CH626402A5 - Process for immobilising proteins on a solid support - Google Patents
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Description
La presente invenzione concerne un procedimento per l'immobilizzazione di proteine su un supporto solido, caratterizzato dal fatto che il supporto viene fatto reagire con un chinone per attivarlo, e che la reazione successiva tra supporto attivato e proteine avviene a temperature comprese fra 0°C e la temperatura di inizio della denaturazione delle proteine.
La reazione di attivazione del supporto può avvenire con il chinone tal quale e con il chinone legato ad una sostanza ad alto peso molecolare, nel qual caso si otterranno proteine legate ad alti polimeri solubili e insolubili in acqua.
Le sostanze proteiche così modificate possono essere di notevole utilità in svariati campi di applicazione a seconda delle loro funzioni. In particolare, se le sostanze proiteiche sono enzimi, cioè catalizzatori biologici, una volta attaccati a supporti insolubili in acqua, possono essere usati come catalizzatori eterogenei in campo preparativo, analitico, biomedico.
Come catalizzatori eterogenei essi diventano facilmente separabili dalla miscela in cui sono messi a reagire, e poiché è stato visto che dopo questa modifica chimica conservano sorprendentemente una notevole stabilità, e possono essere usati ripetutamente.
Anche quegli enzimi la cui procedura di isolamento e di purificazione è assai laboriosa e costosa, una volta modificati, possono essere ripetutamente usati con notevole vantaggio economico.
Inoltre gli enzimi, secondo il procedimento come definito nella rivendicazione 1, possono essere attaccati a polimeri solubili in acqua. In tale modo la loro stabilità agli agenti denaturati aumenta in maniera considerevole e quindi possono essere impiegati in condizioni sperimentali più drastiche di quelle normalmente impiegate.
Anche il peso molecolare di questi enzimi legati a polimeri solubili aumenta rispetto a quello dei corrispondenti enzimi nativi, e permette così l'impiego degli stessi in sistemi separati da membrane ultrafiltranti che lasciano passare soltanto i prodotti della reazione.
Se le sostanze proteiche sono antigeni, una volta attaccate a supporti insolubili in acqua, possono servire in questa forma per separare selettivamente il corrispondente anticorpo presente in una miscela complessa.
Se le sostanze proteiche sono inibitori di enzimi, una volta attaccati a matrici insolubili, possono essere utili per la separazione selettiva degli enzimi che essi inibiscono.
Nel caso che la proteina debba essere legata ad una sostanza ad alto peso molecolare, è allora quest'ultima che viene preventivamente trattata con il chinone.
La reazione fra il supporto e il chinone viene fatta avvenire a temperature comprese fra 0°C e 150°C, preferibilmente intorno a 20°C.
Il tempo di incubazione varia a seconda del tipo di supporto ed è generalmente compreso fra 0,5 e 100 ore, mentre il pH di reazione può variare fra 1 ed 11, preferibilmente essere nell'intorno di 7,5.
Il supporto da attivare può contenere gruppi reattivi di vario tipo quali, ad esempio, ossidrilici, amminici, sulfidrili-ci, immidazolici, pirrolici, fenolici, guanidinici, ecc. La reazione può avvenire sia in ambiente acquoso che anidro in funzione del chinone usato e del tipo di polimero. Una volta attivato il supporto, si procede alla reazione con la proteina.
È stato riscontrato, tra l'altro, che questi chinoni possono anche portare alla reticolazione di molecole proteiche fra di loro, oppure alla formazione di legami incrociati intramolecolari con conseguente stabilizzazione della conformazione della proteina.
Il grado di reticolazione si può regolare così da ottenere tanto derivati proteici a peso molecolare più alto di-quello della proteina nativa, ancora solubili in acqua, quanto derivati proteici reticolati a tal punto da diventare insolubili in acqua.
Le caratteristiche e le modalità operative dell'invenzione saranno comprensibili dall'esame dei seguenti esempi, di esecuzione che hanno un valore puramente esplicativo.
Esempio 1
Immobilizzazione della tripsina su sefarosio 4B-AH con 1,4 benzochinone
1 grammo di sefarosio 4B-AH (Pharmacia Fine Chemicals AR-S-75104 Uppsala I-Svezia) viene sospeso in 20 mi di una soluzione acquosa 0,5 M di cloruro sodico e lasciato per una notte. Poi viene messo in colonna (0,9X15 cm) e lavato con 100 mi di questa soluzione ed infine con 50 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH - 7,4.
Tutto il solido (4 mi) viene sospeso in 25 mi di questo tampone ed addizionato di 2 mi di una soluzione acquosa 0,1 M di 1,4 benzochinone preparata di fresco. Si lascia in agitazione per 24 ore a temperatura ambiente in recipiente protetto dalla luce; il tutto viene poi introdotto in colonna (0,9 X15 cm) ed il solido viene lavato con 100 mi del tampone di reazione. Si ottiene così un supporto solido attivato, intensamente colorato in marrone scuro. Questo viene sospeso in 25 mi dello stesso tampone freddo ed addizionato di 5 mi di una soluzione di tripsina cristallina (British Drag Houses Ltd. Laboratory Chemicals Division - Poole, Inghilterra) in acqua fredda (10 mg/ml).
Dopo 24 ore di contatto a 2°C si introduce di nuovo il tutto in colonna (0,9 X15 cm) ed il solido viene rilavato alternando aliquote da 15 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH 7,4 e a pH 4,4 per un volume totale di 150 mi. Si ottiene così una tripsina supportata su sefarosio 4B-AH che esplica una attività esterasica di 35 unità per mi di supporto (l'attività esterasica è stata determinata con N-benzoil-argi-nin-etilestere (BAEE) come substrato, a 25°C epH=8,0 secondo il metodo di L. Goldstein, Methods in Enzymology -Voi. 19, 935-962 (1970). Una unità enzimatica è quella quantità di enzima che idrolizza 1 limole di substrato per minuto nelle condizioni sopra specificate).
Questo campione di tripsina immobilizzata conservato a 4°C, in soluzione acquosa 1 M in cloruro sodico e 0,5 M in fosfato monosodico (pH—4,4), riprovando saltuariamente la soluzione supernatante, dopo tre mesi esplica ancora tutta l'attività esterasica iniziale.
Un campione di sefarosio 4B-AH non trattato con chi-none, ma messo in contatto con la stessa quantità di tripsina
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per lo stesso tempo e successivamente lavato non esplica alcuna attività enzimatica, dimostrando che non si ha adsorbimento fisico di enzima sul supporto.
Esempio 2
Immobilizzazione della tripsina su sefarosio 4B con 1,4 benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB) viene lavato come descritto nell'esempio precedente, sospeso in 25 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH=7,4 ed addizionato di 2 mi di una soluzione acquosa 0,1 M di 1,4 benzochinone preparato di fresco. Si lascia in recipiente protetto dalla luce, a temperatura ambiente, sotto agitazione per 20 ore. Quindi il solido colorato in marrone scuro ottenuto viene lavato, fatto reagire con la tripsina e poi rilavato esattamente come descritto nell'esempio precedente. Alla fine si ottiene un sefarosio 4B contenente tripsina che esplica una attività esterasica di 26 unità per mi di supporto.
Questo composto dopo tre mesi di conservazione nelle stesse condizioni dell'esempio 1 esplica ancora il 95 % dell'attività esterasica iniziale.
Anche in questo caso un campione di supporto non trattato col chinone, ma trattato con la stessa quantità di enzima e successivamente lavata, non esplica alcuna attività enzimatica.
Esempio 3
Immobilizzazione della tripsina su sefarosio 4B con 1,4 benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B, lavato come descritto nell'esempio 1, viene sospeso in 25 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH = 10 ed addizionato di 10 mi di una soluzione acquosa fresca 0,1 M di 1,4 benzochinone.
Si lascia in agitazione per una notte a temperatura ambiente in recipiente protetto dalla luce. Il solido attivato viene quindi trasferito in colonna (0,9 X15 cm) e lavato con 200 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH 7,4; viene quindi fatto reagire con l'enzima e lavato seguendo esattamente le modalità descritte nell'esempio 1. Alla fine si ottiene un prodotto solido che esplica una attività esterasica di 65 unità per mi.
Esempio 4
immobilizzazione della tripsina su p-ammino benzilcellulosa con 1,4 benzochinone
2 grammi di para-ammino benzilcellulosa (0,11 meg/g) (British Drug-Houses Ltd. - Laboratory Chemicals Division) vengono sospesi in acqua, introdotti in colonna (0,9 X15 cm) e sottoposti a tre cicli di lavaggio, ognuno dei quali consta di 50 mi di HCl 0,1 N in acqua, 20 mi H20, 50 mi di NaOH 0,1 N in acqua e 20 mi H20. Infine vengono lavati con 200 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH 7,4 e divisi in due parti uguali.
Una parte viene sospesa in 25 mi di questo tampone, addizionata di 4 mi di una soluzione acquosa, 0,1 M di 1,4--benzochinone preparata di fresco, e lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente per due giorni. Quindi il solido, colorato in marrone che così si ottiene, viene lavato in colonna (0,9 X15 cm) con 150 mi dello stesso tampone. Viene poi sospeso in 25 mi di questo tampone freddo ed addizionato di 5 mi di una soluzione acquosa fredda di tripsina (10 mg/ml). Il tutto viene mantenuto in agitazione a 4°C per due giorni. Infine il solido viene rilavato in colonna (0,9 X15 cm) col tampone di reazione fino a quando le acque di lavaggio non contengono più proteina dosabile spettrofotometricamente a 280 nm. Il prodotto così preparato esplica una attività trip-tica esterasica di 55 unità per grammo.
L'altra parte di p-amminobenzilcellulosa lavata, non trattata col chinone, ma trattata con l'enzima e successivamente lavata, usando le stesse condizioni sopra descritte non esplica attività enzimatica.
Esempio 5
Immobilizzazione della Penicillina-acilasi su sefarosio 4B con 1,4 benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B, lavato come descritto nell'esempio 1, poi con 100 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH 8,0 viene sospeso in 16 mi di questo tampone ed addizionato di 5 mi di soluzione acquosa 0,1 M di 1,4 benzochinone preparata di fresco. Si lascia sotto agitazione a temperatura ambiente per 13 ore in recipiente protetto dalla luce.
Il solido scuro che così si ottiene viene lavato in colonna (0,9 X15 cm) con 100 mi di tampone sopra descritto, infine sospeso in 6 mi di soluzione tampone ed addizionato di 25 mi di una soluzione di penicillin-acilasi da Escherichia Coli ATCC 9637 nello stesso tampone (l'enzima è stato preparato secondo Marconi ed altri — Journal of Antibiotics Voi. 26 — pag. 228, 1973). Si lascia per 4 ore sotto agitazione a temperatura ambiente, poi il tutto viene trasferito in colonna (0,9X15 cm) ed il solido viene lavato alternando aliquote da 15 mi di tampone fosfato 0,05 M ed 1 M a pH 8,0. Il volume totale usato per i lavaggi è di 150 mi, di cui solo i primi 50 mi contengono proteina dosabile spettrofotometricamente a 280 nm. Si ottiene così un solido scuro contenente enzima che esplica una attività di 125 unità per mi.
125 mi di soluzione enzimatica messi a reagire col solido contenevano 1400 unità di enzima ad attività specifica di 21,1 unità per mg, mentre le acque madri della miscela di reazione e le acque di lavaggio del solito riunite contengono 905 unità enzimatiche.
In pratica tutto l'enzima messo a reagire viene recuperato; inoltre l'enzima immobilizzato mostra la stessa attività di quando è in soluzione.
Un campione di sefarosio 4B, non trattato col chinone, ma trattato con l'enzima e lavato seguendo le stesse modalità sopra descritte non mostra alcuna attività enzimatica, dimostrando che nelle condizioni adottate non si ha adsorbimento di enzima sul supporto.
(L'attività enzimatica è stata determinata a 37°C usando Penicillina G come substrato a pH 8,0 secondo il metodo di Marconi ed altri, Journal of Antibiotics - Voi. 26, pag. 228, 1973). Una unità enzimatica è la quantità di enzima che idrolizza 1 limole di Penicillina G per minuto nelle condizioni del saggio. Usi ripetuti dell'enzima immobilizzato eseguiti nell'arco di 1 mese hanno mostrato perdite irrilevanti di attività.
Esempio 6
Immobilizzazione della Penicillina-Acilasi su sefarosio 4B con 1,4 benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B viene lavato ed attivato con 1,4 benzochinone seguendo esattamente le modalità dell'esempio precedente. Si fa poi reagire con 1580 unità di penicillina-acilasi da E. Coli ad attività specifica 2,7 unità per mg.
Il tempo di reazione è di 15 ore, mentre le altre modalità e i lavaggi sono gli stessi dell'esempio precedente.
Nelle acque di reazione e di lavaggio si recuperano 1300 unità enzimatiche, mentre il solido esplica una attività enzimatica di 67,5 unità per mi.
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Da notare che in questo caso il metodo dà risultati ugualmente soddisfacenti anche se si usa un enzima poco purificato. Anche in questo caso usi ripetuti dell'enzima immobilizzato eseguiti nell'arco di 1 mese hanno mostrato perdite irrilevanti di attività.
Esempio 7
Immobilizzazione della Penicillin-acilasi su sefarosio 4B-AH con 1,2 naftochinone
1 grammo di sefarosio 4B-AH, trattato e lavato con soluzione acquosa 0,5% di NaCl descritto nell'esempio 1, poi lavato con 100 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M a pH 8,0, infine sospeso in 25 mi di questo tampone ed addizionato di 25 mi di diossano contenente 0,5 millimoli di 1,2-nafto-chinone. Si lascia in agitazione a temperatura ambiente, in recipiente protetto dalla luce per 18 ore, quindi si filtra, si lava il solido con 50 mi di una soluzione ottenuta mescolando un volume di tampone fosfato 0,05 M a pH 8,0 con un volume di diossano. Infine il solido, introdotto in colonna (0,9 X15 cm) viene lavato con 100 mi di tampone. Il prodotto nero così ottenuto viene fatto reagire con la penicilli-na-acilasi (da Escherichia Coli ATCC 9637). La miscela di reazione contiene 4 mi di sefarosio 4B-AH attivato a 2030 unità enzimatiche ad attività specifica di 2,7 unità per mg in 30 mi di tampone fosfato 0,05 M a pH 8,0. Il tutto viene lasciato in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente e 48 ore a 4°C. Dopo si lava il solido con le stesse modalità dell'esempio 5 ed alla fine si ottiene un enzima immobilizzato che esplica una attività di 55 unità per mi di supporto, mentre le unità enzimatiche recuperate nelle acque madri e in quelle di lavaggio ammontano a 1815 unità totali. Anche in questo caso non si ha alcuna perdita di enzima ed inoltre quello immobilizzato esplica la stessa attività di quando è in soluzione.
Esempio 8
Immobilizzazione della Perossidasi su sefarosio 4B con 1,4-benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B viene attivato con 0,5 millimoli di 1,4-benzochinone a pH 8,0 usando le stesse modalità dell'esempio 5, infine trattato con perossidasi (prodotto grado I della Ditta Boehringer Mannheim GmbH, 6800 Mannheim 31 - Germania Federale). La miscela di reazione contiene 4 mi di sefarosio 4B attivato, 100 mg di enzima e tampone fosfato 0,05 M a pH 6,0; il volume totale è di 30 mi. Si lascia in agitazione a 4°C per 24 ore, poi si lava alternando porzioni da 15 mi di tampone fosfato 0,05 M e 0,5 M a pH 6,0 per un volume totale di 150 mi ed infine si saggia l'attività del solido. Essa è di 488 unità per mi di supporto.
L'attività perossidasica è stata determinata con ABTS (acido 2,2'-azino-di(3 etilbenzotiazolina)-6' solfonico) (Boehringer Mannheim GmbH) ed acqua ossigenata a 25°C e pH 7,0 secondo il metodo consigliato dalla Ditta fornitrice dell'enzima.
Una unità enzimatica è la quantità di enzima che trasforma 1 limole di substrato per minuto.
Esempio 9
Immobilizzazione di anticorpo anti Ts con 1,4-benzochinone su sefarosio 4B
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B viene attivato con 0,5 millimoli di 1,4-benzochinone come descritto nell'esempio 5, quindi messo a reagire con antisiero anti-Ta(3,3',5 tri-iodiotironina) da coniglio. La miscela di reazione contiene 4 mi di sefarosio 4B attivata, 20 mi di antisiero, tampone fosfato potassico 0,2 M, KCl 0,1 M a pH 7,4. Il volume totale è di 30 mi. Il tutto viene tenuto sotto blanda agitazione per una notte a 4°C, infine si filtra il solido e lo si lava con 200 mi di tampone 0,02 M in fosfato potassico e 0,05 M in trisidrossimetilamminometano cloridrato (Tris-HCl) a pH 7,4 e conservato per 24 ore a 4°C in questo tampone.
Parallelamente si eseguono le stesse operazioni su di un bianco di controllo, a cui viene omesso soltanto il trattamento con l'antisiero. Sui due supporti solidi così preparati si eseguono i saggi di presa dell'ormone 1^:
0,6 mi di supporto (pari a circa 20 mg di prodotto secco) vengono equilibrati con 35 nanogrammi di Ta marcato con 123I in 1,5 mi totali, contenenti tampone fosfato 0,2 M e KCl 0,1 M a pH 7,4, per 1 ora a 37°C ed una notte a 4°C. Si separa per centrifugazione il liquido dal solido e si misura la radioattività presa dal solido.
Il solido trattato con l'antisiero prende il 58% della radioattività totale messa ad equilibrare, mentre il bianco prende solol'11%.
Esempio 10
Immobilizzazione dell'inibitore della tripsina da semi di soia su sefarosio 4B con 1,4-benzochinone
Un campione di 4 mi di sefarosio 4B vengono lavati ed attivati con 0,5 millimoli di 1,4-benzochinone come descritto nell'esempio 5; quindi messi a reagire per 10 ore con 25 mi di tampone fosfato sodico 0,02 M a pH 8,0 contenente 60 mg di inibitore della tripsina da semi di soia (Boehringer Mannheim GmbH). Si lava il supporto con tampone 0,1 M KCl e 0,02 M fosfato sodico a pH 8,0 fino a quando le acque di lavaggio non contengono più proteina. Le acque madri e le acque di lavaggio riunite ed analizzate contengono 46 mg di proteina residua. Il supporto viene poi lavato con 200 mi di tampone a pH 8,0 contenente Tris-HCl 0,05 M, KCl 0,1 e Ca Cl2 0,02 M e lasciato per 24 ore a 4°C in questo tampone.
I 4 mi di composto così preparati hanno la capacità (determinata col metodo di L. J. Loeffler e J. V. Pierce - Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 317, pag. 20, 1973) di legare 13,2 mg di tripsina cristallina con una efficienza del 63 % rispetto all'inibitore non immobilizzato.
Esempio 11
Stabilizzazione della tripsina con 1,4-benzochinone
50 mg di tripsina cristallina (British Drag Houses) vengono sciolti in 50 mi di tampone fosfato sodico 0,05 M pH 7,3 ed addizionati di 0,2 mi di una soluzione acquosa 0,1 M di 1,4-benzochinone. Si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 2 ore e poi per 20 ore a 4°C. Infine si dializza a freddo la miscela di reazione contro acqua portata a pH 3,0 con acido cloridrico diluito. Tutte queste operazioni vengono condotte parallelamente anche su un bianco di controllo, a cui viene omessa l'aggiunta del chinone. Sia la soluzione reagita che la soluzione bianca dopo la dialisi vengono conservate a 4°C e su di esse sì saggia la stabilità alla conservazione. Dopo 5 e 11 giorni si determina l'attività enzimatica della tripsina trattata con chinone e di quella non trattata. La tripsina trattata mostra il 100% ed il 97% dell'attività iniziale mentre la tripsina non trattata l'84% ed il 74% rispettivamente.
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Claims (4)
1. Procedimento per l'immobilizzazione di proteine su un supporto solido, caratterizzato dal fatto che il supporto viene fatto reagire con un chinone per attivarlo, e che la reazione successiva tra supporto attivato e proteine avviene a temperature comprese fra 0°C e la temperatura di inizio della denaturazione delle proteine.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la seconda reazione avviene a temperatura scelta preferibilmente fra 0°C e 25°C.
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RIVENDICAZIONE
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la seconda reazione è realizzata ad un pH variabile da 3 a 11.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il supporto contiene gruppi reattivi scelti fra gli ossidrilici, amminici, solfidrilici, immidazolici, pirro-lici, fenolici, solfonici e guanidinici.
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