JPS5894395A - 連続酸素反応における酵素活性持続方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明にセルラーゼを用いたセルロース加水分解反応に
おいて酵素活性を持続させる方法札関する。さらに詳し
くはセルラーゼ水溶液を用いたセルロースの加水分解反
応において分画分子量３×１０’〜ｌＸｌ０”の分離膜
を用いて該反応ｇを濾過することを特徴とする酵素活性
持続力法に関すゐ。。

酵素は主成分が蛋白質である市分子祷買である。

壺体内あるいは生体内と類似の条汗トーにおいて各酵素
ＩＩｉある反応に触媒活性を有する。又Ｔｔ；５ｇ！汁
は常温・常圧と極めて穏和であり、反応に関与する吻買
（基質）に対する選択性及び触媒反応の特異性が極めて
筒いことが特徴である。Ｖｉ系の持つこれらの特徴を生
かし、臨床検査や食品工業、集品工業において広く酵素
反応が利用されている。

殊に近年の目覚しい酵素化学の進歩により藺分子担体に
酵素を吸着、架橋あるいは包括させた固定化酵素が多数
開発され、酵素の回収と反応の連続化が計られ、効率同
上に大きな貢献をした。

しかし、１冗化酵素法は固定化処理に伴う粘性の減少や
安定性に問題があるばかりか、個々の酵素に最適な固ず
化法を個別に開発しなければならないという煩雑さがあ
る。さらに固体７ｇ体系の不均一化学反応に対して固定
化酵素は化学反応個所である固体表面への拡散が難しい
。

固定化酵素法における上述の欠点を解決すべく分離用合
成高分子膜を反応装置に組み込んだバイオリアクターが
最近−考案された。これは酵素の分子量に応じて膜の分
画分子ｔ（ｃｕｔ　−ｏｆｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅ
ｉｇｈｔ　；以後００Ｍ、Ｗ、と略記）を酵素分子量と
同じか又は約５　＋　０００低めに選定すれば、いかな
る酵素でも反応系内に封鎖することができ、普通、生成
物の分子量は酵素よりはるかに小さいので反応生成物は
膜を通して糸外へ取り出すことができる。

しかも、酵素分子は先の固が化酵素とは違って全く自由
な状態に置かれているので活性の減少などが起こらない
ばかりか、固体／数体系の不拘−化学又応においても固
体表面への酵素の拡散は何ら障害金堂けるものではない
。

しかし、この方法では反応液をポンプにより膜を装層し
た濾過装置に送り込む必要があり、このポンプによる送
液時の剪断力や反応器内の攪拌によ！ｌｌｌ＃素が徐々
に失活してゆく。失活酵素の持っていた活性に見合う分
の新しい酵素を反応系内に添加してゆけば、反応速度の
減少は防げるが、系内に失活酵素が蓄積し、ついには運
転不４ヒとなら”ざるを得ない。

本発明の目的は上述したごとき酵素分離用膜を組み込ん
だ酵素反応６（バイオリアクター）運転中に起こる諸問
題を解決すべくなされたものであって、剪断力による酵
素失活速度が減少し、かつ、失活酵素の系内蓄積を伴な
わない酵素分離用膜を組み込んだ酵素反応器における酵
素活性持続力法を提供することである。

本発明者は上述の点に鑑み、欽慧検討した結末セルラー
ゼ水溶液を用いたセルロースの／ＪＯ水分屑反応におい
て、分画分子量３Ｘ１０’〜ｌＸｌＯｓの分離膜全組み
込んだ酵素反応器を用いると、酵素の剪断力による失活
速度が減少し、かつ、失活酵素が反応系内に蓄積しない
という驚くべき現象を見い出し、本発明を完゛成したも
のである。

以下、本発明の詳細な説明する。

セルラーゼは様々の分子ｔを持つ幾つかの酵素成分より
成る。大部分の酵素成分は分子を範囲４×１０４〜７Ｘ
１０’に入る蛋白質であるが、中にはｌ×１０４付近の
分子量を持つ酵素成分のあることが知られている。しか
し、これら低分子量成分はその含量が非常に微量である
ことから、セルラーゼの分離膜を用いた精製濃縮の場合
、あるいは酵素反応器に分離膜を組み込んでセルラーゼ
によるセルロース連続〃日水分解反応を行う場合には、
通常は上記の酵素成分の分子量範囲を単純に考慮して４
Ｘ１０’〜５ｘｉｏ’の分画分子ｆ（ＣＭＷ）１に持つ
膜が１史われている。該膜を用いると確かに活性酵素は
濾過により糸外に除去きれることはないが、剪断力に原
因した酵素の失活速度は該膜を用いたからと言って減少
することはない。

本発明者は膜を組み込んだ酵素反応器において、セルラ
ーゼによるセルロースの連続刃口水分解を行う場合、反
応系内にセルラーゼ分子よりも分子量の小さな蛋白質が
共存するとセルラーゼの失活速度が遅く゛なること金髪
い出し本発明に至った。

失活速度が減少する原因は明らかでないが、本発明者ら
は以下のように考えている。すなわち、被体が細官中を
通過する場合、液体中に管壁からの距離に従がい、すり
速度の分布ができ、管壁により近い部分に強い剪断力を
受ける。一方、液体中に分子量の異なる溶質が存在する
場合、その溶質の分子量分布に従って鍋分子ｉｋ＃買は
宮中央部（流れの中心部）に、低分子量物′ｊ＆［は管
壁よりに多く分布する傾向にある。よって、溶液中に低
分子量蛋白質がより多く存在するほど尚分子蛋白質であ
る酵素は剪断力の小さな宮中央部（流れの中心部）によ
り濃密に存在することとなり、剪断力による失活速度が
遅くなるものと思われる。

本発明はセルラーゼ溶ｆｆ１．１に用いたセルロースの
加水分解反応において分画分子量３Ｘ１０’〜Ｉ　Ｘ　
１０”の分離膜を用いて該反応液を濾過することを最大
の特徴とする。すなわち、本発明は＃素反応槽と濾過装
置とをパイプで連結し、反応槽内の該反応液をポンプに
より濾過装置に送り込み、該反応液中に含まれるセルラ
ーゼとグルコースを主成分とするセルロース生成物とを
該濾過装置に装着した分離膜によゆ分離し、グルコース
等の低分子切質のみを含む濾液を反応系外に取り出し、
かつ、酵素を含む反応液を反応槽にもどし、再び反応に
利用することを目的とする酵素反応器において、分画分
子ｔ　（０１Ｍ、Ｗ）　３ｘ　１ｏ４〜ｌＸ１０’の分
離膜を用い、セルラーゼ溶液によるセルロースの〃口承
分解の連続酵素反応を行なわせる方法に関する。（第１
図参照） 本発明において分画分子量（００Ｍ、Ｗ、　）　３　Ｘ
　１０’〜Ｉ　Ｘ　１０”の分離膜を利用することによ
って、酵素反応器内の剪断力によるセルラーゼの失活速
度が極度に減少し、かつ、失活した＃素は膜を通して系
外に排出されるので、連続酵素反応を行うに際して、＃
素油性の長期持続と失活酵素による反応系内汚染を防止
することができる。

、活性＃索の漏れが無視できる範囲で分離膜の分画分子
量（Ｃ，Ｍ、Ｗ、）を３Ｘ１０’以上にした場合、剪断
力に起因する酵素の失活速度の低下はみられず、＃素活
性は時間とともに減少してゆく。

分離膜の分画分子ｉ１　（００Ｍ、Ｗ、）がｌＸｌ０”
以下の場合、失活速度は遅くなるものの、透過速度が減
少するとともに、酵素添加連続反応においては失活酵素
による系内汚染が進み、反応液の粘度が徐々に上昇して
ゆく欠点がある。

本発明における効果を適格に発視させるためには、分離
膜の分画分子量が３Ｘ１０’〜Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”、　　
好ましく１ｉ２ｘｌｏ’〜３ＸＩＯ’の範囲にある必要
がある。

本発明における分離膜の素材としては、セルラーゼによ
り分解されない素材であれば、どのような素材でも適用
できる。例えば、ポリアクリロニトリル、モダクリル、
ポリスルボン、ポリオレフィン、゛塩素化ポリエチレン
、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン
などである。膜の安定性及び失活酵素の除去率からポリ
アクリロニトリル、ポリスルホンが望ましい。

本発明で採用されるセルロース加水分解のためのセルラ
ーゼとしては、例えば、ドリセラーゼ、セルラーゼオノ
ズヵ、スミチームｃ１　メイセラーゼなどの市販セルラ
ーゼ製剤のほかに、狗えば、トリコデルマ属、アスペル
ギルス属、イルペックス稿、スポロトリカム楓などのセ
ルラーゼ生産菌の液体培養濾液もしくは固体培養抽出液
などかあげられ、これらを単独あるいは混合して用い得
る。

酵素反応器に分離膜を組み込み、連続的に酵素を（ロ）
収しながら＃累反応を行う場合には、＃素分子全１００
％阻止する最大の分画分子量より低い分画分子！　（？
ｌＪえば、セルラーゼでは３ｘｔｏ！以下）の分ｍ膜全
用いることは、反応系内に低分子量溶質を保持すること
となり、高分子蛋白質の剪断力による失活全低下させる
上で非常に効果的である。

酵素を長期間にわたり連続的に便用していると活性が低
下してゆく現象には様々な原因があるが外界からの雑菌
の浸入や酵素阻害ｖｌＪ質の混入を光分に防止した酵素
反応器における酵素の失活は、熱による失活と系内輸送
での剪断力による失活が主原因となる。工業的規模での
操作においては剪断力による失活が殊に問題となる。

活性酵素を光分に阻止する分離膜を組み込んだ酵素反応
器では、新たに調整した酵素溶液を用いて連続連転を付
うと、反応系内の活性酵素量は徐々に低下し、一方、ａ
液中の不活性蛋白質量は活性蛋白買置の低下に対応して
増加してゆく。すなわち、失活して低分子量化した蛋白
質は低分子量化することにより管壁に近い部分に多く分
布するため、さらに剪断力による低分子量化が進行して
ゆくものと思われる。

以上のことから、セルラーゼ溶液を用いたセルロースの
加水分解反応において、分離膜を組み込んだ酵素反応器
では、■溶液内に低分子を切買が共存することにより酵
素の剪断力による失活速度が遅くなる、■失活した酵素
は剪断力によりさらに速やかに低分子量化される、とい
う２つの現象の起ることが判明した。すなわち、上記反
応器に用いる分離膜の分画分子量（０６Ｍ、Ｗ、）とし
ては、＃累の最大分画分子量よりも小さな分画分子量で
あり、さらに低分子量化された蛋白質を適当な濾過速度
で系外に除去できる分画分子量であることが望ましい。

すなわち、セルラーゼを酵素として用いる場合、３Ｘ１
０’　〜ｌＸｌ０”、好まＬ　＜　ｎ　２Ｘ１ｏ’〜３
Ｘ、１０”の範囲にある分画分子量の分離膜であれば、
低分子量化された失活酵素残渣の適度なｔｌに系内に保
持し、また、適度な速度でそれらを糸外に除去すること
ができる。従って、失活酵素の活性に見合うだけの活性
酵素を運転中に系内に添加してゆく方式（＃素追加連続
反応方式）において、失活速度を遅くすることができる
ので使用酵素量を減少させられるとともに、失活蛋白質
ｐ系内蓄積による系内汚染を防止することができ、運転
期間の大幅延長が可能である。さらにセルラーゼの低分
子ｔ＃素成分も有効に利用することが７でき、反応効率
が向上する利点がある。

本発明における分離膜の形態としては平膜状、中空系状
、スパイラル状、チューブ状の他、あらゆる形態の膜に
ついて本質的に何ら変更なく使用できる。中空糸状分離
膜は他の形態と比較すると膜強度が高く、濾過速度が速
いうえに分画分子量以下の低分子量蛋白質の除去速度が
速く、系内汚染を効率よく防ぐ利点がある。すなわち、
溶液が中空糸を通過する際に、より低分子量の物質が管
壁の近傍に多く分布するためと思われる。中空糸内の剪
断力は極微少であり、Ｓ系全体から見れば無視できる。

従って膜の形態としては望ましくは中空糸状がよい。

以上述べた如く、本発明により分離膜を組み込んだ酵素
反応器で、＃累セルラーゼを分離膜により反応系内に一
定し、かつ、＃素の失枯速＆を減少させ、僅かの酵素量
で長期間にわたり反工６を持続させ、グルコースを主成
分とするセルロース加水分解生成物を効率よく反応禾外
に取り出すことができる。

本発明による酵素活性待伏方法に於ける特徴、作用効果
は、 （Ｏ酵素の剪断力による失活速度を運くすることができ
、必要＃嵩量が節約できる。

■　酵素追加連続反応方式での失活酵素の系内汚染を防
止でき、長期連続運転ができる。

■　酵素成分中・の低分子量酵素成分を効率よく利用で
きる。

■　セルラーゼに限らず、他のあらゆる酵素について応
用が可能である。

■　反応系内の酵素の反応速度を減少せずに系内に固定
することができ、連続吠用できる。

〈実施？ＩＪ　１　＞ 第２図に示すような連続＃素限外濾過装置を用いて、剪
断力による酵素の低分子電化について検討した。

使用した＃素は市販セルラーゼであるスミチームＣ（新
日本化学工業線）、使用した限外濾過膜は中空糸状モジ
ュール（旭化成製ＡＩＬ−１０１０ｔポリアクリロニト
リル、Ｃ０Ｍ、Ｗ、６シ０００を有効膜面積０．２ｍ２
ｙ内径ｏ、ｓ％）であった。送孜経路中のステンレス管
（内径２　％　を長さ５５０ｃｒｎ）内で酵素液に強力
は明断力をかけるようにした。酵素をｐＨ４，０のＭ／
１０酢酸緩衝液にｉ解し、１．０％め＃液を調整した。

送液量は毎時１２．８とし、全系４０℃に保温した。

酵素＃液中のタンパク分子量分布は、ゲル濾過により求
めた。使用したゲルＩｄ　Ｂｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ　−１
００（バイオラッド社製）、溶出ｇはＭ／１０酢酸緩衝
液（ｐＨ４，０）を用いた。第３図、第４図に調整直後
の＃濃溶液と連続酵素限外ＩＪＩｌ過装置内で１２０時
間、剪断力をかけた酵素溶敵の原液（濾過前）とｆＩｉ
液についての分子量分布を示した。第３図のＡ２Ｂのピ
ークにはセルラーゼ活性が存在するが、０には活性はな
い。１２０時間の剪断力処理によりＡｙＢ両ピークとも
大幅に減少しくＡ−＋Ａ′９Ｂ→Ｂ／）、それに伴いＣ
Ｆｉ低分子分子側動しながら増大している。すなわち、
これは溶液中のタンパク賞分子（酵素活性のあるものも
ないものも）が剪断力により分断され、低分子量化され
ていることを如実に示している。活性のめるＡ２Ｂに属
するタンパク質は剪断力により分断され、失活タンパク
質となり、さらに分断されて低分子量タンパク質になる
ものと思われる（　Ａ　ｔ　Ｂ−＋ｃ’）従って、反応
系内で剪断力により失活した酵素タンパク質は次々と低
分子量化されていると考え□　られる。第４図には分画
分子１ｉ６ｔｏ００の限外濾過膜を通過した濾液中のタ
ンパク實分子量分布を示した。１２０時間の剪断力処理
によりｍ液中のタンパク質量は増大しており、失活した
タンパク質が低分子量化されて系外に除去されることを
示している、 人の分子量約５５９０００　、　Ｈの分子量約１５１０
００、Ｃの分子量約ｈ０００であった。ＤνＤ’のピー
クの立ち士り部分（ＦｒａｃｔＩｏｎ　Ａ２５付近）は
分子量６＞０００である。

以上のことからビークＡに鴨する酵素を完全に保持する
ためには、膜の分画分子量は３０ｓＯＯＯ以下である必
要があり、また、失活したタンパクを系外に除去するた
めには膜の分画分子量は１＋ＯＯＯ以上である必要があ
る。ビークＢのような低分子量酵素成分を有効に利用し
、かつ、失活タンパクを効率よく除去して、連続酵素添
ｊＪＯ方式を行う場合に失活タンパクが系内に蓄積して
反応液の粘度上昇などの障害を引き起きないためには、
望ましくは分画分子ｆｉｌ　２Ｘ　１０’〜３ＸｌＯ”
の分離膜が良い。

〈実施例２〉 第５図に酵素添加方式での連続限外濾過装置を示す。使
用した酵素、限外ｌＩＬ遇膜は実施例１と同様である。

糸外に取り出される濾液と同量の緩衝敵（Ｍ／１０酢酸
緩衝辰、ｐＨ４，０）を加えて常に系内のｇ量を一定に
保った。また、２４時間毎に溶液の体積当りのグルコー
ス生成速度を一］ボし、グルコース生成速度が低下した
場合は新たな酵素溶液（１０％溶液）を適量添〃ａし、
系内のグルコース生成で度を一定に保った。グルコース
生成速度は、酵素溶液１０−に対して基質としで濾紙（
東洋濾紙Ａ５１％）ｔ２ｏ＋ｗＢ−加え、４０℃にて１
　ｈｒ反応させたときの生成還元糖量を不ルソンーソモ
ギ法により測足し求めた。タンパク濃Ｉｆは牛血清アル
ブミン（シグマ社）を標準サンプルとして、１、ｏｗｒ
ｙ　−Ｆｏｌ　ｉｎ法により求めた。

表１に、グルコース生成速度、タンパク濃度及び総添７
１Ｆ＋タンパク量の経時変化を示す。

以下余白 運転開始後、４日、目までは酵素の添加をしていない。

＃木製剤中には図３に示したように１低分子量の不活性
タンパクが含まれているため、電初タンパク濃度は酵素
を添加しているにもかかわらず減少してゆく。ｌＯ日目
以降、一定のグルコース生成速度を維持するためには、
タンパク＃度を約４５０〔■／１００ｍ）に保持すれば
可能であった。

すなわち、連続酵素限外ｌｌｌ過においては、酵素が完
全に保持される０６Ｍ１ｗ、の膜を用いれば、系内で失
活したタンパク實は剪断力により低分子量化され、膜を
通して糸外に除去することができ、活性低下を補うため
に新たに酵素を添加して、も系内のタンパク濃度が上昇
することはな−く、酵素溶液の粘度が上昇することもな
かった。

〈実施例３〉 第６図に実験装置を示す。第３図に示したようにスミチ
ーム０には分子量約５５ｙ０００のピークＡと分子量約
１５　＋　０００のビークＢがみられる。ピーク人。

ピークＢを分離するために、まずスミチームＣの１０％
溶液（Ｍ／１０酢酸緩衝液ｐＨ４，０）を調製し、０、
Ｍ、Ｗ、３０ν０００（旭化成、ポリスルホン）の膜に
よりピークＡを分離させた。ついて、その濾液を０、Ｍ
、Ｗ、　１３ツ０００（旭化成、ポリアクリロニトリル
）の膜により濾別し、ピークＢを分離した。ピークＡ１
　　ピークＢｉ含む各々の溶液中のタンパク濃度がほぼ
同様になるよう緩衝液で稀釈し、第６図の装置により１
００時間処理（剪断速度３，７Ｘ１０’（ｍ１ｎ−’）
、剪断応力４．８　ｄｙｎ　／ｌ７ｆｔ”）　した。

各々のビーク成分について実施例１と同様の条件でゲル
濾過奮何ない、その溶出ビークを処理前と処！ｆｉで比
較したところ、ピークＡ１　ピークＢとも処理後のピー
ク高が下降しており、明らかに剪断力による低分子量化
を示していた。ピークのタンパク濃度減少率りを下式に
より計算した。

Ｄ−（（０，０ｔｓｏの減少値）／（Ｙ、ＬＪ前の０．
Ｄ２．。））Ｘ１００ビークＡの場合、Ｄ＝１２．０、
ピークＢの場合、Ｄ＝３０．Ｏであった。すなわち、分
子量の小さい程、剪断力による低分子量化が急速に進む
ことがわかった。

従って、活性酵素タンパクが一度、分子鎖切断により失
活すると、低分子量化されるために、活性酵素タンパク
よりも速やかに低分子量化されてゆくものと考えられる
。

〈実施例４〉 分子量測定用標準タンパク（コアルマ／ア社、リボヌク
レアーゼ；　Ｍ、Ｗ、１３＞７００、キモトリプシノー
ゲン；　Ｍ、Ｗ、２５ツ０００、牛血清アルブミ／；Ｍ
、Ｗ、　６’ｈ０００　）各５０１１ｖをそれぞれ１０
ｗのＭ／１０酢酸緩衝液に溶解させ、該溶液をオートビ
スコメーターＬ−厘型（ＩＷＡＭＯＴＯ５ＢＩＳＡ　Ｋ
ＵＳＨＯＣｏ　、　ｔＬ、ＴＤ、）により剪断力処理し
、前述の如く、ゲル濾過により分子量分布を調べた。剪
断力処理条件は１２℃、剪断速度１．ＩＸ　１０’（５
ｅｅ−”）　、剪断応力１００．０（ｄｙｎ／α２〕で
２４時間行った。

表２に示す如く、タンパク濃度減少率りは分子量の大き
いものほど小ささく、分子量大である程、剪断力による
分子鎖切断を受けにくいと言える。

（以下仝白） 表２　分子量とタンパク濃度減少率の関係１３＋７００
　　リボヌクレアーゼＡ　　　　　　　３８．０２５９
０００　キモトリプシノーゲンＡ　　　　　２３．３６
７＊ＯＯＯ牛血清アルブミン　　　　　　　　９．５〈
実施例５〉 第７図の装置により連続酵素限外濾過を行ない限外濾過
膜の分画分子ｔを変えたときの酵素失活速度への影響全
検討した。便用した＃１ｇはスミチームＣ（新日本化学
工業）、ドリセラーゼ（協和醗酵）であった。限外濾過
膜は中空糸状帯膜を使用した。分画分子量、素材は次の
通りである。

以下余白 ３＋ＯＯＯポリスルホン　　　　　旭化成（試作）６シ
０００　　ポリアクリロニトリル　旭化成ＡＩＬ−１０
１０１３９０００ポリアクリロニトリル　旭化成ＡＣＬ
　−１０１０３０ｒ０００　　ポリスルホン　　　　　
旭化成（試作）２＋０００　　ホ’）スルホン　　　　
　アミコンＨＩＰ２５ν０００　ポリスルホン　　　　
　アミコアＨＩ　Ｐ　５１０ｓ０００　　ポリスルホン
　　　　　アミコンＨＩＰＩＯ５０９０００ポリスルホ
ンアミ−ｆｆ７ＨＩＸ５０酵素はいずれもＭ／１０６￥
酸緩衝液（ｐＨ’４．ｓ）に溶解し、１％溶液とした。

＃索活注は実施例２に記した方法で生成グルコース量を
測足し、初期活性（連続限外濾過開始直後の活性）を１
００としたときの比で比較した。濾過速度は送液量、分
画分子量、有効膜面積により大きく変化する−が、いず
れも１０４／ｄａｙ前後となるよう送液量、圧力を＃Ａ
整した。全糸１に４０℃に保温した。

第８図にドリセラーゼの失活速度と分画分子量との関係
を示した。線図の傾度が大きい程、失活速度が大きいこ
とを示す。分画分子量が大きくなるにつれ、失活速度が
犬きくなっている。分画分子ｉｌｌ　５０＋ＯＯＯでは
時に失活のし方が激しく、反応系内より低分子ｔｍ買（
主にタンパク實と考えられる）（ｉ−除去することが失
活速度を増大させていることをうかがわせる。

第９図には同じくスミチームＣの失活速度と分画分子量
との関係をボした。同様に分画分子量と失活速度との間
に正の相関性のあることがわかる。

濾過速度を高め、かつ、失活速度全人きくしないために
は、分画分子ｔ３０ｇ０００以下の膜が適していると云
える。

本発明方法の実施を図面によって説明する。第１オ誓索
追加連続反応方式における連続酵素反応限外濾過装置に
よって、酵素反応液（９）において生成をれた反応化ｂ
ｇ物（＃素がセルラーゼの場合はグルコース）と低分子
量化されたタンノくり負はポンプ（２）により限外濾過
膜（１ンに送られ、・（イブ（１１）を通って糸外へ除
去さｎる。膜を透過しなかった生成物、低分子量タンパ
ク及び膜を透過できない活性酵素はパイプ０乃を通り、
再び反応種明に入る。

（ロ）より出ていった置数の減少分を補うために緩衝液
タンク（６）外為ら同量の緩衝液が四に入れられる。

また、酵素活性低下を補うために、＃素溶欣夕／り（７
）より活性酵素が追加される。基質Ｖｉ基貞タンク（８
）より添加される。明白はヒーター（３）により一定温
度に保たれ、モーター（４）により攪拌羽根（５１を回
転させ、明白を攪拌する。

第２図には実施例１で使用した連続酵素限外濾過装置を
示す。反応槽（１）には丸菱理化装置研究所製ジャーフ
ァーメンタ−ＭＤ−３００型５Ｌｔｌｔ用した。（１）
に、酵素溶液（ロ）を入れ、ヒーター（２）で４０℃に
別温し、モーター（３）により攪拌羽（４）を回転させ
る。ポンプ（５）は東家理化器ｒ７ｆｉ製チューブポン
プＲＰ−３０型を使用した。パイプ（８）より（ロ）を
ステンレス’！　（６）に送る。限外濾過膜（７）を通
過し′＃−濾液はパイプ明よりサンプリングできる。パ
イプ（９）と（ト）は接続しており、１液Ｖｉ再び（１
）内に入る。

第５図には実施例２で使用した笑験装置を示す。

反応槽（１）、ヒーター（２）、モーター（３）、攪拌
羽（４）、ポンプ（５）、ステンレス管（６）、限外濾
過膜（７）、”イブ（８）などは第２図と同じものであ
る。／くイブ（ト）をパイプ（９）とは接続させず、濾
液を糸外に除去できるようになっている。系内の酵素溶
液四の減少分を補うために緩衝液タンク０刀より緩衝液
が添加できる。また、酵素溶液タンク０のより酵素が添
加できるようになっている。

第６図には実施例３で使用した装ｆｉｉを示す。酵素溶
液（１）約２００−をステンレス細管（３）（内径２〜
．５５０α長）中にポンプ（２）により４５ｄ／ｍｉｎ
で送り込み、酵素の剪断力処理を行った。恒温槽（４）
は４０℃に保温されている。ｔ５）′は圧力計である。

第７図には実施例５で使用した装置ｉを示す。反応槽（
１）、ヒーター（２）、モーター（３）、攪拌羽（４）
、ポンプＬ５１１　（７）、ステンレス管（６）は実施
例１と同じである。限外濾過膜（８）を叢えても常に一
定の剪断力処理ができるように、（６）と（８）のそれ
ぞれの経路を別にしである。（９）は緩衝液タンクであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は連続酵素反応限外濾過装置の正面
略図、第３図はセルラーゼ溶液（スミチームＣ）のゲル
濾過溶出ノくターンの剪断力処理による変化を示す関係
図、第４図は、セルラーゼ溶液（スミチームＯ）を００
Ｍ、Ｗ、６ｔＯ００の限外濾過膜で濾過したときの１版
のゲル濾過溶出ノくターンの剪断力処理による変化を示
す関係図、第５図、第６図および第７図は実施例２、実
施例３および実施例５に吏用した装置の略図をそれぞれ
不す。 第８図はセルラーゼ（ドリセラーゼ）の失活速度と限外
ｍ過膜の分画分子量との関係図、第９図はセルラーゼ（
スミチームＣ）の失活速度と分画分子量との関係図であ
る。 ％軒出願人　　旭化成工業株式会社 第１図 第２囚 第５図 第６図 第７図 第８図 ０　　　　　２　　　　　４　　　　　６　　　　　８
　　　　　１０第９図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　セルラーゼ水溶液ヲ用いたセルロースの加水分解
   反応において分画分子１ｉ３Ｘ１０’〜Ｉ　Ｘ　１０”
   の分離膜を用いて該反応液を濾過し、ａ液を該反応液か
   ら分離すること全狩徴とする酵素活性持続方法 ２　濾過用の分離膜として、中空糸状分離膜を使用する
   特許請求の範囲第１項記載の酵素活性持続方法 ３　中空糸状分離膜がポリアクリロニトリル系あるいは
   ポリスルホン系を素材とするものである＋　ｔｆｆ　Ｍ
   ｒ＋求の範囲第２項記載の酵素活性持続力法