DK148981B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzympraeparat - Google Patents

Description

i 148981

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat ved optagelse af ét eller flere enzymer i en stivelsegel.

5 Det er kendt at kombinere enzymer med en bærer, hvilken bærer er uopløselig i det medium, hvori enzymet skal benyttes. Formålet med immobiliseringen af enzymer er at opnå et enzymprodukt, der let kan skilles fra reaktionsmediet, og som kan benyttes igen som 10 biokemisk katalysator. Der kendes adskillige kemiske såvel som fysiske metoder til at- fæstne et enzym til en uopløselig bærer. F.eks. kan enzymet bindes til en bærer ved hjælp af kovalente kemiske bindinger. I dette tilfælde indeholder bæreren aktive grupper, der kan 15 indføres separat, hvilke aktive grupper reagerer med en eller flere aktive grupper hos enzymet. Aktiverede polysaccharider, syntetiske polymere og aktiverede uorganiske bærere er blevet foreslået som aktive bærematerialer. Det er også kendt, at et enzym kan kobles 20 med en bærer ved hjælp af et bifunktionelt tværbindingsmiddel. F.eks. er glutaraldehyd kendt som tværbindingsmiddel. Som fysiske metoder til at fiksere et enzym til en bærer kan nævnes: fiksering til en ionbytterharpiks, indkapsling i mikrokapsler, fangning i fibre af synte-25 tiske polymere og okklusion i naturlige eller syntetiske geler.

Når de immobiliserede enzymer skal benyttes til fremstilling af et spiseligt produkt,er de metoder til immobilisering,ved hvilke der benyttes et kemisk 30 tværbindingsmiddel og/eller syntetiske polymere,sædvanligvis ikke særlig ønskelige, fordi de kemiske tværbindingsmidler såvel som de kemikalier, der benyttes til fremstillingen af de syntetiske polymere, ikke altid er fuldstændig uskadelige. Ifølge foreliggende opfin-35 delse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat, hvis bestanddele er uskadelige for mennesker og dyr.

Det er blevet foreslået at immobilisere et enzym 2 148981 ved at indeslutte det i en stivelsegel. Dette forslag er blevet beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.223.593.

Til dette formål fremstilles en klar tyktflydende sol ved opvarmning af 3,25 g af en særlig stivelse (Con-5 naught stivelse) og 25 ml destilleret vand. Den afkølede sol blandes med en opløsning af hesteserumcholin-esterase, hvorefter blandingen får lov at gelere. Ifølge én publikation i Anal. Chem. 37 (1965), side 1378-1381 har gelen kun ringe mekanisk styrke, og det fore-10 slås derfor i den pågældende artikel at optage gelen i en pude af polyurethanskum med åbne porer. Også fikseringen af enzymet til gelen lader meget tilbage at ønske, fordi ca. 15% af enzymet let udvaskes.

Ifølge USA-patentskrift nr. 4.106.987 immobili-15 seres glucoseisomerase fikseret til mikrobielle celler i et naturligt vanduopløseligt geldannende stof. Som et af de anvendelige geldannende stoffer nævnes stivelse.

Det har overraskende vist sig, at også cellefri enzymer kan immobiliseres udmærket i en stivelsegel.

20 Et formål med foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et immo-biliseret enzympræparat bestående af formede strukturer af en tørret stivelsegel, hvori ét eller flere cellefri enzymer er okkluderet.

25 Det immobiliserede enzympræparat, der fremstilles ved den omhandlede fremgangsmåde, er i partikelform. Produktet har en overraskende god mekanisk styrke. Enzymindholdet kan indstilles på en vilkårlig ønsket værdi, forudsat at stivelsegelen kan tilbageholde enzy-30 met. I almindelighed er den mængde enzym, der kan optages og tilbageholdes i stivelsegelen, højst 15% beregnet af stivelsens vægt.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzym, hvor ét eller flere en-35 zymer optages i en stivelsegel. Fremgangsmåden er karakteristisk ved, at man blander en i det højeste delvis geleret stivelsesol med et stivelseindhold på 20-60 vægt% med enzymet, lader blandingen gelere, og ekstrude 148981 3 rer blandingen i form af strenge, tørrer strengene og op-deler de tørrede strenge i stykker og, om ønsket, renser det opnåede enzympræparat ved, at man ekstraherer de formede strukturer med vand eller en saltopløsning.

5 I praksis fremstilles der først en stivelsesol ved at ælte stivelsen med vand ved høj temperatur. Solen afkøles derpå til en temperatur,"ved hvilken enzymet eller enzymerne, der skal tilsættes, ikke nedbrydes, hvorefter solen, der kan være i det højeste delvis gele-10 ret, straks blandes med enzymet. Derpå lader man den opnåede blanding gelere. Det er ønskeligt, at blandingen med enzymet udføres ved den højest mulige temperatur for at forhindre en tidlig gelering af blandingen.

Den gelerede enzymholdige blanding formes 15 derpå ved at ekstrudere blandingen til strenge, tørre strengene og derpå opdele strengene i stykker. På denne måde fremstilles et partikelformet produkt med stor mekanisk styrke. Denne egenskab bibeholdes, når produktet bringes i berøring med en vandig væske.

20 Tørringen kan udføres i luften under formindsket tryk, ved høj temperatur men ikke så høj, at der sker deaktivering af enzymet. I almindelighed 25 kan tørringen udføres sikkert ved temperaturer under 30°C.

Selvom en vilkårlig naturlig stivelse såsom majsstivelse, hvedestivelse, rugstivelse, tapioca-stivelse, cassavastivelse, risstivelse, kartoffelsti-30 velse eller boghvedestivelse eller stivelser fra Legu-minosae kan benyttes som stivelse ved den omhandlede fremgangsmåde, kan der også benyttes stivelsesfraktioner udvundet af nævnte stivelser, såsom amylopectin (den forgrenede stivelsefraktion). Det er også muligt at benytte sti-35 velsederivater, der tillader fremstilling af en sol med et indhold på 20-60 vægt%, hvilken sol ikke gelerer fuldstændigt i løbet af kort tid ved den maksimale temperatur, ved hvilken den kan blandes med enzymet (enzymets 148981 4 dekomponeringstemperatur). Stivelsen er fortrinsvis kartoffelstivelse, amylopectin opnået fra kartoffelsesstivelse eller majsstivelse.

Opfindelsen kan benyttes til immobilisering af 5 mange forskellige enzymer såsom lactase, invertase, catalase, glucoseoxidase, phosphoglucoseoxidase, aminoacy-lase, orthophosphorsyremonoester-phosphohydrolase og lignende. Der er opnået særdeles gode resultater med lactase ^ inyertase, catalase, glucoseoxidase og en kombination 10 af catalase og glucoseoxidase.

Det har endvidere overraskende vist sig, at det i en stivelsegel okkluderede enzym, der opnås ifølge opfindelsen, meget let kan renses ved at ekstrahere det immobiliserede enzym med vand eller en saltopløsning, 15 f. eks. en pufferopløsning.

Til dette formål kan granulaterne af det immobiliserede enzym suspenderes i ekstraktionsvæsken, og suspensionen omrøres forsigtigt. Derpå kan det immobiliserede enzym suges af, og om nødvendigt kan dette genta-20 ges flere gange. Som ekstraktionsvæske er en 0,02 M ka-liumphosphatpuffer med pH 7,0 særlig egnet. Det viste sig, at man ved anvendelse af denne ekstraktionsmetode kunne fjerne en stor del, i tilfælde af lactase så meget som 75%, af det oprindelige nitrogenindhold i det 25 immobiliserede enzym uden nedsættelse af enzymets aktivitet. Dette var tilfældet med et i handelen tilgængeligt enzympræparat fremstillet ud fra Saccharomyces lac-tis.

Denne mulighed for rensning af enzympræparatet 30 på simpel måde er overordentlig vigtig, fordi der ifølge opfindelsen som udgangsmaterialer kan benyttes ret urene enzymer, der er langt billigere end rensede enzymer.

De immobiliserede enzympræparater, der fremstilles ifølge opfindelsen er overordentlig velegnede til 35 udførelse af enzymatiske reaktioner.

En vigtig anvendelse af et af de immobiliserede 148981 5 enzymer, nemlig immobiliseret lactase, er behandling af mælk med normalt eller nedsat fedtindhold eller af valle for omdannelse af den deri indeholdte lactose til en blanding af glucose og galactose. Især når der 5 er tale om produkter, der skal indtages af mennesker eller dyr, er det uønsket at tilsætte enzymet i opløselig form, da enzymet i dette tilfælde forbliver i produktet. Som ovenfor anført kræves der kemiske, i almindelighed giftige, hjælpestoffer, nemlig bifunktio-10 nelle reagenser såsom dialdehyder, carbodiimid, epoxi-der og lignende,til enzymimmobilisering (US-patentskrift nr. 3.838.007). I tilfælde af enzympræparater, der er fysisk eller kemisk okkluderet i geler, f.eks. polyacryl-amidgel (Biotechnical and Bio-Engineering 15, 395-402 15 (1973)),ved polymerisation in situ,vil på den anden side gelerne være forurenet af rester af de kemiske katalysatorer, der kræves til polymerisationen, såsom radikal-initiatorer og andre lavmolekulære og også giftige reaktionsacceleratorer. De immobiliserede lactaseprodukter 20 opnået ifølge foreliggende fremgangsmåde har ikke sådanne ulemper, idet produkterne alene er fremstillet ud fra uskadelige produkter.

En anden fordel ved den immobiliserede lactase, der fremstilles ifølge foreliggende opfindelse, er, at 25 lactasens effektivitet næsten ikke aftager ved, at den anvendes. Ikke alene er enzymet meget stærkt fikseret til stivelsen, men hydrolysen af lactosen kan også udføres på en sådan måde, at det immobiliserede enzym ikke svækkes ved tilstopning af porerne ved afsætning af mæLkepro-30 teiner og andre mælkebestanddele på bærepartikleme. Denne ulempe optræder ved de kendte innbbiliserede enzymer (Chemical Vfeek, November 14, 1977, side 37-38). Det har vist sig, at partiklerne kan tåle afskrabning uden at ødelægges. På denne måde kan partiklernes overflade renses og en ekstra 35 diffusionsmodstand, muligvis forårsaget af forurening, undgås. En sådan meget langsom afskrabningsproces kan udføres ved at omrøre indholdet af en reaktor, der inde-- holder blandingen af enzymkatalysatorpartikler og sub- 6 1Λ8981 strat (f.eks. lactoseholdig væske), eller ved at holde enzymkatalysatorpartiklerne i fluidiseret tilstand ved hjælp af en opadgående væskestrøm. Ved kontrol af den energi, der indføres ved omrøring eller fluidisering, 5 kan man let opnå den ønskede afskrabningsgrad og effektivt undgå afsætningen af mælkeprodukter eller andre forurenende aflejringer.

Invertase eller β-fructosidase er et enzym, der kan dannes af visse stammer af Saccharomyces cerevisiae.

10 Enzymet kan benyttes til fremstilling af fructose ud fra saccharose og/eller maltose. Det har vist sig, at invertase i den irnmobiliserede form fremstillet ifølge opfindelsen også fikseres meget stærkt til stivelsegelen. Invertaseakti-viteten reduceres ikke efter lagring i en puffer ved pH 15 5,2 i køleskab i 40 dage. Det irnmobiliserede enzym kan også benyttes til saccharoseinversion ved højere temperatur, f.eks. 40°C, uden at aktiviteten påvirkes. Ved denne højere temperatur forløber inversionsreaktionen betydeligt hurtigere. Når der er benyttet et urent en-20 zym i immobiliseret enzym,er det muligt at udvaske en betydelig mængde urenheder uden at formindske inverta-seaktiviteten.

Catalase kan isoleres fra kolever og kan benyttes til fjernelse af hydrogenperoxider, der er anvendt som des-25 infektionsmiddel. Hydrogenperoxid til desinfektionsformål kan fremstilles under anvendelse af en immobiliseret glucoseoxidase fremstillet ifølge opfindelsen, hvorefter den tilbageværende mængde hydrogenperoxid kan fjernes med catalase immobiliseret ifølge opfindelsen. Catalase så-30 vel som glucoseoxidase er fikseret meget stærkt til stivelsegelen.

En meget vigtig anvendelse af de fremstillede enzympræparater er fjernelse af oxygen fra glucoseholdige væsker, såsom øl og andre drikke. Tilstedeværelsen af 35 oxygen i øl er uønsket, da det kan bevirke en uheldig ændring af smagen. Til fjernelse af oxygen fra glucoseholdige drikke kan man med godt resultat benytte et catalase- og glucoseoxidaseholdigt immobiliseret enzym 148981 7 fremstillet ifølge opfindelsen. Det er også muligt at fremstille gluconsyre ud fra glucose med en katalysator indeholdende de nævnte enzymer ved at indføre oxygen.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af følgende 5 eksempler:

Eksempel 1 80 g lufttør nativ kartoffelstivelse (fugtigheds-indhold 17 vægt-%) og 100 g af en 0,02 M kaliumphosphat-10 puffer med pH 7,0 indføres i den dobbeltvæggede beholder i en Werner Pfleiderer laboratorieælter af rustfrit stål med Σ-formede ælteorganer. Indholdet i ælteren opvarmes under stadig æltning til 96°C ved opvarmning med kogende vand ved hjælp af dobbeltvæggen. Æltningen fortsættes 15 ved denne temperatur i 1 time. Derpå afkøles blandingen i løbet af ca. 30 minutter til 27°C, hvorpå der tilsættes en opløsning af 3,5 g lactasepræparat opnået ud fra Sac-charomyces lactis i 16,5 g af en 0,02 M kaliumphosphat-puffer med pH 7,0. Hele blandingen æltes ved stuetempe-20 ratur i 1 time, og derpå overføres ælterens indhold til en glasbeholder, der lukkes og opbevares i ca. 16 timer ved en temperatur på 4°C.

Næste dag fremstilles der ved 20°C strenge ved hjælp af en ekstruder af rustfrit stål forsynet med en 25 plade med huller med en diameter på 1,0 mm. Derpå tørres de ekstruderede strenge i 6 timer ved 25-28°C i en tørreovn med luftcirkulation til opnåelse af et fugtighedsindhold på ca. 13 vægt-%. Malning i kort tid i f.eks. en kuglemølle og sigtning giver granulater bestående af cy-30 lindriske partikler med en diameter på 0,9 mm og en længde på 0,4 til 1,2 mm. Granulaterne har en lysebrun farve og en muggen lugt.

Eksempel 2 35 Som beskrevet i eksempel 1 æltes en blanding af 110 g lufttørret amylopeetin (fugtighedsindhold ca. 11 vægt-%) og 110 g af en 0,02 M kaliumphosphatpuffer med pH 7,0 i 60 minutter ved 85-90°C. Efter afkøling til 148981 8 30°C tilsættes en opløsning af 5,0 g lufttørt lactase-præparat opnået ud fra Saccharomyces lactis (fugtigheds-indhold ca. 11 vægt-%) i 25,0 g af en 0,02 M phosphat-puffer (pH = 7,0). Blandingen æltes derpå i 1 time ved 5 25°C og henstilles derpå i 16 timer ved 4°C.

Ekstrudering, tørring, malning og sigtning ifølge eksempel 1 resulterer i lignende granulater som opnået ifølge eksempel 1.

10 Eksempel 3

Som beskrevet i eksempel 1 æltes en blanding af 97 g lufttør kartoffelstivelse (fugtighedsindhold 17,2 vægt-%) og 78 g af en 0,02 M kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) under opvarmning. Efter at en temperatur på 96°C 15 er opnået,fortsættes æltningen i 1 time ved 96°C. Derpå køles til 28°C i løbet af ca. 30 minutter, hvorpå der til beholderindholdet sættes en opløsning af 4,0 g lufttør lactase fra Saccharomyces lactis (fugtighedsindhold ca. 8,5 vægt-%) i 25,0 g af en 0,02 M kaliumphosphatpuf-20 fer, pH 7,0. Derpå æltes blandingen i løbet af 1 time ved 28-22°C og opbevares derpå i en lukket glasbeholder i 16 timer ved 4°C.

Ekstrudering, tørring, malning og sigtning ifølge eksempel 1 resulterer i lignende granulater som opnået 25 ifølge eksempel 1.

Eksempel 4

Rensning af enzymkatalysatoren ifølge eksempel 2.

I en lukket reaktionsbeholder af glas, forsynet 30 med omrører, omrøres 100 g af de ifølge eksempel 2 opnåede enzymgranulater og 800 g 0,02 M kaliumphosphatpuffer i dobbeltdestilleret vand med en pH-værdi på 7,0 ved forsigtig omrøring i 7 timer. Derpå standses omrøringen, og den ovenover stående væske frasuges, hvorefter den 35 beskrevne behandling gentages to gange med friske portioner af 800 g vaskevæske. De således opnåede granulater, mættet med pufret vand, er direkte egnede til hydroly-tisk spaltning af lactose i vandige systemer. Dette ma- 9 148981 teriale er såvel i kvældet som i tør tilstand et farveløst lugtløst produkt uden smag.

Det viste sig, at produktet i nævnte tørre til-5 stand (fugtighedsindhold ca. 11-13%) var uændret i mindst 3 måneder, når det blev opbevaret ved en temperatur på ca. 4°C. Under opbevaringsperioden forbliver den specifikke aktivitet identisk med begyndelsesværdien for det friskt fremstillede præparat.

10

Eksempel 5

Hydrolyse af lactose under anvendelse af det for-vaskede kvældede enzymkatalysatorgranulat ifølge eksempel 4.

Substrat: en opløsning af kemisk rent lactosemonohydrat 15 i 0,02 M kaliumphosphatpuffer i dobbeltdestil- leret vand med pH 7,0, der også indeholder 2,0 mM magnesiumsulfat pr. liter. Denne opløsning indeholder pr. 100 ml 5,28 g lactose, beregnet •som vandfrit produkt.

20 I en glasreaktor med omrøring indføres: 1800 g af substratvæsken 300 g af det kvældede katalysatorgranulat (indeholdende kun 100 g lufttørt katalysatormateriale, hvori der er optaget 25 5,0 g lufttørt enzympræparat).

Lactosekoncentrationen synker til 4,75 g vandfri lactose pr. 100 ml ved tilsætning af katalysatoren. Under fortsat, men moderat hurtig omrøring følges nedgangen i lac-toseindholdet i tidens 10b ved 25°C ved hjælp af en au-30 tomatisk oxydimetrisk analyse.

En række resultater iagttaget i løbet af en reaktionsperiode på 60 minutter er opført i tabel A.

35 148981 10

Tabel A

Hydrolyse af lactose i vand under indvirkning af β-galac-tosidase (lactase) i en amylopectingel.

5 Forløbet tid Omdannet lactose i % af den oprin- i minutter_delige lactosemængde_ 0 0 10 23 30 58 60 82 10 ----—--

Efter hydrolyse i 1 time blev der opnået et lactoseind-hold, der var tilstrækkeligt lavt for anvendelse i mejeriindustrien. Katalysatormassen blev fjernet fra væskesubstratet ved filtrering, katalysatoren blev vasket to 15 gange med portioner på 100 ml dobbeltdestilleret vand, pufret med kaliumphosphat ved pH = 7,0, og efter fra-sugning af det sidste vaskevand blev det immobiliserede enzym atter blandet med 1800 g frisk lactoseopløsning.

Denne fremgangsmåde blev gentaget tyve gange, og 20 det viste sig, at de i tabel A viste hydrolyseresultater forblev praktisk talt uændrede, selv efter den tyvende gentagelse.

Efter den tyvende gentagelse blev katalysatoren vasket og tørret, indtil der var opnået konstant vægt.

25 Der var et vægttab på 6% i forhold til katalysatorens begyndelsesvægt som følge af mekanisk "afskrabning" eller "opløsning".

Eksempel 6 30 Som beskrevet i eksempel 5 udførtes hydrolyseprø ver under anvendelse af enzymgranulat opnået som beskrevet i eksempel 1. 2,0 g lufttørt enzymgranulat ifølge eksempel 1 pr. 40,0 g 4,75% vandig lactoseopløsning med pH = 7,0 og en temperatur på 25,0°C blev benyttet.

35 Efter hvert forsøg blev katalysatormassen frafil treret, katalysatoren blev vasket på samme måde som i eksempel 5 og derpå genanvendt ved næste forsøg. Resultaterne er opført i tabel B.

148981 11

Tabel B

Forsøg nr. _Hydrolysegrad_ S Omdannet lactose % Omdannet lactose _efter 10 minutter_efter 30 minutter 5 1 20 48 2 - 57 3 25 60 4 29 60 5 29 59 10 6 7 58 8 26 58 9 27 58 10 26,5 58 15 Efter det tiende forsøg blev enzymgranulatet fra skilt og igen bragt i berøring med 40,0 g af den 4,75% lactoseopløsning. Man lod det hele henstå 12 gange 24 timer. Efter denne periode viste det sig, at enzymgranulatets virkning svarende til den for forsøg nr. 10 an-2 η givne værdi.

Eksempel 7

Der blev udført hydrolyseprøver som beskrevet i eksempel 5 under anvendelse af enzymgranulatet ifølge 25 eksempel 3. 4,0 g lufttørt enzymgranulat ifølge eksempel 3 blev suspenderet i 80,0 g af en 4,75%'s opløsning af lactose i 0,02 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, under moderat hurtig omrøring.

Efter en berøringstid på 10, 30 og 60 minutter 30 ved en temperatur på 25°C blev mængden af omdannet lactose bestemt ved hjælp af en oxydimetrisk automatisk analyse. Reaktions- eller hydrolysegraden blev udtrykt som % omdannet lactose. Efter en berøringstid på 1 time blev substratvæsken skilt fra enzymgranulatet ved dekantering.

35 Enzymgranulatet blev vasket to gange i ca. 15 mi nutter med portioner på 70 g 0,02 M kaliumphosphatpuffer med pH 7,0 og derpå igen suspenderet i en frisk lactoseopløsning. Derpå udførtes atter de samme målinger.

148981 12

Der blev. i fem på hinanden følgende dage udført 4 måle-serier pr. dag. Resultaterne er opført i tabel C.

Tabel. C

Hydrolyse af lactose i vand under indvirkning af lactase 5 i en kartoffelstivelsegel.

Reaktionstid Qtdannelsesgrad i % af den oprindeligt tilstedevæ- i minutter rende lactose efter den nte gentagelse._ n=0 n=3 n=6 n=10 n=15 n=19 io 10 18,0 28,5 31,0 30,0 26,0- 25,5 30 - 61,0 64,0 62,0 57,0 57,0 60 74,0 83,0 86,0 82,0 82,0 83,0

Efter den tyvende måling blev katalysatoren vasket med pufferen, indtil der var opnået konstant vægt, 15 og det blev ved vejning fundet, at ca. 4,21 af den oprindelige granulatvægt var gået tabt ved "afskrabning".

Eksempel 8

Hydrolyse af lactose i steriliseret skummetmælk ved 25°C.

20 Substrat: "Lilac" milk (Belgien) steriliseret ved høj temperaturj lactoseindhold: 4,8 g pr. 100 ml. Forsøgsudstyr, fremgangsmåde og analyse var identisk med det i eksempel 5 beskrevne. I dette eksempel udførtes en serie gentagne målinger med det samme udgangs-enzympræ-25 parat. Der blev udført i alt 20 hydrolyser. Resultaterne er opført i tabel D.

Tabel D

Hydrolyse af lactose i skummetmælk ved 25°C under ind-30 virkning af β-galactosidase okkluderet i en amylopectingel._

Reaktionstid Qtdannelsesgrad i % af den oprindeligt tilstedevæ-i minutter rende lactose efter den ri*·6 gentagelse._ _n=0 n=l n=4 n=8 n=12 n=20_ 35 0 00000 0 10 16,3 15,6 16,1 14,8 14,9 12,1 30 42,5 42,0 43,0 40,0 42,0 37,0 60 58,0 56,0 56,8 56,0 53,0 49,0 120 78,0 76,0 75,7 72,0 71,2 64,0 148981 13

Eksempel 9

Fremstilling af immobiliseret invertase.

En blanding af 40,0 g lufttørt amylopectin (fugtig-hedsindhold ca. 13 vægt-%) og ca. 50 ml 0,02 M kalium-5 phosphatpuffer (pH 5,2) blev på den i eksempel 1 beskrevne måde æltet i 1 time ved 90°C og derpå afkølet til ca.

40°C. Derpå blev tilsat en opløsning af 0,8 g invertase i ca. 9 ml vand. Blandingen blev derpå under stadig afkøling til 25°C æltet i 1 time og yderligere opbevaret 10 i køleskab (ca. 5°C) i 16 timer.

Blandingen blev ekstruderet som beskrevet i eksempel 1 blot med den forskel, at der blev benyttet en plade med huller med en diameter på 0,5 ram. Det ekstruderede produkt blev tørret i en ovn med luftcirkulation 15 og derpå malet og sigtet til opnåelse af en fraktion med den ønskede partikelstørrelse på ca. 0,3 -0,6 mm.

Eksempel 10

Invertaseaktiviteten af den immobiliserede invertase fremstillet ifølge eksempel 9 blev målt som angivet 20 i eksempel 5. Den dannede mængde glucose og fruktose blev målt ved hjælp af automatisk oxydimetrisk analyse. Målingerne blev gentaget flere gange. Mellem målingerne blev enzympræparatet opbevaret ved 5°C i 0,02 M kalium-phosphatpuffer, pH 5,2. Der blev udført en række prøver 25 ved 25°C og ved 40°C. Resultaterne er opført i tabel E.

148481 14

Tabel E

Inversion af saccharose Enzympræparat: ifølge eksempel 9.

Substrat: 5,4 vægt% saccharose i 0,02 M phosphatpuffer, 5 pH 5,2.

Vægtforhold enzympræparat: substrat = 1:80.

Opbevarings- Omdannelsesgrad for saccharose i % af periode før oprindeligt tilstedeværende saccharose

10 m^in^ reaktion ved 25WC reaktion ved 40°C

efter efter efter efter ___10 min. 30 min. 10 min. 20 min.

1/4 27,0 62,0 45,0 75,0 1/2 30,0 62,0 50,0 80,0 2/3 28,0 - 50,0 75,0 15 1 26,0 59,0 47,0 72,0 2 25,5 60,0 40 28,0 61,0

Det fremgår af disse prøver, at den immobilise-20 rede invertase bevarer sin aktivitet selv efter langvarig brug og også kan benyttes ved en højere temperatur (40°C).

. Eksempel 11 A. Fremstilling af immobiliseret katalase.

25 I en Wemer-Pfleiderer ælter, laboratoriemodel, indførtes: 80 g lufttørret amylopectin 90 g 0,05 M kaliumphosphatpuffer med pH 5,6 og der blev æltet i 1 time ved 90°C.

30 Efter afkøling til 20°C blev der til den homo gene masse sat: 30 g af en opløsning opnået ved at opløse eller dispergere 2,5 g katalase (Sigma C^q med en aktivitet på 3400 Sigma-enheder) i 27,5 g 0,05 M 35 kaliumphosphatpuffer med pH 5,6.

Æltningen blev derpå fortsat i 1 time. Derefter blev præparatet opbevaret i en lukket beholder i 16 ti- 15 148*01 mer ved 5°C, og det blev derpå, efter ekstrudering til dannelse af strenge med en diameter på 0,5 mm, tørret og malet til dannelse af granulat bestående af cylindriske partikler med en diameter på 0,45 mm og en læng-5 de på 0,3 til 0,6 mm. Det lufttørre produkt indeholdt ca. 100 enheder katalaseaktivitet pr. mg.

B. Bestemmelse af aktivitetstab ved vask.

Bestemmelse af enzymtab ved hjælp af elektrometrisk måling af oxygen frigjort ved reaktion af den benyttede 10 vaskevæske med 0,04% vandig hydrogenperoxidopløsning.

50 mg af det ifølge A opnåede enzymprodukt blev rystet i 15 minutter med 2,0 ml 0,7 M kaliumphosphat-puffer, pH 7,1. Efter dekantering blev den klare vaskevæske hældt fra, og dens katalaseaktivitet blev målt 15 ved at lade vaskevæsken reagere med en 0,04% hydrogenperoxidopløsning ved 25,0°C og måle produktionen af oxygen med en oxygenelektrode. Denne fremgangsmåde blev udført 15 gange altid under anvendelse af den samme prøve af 50 mg immobiliseret katalase. Efter 6 gange 20 vask viste der sig at være et totalt tab på 35,3 enheder aktivitet, dvs. kun 0,7% af den oprindeligt tilstedeværende katalaseaktivitet. Tabene efter den sjette vask var negligerbare.

Eksempel 12 25 A. Fremstilling af immobiliseret katalase/glucoseoxida-se.

I en Werner-Pfleiderer ælter, laboratoriemodel, indførtes: 79 g lufttør amylopectin 30 100 g 0,01 M phosphatpuffer, pH 5,6 og der blev æltet i 1 time ved 90°C.

Efter afkøling til 36°C blev der til den homogene masse sat: 21 g af en opløsning opnået ved at opløse eller 35 blande: 0,100 g glucoseoxidase (Boehringer Grade I; ak- 16 U89&1 tivitet 200 U/mg) og 1.00 g katalaseopløsning (Boehringer Nr.106836; 260.000 U/ml) 5 i (med) 20 g 0,01 M phosphatpuffer,pH = 5,6.

Blandingen blev under stadig afkøling æltet i 1 time under opnåelse af en sluttemperatur på 30°C. Den opnåede blanding blev opbevaret i 16 timer ved 6°C. Den opnåede gel blev derpå ekstruderet til dannelse af 10 strenge med en diameter på 0,5 mm, strengene blev tørret under anvendelse af en luftstrøm på 30°C og til slut malet til dannelse af korn med en længde på ca. 0,5 mm.

B. Vaskemetode: bestemmelse af tab af enzym ved måling 15 af vaskevandets aktivitet; homogen katalyse.

4.0 g af det lufttørre produkt (fugtighedsind-hold ca. 10 vægt%) fremstillet ifølge A og med et glu-coseoxidaseindhold på ca. 0,125 vægt% blev i forskellige tidsperioder rystet med portioner på 30 g af ca.

20 0,005 M phosphatpuffer, pH 5,6. Efter dekantering, to gange vask af.remanensen med portioner på 25 ml af en frisk pufferopløsning og forening af 11 vaskevæsker blev vaskevæskernes totale glucoseoxidaseaktivitet bestemt. Ved gentagelse af denne vaskemetode med det 25 samme materiale opnåedes de i tabel F opførte resultater.

Tabel F

Tab af enzym ved vask 30 Vask nr. Tid i timer Temperatur i °C Tab af enzym _________i mg xxx 1 x 0,75 22 0,08 2 x 3 22 0,06 3 xx 16 6 0,05 4 x 4 22 0,02 35 5 xx 40 6 0,02 6 x 6 22 0,02 7 xx 90 6 0,02 148981 17 x omrørt med pufferopløsning

xx henstand i pufferopløsning ved 6°C

xxx beregnet ud fra den målte aktivitet i vaskevæsken.

Det totale tab af enzym er således mindre end 5 0,27 mg eller 5,4% af den totale mængde.

C. Anvendelse af de immobiliserede enzymer til fjernelse af oxygen fra en 0,5% glucoseopløsning.

Analysemetode.

0,200 g af de immobiliserede enzymer, vasket 10 ifølge B, blev indført i en reaktionsbeholder af glas på 32,0 ml, holdt ved 25,0°C i en termostat, og forsynet med: a. en magnetisk omrører b. en "Clark"-oxygenelektrode og 15 c. et glaskapillarrør for gastilførsel og der blev tilsat en vandig 0,02 M natriumacetatpuffer med pH 4,59 til opnåelse af et totalt rumfang på 32,0 mL Der blev derpå sendt luft af atmosfæretryk gennem kapillarrøret, idet oxygenoptagelsen blev registre-20 ret ved hjælp af Y.S.I. "biological Oxygen Monitor" (Yellow Springs Instrument Co., Inc.) forsynet med skriver og forbundet med Clark-elektroden. Da mætningskon-.centrationen var nået, blev instrumentet indstillet på 100% mætning, hvorpå der blev sendt nitrogen igen-25 nem under atmosfæretryk, indtil mætningsværdien var reduceret til 50%. Mængden af opløst oxygen er da ca. 0,14 mmol pr. liter eller ca. 4,4 mg pr. liter.

Der blev derpå indført 0,5 ml vandig oxygenfri 32% glucoseopløsning i beholderen gennem kapillarrøret 30 under samtidig udpresning af 0,5 ml af pufferopløsningen (løber bort gennem kapillarrøret). Oxygenformindskelsen, der begyndte med det samme, blev registreret mod tiden under anvendelse af den forbundne skriver. Såsnart hele oxygenmængden var blevet forbrugt, blev gluco-35 seopløsningen dekanteret fra reaktionsbeholderen, enzympræparatet blev vasket fire gange med portioner på 15 ml 148981 18 af frisk glucosefri pufferopløsning, og prøven blev gentaget.

Denne fremgangsmåde blev gentaget ialt 5 gange.

Efter 15 minutters forløb viste det sig, at ca. 20% af 5 mætningskoncentrationen af oxygen var tilstede, medens opløsningen efter 30 minutters forløb var næsten oxygenfri. Der blev ikke fundet aktivitetstab.

Eksempel 13

Fjernelse af oxygen fra øl 10 32 ml øl ("Heinelen Oud Bruin"), hvis oxygen indhold var indstillet på 6,5 mg pr. liter, blev ved den i eksempel 12 C beskrevne metode behandlet med 200 mg af det ifølge eksempel 12 A opnåede enzymprodukt. De opnåede resultater er opført i tabel G.

15 Tabel G

Oxygenindhold i øl efter behandling med immobiliseret glycoseoxidase/katalase ved 25°C,_

Minutter mg C^/l minutter mg 02/l 3 5,85 18 1,43 20 6 5,01 21 0,91 9 3,97 24 0,49 12 2,99 27 0,20 15 2,15 30 0,10 25 Som det fremgår af tabel G opnås der efter 24 minutters forløb en oxygenkoncentration, der er acceptabel for øl, medens der allerede efter 30 minutters forløb er opnået næsten oxygenfrit øl (<0,1 mg/1)·.

Eksempel 14 30 Dannelse af gluconsyre udfra glucose.

Indvirkning af 400 mg af de immobiliserede enzymer opnået ifølge eksempel 12 A på en vandig 0,9% glucoseopløsning pufret med 0,005 M kaliumphosphat med pH 5,6 under kontinuerlig gennemledning af oxygen under 35 atmosfæretryk.· 148981 19

Produktionen af gluconsyre fremgik af forbruget af en 0,1 N natriumhydroxidopløsning, der blev registreret ved hjælp af skriveren på et titreringsapparat med automatisk dosering, idet pH blev holdt konstant.

5 Det fremgik, at der pr. time blev omdannet ca.

4% af den oprindeligt tilstedeværende glucosemængde til den ækvivalente mængde gluconsyre.