CZ306803B6 - Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz - Google Patents
Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz Download PDFInfo
- Publication number
- CZ306803B6 CZ306803B6 CZ2016-311A CZ2016311A CZ306803B6 CZ 306803 B6 CZ306803 B6 CZ 306803B6 CZ 2016311 A CZ2016311 A CZ 2016311A CZ 306803 B6 CZ306803 B6 CZ 306803B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pellet
- pellets
- coated
- detection
- butyrylcholinesterase
- Prior art date
Links
- 239000008188 pellet Substances 0.000 title claims abstract description 103
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 title abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 238000005563 spheronization Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000007962 solid dispersion Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 28
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 23
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims description 21
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 21
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims description 17
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 14
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 14
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium Chemical compound CC(=O)SCC[N+](C)(C)C GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N butyrylthiocholine Chemical compound CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C AWBGQVBMGBZGLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 claims description 3
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- 244000007835 Cyamopsis tetragonoloba Species 0.000 claims description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 claims description 2
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 claims description 2
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 2
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 claims description 2
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004208 shellac Substances 0.000 claims description 2
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 claims description 2
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 claims description 2
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 claims description 2
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 claims description 2
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 claims description 2
- JBOPQACSHPPKEP-UHFFFAOYSA-N Indoxyl acetate Chemical compound C1=CC=C2C(OC(=O)C)=CNC2=C1 JBOPQACSHPPKEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000011162 core material Substances 0.000 claims 4
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 claims 3
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 claims 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims 1
- 239000002329 esterase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 60
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 60
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 60
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 abstract description 46
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 abstract description 46
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N indoxyl Chemical group C1=CC=C2C(O)=CNC2=C1 PCKPVGOLPKLUHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 7
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920003151 Eudragit® RL polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acrylate Chemical compound CCOC(=O)C=C JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 3
- PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N pent‐4‐en‐2‐one Natural products CC(=O)CC=C PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000277305 Electrophorus electricus Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001730 Moisture cure polyurethane Polymers 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000009517 secondary packaging Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 2-butanoylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC(=O)SCC[N+](C)(C)C WEQAAFZDJROSBF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000221702 Aleuria Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122041 Cholinesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000801359 Homo sapiens Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 229920006322 acrylamide copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940053198 antiepileptics succinimide derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- DZGUJOWBVDZNNF-UHFFFAOYSA-N azanium;2-methylprop-2-enoate Chemical compound [NH4+].CC(=C)C([O-])=O DZGUJOWBVDZNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010033929 calcium caseinate Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N chlorotrifluoroethylene Chemical group FC(F)=C(F)Cl UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 150000004700 cobalt complex Chemical class 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical class O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- JAUGGEIKQIHSMF-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dimagnesium;dioxido(oxo)silane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[Mg+2].[Mg+2].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O JAUGGEIKQIHSMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- BAMCQPRAKJWUON-UHFFFAOYSA-N hepta-2,5-dienediamide prop-2-enamide Chemical compound NC(=O)C=C.NC(=O)C=CCC=CC(N)=O BAMCQPRAKJWUON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000480 nickel oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N oxonickel Chemical compound [Ni]=O GNRSAWUEBMWBQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical group FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N thiophosgene Chemical compound ClC(Cl)=S ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010456 wollastonite Substances 0.000 description 1
- 229910052882 wollastonite Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sférické pelety obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g.sup.-1.n., přičemž enzym je imobilizován ve formě pevné disperze v hydrofilním polymeru, která tvoří primární obal pelety v koncentraci 5 až 15 % hmotn. obalené pelety, která je následně obalena sekundárním semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru v koncentraci 1 až 10 % hmotn. obalené pelety, přičemž průměr výsledné velikosti obalených pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm, jakož i způsob výroby peletových jader, určených k nanesení primárního a následně sekundárního obalu, které jsou vyrobeny metodou extruze-sféronizace nebo rotogranulace, přičemž tato peletová jádra jsou oběma vrstvami (primární i sekundární) obalena ve fluidní vrstvě a výsledné obalené pelety se použijí k detekci inhibitorů cholinesteráz ve formě detekční trubičky obsahující uvedené obalené sférické pelety.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká sférických obalených pelet, určených zejména pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiochoiinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, a obsahujících imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g’1, jakož i způsobu výroby těchto pelet extruzísféronizací nebo rotogranulací s následným fluidním obalením, použití těchto pelet pro detekci inhibitorů cholinesteráz a detekční trubičky obsahující uvedené sférické pelety a určené zejména pro detekci nervově paralytických látek (NPL) v ovzduší.
Dosavadní stav techniky
Imobilizované enzymy jsou obvykle proteázy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti, aniž by ztratily svojí specifickou, enzymatickou aktivitu. Mohou být použity i opakovaně a/nebo kontinuálně. Imobilizace zde zajišťuje dostatečný kontakt reaktantů s enzymem, přičemž reaktant je obvykle obsažen v kapalné fázi, která prochází pevnou fází s imobilizovaným enzymem, případně je reaktant obsažen ve fázi plynné, která je nemísitelná s vodou. Na pevnou fázi je zde kladeno několik požadavků. Má mít velký měrný povrch, hydrofilní charakter, má být nerozpustná ve vodě a chemicky, mechanicky a teplotně stálá. Má mít rovněž vhodný tvar a velikost částic, být odolná proti mikrobiálnímu působení a dovolit opakované a/nebo kontinuální používání. V současné době se používá řada způsobů imobilizace.
Způsoby imobilizace
Enzymy na bázi cholinesteráz jsou známy v imobilizovaném stavu již řadu let. K jejich imobilizaci se používají stejné způsoby jako u ostatních proteáz. Patří sem zejména adsorpce na nerozpustný nosič, vazba na ionexy, vazba na magnetické částice, zabudování do membrán a filmů, zabudování do gelů a pěn, zesítěné agregáty, imobilizace pomocí nanostruktur, imobilizace pomocí kovalentní vazby či pomocí protilátek. Lze proto říci, že obecně se k jejich imobilizaci používají substráty a techniky, které nacházejí širší uplatnění v biochemickém průmyslu. V patentové a odborné literatuře je zachycena již řada chráněných postupů, mezi nimiž někdy nelze jednoznačně diferencovat, neboť v sobě obsahují více uvedených principů. Všechny tyto systémy se pak vyskytují, ať už jednotlivě nebo kombinovaně, v různých detekčních systémech.
Následující taxonomie je uvedena pro větší přehlednost.
a) Sorpce na nerozpustný nosič
Jedná se o nejstarší způsob imobilizace, kde se mezi sorbentem a enzymem uplatňují například běžné síly koheze, adheze, vodíkové můstky, Van der Waalsovy síly apod.
Patentový dokument US 3049411 (1962) uvádí u imobilizace cholinesterázy materiály jako je například filtrační papír nebo silikagel. Daný sorbent byl impregnován 4% roztokem enzymu, do něhož byl přidán hovězí sérový albumin nebo želatina, popř. jiná stabilizující bílkovina a směs byla následně vysušena. Při zjišťování potenciální kontaminace byl disk enzymového papírku zvlhčen a pak přes něj byl prosán vzduch. Po aplikaci detekčního roztoku obsahujícího indoxylacetát, neinhibovaná cholinesteráza substrát rozštěpila. Vzniklý indoxyl pak byl vzduchem oxidován na indigo. Takto imobilizovaný enzym zůstával delší dobu aktivní i při relativně vysokých teplotách, pokud byl skladován v suchu.
-1 CZ 306803 B6
Rovněž patentový dokument US 4241180 (1980) uvádí filtrační papír jako substrát pro butyrylcholinesterázu, kde namísto albuminu bylo s obdobnými výsledky použito roztoku 2-merkaptoethanolu.
Patentový dokument US 3666627A (1971) uvádí jako inventivní krok při impregnaci porézního skla skutečnost, že enzym byl vázán na nosič za přítomnosti substrátu. Vazbou bylo zablokováno aktivní místo enzymu, takže se skupiny aktivního místa nemohly podílet na reakci se substrátem. Získaný imobilizovaný enzym pak měl vyšší stabilitu i aktivitu.
Patentový dokument US 3802997 (1972) chrání analogický způsob imobilizace enzymů, doplněný o sušení produktu lyofilizací nebo v rozprašovací sušárně. Jednodušším způsobem je příprava enzymového papírku podle patentového dokumentu US 4120754 (1978), kde byla butyrylcholinesteráza imobilizována na filtračním papíře impregnaci roztokem enzymu v pufru obsahujícím Tergitol 15-S-12. Papírek byl použit k detekci inhibitorů organofosfátového typu.
Ze sorpce cholinesteráz na vybělenou bavlněnou tkaninu pak vychází patentový dokument CZ 288576 (1994) a ze sorpce na granulovanou celulózu pak patentový dokument CZ 285242 (1995).
Patentový dokument US2008160556 (2008) chrání úpravu filtračního papíru pro imobilizaci acetylcholinesterázy určeného pro přípravu proužku pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy. Filtrační papír byl nejprve impregnován kaseinátem vápenatým a po vysušení na něho byla nanesena směs roztoku enzymu s trehalosou a Ellmanovým činidlem. Jako další nerozpustný nosič může být využito sklo ve formě tenkých kapilár (J. Environmental Anal. Chem. 1980, 8, 27725 2 82), polystyrénová fólie (Toxicol. Appl. Pharmacol. 1984, 73, 105-109) nebo povrch elektrody (NATO ASI Series 1988, 226, 187-194).
Jako další nerozpustný nosič k imobilizaci acetylcholinesteráz slouží i sférické pelety, tvořené mikrokrystalickou celulózou bez nebo s oxidem hlinitým a koloidním oxidem křemičitým (Čes. 30 slov, farm., 2012, 61, 234-239). Patentová přihláška EP 16466002.9 (2016) chrání možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu se specifickým povrchem 200 až 400 m2.g_1, který byl zpracován do sférických pelet spolu alespoň jedním sféronizačním činidlem.
b) Vazba na ionexy
Postup imobilizace cholinesterázy a její stabilizace na celulózové podložce chrání patentový dokument US 4324858 (1982). Jako sorbent je zde využit iontoměnič DEAE nebo ECTEOLA papír s bazickými skupinami kovalentně navázanými na celulózu. Jako zdroj cholinesterázy byla vyu40 žita plazma elektrického úhoře (Electrophorus electricus).
Podobně patentový dokument EP0176585B1 (1988) uvádí jako nosič iontoměničový papír s diethylaminoethylovými skupinami pro impregnaci cholinesterázy z platýze. Nejlepších výsledků bylo dosaženo, když byl iontoměničový papír nejprve ekvilibrován s roztokem chloridu sodného 45 a po promytí a vysušení impregnován roztokem cholinesterázy ve fosfátovém pufru s obsahem sacharózy, dextranu a smáčedla Tween 80. Po vysušení mohl být enzymový papír přechováván v zatavených polypropylenových sáčcích při zachování minimálně poloviční počáteční aktivity po dlouhou dobu za vysoké teploty. K. dosažení dobré stability byla nutná přítomnost sacharózy.
c) Vazba na magnetické částice
Magnetické částice s imobilizovanou cholinesterázou byly využity ke stanovení inhibitorů cholinesterázy průtokovou injekční analýzou (FIA). Imobilizovaný protein zde byl uvolněn elektrickým impulzem (Anal. Chim. Acta 1990, 234, 113-117). K FIA je krom magnetických částic _ 7 _ možné využít i pouhé porézní sklo (J. Chromatogr. A. 1991, 539, 47-54) případně různé methakryláty (Anal. Chim. Acta 1996, 324, 21-27).
d) Zabudování do membrán a filmů
Patentový dokument US 2475793 (1949) popisuje imobilizovanou cholinesterázu na bezbarvém krevním stromatu, které lze považovat za biologickou membránu, kde je vázána fyzikálními a iontovými vazbami. I po dalších úpravách ovšem enzym nebyl dostatečně stabilní, což vyplynulo ze snižování aktivity uvolněné cholinesterázy z nerozpustného podílu po několikadenním skladování v lednici.
Patentové dokumenty CZ 284970 (1997) a CZ 6566 (1997) chrání platinovou elektrodu s nanesenou grafitovou vrstvou modifikovanou kobaltnatým komplexem fitalocyaninu, která byla potažena membránou s imobilizovanou cholinesterázou. Membrána byla vytvořena nanesením směsi roztoku hovězího séra albuminu, roztoku butyrylcholinesterázy a roztoku glutaraldehydu jako látky síťující bílkoviny a roztoku fosfátového pufru o pH 7,4. Membrána pak vznikla zaschnutím nanesené vrstvy při pokojové teplotě.
Patentový dokument CN101586100 (2012) chrání filmy obsahující imobilizovanou cholinesterázu, které jsou vytvořeny z roztoků vodorozpustných polymerů, jakými jsou polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon nebo arabská guma ve fosfátovém pufru. Dále se může jednat o kompozit obsahující kromě vodorozpustného polymeru i lipoplast ve formě lipofilního polymeru. K vytvořeným roztokům se přidává enzym a hovězí sérum albumin. Enzymový film se připravuje jejich nasáknutím nebo nanesením na vhodnou podložku.
Dále existují práce, které popisují zabudování cholinesteráz do polyakrylové membrány, případně pomocí kovalentní vazby na povrch nylonových trubiček, nebo imobilizaci v lipidických membránách lipozomů (Adv. Mat. Res. 2013, 726-731, 850-53). Jsou známy také pokusy o imobilizaci v nitrocelulózovém filmu (Anal. Chim. SSSR 1990, 45, 1002-1004).
e) Zabudování do gelů
Patentový dokument US 4241180 (1980) uvádí imobilizaci cholinesterázy z koňského séra v polysacharidovém gelu na bázi škrobu, agaru nebo karagenanu, který vznikl lyofilizací tuhnoucího gelu na filtračním papíře. Imobilizovaná cholinesteráza pak rozštěpila substrát a vzniklý thiocholin zredukoval modrý 2,6-dichlorfenolindofenol na bezbarvý produkt. Byl-li k roztoku přidán inhibitor cholinesterázy, k odbarvení nedošlo. Nevýhodou takto připravovaných polysacharidových gelů je nízká mechanická pevnost.
Tuto nevýhodu odstraňuje patentový dokument DE 2946642 (1988), který využívá vyšších koncentrací škrobu. Připravuje se zde škrobový extrudát, vznikající extruzí škrobové pasty. Ten se následně vysuší, rozemele a přesítuje.
Patentový dokument WO 8300345 (1987) chrání způsob navázání enzymů na kopolymemí gely, obsahující karboxylové skupiny. Nosičem enzymu byl slabě kyselý katex Akrilex C-100, což je parciálně hydrolyzovaný kopolymer akrylamidu s methylen-bis-akrylamidem. Ten ve srovnání s jinými nosiči poskytl nejlepší výsledky. Při srovnávacích experimentech byla úspěšná i imobilizace v zesítěném maleinanhydridu.
Patentový dokument BG 50904 (1992) popisuje imobilizaci cholinesterázy z hovězího, telecího a lidského séra v agarovém gelu. Enzym se na sorbentu zachytil v prostředí s nízkou iontovou silou. Adsorpční vazba enzymu byla při nízké iontové síle dostatečně silná, o čemž svědčilo vymytí balastních bílkovin při promývání roztokem chloridu sodného. Při zvýšení iontové síly se však enzym uvolnil a byl vymyt.
-3CZ 306803 B6
Patentový dokument WO 2009061921 (2009) chrání způsob stabilizace cholinesterázy formou imobilizace v pórech gelu na bázi přírodních i syntetických polymerů. Vedle toho uvádí i stabilizaci ve formě liposomů a nanokompositů a v polyuretanové pěně.
Existují i odborné studie, zabývající se imobilizaci acetylcholinesteráz k analytickým účelům za pomocí fluorimetrie do škrobového gelu, naneseného na polyuretanové podložce (Anal. Chem. 1965, 37, 1675-1680) nebo v enzymových polštářcích (Anal. Biochem. 1967, 19, 587-592).
f) Zabudování do pěny
Patentový dokument US 6406876 BI (2002) uvádí polyuretanovou pěnu jako prostředek imobilizace cholinesteráz. Tento způsob imobilizace spočívá v reakci aminoskupiny lysinových a argininových zbytků lokalizovaných na povrchu molekuly, přičemž žádná není na vstupu do dutiny aktivního centra. Navázání enzymu proto neblokuje přistup substrátů, inhibitorů a reaktivátorů do katalytického místa. Příprava porézního nosiče zahrnuje použití pre-polymeru a povrchově aktivní látky. Výsledek imobilizace značně závisí na intenzitě míchání během polymerace. Před denaturací vlivem střižných sil chránil imobilizovaný enzym přídavek povrchově aktivních látek, jako je Pluronic C-65, popř. malé množství glycerolu. Imobilizované enzymy jsou stálé i při vyšší teplotě. Při konstrukci biosenzoru mohou být spolu s cholinesterázou koimobilizovány i další enzymy.
Patentové dokumenty US 6759220 (2004) a US 7422892 (2008) obsahují variace ve způsobu přípravy polyuretanové pěny, které ovlivňují jak její vlastnosti, tak i stupeň interakce enzymu s reaktivními skupinami pre-polymeru. Z hydrolytických enzymů zde byly imobilizovaný i butyrylcholinesteráza a acetylcholinesteráza. Zařízení s těmito enzymy bylo využito pro kontinuální monitoring různých inhibitorů ve vodě i ve vzduchu.
g) Zesítěné agregáty
Patentový dokument RU 2182929 (2002) uvádí metodu zesítění bílkoviny glutaraldehydem k imobilizaci cholinesterázy z koňského séra. Předmětem ochrany je souprava pro stanovení inhibitorů cholinesteráz s použitím imobilizovaného enzymu. Imobilizace byla provedena rovnoměrným nanášením roztoku cholinesterázy z koňské krve v pufru, spolu se síťujícím činidlem, na pohybující se pás vláknitého materiálu. Nanášení enzymu a činidla probíhalo dvěma oddělenými trubicemi.
Patentový dokument RU 2386120 (2010) chrání optický biosenzor pro detekci ireverzibilních inhibitorů, který obsahuje jako aktivní prvek intenzivně fluoreskující komplex cholinesterázy s reverzibilním inhibitorem - luminogenem. Komplex je imobilizovaný na neutrální podložce uzavřením v N-isopropylakrylamidovém gelu řídce síťovaném methylenbisakrylamidem. Zesítěný gel se připravuje přímo na podložce fotopolymerací.
h) Imobilizace pomocí nanostruktur
Za nový typ nosiče lze považovat uhlíková nanovlákna, která byla nejprve karboxylována a pak ultrazvukem dispergována v roztoku. Po odstranění roztoku vzniká porézní membrána, která může prostřednictvím karbodiimidu sloužit k vazbě cholinesterázy (J. Mater. Chem. B 2014, 2,915-922).
i) Imobilizace pomocí kovalentní vazby
Při tomto druhu imobilizace se používají specifické vazebné reakce mezi enzymem a substrátem. Patentový dokument US 3519538A (1970) uvádí jako sorbent, který poskytuje s enzymem kovalentní vazbu, silikagel, různé silikáty (bentonit, wollastonit) a oxidy kovů (hliníku, hydroxylapatitu nebo oxidu nikelnatého, jehož vrstvička byla např. získána po oxidaci sítka z niklu). Nosič byl
-4 CZ 306803 B6 nejprve modifikován reakcí s aminopropyltriethoxysilanem v toluenu. Primární aminoskupiny získaného produktu pak byly využity k navázání enzymů známými postupy imobilizace např. pomocí dicyklohexylkarbodiimidu. Připravený derivát s aromatickými aminoskupinami pak může být diazotován a kopulován s enzymem. Aminoskupiny modifikovaného nosiče mohou být také aktivovány reakcí s thiofosgenem za vzniku derivátu s isothiokyanátovými skupinami, které pak reagují s aminoskupinami enzymu. Nejčastěji se ale využívá reakce s glutaraldehydem, kdy se enzym váže za vzniku Schiffových bází.
Předmětem patentového dokumentu DE 1768934 (1972) je mimo jiné obecný způsob imobilizace enzymů na nerozpustný polymemí nosič s kovalentně navázaným reverzibilním inhibitorem. Na ten se pak váže odpovídající enzym, který lze z afinitní vazby uvolnit změnou pH a/nebo iontové síly prostředí, případně vytěsněním kompetitivními látkami nebo substráty.
Patentový dokument US 3809616A (1974) uvádí jako nosič upravený filtrační papír s modifikovaným polyakroleinem s imobilizovanou cholinesterázou z koňského séra. Při imobilizaci cholinesterázy se na polymer (polyakrolein solubilizovaný siřičitany a následně zesítěný reakcí s alifatickým diaminem) navázalo více než tři čtvrtiny enzymu. Cholinesteráza se přitom mohla kovalentně vázat na zbytkové aldehydické skupiny modifikovaného polyakroleinu, ale také mohla být vázána nekovalentními iontovými vazbami na jeho aminoskupiny. Po impregnování roztokem Nmethylindoxylbutyrátu v isopropanolu se na papíře postupně objevilo tmavě zelené zbarvení produktu oxidací indoxylu, který vznikl hydrolýzou esteru. V přítomnosti inhibitorů cholinesterázy ve vzduchu ke vzniku zbarvení nedocházelo.
Patentový dokument US 7572764 (2009) uvádí rekombinantní lidskou acetylcholinesterázu nebo purifikovanou acetylcholinesterázu z hovězího fetálního séra a butyrylcholinesterázu, navázané skrze aminoskupinu na rozpustný polymer - methoxypolyethylenglykol 5000 nebo 20 000, který byl aktivovaný sukcinimidylpropionátem. Ve srovnání s nativním enzymem konjugáty lépe odolávají působení krevních proteáz a jsou stabilnější v krevním oběhu. Mohou proto také lépe sloužit k detoxikaci organismu od organofosfátů. Princip aktivace koncových hydroxylových skupin polyetherů deriváty sukcinimidu lze využít nejen pro přípravu rozpustných konjugátů, ale pro přípravu enzymů imobilizovaných na nerozpustných nosičích s hydroxylovými skupinami. Kromě volných aminoskupin mohou být k reakci využity i thiolové skupiny cysteinových zbytků.
Ze stejného principu vychází i patentový dokument WO 2009139905, který chrání konjugáty cholinesterázy s rozpustnými nepeptidickými polymery se zlepšenými vlastnostmi.
Patentový dokument EP 1561100 (2005) uvádí specifický postup vazby acetylcholinesterázy na selektivní tranzistor z oxidu hlinitého prostřednictvím kyanurchloridu. Iontově selektivní tranzistor s imobilizovaným enzymem vytváří biosenzor, z něhož se enzym uvolňuje působením elektrického pole.
Patentový dokument WO 200806495 (2008) uvádí imobilizaci acetylcholinesterázy z elektrického úhoře pomocí konjugátů s avidinem, který vznikl působením glutaraldehydu. Konjugát reagoval s biotinem, který byl navázán na povrchu plastové mikrotitrační destičky. Systému je možné využít jako biosenzoru.
Existují práce, které uvádějí vazbu cholinesterázy na piezoelektrický senzor, tvořený křemenným krystalem, povlečeným tenkými vrstvičkami zlata s navázanou monovrstvou 11-merkaptoundekanové kyseliny s derivátem kokainu inhibujícím enzym. Na takto upravený povrch je pak navázána cholinesteráza. V přítomnosti jiných inhibitorů se pak navázaný enzym uvolňuje (Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 1904-1911).
-5CZ 306803 B6
j) Imobilizace pomocí protilátek
Patentový dokument EP O73889(B1) (2003) chrání imobilizaci cholinesterázy na fragment myší protilátky proti lidské sérové cholinesteráze, který je zde fixovaný sorpcí v jamkách polystyrénové mikrotitrační destičky. Tvorby komplexu fragmentu protilátky a cholinesterázy se využívá ke stanovení aktivity cholinesterázy v séru, která při onemocnění cirhózou nebo rakovinou jater klesá. Stanovení je založeno na afinitě další látky k cholinesteráze, a to lektinu z houby mísenky oranžové (Aleuria auratid), na nějž byl navázán biotin. Cholinesterázy jako glykoproteiny s lektiny interagují.
V analogickém patentovém dokumentu JP 2004257996 (A) (2004) se chrání snáze dostupný lektin z čočky. Patentový dokument JP 2004257996 (A) (2004) analogicky chrání i značenou protilátku pro její snadné stanovení.
k) Detekční systémy
Na základě výše popsaných mechanismů, uplatňujících se v imobilizaci cholinesteráz, existují detekční systémy, které využívají tyto principy ke konstrukci sofistikovaných zařízení. Ta se dají s různým úspěchem využívat při detekci inhibitorů cholinesteráz například v životním prostředí. Patentový dokument S 3689224 (1972) chrání sofistikované laminované destičkové zařízení kryté polymery monochlorotrifluoroethylenem nebo tetrafluoroethylenem, které je adjustované v hliníkové fólii. Patentový dokument US 3809617A (1974) chránící kombinované detekční disky a patentový dokument WO 8504424 (1985) chrání jednoduché detektorové kity s dvěma dotykovými plochami pro detekci látek.
Zcela originálním řešením jsou detekční trubičky pro inhibitory cholinesteráz, kde byl použit lyofílizovaný preparát butyrylcholinesteráza s plnivem želatinou, která zvyšovala stabilitu enzymu (Int. J. Environ. Anal. Chem. 1979, 6, 89-94). Patentový dokument CZ 285242 (1993) popisuje detekční trubičku k indikaci bojových chemických látek na bázi inhibitorů cholinesteráz ve vzduchu a ve vodě.
Z dosavadního stavu techniky vyplývá, že v současné době jsou velmi progresivním způsobem detekce inhibitorů cholinesteráz v terénu tzv. detekční trubičky. Patentový dokument CZ 285242 (1993) uvádí takový detekční systém s obsahem cholinesterázy (acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza), imobilizované na celulózových granulích o rozměrech 0,8 až 1,2 mm, případně ve formě sférických pelet o velikosti 0,8 až 1,25 mm, připravených metodou extruze sferonizace (Čes. Slov. Farm. 2012, 61, 234-239). Granulát i pelety jsou adjustovány ve skleněných trubičkách. Granule a pelety v tomto detekční systému však poskytují poměrně málo syté zbarvení a poměrně málo zřetelný a uniformní barevný přechod při enzymatické kolorimetrické reakci ať už s použitím chromogenních činidel a substrátů nebo samotných chromogenních substrátů. Tento stav se snaží zlepšit patentová přihláška EP 16466002.9 (2016), která popisuje možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu, který byl zpracován do sférických pelet o rozměrech 0,8 do 1,25 mm a kterými byly detekční trubičky vyplněny. Zde sice docházelo k sytému zabarvení pelet, ale tato barva se postupem času vyplavovala do reakční-ho prostředí, které rovněž zbarvila, což mohlo způsobit problém v identifikaci barevného přechodu. Tento nedostatek eliminuje řešení podle následujícího vynálezu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou sférické obalené pelety, určené zejména pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, a obsahující imobilízovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g ', jejichž podstata spočívá v tom, že enzym je imobiiizován na povrchu peletových jader ve formě pevné disperze v hydrofilním polymeru, tvořící primární obal peletových jader, který je následně překryt sekundárním semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru, přičemž průměr výsledné velikosti obalených pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm.
Primární hydrofilní polymer je tvořen různými alkylovanými deriváty celulózy, polyvinylpyrrolidonem, polyvinylalkoholem, polyethylenglykolem, škrobem a jeho deriváty, dextranem, dextrinem, akácií, guarovou, arabskou nebo xanthanovou gumou, případně algináty, nebo libovolnou směsí těchto látek v libovolném poměru, ve výsledné koncentraci od 0,1 do 20 % hmotnosti obalené pelety, výhodně hydroxypropylmethylcelulózou (použita pod komerčním názvem Pharmcoat® 606, ShinEtsu, Japan) v koncentraci 5 až 15 % hmotnosti obalené pelety.
Sekundární semipermeabilní, vodonerozpustný polymer je tvořen akryláty a jejich deriváty, estery a étery celulózy, šelakem, polyvinylacetátem, případně jejich směsí v libovolném poměru, případně ve směsi s výše uvedenými hydrofilními polymery v celkové koncentraci od 0,1 do 15 % hmotnosti obalené pelety, výhodně směsí kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny (použita pod komerčním názvem Eudragit® RL, Evonik, Germany) ve směsi s polyethylenglykolem a/nebo polyvinylpyrolidonem v jejich vzájemném poměru 1,5-6,5 : 0,5-1,7 : 0,1-0,5, přičemž celková koncentrace obalu činí 1 až 10% hmotnosti obalené pelety.
Podíl imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz v hydrofilním obaluje roven 0,01 až 1 % hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost pelet, k zajištění výsledné aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz v rozmezí od 1 do 100 nkat.g-1. Enzym na bázi cholinesterázy tvoří acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza.
Obalené pelety se adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz od 0,1 do 100 nkat, výhodně 3 nkat, v jedné detekční trubičce.
Předmětem vynálezu je rovněž výroba peletových jader, určených k nanášení obalu, které se vyrobí metodou extruze-féronizace nebo rotogranulace, a následné se obaly nanesou ve fluidní vrstvě.
Předmětem vynálezu je rovněž použití výše definovaných sférických pelet pro detekci inhibitorů chlolinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu.
Předmětem vynálezu je rovněž detekční trubička pro detekci inhibitorů chlolinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje výše definované sférické pelety, substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiocholin a chromogenní činidlo.
Z výše uvedeného je zřejmé, že se vynález týká složení sférických pelet s obsahem imobilizovaného enzymu cholinesterázy resp. butyrylcholinesterázy o aktivitě 1 až 100 nkat.g-1, které jsou adjustovány ve formě skleněných detekčních trubiček,
Enzym je v obalených peletách imobiiizován ve formě primárního, hydrofílního obalu a tato vrstva je následně překryta semipermeabilním, vodonerozpustným obalem, který zabraňuje nadměrnému vyplavení enzymu do vnějšího prostředí. Obalené pelety jsou adjustovány do skleně
- 7 CZ 306803 B6 ných trubiček. Trubičky s adjustovanými peletami slouží pro detekci nervově paralytických látek (NPL) v ovzduší.
Trubička obsahuje dvě vrstvy a dvě skleněné ampulky s roztoky. Indikační vrstva obsahuje pelety s imobilizovanou acetylcholinesterázou/butyrylcholinesterázou. Další vrstva obsahuje drcené sklo impregnované substrátovým acetylthiocholinem/butyrylthiocholinem a chromogenním činidlem (Ellmanovo činidlo). Obě ampulky jsou plněny roztokem pufru o pH 6 až 9.
Při detekci se ampulka u indikační vrstvy rozbije kovovým bodcem a její obsah se setřepe na pelety. Do trubičky se nasaje ekvivalentní objem vzduchu. Poté se rozbije druhá ampulka a její obsah se setřese přes drcené sklo až na pelety. Hodnotí se změna zabarvení vrstvy s obsaženými peletami. Pokud dojde ke žlutému zabarvení, ovzduší neobsahuje NPL. V opačném případě zůstane vrstva beze změny, případně dochází ke žlutému zbarvení až po delší době. Jedno z možných provedení uvedené detekční trubičky je znázorněno na obr. 1.
Principem detekce NPL je enzymatická kolorimetrická reakce, kdy v nepřítomnosti NPL dochází k hydrolýze acetylthiocholinu, resp. butyrylthiocholinu cholinesterázou na příslušnou kyselinu a thiocholin. Thiocholin dále reaguje s Ellmanovým činidlem (kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou)) za vzniku kyseliny 2-nitro-5-thiobenzoové (viz obr. 2). Kyselina 2-nitro-5thiobenzoová pak způsobí žluté zabarvení detektoru, které lze vyhodnotit pouhým okem nebo spektrofotometricky při 412 nm. Pokud ke změně barvy nedojde, jedná se o kontaminaci ovzduší NPL, kdy NPL inhibuje enzym a nedochází k uvolnění thiocholinu a následné barevné reakci. Detekční trubičku lze využít i pro zjištění přítomnosti NPL ve vodě.
AChE
+ CH3COOH
Obr. 2 Reakční schéma Ellmanovy reakce
Kromě EUmanova činidla lze k detekci NPL využít i jiná chromogenní činidla nebo chromogenní substráty, např. indoxylacetát, kdy hydrolýzou indoxylacetátu vzniká indoxyl a kyselina octová. Indoxyl se poté samovolně přeměňuje na indigo a roztok se zbarvuje do modra (obr. 3). Postup práce s trubičkou je zde obdobný.
+ 2H2O
Obr. 3 Reakční schéma s indoxylacetátem
Dosavadní řešení imobilizace enzymů ve vodorozpustných membránách CN 101586100 (2012) nebo pelet adjustovaných ve formě trubiček s obsahem pelet EP 16466002.9 (2016) mají tu nevýhodu, že při testování dochází k vyplavení zabarvení do vnějšího prostředí, čímž se snižuje intenzita zbarvení samotných pelet. V případě EP 16466002.9 (2016) se z těla pelet uvolňuje zabarvení do vnějšího, tekutého prostředí.
Tuto nevýhodu překvapivě odstranila imobilizace enzymu rovněž na povrchu pelet, avšak ve vodorozpustné membráně ve formě primárního obalu, který je obalen ještě další vodonerozpustnou (sekundární obal), avšak semipermeabilní membránou. Mechanismus účinku spočívá v tom, že pelety při styku s kapalinou obsahující činidlo dovolí přístupu činidla k imobilizovanému enzymu skrze sekundární obal. Sekundární obal je sice nerozpustný ve vodě, ale dovolí prostupu vody s činidlem k primárnímu obalu. Zde pak dojde k barevné reakci. Sekundární obal, který zůstává zachován, pak zpomalí odplavení vzniklého barviva do vnějšího prostředí. To se viditelně projeví i v intenzitě zabarvení tohoto prostředí, které odpovídá změřené absorbanci, jejíž hodnota je přímo úměrná koncentraci uvolněného barviva. Například při použití Ellmanova činidla o aktivitě 30 nkat/g nosiče je u pelet připravených dle EP 16466002.9 (2016) absorbance vnějšího prostředí po pěti minutách 0,4114. U pelet připravených podle příkladů uvedených v tomto vynálezu se absorbance vnějšího prostředí nachází za stejnou dobu v rozmezí 0,1928 až 0,3369 dle jednotlivých kompozic (viz tab. 2). Nižší absorbance odpovídá i nižší koncentraci uvolněného barviva. Detailní popis zkoušky uvádí příklad 9 tohoto vynálezu.
Toto provedení má pak další výhodu v tom, že celé množství enzymu je koncentrováno pouze ve formě primárního obalu na povrchu pelety, nikoliv v celém jádru pelety, jako v případě EP 16466002.9. Tím se zintenzívní barevná reakce imobilizovaného enzymu s činidlem, jelikož barvivo je zakoncentrováno na mnohem menší ploše. Například při použití Ellmanova činidla o aktivitě 30 nkat/g nosiče vzniká u pelet připravených dle EP 16466002.9 (2016) zabarvení PANTONE 116 U. U pelet připravených podle příkladů uvedených v tomto vynálezu (viz tab. 2) vzniká mnohem intenzivnější zbarvení ve škále mezi PANTONE 122 až 123 U (podle vzomíku PANTONE FORMULA GUIDE). Detailní popis zkoušky uvádí příklad 9 tohoto vynálezu.
Tento vynález tedy zabraňuje vyplavování barviva do vnějšího prostředí, což vede k lepšímu barevnému rozlišení zabarvení pelet vůči vnějšímu prostředí, a zároveň zintenzivňuje samotné zabarvení pelet díky koncentraci barviva na menší ploše resp. jen na povrchu pelet.
Primární obal je zde výhodně tvořen hydroxypropylmethylcelulózou v koncentraci 5 až 15 % (použita pod komerčním názvem Pharmacoat 606, ShinEtsu, Japan) a tento hydrofilní polymer velice rychle hydratuje a přijímá vodu. Sekundární obal je výhodně tvořen směsí kopolymeru
-9CZ 306803 B6 ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny (použita pod komerčním názvem Eudragit® RL, Evonik, Germany). Již tento obal je semipermeabilní, dovolující prostupu vody, ale sám je vodonerozpustný a zůstane po celou dobu testování na peletě. Prostupnost vody z časového hlediska lze zvýšit přísadou ve vodě rozpustných látek, které v obalu vytvoří póry, umožňující rychlý přístup činidla k primárnímu, hydrofilnímu obalu s obsahem imobilizovaného enzymu. Mezi tyto vodorozpustné látky patří polyethylenglykol a/nebo polyvinylpyrrolidon, případně jejich směs. Výhodný hmotnostní poměr Eudragit® RL : polyethylenglykol : polyvinylpyrrolidon činí 1.5-6.5 : 0.5-1.7 : 0.1-0.5, přičemž celková koncentrace obalu činí 1 až 10 % hmotnosti obalené pelety. Primární a sekundární obal jsou ve dvou krocích naneseny z vodného (primární obal) a lihového (sekundární obal) roztoku na sférická peletová jádra podle uvedených příkladů (1 až 8).
Výsledné sférické obalené pelety mají průměr velikosti ze 75 % v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm. Zpracování do formy pelet má pak oproti stavu techniky (EP 16466002.9) i tu výhodu, že pelety jsou chráněny sekundárním obalem, což snižuje jejich abrazi při mechanickém namáhání, a tím zabraňuje tvorbě prachu při manipulaci s nimi.
Imobilizované cholinesterázy jsou zde zastoupeny ve formě acetylcholinesterázy nebo butyrylcholinesterázy, případně jejich směsi v neomezeném poměru. Výhodně je zde obsažena butyrylcholinesteráza samotná, protože umožňuje použít i chromogenní substráty (tj. látky, které hydrolyzují přímo za vzniku barevného produktu, např. indoxylacetát), což může být v případě acetylcholinesterázy problematické. Hydrolýza totiž může být pomalejší a enzym může být inhibován reakčními produkty. Poměr cholinesteráz k tomuto sorpčnímu anorganickému materiálu v peletách činí od 0,01 do 1 % hmotnosti výsledných pelet.
Výsledné obalené pelety jsou adjustovány do skleněných detekčních trubiček tak, aby aktivita enzymu(ů) činila od 0,1 do 100 nkat v jedné detekční trubičce, výhodně 3 nkat. Při manipulaci s peletami resp. jejich adjustace do trubiček, oproti neobaleným peletám (EP 16466002.9), rovněž prakticky nevzniká žádný prachový podíl, který může vést ke ztrátám vnější vrstvy s nasorbovaným enzymem.
Pelety s imobilizovanými enzymy se pak využijí k detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátu acetylthiocholinu nebo butyrylthiocholinu nebo jejich směsi, za vzniku odpovídajícího thiolu, jenž je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, případně metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu.
Příklady uskutečnění vynálezu
Způsob přípravy podle vynálezu je objasněn následujícími příklady provedení, aniž by jimi byl rozsah vynálezu omezen.
Příklady 1 až 8
Příklady složení pelet v procentech hmotnosti uvádí tab. 1. Všechny příklady se zpracovávají společným postupem, jenž se liší pouze rozdílným složením.
Λ
Tab. 1 Složení pelet v procentech hmotnosti
| Příklad | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| Jádro | Avicel PH 10111 | 88,89 | 86,96 | 85,10 | 83,33 | 88,89 | 86,96 | 85,10 | 83,33 |
| Voda* | 97,0 | 95,7 | 93,6 | 91,7 | 97,0 | 95,7 | 93,6 | 91,7 | |
| Primární obal | Pharmacoat 6062) | 8,89 | 8,69 | 8,51 | 8,33 | 8,89 | 8,69 | 8,51 | 8,33 |
| Voda* | 80,01 | 78,21 | 76,59 | 74,97 | 80,01 | 78,21 | 76,59 | 74,97 | |
| IU BuChE** | 177,80 | 173,80 | 170,20 | 166,60 | 177,80 | 173,80 | 170,20 | 166,60 | |
| Sekundární obal | Eudragit® RL3) | 1,78 | 3,48 | 5,11 | 6,67 | 1,67 | 3,26 | 4,79 | 6,25 |
| PEG 400 | 0,44 | 0,87 | 1,28 | 1,67 | 0,44 | 0,87 | 1,28 | 1,67 | |
| PVP | - | - | - | - | 0,11 | 0,22 | 0,32 | 0,42 | |
| Ethanol* | 12,46 | 24,36 | 35,77 | 46,69 | 12,46 | 24,36 | 35,77 | 46,69 |
υ mikrokrystalická celulóza 2) hydroxypropylmethylcelulóza 3) směs kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny • není součástí výrobku ** ředí se dle aktuální koncentrace substrátu a IU nejsou zahrnuty do hmotnosti obalené pelety.
Postup přípravy jader • Množství Avicel® PH 101 smísíme po dobu tri minut s množstvím vody v rychloběžném mixéru (Tefal Kaleo, Francie) do vzniku vlhké hmoty.
• Vlhkou hmotu extrudujeme sítem o velikosti otvoru 1,25 mm na extrudéru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 100 ot./min.
• Extrudát sféronizujeme na sferonizeru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 1000 rpm po dobu 5 minut.
• Vzniklé pelety vysušíme při teplotě 60 °C po dobu 24 hodin (Horo 03 8A, Dr. Ing. A. Hoffman GmbH, Německo) do vlhkosti pod 0,5 %.
Postup přípravy primárního obalu • Pharmcoat® 606 se na elektromagnetické míchačce disperguje ve vodě zahřáté cca na 70 °C a poté se disperze míchá do vychladnutí na cca 25 °C a přidáme potřebné množství roztoku butyrylcholinesterázy o koncentraci 50 Ul.g1.
• Roztok se poté nastříkne na povrch pelet ve fluidním zařízení M-100 (Medipo, Česká republika) při teplotě 40 °C, velikosti trysky 1 mm a tlaku vzduchu 1 až 2 bar. Obalené pelety se následně dosuší při 25 °C po dobu 24 hodin.
Postup přípravy sekundárního obalu • Eudragit® RL se na elektromagnetické míchačce rozpustí v lihu a do roztoku se za stálého míchání přidá PEG 400, případně PVP až do rozpuštění.
• Roztok se poté nastříkne na povrch pelet s již ukotveným enzymem ve fluidním zařízení ΜΙ 00 (Medipo, Česká republika) při teplotě 40 °C, velikosti trysky 1 mm a tlaku vzduchu 1 až 2 bar. Obalené pelety se následně dosuší při 25 °C po dobu 24 hodin.
-11CZ 306803 B6
Příklad 9
Test funkce pelet (aktivity enzymu) • Do zkumavky se naváží příslušné množství pelet tak, aby navážka obsahovala 9,375 nkat enzymu.
• K. peletám se k provlhčení přidá 0,5 ml vody a nechá se stát 3 minuty.
• Po 3 minutách se ke vzorku napipetuje 0,5 ml zkušebního roztoku obsahujícího Ellmanovo činidlo a butyrylthiocholin jodid a nechá se působit 5 minut.
• Po pěti minutách se roztok nad peletami slije do čisté zkumavky.
• K. měření absorbance se odpipetuje do 0,5 cm kyvety 0,2 ml slitého roztoku a přidá se 1,4 ml pufru o pH 7,6. Měření probíhá při vlnové délce 412 nm (UV/VIS spectrophotometr Lambda 25, PerkinElmer®, Waltham, USA) proti čistému pufru o pH 7,6. Výsledky dosažené při testu uvádí tab. 2.
Tab. 2 Absorbance vnějšího vodného roztoku a barva dle škály Pantone®
| Vzorek | Průměrná absorbance | Směrodatná odchylka | Barva ze škály Pantone® |
| EP 16466002.9 | 0,4114 | 0,0081 | Pantone® 116 C |
| 5 | 0,3369 | 0,0020 | Pantone® 122 U |
| 6 | 0,2413 | 0,0015 | Pantone® 123 U |
| 7 | 0,1928 | 0,0006 | Pantone® 123 U |
Příklad 10
Trubička obsahuje (ve směru proudění kontaminovaného vzduchu):
• Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).
• Vrstvu drceného skla impregnovaného substrátem a indikátorem (případně jenom chromogenním substrátem). Délka vrstvy 10 mm, hmotnost vrstvy asi 0,1 g.
• Vrstvu pelet s imobilizovaným enzymem. Délka vrstvy 10 mm, hmotnost asi 0,05 g.
• Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).
Vrstvy jsou upevněné a vzájemně oddělené vymezovacími tělísky z PE, propouštějícími plyn i kapalinu (ve tvaru hvězdiček).
Postup práce s detekční trubičkou • Rozdrtíme spodní ampulku a setřepeme její obsah na vrstvu pelet s enzymem.
• Provedeme odběr vzorku kontaminovaného vzduchu (ruční nebo elektrickou pumpičkou, objem 1 litr vzduchu).
• Počkáme 2 minuty (doba inkubace).
• Rozdrtíme horní ampulku a její obsah setřepeme přes vrstvu drceného skla až na vrstvu pelet (smýt impregnovaná činidla).
• Vyhodnotíme změnu zabarvení vrstvy pelet. Pokud vzduch není kontaminován, systém pracuje normálně a dochází k redukci chromogenního činidla nebo hydrolýze chromogenního substrátu, což je doprovázeno barevnou změnou (zabarvení nebo odbarvení indikační vrstvy). V přítomnosti kontaminantů se zabarvení indikační vrstvy po určitou dobu nemění. Na základě délky této doby lze určit koncentraci kontaminantů v ovzduší.
Průmyslová využitelnost
Obalované pelety by mohly mít uplatnění v průmyslové výrobě detekčních trubiček ke zjišťování inhibitorů cholinesteráz, zejména nervově paralytických bojových chemických látek a dalších vojensky významných sloučenin s podobným mechanismem toxického účinku. Jednoduché detekční prostředky tohoto typu jsou standardní součástí technické výbavy vojenských chemických jednotek a chemických specialistů v oblasti ochrany obyvatelstva.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (5)
1. Sférické pelety, určené pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy, tvořené nerozpustným nosičovým jádrovým materiálem, zejména mikrokrystalickou celulózou, tvořícím jádro pelet, a obsahující imobilizovanou acetylcholinesterázu a/nebo butyrylcholinesterázu o aktivitě 1 až 100 nkat.g’1, vyznačené tím, že acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza je imobilizována na povrchu jader pelet ve formě mezilehlé vrstvy pevné disperze acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy v hydrofilním polymeru, tvořeném alespoň jednou látkou ze souboru sestávajícího z alkylovaného derivátu celulózy, polyvinylalkoholu, polyethylenglykolu, škrobu a jeho derivátů, dextranu, dextrinu, akácie, guarové, arabské a xanthanové gumy a alginátu, přičemž uvedená mezilehlá vrstva tvoří primární obal pelet, který je překryt povrchovou vrstvou semipermeabilního vodonerozpustného polymeru, tvořenou alespoň jednou látkou ze souboru sestávajícího z akrylátů a jejich derivátů, esterů a etherů celulózy, šelaku a polyvinylacetátu, případně v kombinaci s hydrofilním polymerem definovaným pro mezilehlou vrstvu, přičemž uvedená povrchová vrstva tvoří sekundární obal pelet, přičemž velikost obalených pelet je alespoň ze 75 % v rozmezí od 0,1 do 3,0 mm, hmotnost uvedené mezilehlé vrstvy představuje 0,1 až 20 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost obalené pelety, a hmotnost uvedené povrchové vrstvy představuje 0,1 až 15 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost obalené pelety, a obsah acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy imobilizované v primárním obalu pelety je roven 0,01 až 1 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost obalené pelety.
2. Způsob výroby sférických pelet definovaných v nároku 1, vyznačený tím, že se na jádra pelet vyrobená extruzí-sféronizací nebo rotogranulací nanese ve fluidní vrstvě primární obal pelet a následně sekundární obal pelet.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se obalené pelety adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity imobilizované acetylcholinestrázy a/nebo butyrylcholinesterázy rovné 0,1 až 100 nkat v jedné detekční trubičce.
4. Použití sférických pelet definovaných v nároku 1 pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, tvořeného kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou), nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, zejména tvořeného indoxylacetátem.
5. Detekční trubička pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, tvoře
- 13 CZ 306803 B6 ného kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou), nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, zejména tvořeného indoxylacetátem, vyznačená tím, že v oddělené první sekci detekční trubičky obsahuje sférické pelety definované v nároku 1, v oddělené druhé sekci detekční trubičky obsahuje substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiocholin a re5 doxní indikátor tvořený kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) nebo v oddělené druhé sekci detekční trubičky obsahuje chromogenní substrát, a v alespoň jedné oddělené třetí sekci obsahuje roztok pufru.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-311A CZ306803B6 (cs) | 2016-05-26 | 2016-05-26 | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2016-311A CZ306803B6 (cs) | 2016-05-26 | 2016-05-26 | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2016311A3 CZ2016311A3 (cs) | 2017-07-12 |
| CZ306803B6 true CZ306803B6 (cs) | 2017-07-12 |
Family
ID=59284920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2016-311A CZ306803B6 (cs) | 2016-05-26 | 2016-05-26 | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ306803B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308597B6 (cs) * | 2019-04-17 | 2020-12-23 | Oritest Spol. S R.O. | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4241180A (en) * | 1978-02-27 | 1980-12-23 | Owens-Illinois, Inc. | Enzymatic method for determining surfactants on surfaces |
| US4418147A (en) * | 1978-11-20 | 1983-11-29 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Ten Behoeve Van Nijverheid, Handel En Verkeer | Enzyme immobilization in a starch gel |
| CZ117993A3 (en) * | 1993-06-17 | 1995-10-18 | Oritest | Detection tube of choline esterases inhibitors in air and water |
| US20050054025A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-10 | Rogers Kim R. | Stabilized enzymes for detecting and monitoring chemical toxins |
| CZ29220U1 (cs) * | 2015-09-14 | 2016-03-08 | Oritest Spol. S R.O. | Trubičkový detektor inhibitorů cholinesteráz ve vodě |
-
2016
- 2016-05-26 CZ CZ2016-311A patent/CZ306803B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4241180A (en) * | 1978-02-27 | 1980-12-23 | Owens-Illinois, Inc. | Enzymatic method for determining surfactants on surfaces |
| US4418147A (en) * | 1978-11-20 | 1983-11-29 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Ten Behoeve Van Nijverheid, Handel En Verkeer | Enzyme immobilization in a starch gel |
| CZ117993A3 (en) * | 1993-06-17 | 1995-10-18 | Oritest | Detection tube of choline esterases inhibitors in air and water |
| US20050054025A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-10 | Rogers Kim R. | Stabilized enzymes for detecting and monitoring chemical toxins |
| CZ29220U1 (cs) * | 2015-09-14 | 2016-03-08 | Oritest Spol. S R.O. | Trubičkový detektor inhibitorů cholinesteráz ve vodě |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23256657 (PubMed) D. Vetchý et al. "[Methods of pharmaceutical technology in preparation of pellets for detection of acetylcholinesterase inhibitors]." Ceska Slov Farm. 61 (5), 234-9 * |
| V Pitchmann et al.: "Výzkum detekcních trubicek pro bojové chemické látky v Ceské republice" Chem. Listy 105, 334-345 (2011) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308597B6 (cs) * | 2019-04-17 | 2020-12-23 | Oritest Spol. S R.O. | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2016311A3 (cs) | 2017-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liang et al. | Co-immobilization of multiple enzymes by metal coordinated nucleotide hydrogel nanofibers: improved stability and an enzyme cascade for glucose detection | |
| US20240011011A1 (en) | Biocatalytical composition | |
| Tukel et al. | Immobilization and kinetics of catalase onto magnesium silicate | |
| Sakr et al. | Encapsulation of enzymes in Layer-by-Layer (LbL) structures: latest advances and applications | |
| Memon et al. | Coordination of GMP ligand with Cu to enhance the multiple enzymes stability and substrate specificity by co-immobilization process | |
| Srivastava et al. | Stable encapsulation of active enzyme by application of multilayer nanofilm coatings to alginate microspheres | |
| Srivastava et al. | Stabilization of glucose oxidase in alginate microspheres with photoreactive diazoresin nanofilm coatings | |
| Alptekin et al. | Covalent immobilization of catalase onto spacer-arm attached modified florisil: Characterization and application to batch and plug-flow type reactor systems | |
| Cao et al. | PEI-crosslinked lipase on the surface of magnetic microspheres and its characteristics | |
| Othman et al. | Kinetic and thermodynamic study of laccase cross-linked onto glyoxyl Immobead 150P carrier: characterization and application for beechwood biografting | |
| CN109810969B (zh) | 一种基于镧系核苷酸配合物和dna定向固定技术构建人造多酶系统的方法 | |
| US12257310B2 (en) | Reactive and sorbent materials | |
| Fan et al. | One-pot spatial engineering of multi-enzymes in metal–organic frameworks for enhanced cascade activity | |
| Al-Garawi et al. | Immobilization of urease onto nanochitosan enhanced the enzyme efficiency: biophysical studies and in vitro clinical application on nephropathy diabetic iraqi patients | |
| CZ306803B6 (cs) | Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz | |
| Edwards et al. | Immobilization of active human carboxylesterase 1 in biomimetic silica nanoparticles | |
| CN103865916B (zh) | 磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用 | |
| EP1430142B1 (en) | Positive response biosensors and other sensors | |
| US8785142B2 (en) | Test arrangement | |
| CZ308597B6 (cs) | Obalené sférické matricové pelety určené k adjustaci do detekčních trubiček k detekci inhibitorů cholinesteráz | |
| US20080124780A1 (en) | Hybrid immobilized catalytic system with controlled permeability | |
| AU2002303565A1 (en) | Positive response biosensors and other sensors | |
| EP3196315B1 (en) | Spherical pellets, manufacturing process of such pellets, use, and a detection tube comprising such pellets | |
| Zhang et al. | Immobilization of hemoglobin on chitosan films as mimetic peroxidase | |
| Yu et al. | Microencapsulation of tannase by chitosan–alginate complex coacervate membrane: synthesis of antioxidant propyl gallate in biphasic media |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20200526 |