CZ2016311A3 - Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz - Google Patents

Abstract

Sférické pelety obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g.sup.-1.n., přičemž enzym je imobilizován ve formě pevné disperze v hydrofilním polymeru, která tvoří primární obal pelety v koncentraci 5 – 15 % hmotn. obalené pelety, která je následně obalena sekundárním semipermeabilním obalem z vodonerozpustného polymeru v koncentraci 1 – 10 % hmotn. obalené pelety, přičemž průměr výsledné velikosti obalených pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm, jakož i způsob výroby peletových jader, určených k nanesení primárního a následně sekundárního obalu, které jsou vyrobeny metodou extruze-sféronizace nebo rotogra-nulace, přičemž tato peletová jádra jsou oběma vrstvami (primární i sekundární) obalena ve fluidní vrstvě a výsledné obalené pelety se použijí k detekci inhibitorů cholinesteráz ve formě detekční trubičky obsahující uvedené obalené sférické pelety.

Description

Obalené sférické pelety, jejich výroba a adjustace v detekčních trubičkách k detekci inhibitorů cholinesteráz

Oblast techniky

Vynález se týká sférických obalených pelet, určených zejména pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyryl thiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, a obsahujících imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g'¹, jakož i způsobu výroby těchto pelet extruzí-sféronizací nebo rotogranulací s následným fluidním obalením, použití těchto pelet pro detekci inhibitorů cholinesteráz a detekční trubičky obsahující uvedené sférické pelety a určené zejména pro detekci nervově paralytických látek (NPL) v ovzduší.

Dosavadní stav techniky

Imobilizované enzymy jsou obvykle proteázy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti, aniž by ztratily svojí specifickou, enzymatickou aktivitu. Mohou být použity i opakovaně a/nebo kontinuálně. Imobilizace zde zajišťuje dostatečný kontakt reaktantů s enzymem, přičemž reaktant je obvykle obsažen v kapalné fázi, která prochází pevnou fází s imobilizovaným enzymem, případně je reaktant obsažen ve fázi plynné, která je nemísitelná s vodou. Na pevnou fázi je zde kladeno několik požadavků. Má mít velký měrný povrch, hydrofilní charakter, má být nerozpustná ve vodě a chemicky, mechanicky a teplotně stálá. Má mít rovněž vhodný tvar a velikost částic, být odolná proti mikrobiálnímu působení a dovolit opakované a/nebo kontinuální používání. V současné době se používá řada způsobů imobilizace.

Způsoby imobilizace

Enzymy na bázi cholinesteráz jsou známy v imobilizovaném stavu již řadu let. K jejich imobilizaci se používají stejné způsoby jako u ostatních proteáz. Patří sem zejména adsorpce na nerozpustný nosič, vazba na ionexy, vazba na magnetické částice, zabudování do membrán a filmů, zabudování do gelů a pěn, zesítěné agregáty, imobilizace pomocí nanostruktur, imobilizace pomocí kovalentní vazby či pomocí protilátek. Lze proto říci, že obecně se kjejich imobilizaci používají substráty a techniky, které nacházejí širší uplatnění v biochemickém průmyslu. V patentové a odborné literatuře je zachycena již řada chráněných postupů, mezi nimiž někdy nelze jednoznačně diferencovat, neboť v sobě obsahují více uvedených principů. Všechny tyto systémy se pak vyskytují, ať už jednotlivě nebo kombinovaně, v různých detekčních systémech.

Následující taxonomie je uvedena pro větší přehlednost.

a) Sorpce na nerozpustný nosič

Jedná se o nejstarší způsob imobilizace, kde se mezi sorbentem a enzymem uplatňují například běžné síly koheze, adheze, vodíkové můstky, Van der Waalsovy síly apod.

Patentový dokument U 5^3049411 (1962) uvádí u imobilizace cholinesterázy materiály jako je například filtrační papír nebo silikagel. Daný sorbent byl impregnován 4% roztokem enzymu, do něhož byl přidán hovězí sérový albumin nebo želatina, popř. jiná „stabilizující“ bílkovina a směs byla následně vysušena. Při zjišťování potenciální kontaminace byl disk „enzymového papírku“ zvlhčen a pak přes něj byl prosán vzduch. Po aplikaci detekčního roztoku obsahujícího indoxylacetát, neinhibovaná cholinesteráza substrát rozštěpila. Vzniklý indoxyl pak byl vzduchem oxidován na indigo. Takto mobilizovaný enzym zůstával delší dobu aktivní i při relativně vysokých teplotách, pokud byl skladován v suchu.

Rovněž patentový dokument 1^4241180 (1980) uvádí filtrační papír jako substrát pro butyrylcholinesterázu, kde namísto albuminu bylo s obdobnými výsledky použito roztoku 2merkaptoethanolu.

Patentový dokument 666627A (1971) uvádí jako inventivní krok při impregnaci porézního skla skutečnost, že enzym byl vázán na nosič za přítomnosti substrátu. Vazbou bylo zablokováno aktivní místo enzymu, takže se skupiny aktivního místa nemohly podílet na reakci se substrátem. Získaný mobilizovaný enzym pak měl vyšší stabilitu i aktivitu.

Patentový dokument U^3802997 (1972) chrání analogický způsob imobilizace enzymů, doplněný o sušení produktu lyofilizací nebo v rozprašovací sušárně. Jednodušším způsobem je příprava enzymového papírku podle patentového dokumentu US^ 120754 (1978), kde byla butyryl cholinesteráza mobilizována na filtračním papíře impregnaci roztokem enzymu vpufru obsahujícím Tergitol 15-S-12. Papírek byl použit k detekci inhibitorů organofosfátového typu.

Ze sorpce cholinesteráz na vybělenou bavlněnou tkaninu pak vychází patentový dokument CŽ288576 (1994) a ze sorpce na granulovanou celulózu pak patentový dokument CZ285242 (1995).

Patentový dokument US2008160556 (2008) chrání úpravu filtračního papíru pro mobilizaci acetylcholinesterázy určeného pro přípravu proužku pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy. Filtrační papír byl nejprve impregnován kaseinátem vápenatým a po vysušení na něho byla nanesena směs roztoku enzymu s trehalosou a Ellmanovým činidlem. Jako další nerozpustný nosič může být využito sklo ve formě tenkých kapilár (J. Environmental Anal. Chem. 1980, 8, 277-282), polystyrénová fólie (Toxicol. Appl. Pharmacol. 1984, 73, 105-109) nebo povrch elektrody (NATO ASI Senes 1988, 226, 187-194).

Jako další nerozpustný nosič k imobilizaci acetylcholinesteráz slouží i sférické pelety, tvorene mikrokrystalickou celulózou bez nebo s oxidem hlinitým a koloidním oxidem křemičitým (Čes. slov, farm., 2012, 61, 234-239). Patentová přihláška EP16466002.9 (2016) chrání možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu se specifickým povrchem 200 až 400 m ,g , který byl zpracován do sférických pelet spolu alespoň jedním sféronizačním činidlem.

b) Vazba na ionexy

Postup imobilizace cholinesterázy a její stabilizace na celulózové podložce chrání patentový dokument US^324858 (1982). Jako sorbent je zde využit iontoměnič DEAE nebo ECTEOLA papír s bazickými skupinami kovalentně navázanými na celulózu. Jako zdroj cholinesterázy byla využita plazma elektrického úhoře (Electrophorus electricus).

Podobně patentový dokument EPjpl 76585B1 (1988) uvádí jako nosič iontoměničový papír s diethylaminoethylovými skupinami pro impregnaci cholinesterázy z platýze. Nejlepsich výsledků bylo dosaženo, když byl iontoměničový papír nejprve ekvilibrován s roztokem chloridu sodného a po promytí a vysušení impregnován roztokem cholinesterázy ve fosfátovém pufru s obsahem sacharózy, dextranu a smáčedla Tween 80. Po vysušení mohl být enzymový papír přechováván v zatavených polypropylenových sáčcích při zachování minimální poloviční počáteční aktivity po dlouhou dobu za vysoké teploty. K dosažení dobré stability byla nutná přítomnost sacharózy.

c) Vazba na magnetické částice

Magnetické částice s imobilizovanou cholinesterázou byly využity ke stanovení inhibitorů cholinesterázy průtokovou injekční analýzou (FIA). Imobilizovaný protein zde byl uvolněn elektrickým impulzem (Anal. Chim. Acta 1990, 234, 113-117). K FIA je krom magnetických částic možné využít i pouhé porézní sklo (J. Chromatogr. A. 1991, 539, 47-54) případně různé methakryláty (Anal. Chim. Acta 1996, 324, 21-27).

d) Zabudování do membrán a filmů

Patentový dokument US^475793 (1949) popisuje imobilizovanou cholinesterázu na bezbarvém krevním stromatu, které lze považovat za biologickou membránu, kde je vázána fyzikálními a iontovými vazbami. I po dalších úpravách ovšem enzym nebyl dostatečně stabilní, což vyplynulo ze snižování aktivity uvolněné cholinesterázy z nerozpustného podílu po několikadenním skladování v lednici.

Patentové dokumenty CZ[284970 (1997) a CZj)566 (1997) chrání platinovou elektrodu s nanesenou grafitovou vrstvou modifikovanou kobaltnatým komplexem ftalocyaninu, která byla potažena membránou s imobilizovanou cholinesterázou. Membrána byla vytvořena nanesením směsi roztoku hovězího séra albuminu, roztoku butyrylcholinesterázy a roztoku glutaraldehydu jako látky síťující bílkoviny a roztoku fosfátového pufru o pH 7,4. Membrána pak vznikla zaschnutím nanesené vrstvy při pokojové teplotě.

Patentový dokument CN101586100 (2012) chrání filmy obsahující imobilizovanou cholinesterázu, které jsou vytvořeny z roztoku vodorozpustných polymerů, jakými jsou polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon nebo arabská guma ve fosfátovém pufru. Dále se může jednat o kompozit obsahující kromě vodorozpustného polymeru i „lipoplast“ ve formě lipofilního polymeru. K vytvořeným roztokům se přidává enzym a hovězí sérum albumin. Enzymový film se připravuje jejich nasáknutím nebo nanesením na vhodnou podložku.

Dále existují práce, které popisují zabudování cholinesteráz do polyakrylové membrány, případně pomocí kovalentní vazby na povrch nylonových trubiček, nebo imobilizaci vlipidických membránách lipozomů (Adv. Mat. Res. 2013, 726-731, 850-53). Jsou známy také pokusy o imobilizaci v nitrocelulózovém filmu (Anal. Chim. SSSR 1990, 45, 10021004).

e) Zabudování do gelů

Patentový dokument US>j4241180 (1980) uvádí imobilizaci cholinesterázy z koňského séra v polysacharidovém gelu na bázi škrobu, agaru nebo karagenanu, který vznikl lyofilizací tuhnoucího gelu na filtračním papíře. Imobilizovaná cholinesteráza pak rozštěpila substrát a vzniklý thiocholin zredukoval modrý 2,6-dichlorfenolindofenol na bezbarvý produkt. Byl-li k roztoku přidán inhibitor cholinesterázy, k odbarvení nedošlo. Nevýhodou takto připravovaných polysacharidových gelů je nízká mechanická pevnost.

X

Tuto nevýhodu odstraňuje patentový dokument D^946642 (1988), který využívá vyšších koncentrací škrobu. Připravuje se zde škrobový extrudát, vznikající extruzí škrobové pasty. Ten se následně vysuší, rozemele a přesítuje.

Patentový dokument Woj8300345 (1987) chrání způsob navázání enzymů na kopolymemí gely, obsahující karboxylové skupiny. Nosičem enzymu byl slabě kyselý katex Akrilex C-100, což je parciálně hydrolyzovaný kopolymer akrylamidu s methylen-bis-akrylamidem. Ten ve srovnání s jinými nosiči poskytl nejlepší výsledky. Při srovnávacích experimentech byla úspěšná i imobilizace v zesítěném maleinanhydridu.

Patentový dokument BC^0904 (1992) popisuje imobilizaci cholinesterázy z hovězího, telecího a lidského séra v agarovém gelu. Enzym se na sorbentu zachytil v prostředí s nízkon iontovou silou. Adsorpční vazba enzymu byla při nízké iontové síle dostatečně silná, o čemž svědčilo vymyti balastních bílkovin při promyvání roztokem chloridu sodného. Při zvýšení iontové síly se však enzym uvolnil a byl vymyt.

Patentový dokument WC^2009061921 (2009) chrání způsob stabilizace cholinesterázy formou imobilizace v pórech gelu na bázi přírodních i syntetických polymerů. Vedle toho uvádí i stabilizaci ve formě liposomů a nanokompositů a v polyuretanové pěně.

Existují i odborné studie, zabývající se imobilizaci acetylcholinesteráz k analytickým účelům za pomocí fluorimetrie do škrobového gelu, naneseného na polyuretanové podložce (Anal. Chem.1965, 37, 1675-1680) nebo v enzymových polštářcích (Anal. Biochem. 1967, 19, 587-592).

f) Zabudování do pěny ,

Patentový dokument U^6406876Bl (2002) uvádí polyuretanovou pěnu jako prostředek imobilizace cholinesteráz. Tento způsob imobilizace spočívá v reakci aminoskupiny lysinových a argininových zbytků lokalizovaných na povrchu molekuly, přičemž žádná není na vstupu do dutiny aktivního centra. Navázání enzymu proto neblokuje přístup substrátů, inhibitorů a reaktivátorů do katalytického místa. Příprava porézního nosiče zahrnuje použití prepolymeru a povrchově aktivní látky. Výsledek imobilizace značně závisí na intenzitě míchání během polymerace. Před denaturací vlivem střižných sil chránil imobilizovaný enzym přídavek povrchově aktivních látek, jako je Pluronic C-65, popř. malé množství glycerolu. Zmobilizované enzymy jsou stálé i při vyšší teplotě. Při konstrukci biosenzoru mohou být spolu s cholinesterázou koimobilizovány i další enzymy.

Patentové dokumenty USJ6759220 (2004) a 14^7422892 (2008) obsahují variace ve způsobu přípravy polyuretanové pěny, které ovlivňují jak její vlastnosti, tak i stupeň interakce enzymu s reaktivními skupinami pre-polymeru. Z hydrolytických enzymů zde byly mobilizovány i butyrylcholinesteráza a acetylcholinesteráza. Zařízení s těmito enzymy bylo využito pro kontinuální monitoring různých inhibitorů ve vodě i ve vzduchu.

g) Zesítěné agregáty

Patentový dokument Rl^ 182929 (2002) uvádí metodu zesítění bílkoviny glutaraldehydem k imobilizaci cholinesterázy z koňského séra. Předmětem ochrany je souprava pro stanovení inhibitoru cholinesteráz s použitím imobilizovaného enzymu. Imobilizace byla provedena rovnoměrným nanášením roztoku cholinesterázy z koňské krve v pufru, spolu se síťujícím činidlem, na pohybující se pás vláknitého materiálu. Nanášení enzymu a činidla probíhalo dvěma oddělenými trubicemi.

Patentový dokument RUj2386120 (2010) chrání optický biosenzor pro detekci ireverzibilních inhibitorů, který obsahuje jako aktivní prvek intenzivně fluoreskující komplex cholinesterázy s reverzibilním inhibitorem — luminogenem. Komplex je imobilizovaný na „neutrální podložce“ uzavřením v N-isopropylakrylamidovém gelu řídce síťovaném methylenbisakrylamidem. Zesítěný gel se připravuje přímo na podložce fotopolymerací.

h) Imobilizace pomocí nanostruktur

Za nový typ nosiče lze považovat uhlíková nanovlákna, která byla nejprve karboxylována a pak ultrazvukem dispergována v roztoku. Po odstranění roztoku vzniká porézní membrána, která může prostřednictvím karbodiimidu sloužit k vazbě cholinesterázy (J. Mater. Chem. B 2014, 2,915-922).

i) Imobilizace pomocí kovalentní vazby

Při tomto druhu imobilizace se používají specifické vazebné reakce mezi enzymem a substrátem. Patentový dokument U^519538A (1970) uvádí jako sorbent, který poskytuje s enzymem kovalentní vazbu, silikagel, různé silikáty (bentonit, wollastonit) a oxidy kovů (hliníku, hydroxylapatitu nebo oxidu nikelnatého, jehož vrstvička byla např. získána po oxidaci sítka z niklu). Nosič byl nejprve modifikován reakcí s aminopropyltriethoxysilanem v toluenu. Primární aminoskupiny získaného produktu pak byly využity k navázání enzymů známými postupy imobilizace např. pomocí dicyklohexylkarbodiimidu. Připravený derivát s aromatickými aminoskupinami pak může být diazotován a kopulován s enzymem. Aminoskupiny modifikovaného nosiče mohou být také aktivovány reakcí s thiofosgenem za vzniku derivátu s isothiokyanátovými skupinami, které pak reagují s aminoskupinami enzymu. Nejčastěji se ale využívá reakce s glutaraldehydem, kdy se enzym váže za vzniku Schiffových bází.

Předmětem patentového dokumentu DEjí768934 (1972) je mimo jiné obecný způsob imobilizace enzymů na nerozpustný polymemí nosič s kovalentně navázaným reverzibilním inhibitorem. Na ten se pak váže odpovídající enzym, který lze z afinitní vazby uvolnit změnou pH a/nebo iontové síly prostředí, případně vytěsněním kompetitivními látkami nebo substráty.

Patentový dokument USJ3809616A (1974) uvádí jako nosič upravený filtrační papír s modifikovaným polyakroleinem s imobilizovanou cholinesterázou z koňského séra. Při mobilizaci cholinesterázy se na polymer (polyakrolein solubilizovaný siřičitany a následně zesítěný reakci s alifatickým diaminem) navázalo více než tři čtvrtiny enzymu. Cholinesteráza se přitom mohla kovalentně vázat na zbytkové aldehydické skupiny modifikovaného polyakroleinu, ale také mohla být vázána nekovalentními iontovými vazbami na jeho aminoskupiny. Po impregnováni roztokem N-methylindoxylbutyrátu v isopropanolu se na papíře postupně objevilo tmavě zelené zbarvení produktu oxidací indoxylu, který vznikl hydrolýzou esteru. V přítomnosti inhibitorů cholinesterázy ve vzduchu ke vzniku zbarvení nedocházelo.

Patentový dokument U^7572764 (2009) uvádí rekombinantní lidskou acetylcholinesterázu nebo puntíkovanou acetylcholinesterázu z hovězího fetálního séra a butyrylcholinesterázu, navázané skrze aminoskupinu na rozpustný polymer - methoxypolyethylenglykol 5000 nebo 20 000, který byl aktivovaný sukcinimidylpropionátem. Ve srovnání s nativním enzymem konjugáty lépe odolávají působení krevních proteáz a jsou stabilnější v krevním oběhu. Mohou proto take lépe sloužit k detoxikaci organismu od organofosfátů. Princip aktivace koncových hydroxylových skupin polyetherů deriváty sukcinimidu lze využít nejen pro přípravu rozpustných konjugátů, ale pro přípravu enzymů mobilizovaných na nerozpustných nosičích s hydroxylovými skupinami. Kromě volných aminoskupin mohou být k reakci využity i thiolové skupiny cysteinových zbytků.

Ze stejného principu vychází i patentový dokument WC^009139905, který chrání konjugáty cholinesterázy s rozpustnými nepeptidickými polymery se zlepšenými vlastnostmi.

Patentový dokument E^l 561100 (2005) uvádí specifický postup vazby acetylcholinesterázy na selektivní tranzistor z oxidu hlinitého prostřednictvím kyanurchloridu. Iontově selektivní tranzistor s mobilizovaným enzymem vytváří biosenzor, z něhož se enzym uvolňuje působením elektrického pole.

Patentový dokument W6^00806495 (2008) uvádí mobilizaci acetylcholinesterázy z elektrického úhoře pomocí konjugátu s avidinem, který vznikl působením glutaraldehydu. Kon jugát reagoval s biotinem, který byl navázán na povrchu plastové mikrotitrační destičky. Systému je možné využít jako biosenzoru.

Existují práce, které uvádějí vazbu cholinesterázy na piezoelektrický senzor, tvořený křemenným krystalem, povlečeným tenkými vrstvičkami zlata s navázanou monovrstvou 11merkaptoundekanové kyseliny s derivátem kokainu inhibujícím enzym. Na takto upravený povrch je pak navazána cholinesteráza. V přítomnosti jiných inhibitorů se pak navázaný enzym uvolňuje (Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382,1904-1911).

j) Imobilizace pomocí protilátek

Patentový dokument E^O73889(B1) (2003) chrání imobilizaci cholinesterázy na fragment myší protilátky proti lidské sérové cholinesteráze, který je zde fixovaný sorpcí v jamkách polystyrénové mikrotitrační destičky. Tvorby komplexu fragmentu protilátky a cholinesterázy se využívá ke stanovení aktivity cholinesterázy v séru, která při onemocnění cirhózou nebo rakovinou jater klesá. Stanovení je založeno na afinitě další látky k cholinesteráze, a to lektinu z houby mísenky oranžové (Aleurici auratid), na nějž byl navázán biotin. Cholinesterázy jako glykoproteiny s lektiny interagují.

V analogickém patentovém dokumentu 11^2004257996 (A) (2004) se chrání snáze dostupný lektin z čočky. Patentový dokument 11^004257996 (A) (2004) analogicky chrání i značenou protilátku pro její snadné stanovení.

k) Detekční systémy

Na základě výše popsaných mechanismů, uplatňujících se v imobilizaci cholinesteráz, existují detekční systémy, které využívají tyto principy ke konstrukci sofistikovaných zařízení. Ta se dají s různým úspěchem využívat při detekci inhibitorů cholinesteráz například v životním prostředí. Patentový dokument 2^689224(1972) chrání sofistikované laminované destičkové zařízení kryté polymery monochlorotrifluoroethylenem nebo tetrafluoroethylenem, které je adjustované v hliníkové fólii. Patentový dokument Usj3809617A (1974) chránící kombinované detekční disky a patentový dokument W(^8504424 (1985) chrání jednoduché detektorové kity s dvěma dotykovými plochami pro detekci látek.

Zcela originálním řešením jsou detekční trubičky pro inhibitory cholinesteráz, kde byl použit lyofilizovaný preparát butyrylcholinesteráza s plnivem želatinou, která zvyšovala stabilitu enzymu (Int. J. Environ. Anal. Chem. 1979, 6, 89-94). Patentový dokument C^285242 (1993) popisuje detekční trubičku k indikaci bojových chemických látek na bázi inhibitorů cholinesteráz ve vzduchu a ve vodě.

Z dosavadního stavu techniky vyplývá, že v současné době jsou velmi progresivním způsobem detekce inhibitorů cholinesteráz v terénu tzv. detekční trubičky. Patentový dokument CZ 285242 (1993) uvádí takový detekční systém s obsahem cholinesterázy (acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza), imobilizované na celulózových granulích o rozměrech 0,8 1,2 mm, případně ve formě sférických pelet o velikosti 0,8 a 1,25 mm, připravených metodou extruze sferonizace (Čes. Slov. Farm. 2012, 61, 234-239). Granulát i pelety jsou adjustovány ve skleněných trubičkách. Granule a pelety v tomto detekční systému však poskytují poměrně málo syté zbarvení a poměrně málo zřetelný a uniformní barevný přechod při enzymatické kolorimetrické reakci ať už s použitím chromogenních činidel a substrátů nebo samotných chromogenních substrátů. Tento stav se snaží zlepšit patentová přihláška E^l 6466002.9 (2016), která popisuje možnost imobilizace acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy za pomocí nerozpustného nosiče na bázi magnesiumaluminometasilikátu, který byl zpracován do sférických pelet o rozměrech 0,8 do 1,25 mm a kterými byly detekční trubičky vyplněny. Zde sice docházelo k sytému zabarvení pelet, ale tato barva se postupem času vyplavovala do reakčního prostředí, které rovněž zbarvila, což mohlo způsobit problém v identifikaci barevného přechodu. Tento nedostatek eliminuje řešení podle následujícího vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou sférické obalené pelety, určené zejména pro detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, a obsahující imobilizovaný enzym na bázi cholinesteráz o aktivitě 1 až 100 nkat.g-1, jejichž podstata spočívá v tom, že enzym je imobilizován na povrchu peletových jader ve formě pevné disperze v hydrofilnim polymeru, tvořící primární obal peletových jader, který je následně překryt sekundárním semipermeabilnim obalem z vodonerozpustného polymeru, přičemž průměr výsledné velikosti obalených pelet se minimálně ze 75 % nachází v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm.

Primární hydrofilní polymer je tvořen různými alkylovanými deriváty celulózy, polyvinylpyrrolidonem, polyvinylalkoholem, polyethylenglykolem, škrobem a jeho deriváty, dextranem, dextrinem, akácií, guarovou, arabskou nebo xanthanovou gumou, případně algináty, nebo libovolnou směsí těchto látek v libovolném poměru, ve výsledné koncentraci od 0,1 do 20 % hmotnosti obalené pelety, výhodně hydroxypropylmethylcelulózou (použita pod ko(A merčním názvem Pharmcoat 606, ShinEtsu, Japan) v koncentraci 5-/15% hmotnosti obalené pelety.

Sekundární semipermeabilní, vodonerozpustný polymer je tvořen akryláty a jejich deriváty, estery a étery celulózy, šelakem, polyvinylacetátem, případně jejich směsí v libovolném poměru, případně ve směsi s výše uvedenými hydrofilními polymery v celkové koncentraci od 0,1 do 15 % hmotnosti obalené pelety, výhodně směsí kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny (použita pod komerč ním názvem Eudragit® RL, Evonik, Germany) ve směsi s polyethylenglykolem a/nebo polyvinylpyrolidonem v jejich vzájemném poměru 1,5-6,5 : 0,5-1,7 : 0,1-0,5, přičemž celková koncentrace obalu činí 1 4 10 % hmotnosti obalené pelety.

Podíl imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz vhydrofilním obalu je roven 0,01 až 1 % hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost pelet, k zajištění výsledné aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz v rozmezí od 1 do 100 nkat.g¹. Enzym na bázi cholinesterázy tvoří acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza.

Obalené pelety se adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity imobilizovaného enzymu na bázi cholinesteráz od 0,1 do 100 nkat, výhodně 3 nkat, v jedné detekční trubičce.

Předmětem vynálezu je rovněž výroba peletových jader, určených k nanášení obalu, které se vyrobí metodou extruze-sféronizace nebo rotogranulace, a následné se obaly nanesou ve fluidní vrstvě.

Předmětem vynálezu je rovněž použití výše definovaných sférických pelet pro detekci inhibitorů chlolinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu.

Předmětem vynálezu je rovněž detekční trubička pro detekci inhibitorů chlolinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiocholinu nebo/a butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje výše definované sférické pelety, substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiocholin a chromogenní činidlo.

Z výše uvedeného je zřejmé, že se vynález týká složení sférických pelet s obsahem imobilizovaného enzymu cholinesterázy resp. butyrylcholinesterázy o aktivitě 1 až 100 nkat.g ', které jsou adjustovány ve formě skleněných detekčních trubiček.

Enzym je v obalených peletách imobilizován ve formě primárního, hydrofilního obalu a tato vrstva je následně překryta semipermeabilním, vodonerozpustným obalem, který zabraňuje nadměrnému vyplavení enzymu do vnějšího prostředí. Obalené pelety jsou adjustovány do skleněných trubiček. Trubičky s adjustovanými peletami slouží pro detekci nervově paralytických látek (NPL) v ovzduší.

Trubička obsahuje dvě vrstvy a dvě skleněné ampulky s roztoky. Indikační vrstva obsahuje pelety s imobilizovanou acetylcholinesterázou/butyrylcholinesterázou. Další vrstva obsahuje drcené sklo impregnované substrátovým acetylthiocholinem/butyrylthiocholinem a chromogenním činidlem (Ellmanovo činidlo). Obě ampulky jsou plněny roztokem pufru o pH Λ2.

6/-9.

Při detekci se ampulka u indikační vrstvy rozbije kovovým bodcem a její obsah se setřepe na pelety. Do trubičky se nasaje ekvivalentní objem vzduchu. Poté se rozbije druhá ampulka a její obsah se setřese přes drcené sklo až na pelety. Hodnotí se změna zabarvení vrstvy s obsaženými peletami. Pokud dojde ke žlutému zabarvení, ovzduší neobsahuje NPL. V opačném případě zůstane vrstva beze změny, případně dochází ke žlutému zbarvení až po delší době. Jedno z možných provedení uvedené detekční trubičky je znázorněno na obr. 1.

pegenním substrátem.

1. Ampulka s tlumivým rojtókem;

2. Vymezovací a těsnípřtělíska;

3. Indikační vrstva^peletami;

4. Vrstva drceného skla se substrátem a indikátorem, případně jen s chroi

ObyzÍPříklad konstrukce detekční trúÚčky

Principem detekce NPL je enzymatická kolorimetrická reakce, kdy v nepřítomnosti

NPL dochází k hydrolýze acetylthiocholinu, resp. butyrylthiocholinu cholinesterázou na příslušnou kyselinu a thiocholin. Thiocholin dále reaguje s Ellmanovým činidlem (kyselinou

5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou)) za vzniku kyseliny 2-nitro-5-thiobenzoové (viz obr. 2). Kyselina 2-nitro-5-thiobenzoová pak způsobí žluté zabarvení detektoru, které lze vyhodnotit pouhým okem nebo spektrofotometricky při 412 nm. Pokud ke změně barvy nedojde, jedná se o kontaminaci ovzduší NPL, kdy NPL inhibuje enzym a nedochází k uvolnění thiocholinu a následné barevné reakci. Detekční trubičku lze využít i ro zjištění přítomnosti NPL ve vodě.

Obr. 2 Reakční schéma Ellmanovy reakce

Kromě Ellmanova činidla lze k detekci NPL využít i jiná chromogenní činidla nebo chromogenní substráty, např. indoxylacetát, kdy hydrolýzou indoxylacetátu vzniká indoxyl a kyselina octová. Indoxyl se poté samovolně přeměňuje na indigo a roztok se zbarvuje do modra (obr. 3). Postup práce s trubičkou je zde obdobný.

AChE

+ 2 CH jCOOH

Obr. 3 Reakční schéma s indoxylacetátem

Dosavadní řešení imobilizace enzymů ve vodorozpustných membránách CN|101586100 (2012) nebo pelet adjustovaných ve formě trubiček s obsahem pelet E^l 6466002.9 (2016) mají tu nevýhodu, že při testování dochází k vyplavení zabarvení do vnějšího prostředí, čímž se snižuje intenzita zbarvení samotných pelet. V případě E^l 6466002.9 (2016) se z těla pelet uvolňuje zabarvení do vnějšího, tekutého prostředí.

1X

Tuto nevýhodu překvapivě odstranila imobilizace enzymu rovněž na povrchu pelet, avšak ve vodorozpustné membráně ve formě primárního obalu, který je obalen ještě další vodonerozpustnou (sekundární obal), avšak semipermeabilní membránou. Mechanismus účinku spočívá vtom, že pelety při styku skapalinou obsahující činidlo dovolí přístupu činidla k imobilizovanému enzymu skrze sekundární obal. Sekundární obal je sice nerozpustný ve vodě, ale dovolí prostupu vody s činidlem k primárnímu obalu. Zde pak dojde k barevné reakci. Sekundární obal, který zůstává zachován, pak zpomalí odplavení vzniklého barviva do vnějšího prostředí. To se viditelně projeví i v intenzitě zabarvení tohoto prostředí, které odpovídá změřené absorbanci, jejíž hodnota je přímo úměrná koncentraci uvolněného barviva. Například při použití Ellmanova činidla o aktivitě 30 nkat/g nosiče je u pelet připravených dle ΕΡ| 6466002.9 (2016) absorbance vnějšího prostředí po pěti minutách 0,4114. U pelet připravených podle příkladů uvedených, v tomto vynálezu se absorbance vnějšího prostředí nachází za stejnou dobu v rozmezí 0,1928 ^0,3369 dle jednotlivých kompozic (viz tab. 2). Nižší absorbance odpovídá i nižší koncentraci uvolněného barviva. Detailní popis zkoušky uvádí příklad 9 tohoto vynálezu.

Toto provedení má pak další výhodu v tom, že celé množství enzymu je koncentrová no pouze ve formě primárního obalu na povrchu pelety, nikoliv v celém jádru pelety, jako v případě E^l 6466002.9. Tím se zintenzivní barevná reakce imobilizovaného enzymu s činidlem, jelikož barvivo je zakoncentrováno na mnohem menší ploše. Například při použití Ellmanova činidla o aktivitě 30 nkat/g nosiče vzniká u pelet připravených dle E^í 6466002.9 (2016) zabarvení PANTONE 116 U. U pelet připravených podle příkladů uvedených v tomto vynálezu (viz tab. 2) vzniká mnohem intenzivnější zbarvení ve škále mezi PANTONE 122 až

123 U (podle vzormku PANTONE FORMULA GUIDE). Detailní popis zkoušky uvádí příklad tohoto vynálezu.

Tento vynález tedy zabraňuje vyplavování barviva do vnějšího prostředí, což vede k lepšímu barevnému rozlišení zabarvení pelet vůči vnějšímu prostředí, a zároveň zintenzivňuje samotné zabarvení pelet díky koncentraci barviva na menší ploše resp. jen na povrchu pelet.

Primární obal je zde výhodně tvořen hydroxypropylmethylcelulózou v koncentraci 5 t-dA> 15 % (použita pod komerčním názvem Pharmacoat 606, ShinEtsu, Japan) a tento hydrofilní polymer velice rychle hydratuje a přijímá vodu. Sekundární obal je výhodně tvořen směsí kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny (použita pod komerčním názvem Eudragit® RL, Evonik, Germany). Již tento obal je semipermeabilní, dovolující prostupu vody, ale sám je vodonerozpustný a zůstane po celou dobu testování na peletě. Prostupnost vody z časového hlediska lze zvýšit přísadou ve vodě roz-ΙΫ~ · : · Ί pustných látek, které v obalu vytvoří póry, umožňující rychlý přístup činidla k primárnímu, hydrofilnímu obalu s obsahem mobilizovaného enzymu. Mezi tyto vodorozpustné látky patří polyethylenglykol a/nebo polyvinylpyrrolidon, případně jejich směs. Výhodný hmotnostní poměr Eudragit® RL : polyethylenglykol: polyvinylpyrrolidon činí 1.5-6.5 : 0.5-1.7 :0 1-0 5 přičemž celková koncentrace obalu činí 1 jr 10 % hmotnosti obalené pelety. Primární a sekundární obal jsou ve dvou krocích naneseny z vodného (primární obal) a lihového (sekundární obal) roztoku na sférická peletová jádra podle uvedených příkladů (1 ^-8).

Výsledné sférické obalené pelety mají průměr velikosti ze 75 % v rozmezí velikosti od 0,1 do 3,0 mm, výhodně od 0,8 do 1,25 mm. Zpracování do formy pelet má pak oproti stavu techniky (EP 16466002.9) i tu výhodu, že pelety jsou chráněny sekundárním obalem, což snižuje jejich abrazi při mechanickém namáhání, a tím zabraňuje tvorbě prachu při manipulaci s nimi.

Zmobilizované cholinesterázy jsou zde zastoupeny ve formě acetylcholinesterázy nebo butyrylcholinesterázy, případně jejich směsi v neomezeném poměru. Výhodně je zde obsažena butyrylcholinesteráza samotná, protože umožňuje použít i chromogenní substráty (tj. látky, které hydrolyzují přímo za vzniku barevného produktu, např. indoxylacetát), což může být v případě acetylcholinesterázy problematické. Hydrolýza totiž může být pomalejší a enzym může být inhibován reakčními produkty. Poměr cholinesteráz k tomuto sorpčnímu anorganickému materiálu v peletách činí od 0,01 do 1 % hmotnosti výsledných pelet.

Výsledné obalené pelety jsou adjustovány do skleněných detekčních trubiček tak, aby aktivita enzymu(ů) činila od 0,1 do 100 nkat v jedné detekční trubičce, výhodně 3 nkat. Při manipulaci s peletami resp. jejich adjustace do trubiček, oproti neobaleným peletám (EP 16466002.9), rovněž prakticky nevzniká žádný prachový podíl, který může vést ke ztrátám vnější vrstvy s nasorbovaným enzymem.

Pelety s imobilizovanými enzymy se pak využijí k detekci inhibitorů cholinesteráz metodou enzymatické hydrolýzy substrátu acetylthiocholinu nebo butyrylthiocholinu nebo jejich směsi, za vzniku odpovídajícího thiolu, jenž je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, případně metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu.

Příklady provedení

Způsob přípravy podle vynálezu je objasněn následujícími příklady provedení, aniž by jimi byl rozsah vynálezu omezen.

Příklady 1 až 8

Příklady složeni pelet v procentech hmotnosti uvádí tab. 1. Všechny příklady se zpracovávají společným postupem, jenž se liší pouze rozdílným složením.

Tab. 1 Složení pelet v procentech hmotnosti

	Příklad	1	2	3	4	5	6	7	8
Jádro	Avicel PH 101 b	88,89	86,96	85,10	83,33	88,89	86,96	85,10	83,33
Voda*	97,0	95,7	93,6	91,7	97,0	95,7	93,6	91,7
Primární obal	Pharmacoat 6062)	8,89	8,69	8,51	8,33	8,89	8,69	8,51	8,33
Voda*	80,01	78,21	76,59	74,97	80,01	78,21	76,59	74,97
IU BuChE**	177,80	173,80	170,20	166,60	177,80	173,80	170,20	166,60
Sekundární obal i)	Eudragit® RL3)	1,78	3,48	5,11	6,67	1,67	3,26	4,79	6,25
PEG 400	0,44	0,87	1,28	1,67	0,44	0,87	1,28	1,67
PVP	-	-	-	-	0,11	0,22	H0,32	0,42
Ethanol*	12,46	24,36	35,77	46,69	12,46	24,36	35,77	46,69

²⁾ hydroxypropylmethylcelulóza ³⁾ směs kopolymeru ethylakrylátu, methylmethakrylátu a esteru amonné soli methakrylové kyseliny * není součástí výrobku ** ředí se dle aktuální koncentrace substrátu a IU nejsou zahrnuty do hmotnosti obalené pelety.

Postup přípravy jader

Množství Avicel® PH 101 smísíme po dobu tři minut s množstvím vody v rychloběžném mixéru (Tefal Kaleo, Francie) do vzniku vlhké hmoty.

Vlhkou hmotu extrudujeme sítem o velikosti otvoru 1,25 mm na extrudéru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 100 ot./min.

Extrudát sferonizujeme na sferonizeru (PharmTex 35T, Wyss and Probst Engineering, Švýcarsko) při rychlosti 1000 rpm po dobu 5 minut.

Vzniklé pelety vysušíme při teplotě 60 °C po dobu 24 hodin (Horo 038A, Dr. Ing. A. Hoffman GmbH, Německo) do vlhkosti pod 0,5 %.

Postup přípravy primárního obalu

Pharmcoat® 606 se na elektromagnetické míchačce disperguje ve vodě zahřáté cca na 70 °C a poté se disperze míchá do vychladnutí na cca 25 °C a přidáme potřebné množství roztoku butyrylcholinesterázy o koncentraci 50 Ul.g’¹.

Roztok se poté nastříkne na povrch pelet ve fluidním zařízení M-100 (Medipo, Česká republika) při teplotě 40 °C, velikosti trysky 1 mm a tlaku vzduchu 1)2 bar. Obalené pelety se následně dosuší při 25 °C po dobu 24 hodin.

Postup přípravy sekundárního obalu

Eudragit® RL se na elektromagnetické míchačce rozpustí v lihu a do roztoku se za stálého míchání přidá PEG 400, případně PVP až do rozpuštění.

Roztok se poté nastříkne na povrch pelet s již ukotveným enzymem ve fluidním zařízení M100 (Medipo, Česká republika) při teplotě 40 °C, velikosti trysky 1 mm a tlaku vzduchu lf2 bar. Obalené pelety se následně dosuší při 25 °C po dobu 24 hodin.

Příklad 9

Test funkce pelet (aktivity enzymu)

Do zkumavky se naváží příslušné množství pelet tak, aby navážka obsahovala 9,375 nkat enzymu.

K peletám se k pro vlhčení přidá 0,5 ml vody a nechá se stát 3 minuty.

Po 3 minutách se ke vzorku napipetuje 0,5 ml zkušebního roztoku obsahujícího Ellmanovo činidlo a butyrylthiocholin jodid a nechá se působit 5 minut.

Po pěti minutách se roztok nad peletami slije do čisté zkumavky.

K měření absorbance se odpipetuje do 0,5 cm kyvety 0,2 ml slitého roztoku a přidá se 1,4 ml pufru o pH 7,6. Měření probíhá při vlnové délce 412 nm (UV/VIS spectrophotometr Lambda 25, PerkinElmer®, Waltham, USA) proti čistému pufru o pH 7,6. Výsledky dosažené při testu uvádí tab. 2.

Tab. 2 Absorbance vnějšího vodného roztoku a barva dle škály Pantone®

Vzorek	Průměrná absorbance	Směrodatná odchylka	Barva ze škály Pantone®
EP16466002.9	0,4114	0,0081	Pantone® 116 C
5	0,3369	0,0020	Pantone® 122 U
6	0,2413	0,0015	Pantone® 123 U
7	0,1928	0,0006	Pantone® 123 U

Příklad 10

Trubička obsahuje (ve směru proudění kontaminovaného vzduchu):

Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).

Vrstvu drceného skla impregnovaného substrátem a indikátorem (případně jenom chromogenním substrátem). Délka vrstvy 10 mm, hmotnost vrstvy asi 0,1 g.

Vrstvu pelet s imobilizovaným enzymem. Délka vrstvy 10 mm, hmotnost asi 0,05 g. Ampulku s roztokem pufru (objem 0,03 ml).

Vrstvy jsou upevněné a vzájemně oddělené vymezovacími tělísky z PE, propouštějícími plyn i kapalinu (ve tvaru hvězdiček).

Postup práce s detekční trubičkou

Rozdrtíme spodní ampulku a setřepeme její obsah na vrstvu pelet s enzymem.

Provedeme odběr vzorku kontaminovaného vzduchu (ruční nebo elektrickou pumpičkou, objem 1 litr vzduchu).

Počkáme 2 minuty (doba inkubace).

Rozdrtíme horní ampulku a její obsah setřepeme přes vrstvu drceného skla až na vrstvu pelet (smýt impregnovaná činidla).

Vyhodnotíme změnu zabarvení vrstvy pelet. Pokud vzduch není kontaminován, systém pracuje normálně a dochází k redukci chromogenního činidla nebo hydrolýze ohromo genního substrátu, což je doprovázeno barevnou změnou (zabarvení nebo odbarvení indikační vrstvy). V přítomnosti kontaminantů se zabarvení indikační vrstvy po určitou dobu nemění. Na základě délky této doby lze určit koncentraci kontaminantů v ovzduší.

Průmyslová využitelnost

Obalované pelety by mohly mít uplatnění v průmyslové výrobě detekčních trubiček ke zjišťování inhibitorů cholinesteráz, zejména nervově paralytických bojových chemických látek a dalších vojensky významných sloučenin s podobným mechanismem toxického účinku. Jednoduché detekční prostředky tohoto typu jsou standardní součástí technické výbavy vojenských chemických jednotek a chemických specialistů v oblasti ochrany obyvatelstva.

Claims (5)

1. Patentové nároky

   1. Sférické pelety, určené pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy, tvořené nerozpustným nosičovým jádrovým materiálem, zejména mikrokrystalickou celulózou, tvořícím jádro pelet, a obsahující mobilizovanou acetylcholinesterázu a/nebo butyrylcholinesterázu o aktivitě 1 až 100 nkat.g’, vyznačené tím, že acetylcholinesteráza a/nebo butyrylcholinesteráza je mobilizována na povrchu jader pelet ve formě mezilehlé vrstvy pevné disperze acetylcholinesterázy a/nebo butyrylchloinesterázy v hydrofilním polymeru, tvořeném alespoň jednou látkou ze souboru sestávajícího z alkylovaného derivátu celulózy, polyvinylalkoholu, polyethylenglykolu, škrobu a jeho derivátu, dextranu, dextrinu, akácie, guarové, arabské a xanthanové gumy a alginátu, přičemž uvedená mezilehlá vrstva tvoří primární obal pelet, který je překryt povrchovou vrstvou semipermeabilního vodonerozpustného polymeru, tvořenou alespoň jednou látkou ze souboru sestávajícího z akrylátů a jejich derivátů, esterů a etherů celulózy, šelaku a polyvinylacetátu, případně v kombinaci s hydrofilním polymerem definovaným pro mezilehlou vrstvu, přičemž uvedená povrchová vrstva tvoří sekundární obal pelet, přičemž velikost obalených pelet je alespoň ze 75 % v rozmezí od 0,1 do 3,0 mm, hmotnost uvedené mezilehlé vrstvy představuje 0,1 až 20 hmotnostních %, vztaženo na celkovouJimQtnos^qbalené pelety, a hmotnost uvedené povrchové vrstvy představuje 0,1 až 15 hmotnpstníeh %, vztaženo na celkovou hmotnost obalené pelety, a obsah acetylcholinesterázy a/nebo butyrylchloinesterázy imobiklizované v primárním obalu pelety je roven 0,01 až l^rt^taP/o, vztaženo na celkovou hmotnost obalené pelety.
2. 2. Způsob výroby sférických pelet definovaných v nároku 1, vyznačený tím, že se na jádra pelet vyrobená extruzí-sféronizací nebo rotogranulací nanese ve fluidní vrstvě primární obal pelet a následně sekundární obal pelet.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se obalené pelety adjustují do skleněných detekčních trubiček v množství nezbytném k dosažení aktivity mobilizované acetylcholinestrázy a/nebo butyrylcholinesterázy rovné 0,1 až 100 nkat v jedné detekční trubičce.
4. 4. Použití sférických pelet definovaných v nároku 1 pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiochloinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, tvořeného kyselinou 5,5' dithiobis-(2-nitrobenzoovou), nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, zejména tvořeného indoxylacetátem.
5. 5. Detekční trubička pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázy a/nebo butyrylcholinesterázy metodou enzymatické hydrolýzy substrátového acetylthiochloinu a/nebo butyrylthiocholinu za vzniku odpovídajícího thiolu, který je indikován barevnou změnou redoxního indikátoru, tvořeného kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou), nebo metodou enzymatické hydrolýzy chromogenního substrátu, zejména tvořeného indoxylacetátem, vyznačená tím, že v oddělené první sekcí detekční trubičky obsahuje sférické pelety definované v nároku 1, v oddělené druhé sekci detekční trubičky obsahuje substrátový acetylthiocholin a/nebo butyrylthiochloin a redoxní indikátor tvořený kyselinou 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) nebo v oddělené druhé sekci detekční trubičky obsahuje chromogenní substrát, a v alespoň jedné oddělené třetí sekci obsahuje roztok pufru.