavuus oli 9,4 ml(kg, so* * * .

noin 0,3 ml/hiiri. 0,45 ml verta kerättiin nukutuksen alai- 1 sena onttolaskimosta muoviruiskuihin, jotka sisälsivät 0,05 '· ml 0,13 M natriumsitraattia. Sitten kerätystä verestä vai- i 30 mistettiin plasma sentrifugoimalla (8800 g 7 minuuttia) ja il pidettiin jäätyneenä muovisissa Cryoflex-putkissa -70 °C: s-sa kunnes tuli tekijä VIII -aktiivisuuden määrittämisen 1 • * * . '-'-u • · 1 i '7·“ * .· aika.

• * : I

.*:* . . :?

» · · -I

• · « : ·/ : * · · , ··..·, ·* "> s ·. 1 \ '"{ * : ,5 118171 ;;

Tulokset:

Taulukko 1 4

VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat I

5 r-VIII SQ:ta 10000 IU/ruumiin painokiloa ihonalaisesti.

Aika antamisen jäi- VIII:C (IU/ml) n - havaintojen > keen (tuntia) X±Sd lukumäärä 0 0,82*0,43 12 ξ 10 0,33 1,23±0,41 3 1.0 1 ,38*0,56 4 1,5 1,83±0,60 12 2.0 1 ,43*0,91 8 ..j 4.0 1 ,34±0,72 6 Λ 156,0 1,27*0,42 4 8.0 1 ,55*0,80 4 16.0 0,62*0,28 4 | 20.0 0,58*0,12 3 v| 24.0 0,76*0,53 4 20

Taulukko 2 *·’ : VIIIiC plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat * *'· r-VIII SQ:ta 1 0000 IU/ruumiin painokiloa suonensisäisesti.

ϊ’:’ι Havaintojen lukumäärä oli 6 testeissä.

t * H I Λ _ : · -· 25 • it ·γ· . ;*; Aika antamisen jälkeen VIII:C (IU/ml) ·, *»·* "r";

(min. ) X

0 1,6 ! 5 66,7 ί 30 1 5 43,7 "·|

30 32,1 I

M· 45 ' ' . 27,4 "t IM :":f 60 22,5 ' .*:* 120 15,7 .·*· 35 240 2,3 • · - i'1:? * * ♦ · ·* i *" Taulukko 3 V*; Annos - vaste hiirissä, jotka saavat r-VIII SQ ihonalaises ti.

16 118171

Annos:annos r-VIII SQ annettuna (IU/kg).

Vaste: III:C plasmassa (iu/ml) 1,5 tuntia ihonalaisen antamisen jälkeen.

,'ψ 5 Annos Vaste Vaste Havaintojen (IU/kg) (IU/ml) (IU/ml) lukumäärä (peruslinj a säädetty)

Nolla 0,82±0,43 - 12 10 (peruslinja)

Suolaliuos 1,21±0,34 0,39 4 1 0000 1 ,83±0,60 1 ,01 12 f 50000 2,47±0,60 1,65 6 ^ 15 1. VIIl:C:n muutos plasmassa ajan ihonalaisen annnoksen r- VIII SQ, 10000 IU/kg, jälkeen kanssa osoittaa tyypillisen kaavion lääkkeelle, joka on absorboitunut ihonalaisesta 4 varastosta (katso taulukko 1). Maksimaalinen VIII;C-taso plasmassa on havaittavissa noin 1,5 tuntia antamisen jäl-. 20 keen (katso taulukko 1). Edellä mainituissa testeissä käy- ^ ’ 1 tetyt erittäin suuret annokset valittiin vaikutuksen saarni- 5

• " seksi, joka oli tilastollisesti merkittävät. I

• · • · 1 -3' • · · _$ • 1.· 2. r-VIII SQ:n absorboitumisen ihonalaisesta varastosta 1 • '? : 25 varmisti maksimaalisen konsentraation lisäys, joka havait- :V: tiin, kun annos nostettiin viisinkertaiseksi. Mitään mer- % ft . ." < kittävää vaikutusta ei havaittu saadulla VlII:C:n plasma- v§

tasolla, kun ihonalaisen injektion tilavuus muutettiin I

94:stä 47 ml:aan/kg, kun taas r-VIII SQ:n annos pidettiin >’ . 30 vakiona. Lisäksi plasmaan saatu VIII:C ei ollut oleellises- • « t ;·. 77

Ill ti riippuvaista antoliuoksen osmolaalisuudesta.

• · · · 3. r-VIII SQ:n hyötyosuus ihonalaisen (s.c.) hiirelle an- tamisen jälkeen oli noin 10 % hyötyosuudesta suonensisäi- y] 35 sen i.v.) antamisen jälkeen viimeksi mainitun ollessa 100 . % määritettynä. Esillä olevissa testeissä annostaso s.c. ί • · · ’ ’ oli sama kuin annostaso i.v. Hyötyosuus laskettiin alueel ta, joka on aktiivisuus (VIII:C) - aikakäyrän (AUC) alapuolella. Täten hyötyosuus ihonalaisen antamisen jälkeen voi- 4 1 7 118171 daan laskea seuraavan yhtälön mukaisesti (tietojen osalta katso taulukot 1 ja 2):

Hyötyosuuss#C4-AUCs-C_/AUCj_>v. * annosi,v>/annosSiC- (1) i:.; 5

Esimerkki 2

Rekombinanttinen tekijä VIII valmistettiin kohdassa Kokeet kuvatun menetelmän mukaisesti seuraavin poikkeuksi: (i) r- > VIII SQ:n materiaali^ joka saatiin lopullisesta puhdistus-10 vaiheesta, laimennettiin puskurilla, joka ei sisältänyt PEG:tä, (ii) r-VIII SQ -liuosta ei pakastekuivattu, se säilytettiin -70 °C:ssa.

r-VIII SQ-liuoksen koostumus oli seuraava: 15 -- -1

Koostumus lääkepulloa kohti: L-histidiini, mg 7,5

Sakkaroosi, mg 158 |

Natriumkloridi, mg 45 ;i 20 Kalsiumkloridi * (2 H2O), mg 1,25 ^ • · .. Polyoksietyleeni-(20)-sorbitaanimono-oleaat- » * \ 1 ti (Tween 80R), mg 0,50 ’·*·' VIII:C panostettu, IU/lääkepullo 6070 i ·♦ · : V* vni:c, iu/mi* 1130

25 Laimennettu r-VIII SQ -liuos (1 osa r-VIII SQ

‘•ml -liuosta + 1 osa vettä til./til.) i , · "rjt • - ' .-.'3 r-VIII SQ -liuos laimennettiin steriiliin injektointiveteen (1 osa r-VIII SSQ -liuosta + 1 osa vettä til./til.) ennen . .*. 30 antamista, kun VIII:C-annos oli alle 30000 IU /ruumiin pai- • » * v«7 • · « .r nokiloa. ^ » ! · y* • · ·*♦ ·.· Naaraspuolisiin cynomolgusapinoihin (Macaca fascicularis), "'.f * * *

jotka painoivat noin 3-3,5 kg, injektoitiin ihonalaisesti I

«f "> ;·, 35 dorsaalialueella r-VIII SQ -liuosta. Annoksesta riippuen * * * ; inj ektiotilavuus vaihteli suunnilleen 0,2-2,0 ml/ruumiin- * * * .:> painokiloa. Ihonalaiset injektiot yksittäisillä annoksilla % 250, 2500 ja 5000 Ιϋ/kg annettiin. Jokaisesssa näytteenot- | totilaisuudessa kerättiin 1,8 ml verta putkiin, jotka si- ' > 18 118171 sältivät sitraattia hyytymisenestoaineena (0,2 ml). Sentri-fugoinnin jälkeen plasma erotettiin ja pakastettiin alik-vootteina (<-60 °C).

5 Tulokset:

Taulukko 4

Vili:C plasmassa, joka on peräisin apinoista, jotka saavat r-VIII SQ:ta 250 IU/ruumiin painokiloa ihonalaisesti. An-10 toliuoksessa oli VIIl:C:tä noin 1130 IU/ml.

Apina nro 1 2 3 Näyte injek- VIII:C VIIIjC VIII:C | toinnin jäi- (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml 15 keen (tuntia) 0 2,15 1,49 1,76 1 2,32 1,75 1,92 ; 4 2,43 1,52 1,89 8 2,48 1,67 1,92 , . 20 10 2,41 5 1,76 2,03 .! ' 1 2 2,29 1 ,70 2,01 * 1 '' 1 4 2,20 1 ,69 2,00 j 24 1 ,76 1 ,32 1 ,98 • · » : i V 30 2,31 1 ,46 1 ,90 1 25 48 2,18 1 ,64 1 ,96 j • · · * · · 1 .il ' % - W- ·.

• 1 · 9 » ?' >·' • · · • 1 S • -*·- ♦·.·. J.

« « • · 1 • · f · ···' • · « 1 * 1 · • « ;

* · V

• 1 • »» -- • · · > · 1- • · » * ·1 · J‘; • « 19 118171

Taulukko 5

VIII:C plasmassa, joka on peräisin apinoista, jotka saavat r-VIII SQ:ta 2500 IU/ruumiin painokiloa ihonalaisesti. An-toliuoksessa oli VIII;C:tä noin 1130 lU/ml. J

; f 5

Apina nro 4a 5a 6a ;f

Näyte injek- VIII:C VIII:C VIII:C

toinnin jäi- (IU/ml) (lU/ml) (lU/ml keen (tuntia) 10 0 1 ,85 1 ,43 2,1 8 1 1 ,96 1 ,82 2,72 .1 4 2,70 2,22 3,14 - 8 3,19 2,60 3,37 ' 10 3,19 2,81 3,46 15 12 3,06 1,56 3,02 1 4 2,56 2,42 2,85 -,v 24 2,34 2,12 2,75 5 30 2,20 2,01 2,55 48 2,02 1,83 2,38 20 • 1 1 1 1

Apina nro 4b 5b 6b • «

: " Näyte inj ek- VIII:C VIII:C VIII:C

* 4 toinnin jäi- (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml - ·1 » V keen (tuntia) 25 0 1 ,98 1 ,35 2,30 :V 2 2,43 1,88 3,05 6 3,51 2,45 3,59 9 3,91 2,47 4,16 11 3,47 2,24 3,68 | , .·. 30 1 3 3,1 1 2,06 3,34 .{ *::: 22 2,38 1,55 2,79 \ . 40 2,01 1 ,49 2,38 • 99 • · • · * ♦ » · « · • » ··1 *#···.. ' ·; * · ' 7 • 1 ' £ • · ·' 11 1 • · · • « · • · 118171 ’ 20

Taulukko 6

Vili:C plasmassa, joka on peräisin apinoista, jotka saavat r-VIII SQ:ta 5000 IU/ruumiin painokiloa ihonalaisesti. An-toliuoksessa oli VIII:C:tä noin 2470 IU/ml.

5

Apina nro 7 8 9

Näyte injek- VIII:C VIII:C VIII:C

toinnin jäi- (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml keen (tuntia) 10 0 2,04 1,78 1,54 2 2,99 2,37 2,99 6 4,56 3,33 5,32 9 4,75 3,89 5,70 11 4,72 3,32 5,46 1513 4,23 3,06 4,63 : - 22 3,03 3,33 3,46 40 2,76 1 ,77 2,60

Taulukko 7 % 20 Annos - Vaste apinoissa, jotka saavat r-VIII SQ ihonalai- • · sesti.

t · ^ • Annos:Annos r-VIII SQ annettuna (IU/ruumiinpaino kg).

* · » |·*·' Vaste: VIII:c plasmassa (IU/ml) 9 tuntia antamisen jälkeen.

• f · 9 * 9 t 9 ';· 25 Annos Vaste Vaste Havaintojen ), :V* (iu/kg) (IU/ml) (IU/ml) lukumäärä ( perus Iinj a :¾ säädetty)

Nolla 1,8±0,3 9 , 30 (peruslinja) • · .·:*· 250 0,37±0,05 3 *. . 2500 1 ,70±0,06 3 t · · 2500 2,05 + 0,57 3 '·"/ 5000 3,4±1 ,20 3 :·! ‘ 35 t ·« 1 . Taulukko 8 * · · : . · v • «« ;· u r-VIII SQ:n hyötyosuus ihonalaisen antamisen jälkeen api- i noissa. VIII:C vaihteli antoliuoksessa noin 1,130 IU/ml - :; noin 2470 IU/ml. Hyötyosuus laskettiin yhtälön 1 mukaisesti 21 118171 tiedoista, jotka on annettu taulukoissa 4-6 ja vastaavista tiedoista suonensisäisen antamisen jälkeen.

Annos Hyötyosuus 5 (IU/kg ruumiinpainoa) (%) 250 11 | 250 9 2500 7 2500 11 10 2500 6 2500 6 2500 5 2500 5 5000 7

15 5000 3 .J

5000 . , 9 ’ J

1. Tulosten mukaisesti (taulukot 4-6) plasmakonsentraatio ΐ !>i ajan funktiona seuraa tyypillistä kaaviota lääkkeelle, joka 4 20 on absorboitunut ihonalaisen antamisen jälkeen. Maksimaali- * · „ nen VIIl:C-konsentraatio on havaittavissa noin 9 tuntia * * - ·.·, } t t« f *, , antamisen jälkeen. * • · · « t > • * ...

*t · '··'? • tl * • ** 2. Saatu annos-vastesuhde (taulukko 7) antaa lisävarmistuk- * 25 sen siitä, että ihonalaisen injektion jälkeen esiintyy » · ϊ,ί : VIII:C:n absorboitumista verivirtaan.

ti· 3. r-VIII SQ:n hyötyosuus ihonalaisen apinalle antamisen . ;? jälkeen oli noin 5-10 % (taulukko 8). Hyötyosuus oleelli- . .· 30 sesti r-VIII SQ:n annoksesta riippumaton.

• · · »·* at • t

Esimerkki 3 V Käytettiin kummankin edellä mainitun (esimerkit 1 ja 2) • « koostumusten rekombinanttista tekijää VIII (r-VIII SQ).

• · -j :·. 35 f tf .·,· Urospuolisiin albinohiiriin, jotka painoivat noin 30 g ja » t * jotka olivat kantaa NMRI, SPF, injektoitiin ihonalaisesti niskaan rekonstituoitua r-VIII SQ -formulointia.

: «Λ , · 22 118171

Annos oli 10000 IU/kg ja injektiotilavuus oli noin 10 ml/-kg. 3-5 minuuttia ennen verinäytteiden ottamista hiiret nukutettiin intraperitoneaalisesti MebumalR (pentobarbitaa- | li) vet. 60 mg/ml:lla. Annostilavuus oli noin 0,3 ml/hii-5 ri. 0,45 ml verta kerättiin nukutuksen alaisena onttolas-kimosta muoviruiskuihin, jotka sisältivät 0,05 ml natrium-sitraattia (0,13 M). Plasma valmistettiin verestä sentri-fugoimalla (8800 g 7 minuuttia) ja varastoitiin sen jälkeen muovisiin Cryoflex-putkiin -70 °C:ssa tekijä VIII -aktiivi-10 suuden määrittämiseen saakka.

r-VIII SQ -liuosta yhdistettynä erilaisiin tekijän VIII hyötyosuutta lisääviin lisäaineisiin (taulukko 9) annettiin ihonalaisesti hiirille.

. 15 ;;X

Taulukko 9

Lisäaineet, joita lisättiin r-VIII SQ -liuokseen ennen ihonalaista hiirille antamista.

·. v·? 20 Lisäaine Kauppanimi Lisäaineen konsentraa-

,, Kauppalähde tio annetussa r-VIII

* · • SQ -liuoksessa • * · .¾ # * ·.« • · ·· · -¾ : Aminohapposeos VaminR/pharmacia AB 4,5 g N/l i- ' * '·* 25 Dekstraani PromitenR/PharmaciaAB 150 mg/ml Ϊ

!(! Hyaluronihappo Healon^/Pharmacia AB 5 mg/ml X

Hydrolysoitu kollageeni PrionexR/Pentapharm 150 g/1 ‘

Ltd

Hydrolysoitu gelatiini HaemaccelR/Hoechst 17,5-35 g/l , ,·, 30 Ihmisen seerumin albu- AlbuminR/Pharmacia AB 100-200 g/l t · · "· raiini • ·

. Poly(0-2-hydrcksietyy- HAES-sterilR/Meda 50-100 g/l X

V li)tärkkelys

Soijaöljyemulsio IntralipidR/Pharmacia 150-200 mg/ml %

:·! * 35 AB X

• ·4 9 9 »

Taulukko 10 VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat ihonalaisesti r-VIII SQ -liuosta, joka sisältää hydrolysoi- r i:r :?' 23 118171 tua gelatiinia. VIIl:C:tä oli antoliuoksessa noin 1100 IU/-ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 iu/ruumiin painokiloa.

Aika antamisen jäi- VIII:C n * havaintojen λ 5 keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä 0 0,82±0,43 12 1.5 1 ,83±0,37 4 6 2,02±0,43 6 16 1 ,94±0,44 9 10 24 2,00±0,52 5 30 1 ,52±0,41 6 48 1 ,32±0,41 6

Taulukko 11 15 VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat | ihonalaisesti r-VIII SQ -liuosta, joka sisältää soijaöljy- ΐ emulsiota. VIII:C:tä oli antoliuoksessa noin 1100 IU/ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 IU/ruumiin painokiloa.

• Sr.

• ’ 20 Aika antamisen jKl- VIII:C n - havaintojen *.*. keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä P; 0 0,82±0,43 12 1.5 1 ,41 ±0,44 4 :V 3,5 1 ,46±0,34 5 5 25 6 1,48±0,87 4 16 1,29±0,25 6 16 1 ,35±0,31 3 .

. .· 30 1 ,92±0,51 6 | 48 1 ,97±0,29 5 ? 30 ··· * » * · # ·*» » **· * · * · • ;:ϊ .../5 * * ψ' " 118171

Taulukko 12 VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat ' ihonalaisesti r-VIII SQ -liuosta, joka sisältää poly(0-2--hydroksietyyli)tärkkelystä. VllI:C:tä oli antoliuoksessa ..

5 noin 1100 IU/ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 IU/ruumiin pai-nokiloa.

Aika antamisen jäi- VIII:C n - havaintojen keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä 100 0,82±0,43 12 1.5 1,00±0,44 5 λ 3.5 1 ,62±0,19 4 " 6 1 ,65±0,69 6 16 1 ,62±0,38 6 15 16 1,19±0,40 4 24 0,73±0,52 4 30 1 ,33±0,39 5 48 1 ,10±0,38 3 "" 20 Taulukko 13 " „ VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat • · *t 1 ihonalaisesti r-VIII-liuosta, joka sisältää hyaluronihap- ’V poa. Laskettua VlII:C:tä oli antoliuoksessa noin 1100 IU/- »» i ; ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 IU/ruumiin painokiloa.

:25 »•a :V Aika antamisen jäi- VIII:C n - havaintojen keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä 0 0,82±0,43 12 1.5 1 ,67±0,42 5 .r , ,·. 30 3,5 1 ,33±0,35 4 ]::: 6 1,72±o,6i 4 1 \. 16 1 ,36±0,43 5 j tll 9 3 * · +> 1 · » * - -·>· • · 9 9 9 » 9 9 9 * • J 1.

9 · ' ...

: 25 118171

Taulukko 14 VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat % ihonalaisesti r-VIII SQ -liuosta, joka sisältää dekstraa-nia. VIII:C:tä oli antoliuoksessa noin 1100 iU/ml. r-VIII 5 SQ -annos oli 10000 IU/ruumiin painokiloa.

Aika antamisen jäi- VIII:C n - havaintojen keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä 0 0,82±0,43 12 10 1,5 1 ,67±0,43 6 , 3,5 1 ,74±0,10 5 6 1 ,02±0,51 5 yl 16 1 ,54±0,36 6 | 15 Taulukko 15 VIIIίΟ plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat ihonalaisesti r-VIII SQ -liuosta, joka sisältää hydrolysoitua kollageeniä. VIIi:C:tä oli antoliuoksessa noin 1100 IU/ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 IU/ruumiin painokiloa.

20 *:··· Aika antamisen jäi- VIII:C n - havaintojen .·; ·1·,, keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä .1.·. 0 0,82±0,43 12 / • 1 1 ;v. 1 ,5 1 ,00±0,54 6 • » • : 25 7 1,36±0,71 4 16 1 ,39+0,93 6 ··1.

24 1 ,31 ±0,51 5 30 0,93+0,59 4 /· 48 1 ,16+0,51 6 | 30 1 • · · -v » · · i · . .,/ ♦ · · . <t • « • · • 1 * · * · * · ♦ · · • 1 • · · 26 118171

Taulukko 16 VIII:C plasmassa, joka on peräisin hiiristä, jotka saavat ihonalaisesti aminohappojen seosta. VIII:C:tä oli antoliu- -> oksessa noin 1100 IU/ml. r-VIII SQ -annos oli 10000 IU/ruu- 7 5 miin painokiloa.

Aika antamisen jäi- VIII:C n - havaintojen keen (tuntia) (IU/ml) lukumäärä 0 0,82*0,43 12 10 1 ,5 1 ,47*0,79 4 7 1 ,66*0,21 4 16 1 ,26*0,61 6 . f

Taulukko 17 15 r-VIII SQ:n hyötyosuus ihonalaisen hiirille antamisen jälkeen. Ihonalaisesti annettu r-VIII 3Q -lios, joka sisälsi vaihtelevia lisäaineita konsentraatiossa on annettu taulukossa 8. VIII:C oli antoliuoksessa noin 1100 IU/ml ja annos oli 10000 IU/kg. Hyötyosuus laskettiin alueelta aktiivisuus 20 (VIII :C) -aikakäyrän alapuolella korkeintaan 48 tuntiin *:"i saakka. Hyötyosuus r-VIII SQ:n ihonalaisen antamisen jäi- ; keen on annettu hyötyosuusprosentteina, joka on saatu an- [ nettaessa suonensisäisesti sama annos (10000 iu/kg).

* * • · · • « · • * 25 Lisäaine, joka li- Hyötyosuus Antotapa V:’ sää tekijän VIII (%) • · • · · * hyötyosuutta

"M

Ei mikään 100 suonensisäinen

Ei mikään 10 ihonalainen 30 Dekstraani 35 ihonalainen *

Hyaluronihappo 45 ihonalainen · *

Hydrolysoitu kol- .··' lageeni 20 ihonalainen * *

Hydrolysoitu gela- 35 tiini 50 ihonalainen • *·· Poly (0-2-hydroksi- i etyyli) tärkkelys 25 ihonalainen

Soijaöljyemulsio 60 ihonalainen 27 118171

Tulokset

1. Tulokset osoittavat, että on mahdollista lisätä r-VIII

-.¾ SQ:n hyötyosuutta. On myös osoitettu, että aktiivisen r-VIII:n korkea plasmakonsentraatio on saatu paljon pidem-5 män ajan kuluessa, jopa 48 tunnin kuluttua, kun esillä olevan keksinnön mukaista hyötyosuutta lisäävää lisäainetta sisällytetään ihonalaisesti annettuun formulointiin. Tämä on verrattuna plasmakonsentraatioon, joka saadaan, kun r-VIII SQ -liuosta, jossa ei ole tällaista lisäainetta, 10 annetaan ihonalaisesti. Aktiivisen r-VIII SQ:n vähintään 50~&:inen hyötyosuus saavutetaan annettaessa ihonalaisesti liuosta, joka sisältää r-VIII SQ ja hydrolysoitua gelatiinia tai soijaöljyemulsiota.

* **·*»· • « • * * ·..?> • ..

* · t • · · ·*.' • * ' *·· • · V .

• * • · • · » • · · *·*' • I'.·.

·*··· • · - • X . i •t • · · • · • · · • · · '··'·' ♦ * ·, '< » · • · » • · · * • a • 4 • · * * • ·

* I

« · ··» * · * ...

« *

Claims

28 118171

1. Ihonalaiseen, lihaksensisäiseen tai ihonsisäiseen antami-seen tarkoitettu farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää (i) hyytymistekijää Vili, jonka ak- 7 5 tiivisuus on vähintään 500 IU/ml tai sen johdannaista, jonka molekyylimassa on vähintään 170 kDa, ja (ii) orgaanista lisäainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu aminohapoista, peptideistä, proteiineista, polysakkarideista, emulsioista, polaaristen lipidien dispersioista, tai niiden yhdistel-10 mistä, jolloin lisäaine lisää tekijä VIII:n hyötyosuutta, ja jolloin formulointi antaa tekijä Vili -aktiivisuuden terapeuttisen tason vähintään 1,5 % normaalista plasmatasosta veressä vähintään 6 tuntia antamisen jälkeen.

2. Formulering enligt patentkrav 1, kännetecknad av Μι att formuleringen ger en ätminstone 2,5 % terapeutisk nivä av faktor VIII -aktivitet av normal plasmanivä i blodet efter administreringen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen formulointi, tunnet-15 t u siitä, että formulointi antaa tekijä Vili -aktiivisuuden terapeuttisen tason vähintään 2,5 % normaalista plasmatasosta veressä antamisen jälkeen.

3. Formulering enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att den terapeutiska nivän av faktor Vili -aktivitet bestär ätminstone 12 timmar efter administreringen.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen formulointi, tunnettu siitä, että tekijä VIII -aktiivisuuden terapeutti- ft * 20 nen taso säilyy vähintään 12 tuntia antamisen jälkeen. ·· • ’·· 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen formulointi, tunnet- • » ί,ί^ϊ t u siitä, että proteiini valitaan ryhmästä, joka koostuu :*·*: gelatiinista ja kollageenista. • · • · · • » #

4. Formulering enligt patentkrav 1, kännetecknad av 10 att proteinet väljs ur en grupp bestäende av gelatin och kollagen.

5. Formulering enligt patentkrav 1, kännetecknad av att polysackariden är vald ur en grupp bestäende av kitosaner, cyklodextriner, stärkelse, dextraner, cellulosa 15 och vilket derivat och/eller kombination som heist av dessa.

5, Patenttivaatimuksen 1 mukainen formulointi, tunnet- • · · ** * 25 t u siitä, että polysakkaridi on valittu ryhmästä, joka 7 koostuu kitosaaneista, syklodekstriineistä, tärkkelyksestä, l **· dekstraaneista, selluloosasta ja mistä tahansa niiden johdan- ··· J..,· naisesta ja/tai yhdistelmästä. » ♦ · • · · *·ϊ · 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen formulointi, tunnet- ·«· 30. u siitä, että polysakkaridi on valittu ryhmästä, joka * koostuu hyaluronihapoista. • « • · · *· ** 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen formulointi, tunnet- t u siitä, että lisäaine valitaan ryhmästä, joka koostuu öl- 118171 29 jy vedessä -emulsioista öljyn ollessa dispergoitu faasi, vesi öljyssä -emulsioista öljyn ollessa jatkuva faasi ja polaaris- ΐ' ten lipidien dispersiosta. -

6. Formulering enligt patentkrav 1, kännetecknad av att polysackariden är vald ur en grupp bestäende av :'4 hyaluronsyror.

*:··· 7. Formulering enligt patentkrav 1, kännetecknad av • 20 att tillsatsämnet väljs ur en grupp bestäende av olja i * .y. vatten-emulsioner, varvid oljan är en dispergerad fas, JV. vatten i olja-emulsioner, varvid oljan är en kontinuerlig • · I I fas, och en dispersion av polära lipider. • · * ♦ ·· ♦ · · ·* 8. Formulering enligt patentkrav 7, kännetecknad av 25 att oljan är sojaolja. ·· • · 9* Formulering enligt vilket som heist av föregäende **”* patentkrav, kännetecknad av att faktor VIII aktiviteten är over 1000 iu/ml, f öreträdesvis over 1500 :***: iu/ml. «·*

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen formulointi, tunnet-5 t u siitä, että öljy on soijaöljy.

9. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen formulointi, tunnettu siitä, että tekijä vm -aktiivisuus on yli 1000 IU/ml, edullisesti yli 1500 IU/ml.

10. Formulering enligt vilket som heist av föregäende ·.*·· patentkrav, kännetecknad av att dess volym är over 0,01 ml, fÖreträdesvis 0,1-2 ml. 118171 32

10. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen for- 10 mulointi, tunnettu siitä, että sen tilavuus on yli 0,01 . 3 ml, edullisesti 0,1-2 ml.

11. Formulering enligt vilket som heist av föregäende patentkrav, kännetecknad av att faktor Vili är en rekombinant koaguleringsfaktor VIII.

11. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen for mulointi, tunnettu siitä, että tekijä VIII on rekombi-nanttinen hyytymistekijä Vili. -¾

12. Formulering enligt patentkrav 11, kännetecknad 5 av att faktor VIII är ett deletionsderivat av den rekombinanta koaguleringsfaktorn VIII.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen formulointi, tunnet- :: t u siitä, että tekijä VIII on rekombinanttisen hyytymiste- f kijän VIII deleetiojohdannainen. j|

13. Formulering enligt patentkrav 11, kännetecknad av att den innefattar i) ätminstone 500 iu/ml av faktor VIII, företrädesvis 10 ätminstone 1500 IU/ml av deletionsderivatet av den rekombinanta faktorn VIII, ii) ätminstone 0,01 mg/ml polyoxietylensorbitanfettsyraester, : iii) natriumklorid, företrädesvis i en mängd over 0,1 M, 1 iv) kalciumsalt, säsom kalciumklorid eller kalciumglukonat, 15 företrädesvis i en mängd over 0,5 mM, v) aminosyra, säsom L-histidin i en mängd over 1 mM, *:··· vi) ett tillsatsämne som ökar faktor VIII :s nyttoandel. - • · • · *, 14. Formulering enligt vilket som heist av patentkraven 11- • · * *·’·* 13, kännetecknad av att deletionsderivatet faktor j *i · : .1 20 VIII är deletionsderivatet rekombinanta faktor VIII SQ (r- viii sq) . • · · • ♦ * * * ·

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen formulointi, tunnet- • · - v) .. t u siitä, että se käsittää i * · *. . 20 i) vähintään 500 IU/ml tekijää VIII, edullisesti vähintään > • · ♦ !;*·* 1500 IU/ml rekombinanttisen tekijän Vili deleetiojohdannais- • · · ·* ta, ♦ · ii) vähintään 0,01 mg/ml polyoksietyleenisorbitaani- i * · · ·.· * rasvahappoesteriä, 25 iii) natriumkloridia, edullisesti määränä yli 0,1 M, :*·„ iv) kalsiumsuolaa, kuten kalsiumkloridia tai kalsiumgluko- ·'**; naattia, edullisesti määränä yli 0,5 mM, • · · . *. v) aminohappoa, kuten L-histidiiniä, määränä yli 1 mM, • · t ‘l\J vi) tekijän VIII hyötyosuutta nostavaa lisäainetta. * · • · ···

14. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11-13 mukainen formu- • * . . lointi, tunnettu siitä, että deleetiojohdannainen teki- ! *** * : jä Vili on deleetiojohdannainen rekombinanttinen tekijä Vili SQ (r-VIII SQ). 118171 30

15, Formulering enligt vilket som heist av patentkraven 1-14, .. kännetecknad av att till den blandas en eller flera * · vattenlösningar eller -dispersioner som en blandning eller i • 4 *···* 25 sekvens fore administreringen. • · ··;.«··: ♦ · * · · ”1/ 16. Formulering enligt patentkrav 15, kännetecknad • · *** av att den är en stabil vattenlösning eller -dispersion, och *5**· färdig att ges . • · • 4 # • ·· ·

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-14 mukainen formulointi, tunnettu siitä, että siihen sekoitetaan yhtä tai useampaa vesiliuosta tai -dispersiota seoksena tai sekvenssinä ennen antamista.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen formulointi, tunnet- t u siitä, että se on stabiili vesiliuos tai -dispersio, ja valmis annettavaksi.

17. Formulering enligt vilket som heist av patentkraven 1-14, 30 kännetecknad. av att den torkas och rekonstitueras 118171 33 med en eller flera vattenlösningar eller dispersioner som en blandning eller en sekvens fore administreringen.

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-14 mukainen formulointi, tunnettu siitä, että se kuivataan ja rekonsti- 10 tuoidaan yhden tai useamman vesiliuoksen tai dispersion kans- r sa seoksena tai sekvenssinä ennen antamista.

18. Användning av en formulering enligt vilket som heist av föregäende patentkrav för att framstalla ett läkemedel avsett 5 för behandling av hemofili och avsett att ges subkutant, intramuskulart eller intrakutant.

18. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukaisen for muloinnin käyttö hemofilian hoitoon tarkoitetun ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai ihonsisäisesti annettavaksi tar- y 15 koitetun lääkkeen valmistukseen.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukaisen formuloinnin tai delee-tiojohdannaisen käyttö, jossa lääke on vakaassa vesiliuoksessa tai -dispersiossa tai kuivattu. ····* μ • · • * ' ' ' * 20 Patentkrav • · - - • · · • · * ·***: 1. Farmaceutisk komposition avsedd att ges subkutant, ♦ « • ·*. intramuskulärt eller intrakutant, kännetecknad av ♦ · · »** att den innef attar (i) koaguleringsfaktor Vili, vars • ♦ · m aktivitet är minst 500 iu/ml eller dess derivat, vars 25 molekylmassa är minst 170 kDa, ooh (i i) organiskt * · · tillsatsämne, som är valt ur en grupp bestäende av •y* aminosyror, peptider, proteiner, polysackarider, emulsioner, • · j en dispersion av polära lipider, eller av deras kombination, :***: varvid tillsatsämnet ökar faktor Vili: s nyttoandel, och • · · . '2 30 varvid formuleringen ger ätminstone en 1,5 % terapeutisk nivä . . av faktor Vili -aktivitet av den normala plasmanivän i blodet • · * *· ** ätminstone 6 timmar efter administreringen. 118171 31

19. Användning av en formulering eller ett deletionsderivat enligt patentkrav 18, varvid läkemedlet är i en stabil vattenlösning eller -dispersion eller torkat. ..:4 * ·····;. ·· • · * ·1 • · • « · ·· * · «I I » » · • · • · • I · • · · ·· · I • ·« M# • · • · ··· • · * « 1 • · · • M · • 1« * · • 1 ··· * ·····... * · ; · • · · •e··'·.· • ·