DK171534B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af bakteriecelleaggregater - Google Patents

Description

DK 171534 B1 o

Anvendelsen af enzymer fra mikrobielle celler til gennemførelse af specifikke kemiske omdannelser er velkendt. Ved udførelsen af sådanne omdannelser kan der som kilden til biokatalysatoren anvendes det cellefri enzympræparat, sprængte 5 celler eller hele celler. Når det frie enzym eller cellerne anvendes som kilden til biokatalysatoren, kan disse bestanddele effektivt anvendes ved processer af batch-typen, men de er ikke velegnede til kontinuerlige processer i industriel målestok.

Denne vanskelighed har ført til en forøget interesse for frem-10 stillingen af forskellige former for immobiliserede biokatalysatorer. En kontinuerlig proces i industriel målestok til enzymatisk omdannelse vil typisk omfatte anvendelsen af en kolonnereaktionsbeholder indeholdende et lag af den immobiliserede biokatalysator, gennem hvilket der strømmer en opløsning af materials le, hvis biokatalytiske omdannelse ønskes gennemført.

Ved den biokatalytiske omdannelse af glucose til fructose ledes en glucoseholdig opløsning over og gennem laget indeholdende biokatalysatoren, hvilket resulterer i omdannelsen af en del af glucosen til fructose. Biokatalysatoren iromobilise-20 res typisk ved flokkulering med et kationisk eller anionisk flok-kuleringsmiddel, der kan være tværbundet ved tilsætning af et egnet tværbindingsmiddel til reaktionsmediet.

Reaktionsproduktet af biokatalysatoren, flokkulerings-middel og tværbindingsmiddel bør udvise høj fysisk styrke, målt 25 ved dets sejh.ed, således at det ikke bliver blødt og falder sammen ved brug og derved begrænser strømningen af væske gennem laget. Faste, sfæriske, pelletiserede partikler af den immobiliserede biokatalysator har visse fordele i forhold til det materiale, der simpelthen ekstruderes gennem en sigteplade 30 til dannelse af nudel-lignende partikler ved tørring. Eksempelvis strømmer sådanne sfæriske partikler frit til lettelse af materialehåndteringsproblemer. Sfæriske partikler kan desuden anvendes til fyldning af en pakket kolonnereaktionsbeholder til en større tæthed af aktivt materiale, end tilfældet er med det 35 ikke-ensartede, tørrede ekstrudat.

O

DK 171534 Bl 2

Conine et al. har i udgaven fra april 1970 af Drug and Cosmetic Industry rapporteret fremstillingen af små, faste farmaceutiske kugler ved anvendelse af et sfæroniserings- II !) apparat, der markedsføres under handelsbetegnelsen Marumerizer. 5 i artiklen beskrives apparatet som omfattende en horisontal roterende plade i en stationær cylinder. Pladen er riflet til dannelse af en ru overflade, der frembringer friktion mellem sig selv og det materiale, der skal sfæroniseres. Apparatet er yderligere beskrevet i Manufacturing Chemist and Aerosol 10 News, vol. 41, nr. 6, side 40-44, Juni 1970, hvor det angives, at produktet fra ekstruderen føres til den roterende plade, hvor det afsættes mod væggen i en ringformet form. Strengene af ekstrudatet nedbrydes til at begynde med ved denne bevægelse i korte længder, der ideelt svarer til deres 15 diameter.

I DE-fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 er der beskrevet en metode til sfæronisering af enzympræparater, især sådanne, der er nyttige i detergentindustrien. De præparater, der skal sfæroniseres, beskrives som værende en 20 blanding af 75 til 97% af et fast pulver indeholdende enzymet med 25 til 3% vand.

Pulveret kan også indeholde en enzymstabilisator, et smøremiddel, et fyldstof og/eller et bindemiddel. Som eksempler på fyldstoffer nævnes der i den ovenfor angivne reference 25 uorganiske salte, cellulosepulver, polyvinylalkohol og poly-vinylpyrrolidon, idet de to sidstnævnte materialer også tjener som bindemidler, medens polyethylenglycoler er beskrevet som værende egnede smøremidler. Gelatine, stivelsesnedbrydningsprodukter og andre substituenter for enzymer er beskrevet som 30 værende egnede stabilisatorer. Enzympræparatet sfæroniseres ved ekstrudering deraf på den roterende plade i et sfæronise-ringsapparat af den tidligere beskrevne type.

I US patentskrift nr. 4.212.943, der er udstedt den 15. juli 1980, er der beskrevet et bakteriecelleaggregat 35 med forøget hårdhed, der fremstilles ved kontakt mellem en masse af bakterieceller og et tværbindingsreaktionsprodukt af (1) glutaraldehyd, cyanursyrehalogenid eller en kombina- 3 DK 171534 B1 o tion deraf og (2) en specifik kationisk polymer, der er fremstillet ved polymerisation af en epihalohydrin og en alkylenpolyamin. Et bakteriecelleaggregat af denne type med forbedrede hårdhedsegenskaber er beskrevet i US patentskrift 5 nr. 4.251.632. Dette aggregat fremstilles på den måde, at man først danner produktet af celler, tværbindingsmiddel og kationisk polymer, kombinerer det med partikler af et tidligere fremstillet og tørret aggregat med lignende sammensætning, ekstruderer produktet gennem en dyse, tørrer 10 ekstrudatet og formaler det tørrede ekstrudat til den ønskede partikelstørrelse.

De resulterende partikler er uensartede og har brudte, forrevne kanter med irregulære overflader på grund af formalingsprocessen. Denne type morfologi har tendens til indeslutning 15 af luftbobler under hydratisering i glucosesirup, hvilket bevirker et flydeproblem, især når sirupkoncentrationen er større end 45% på basis af tørt, fast stof. Denne strukturegenskab udviser også en smuldrende natur, hvorved der dannes uønskede fine partikler under transport. Dannede fine partikler 20 afvaskes under chargering og hydratisering af det immobilisere-de enzym i reaktionsbeholderen, og tabet af afvaskede fine partikler vil på ødelæggende måde påvirke enzymreaktionsbeholderens totale produktivitet.

; Den foreliggende opfindelse består ikke i simpelt 25 hen at anvende sfæroniseringsmetoden ifølge Manufacturing Chemist and Aerosol News til at bringe bakteriecelleaggre-gatet ifølge US patentskrift nr. 4.212.943 på sfærisk form.

Der stilles andre krav, idet f.eks. filterkagen indeholdende aggregatet af bakterieceller og tværbunden polyamin skal 30 formales til partikler, der ikke er større end svarende til 60 mesh (250 Mm), hvilke partikler ekstruderes på sfæroni-seringsanordningen. Formalingen ændrer formen og teksturen af filterkagen, hvilket forøger homogen blanding. Formalingen hindrer også dannelsen af for mange fine partikler under 35 sfæronisering som beskrevet umiddelbart inden eksempel 1. I DE-fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 og i Manufacturing Chemist and Aerosol News, der angiver sfæronisering, er 4 DK 171534 B1 der ingen omtale af nogen formaling inden sfæronisering. US patentskrift nr. 4.212.943 omtaler ikke formaling og ej heller sfæronisering, medens der ifølge US patentskrift nr. 4.251.632 kræves formaling efter ekstrudering og ikke omtales 5 sfæronisering.

En anden forudsætning for den foreliggende opfindelse er et højt fugtighedsindhold. Det er ikke blot daglig rutine at optimere processen med et højt fugtighedsindhold.

Da der således ifølge DE fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 10 kræves et meget lavt fugtighedsindhold på 3-25% vand, fører denne kendte teknik sammen med den øvrige omtalte kendte teknik bort fra den foreliggende opfindelse. Det kritiske ved anvendelsen af et højt fugtighedsindhold på 68-76 vægt-% ifølge den foreliggende opfindelse er omtalt indgående i 15 det følgende. Et for højt fugtighedsindhold vil bevirke glidning i ekstruderen og udtværing og klumpdannelse i sfæ-roniseringsapparatet, medens et for lavt fugtighedsindhold vil forårsage for høj friktion med deraf følgende varmeudvikling under sfæronisering. Det kunne således ikke forudses, 20 at man ved anvendelse af opfindelsens betingelser, jf. det følgende, kunne opnå et forbedret sfærisk enzymaggregat.

På grund af slutanvendelsen af de sfæriske bak-teriecelleaggregater, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er det et implicit krav, at de i det 25 væsentlige skal være vanduopløselige. På den anden side beskrives der i DE fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 sfæronisering af et enzym, hvor det sfæroniserede produkt er letopløseligt i vand, hvilket er en særlig fordel, når produktet anvendes som et enzymadditiv i vaskemidler. I modsætning 30 hertil skal de sfæroniserede bakteriecelleaggregater, der fremstilles ifølge opfindelsen, anbringes i et lag eller en søjle, og en vandig opløsning af det materiale, der skal omdannes biokatalytisk, ledes gennem laget eller søjlen i flere dage. I dette tidsrum må det sfæroniserede bakterie-35 celleaggregat ikke opløses i væsentligt omfang, men skal forblive intakt, således at enzymet indeholdt i cellerne 5 DK 171534 B1 vil omdanne substratet. Slutanvendelsen for produktet fremstillet ifølge opfindelsen er omtalt indgående i det følgende under "Bestemmelsesmetode", og tabel V viser specifikt halveringslevetider på 32 og 53 dage for det her omhandlede, 5 sfæroniserede produkt. Endvidere hverken beskrives eller antydes det i Manufacturing Chemist and Aerosol News, hvorledes et højt fugtighedsindhold vil påvirke et "hårdt" celleprodukt, der har en sådan lang halveringslevetid.

Endelig kræves det ifølge den foreliggende opfin-10 delse, at pladen i sfæroniseringsapparatet roteres med en tangential hastighed på fra 4,5 til 12 meter pr. sekund. En for høj hastighed vil bevirke, at materialet slynges bort og går i stykker på cylindervæggen, og en for lav hastighed vil ikke tillade et tilstrækkeligt moment til sfæronisering.

15 Den angivne bestemte ønskelige hastighed i kombination med de øvrige, ovenfor omtalte fordringer er ikke antydet nogetsteds i Manufacturing Chemist and Aerosol News eller i den øvrige kendte teknik, der er omtalt her. Endvidere vedrører DE fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 ekstracellulære enzymer, 20 ikke immobiliseringen af mikroorganismer, der indeholder enzymer. Den foreliggende opfindelse omhandler derimod mikroorganismer, nemlig bakterieceller, der indeholder intracel-lulære enzymer. Der er intet i DE fremlæggelsesskrift nr.

2.137.042 eller i Manufacturing Chemist and Aerosol News, 25 der beskriver eller blot antyder, at sfæronisering af enzymer kan anvendes i forbindelse med de enzymholdige bakterieceller ifølge US patentskrift nr. 4.212.943, som ikke omtaler sfæronisering, netop fordi disse bakterieceller indeholder enzymer.

30 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af bakteriecelleaggregater, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man a) tilvejebringer et vandigt medium indeholdende levedygtige celler af en enzymproducerende mikroorganisme, 35 b) indfører en tværbunden polyamin, der er reak tionsproduktet af (i) et langkædet polyamin-kationisk flok- 6 DK 171534 B1 kuleringsmiddel, der er en epihalohydrin-polyamin-copolymer, og (ii) et tværbindingsmiddel for flokkuleringsmidlet, i det vandige medium til flokkulering af cellerne og dannelse af et celle-tværbundet polyamin-aggregat, 5 c) fjerner aggregatet fra det vandige medium ved tilstrækkelig filtrering til dannelse af en filterkage indeholdende fra 68 til 76 vægtprocent vand, d) formaler filterkagen til partikler, der ikke er større end svarende til 60 mesh (250 μιη) , 10 e) ekstruderer filterkagen gennem en åbning, der omtrentlig er lig med diameteren af de sfærisk formede celleaggregater, der skal fremstilles, ud på den roterende plade af et sfæroniseringsapparat, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor anbragt i en cylinder således, at 15 cylinderen tilvejebringer en stationær sidevæg for pladen og samtidig tillader denne at rotere frit, f) roterer pladen med en tangential hastighed på fra 4,5 til 12 meter pr. sekund i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at bevirke, at det ekstruderede aggregat 20 afsættes mod cylindervæggen og formes til adskilte sfæriske partikler af celleaggregatet, og g) udtager det sfærisk formede bakterielle aggregat fra sfæroniseringsapparatet.

Opfindelsen angår en yderligere fremgangsmåde til 25 fremstilling af bakteriecelleaggregater, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.

Typiske eksempler på de mikroorganismer, der kan immo-biliseres i form af seje, sfæriske aggregater ved fremgangsmå-30 den ifølge opfindelsen, er de, der er anvendelige ved produktionen af glucoseisomerase. Glucoseisomerase er et enzym, der kan anvendes til katalyse af omdannelsen af glucose (dextrose) til fructose (lævulose). Det er kendt, at fermentering af visse organismer såsom Streptomyces flavoirens, S.echinatur, 35 S.achromogenus, S.albus, S.olivaceus, Actinoplanes missourien-sis og Bacillus coagulans i et egnet næringsmedium resulterer i

O

7 DK 171534 B1 produktion af glucoseisomerease. Omend den detaljerede beskrivelse i det følgende vedrører immobiliseringen af de celler, der producerer glucoseisomerase, kan fremgangsmåden anvendes med forskellige enzymholdige bakterieceller.

5 Det foretrukne polyamin-kationiske flokkuleringsmiddel, der anvendes ved aggregatdannelsesprocessen, er kommercielt tilgængeligt under varemærket BETZ 1180 fra Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania. BETZ 1180 har en molekylvægt på mindre end én million, indeholder ca. 0,288 millimol amino-10 grupper pr. gram opløsning (baseret på en ninhydrin-bestemmeIse) og markedsføres som en opløsning indeholdende 30 vægtprocent faste stoffer, beregnet på den totale opløsningsvægt. Dette materiale er yderligere beskrevet i US patentskrift nr. 3.915.904 som en vandopløselig, kationisk polymer fremstillet 15 ved polymerisation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin med formlen R^R^NRNI^» hvor R er en alkylengruppe med 2 til ca. 6 carbonatomer, og R^· og R^ hver betyder en alkylgruppe med fra ca. l til ca. 6 carbonatomer, idet molforholdet mellem epihalohydrin og polyamin er fra ca. 0,60:1 til ca.

20 2,7:1, idet polymerisationen omfatter omsætning af alkylen- polyaminen med fra ca. 50 til ca. 90% af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, hvorpå man lader reaktionen fortsætte, indtil reaktionsmediet opnår en i det væsentlige ensartet viskositet, og omsætter den resterende mængde af 25 epihalohydrinen portionsvis til opnåelse af den kationiske polymer, hvorhos polymerisationstemperaturen ligger fra ca.

60 til ca. 120°C.

Tværbindingsmidlet for polyamin-flokkuleringsmidlet er typisk enten glutaraldehyd, et cyanursyrehalogenid eller en 30 kombination deraf. Glutaraldehydet og/eller cyanursyrehalo-genidet, der kolkektivt betegnes som komponent (1), omsættes med polyamin-flokkuleringsmidlet, der her betegnes som komponent (2), ved en pH-værdi på ca. 6 til ca. 10 og en temperatur fra ca. 0 til ca. 30°C i et tidsrum fra ca. 0,5 til ca. 2,5 ti-35 mer. Det samlede tværbindings-reaktionsprodukt indeholder fra ca. 12 til ca. 77 vægtprocent af komponent (1) og fra ca. 23 til ca. 88 vægtprocent af komponent (2), beregnet på

O

8 DK 171534 B1 den totale vægt af de aktive bestanddele i komponenterne (1) og (2). Glutaraldehydindholdet i reaktionsproduktet ligger fra ca. 0 til ca. 77 procent, og cyanursyrehalogenidindholdet ligger fra ca. 0 til ca. 22 procent på vægtbasis.

5 Bakteriecelleaggregater fremstilles fortrinsvis ved kontakt mellem en masse af bakterieceller i et vandigt medium og det tværbundne reaktionsprodukt fremstillet som beskrevet ovenfor, ved en pH-værdi på fra ca. 8 til ca. 9 og en temperatur fra ca. 0 til ca. 30°C i et tidsrum fra ca. 0,5 til 10 ca. 1,5 time. Det tværbundne reaktionsprodukt anvendes i en sådan mængde, at bakteriecellerne kommer i kontakt med fra ca, 4,5 til ca. 60 vægtprocent af reaktionsproduktet, beregnet på den tørre vægt af cellerne.

Efter dannelse af bakteriecelleaggregat-opslæmningen som 15 ovenfor beskrevet anbringes denne bekvemt i en holde- eller stigetank opstrøms i forhold til et filtreringsapparat, f.eks. et roterende vakuumfilter. Opslæmningen filtreres derpå til tilvejebringelse af en filterkage af fugtigt bakteriecelleaggre-gat. Det har vist sig, at filtreringen må reguleres omhyggeligt 20 til tilvejebringelse af en filterkage indeholdende fra 68 til 76 vægtprocent vand, såfremt sfæroniseringstrinet skal fungere tilfredsstillende. Et for højt fugtighedsniveau i filterkagen bevirker transportvanskeligheder gennem ekstruderen på grund af slipvirkning, hvilket forårsager et tab i den ønskelige 25 kompressionseffekt af ekstruderen på filterkagen. Det således fremstillede ekstrudat vil også bevirke udtværings- og klumpdannelsesproblemer under sfæronisering. Det samlede fugtigheds-indhold kan formindskes ved tilsætning af fine partikler af den immobiliserede biokatalysator opnået ved en tidligere sfæ-30 ronisering, men tilsætningen af for mange fine partikler, således som det vil kræves, når mere end 76% vand er til stede i filterkagen, resulterer i en svækket slutstruktur. Omvendt vil et for lavt fugtighedsniveau i kagen have tendens til at tilvejebringe for megen friktionsvarme under ekstrudering, hvilket 35 kan resultere i desaktivering af enzymet og også kan resultere i tilstopning af dysen. Endvidere kan det således opnåede ekstrudat let blive ødelagt under sfæronisering på grund af manglen

O

9 DK 171534 B1 på vand, der kan virke som blødgøringsmiddel. Ekstrudatet føres fra ekstruderen ud på den roterende, riflede plade, hvor det afsættes mod cylindervæggen i en ringformet eller doughnut--lignende form med et gradient-tværsnit. Ekstrudatet nedbrydes 5 til at begynde med i korte stykker, ideelt lig med dets diameter, på grund af friktionskraften på den riflede plade og tillige gennem den intergranulære kollision og friktion af den bevægende masse. Den karakteristiske fordeling af materialet er et resultat af centrifugalkraften ved rotationen af pladen 10 og af tangent ialkr af ten ved friktionen mellem materialet og den riflede overflade. En glat roterende overflade tillader ikke ekstrudatet at rulle, men blot at glide til pladens periferi. Bevægelsens karakteristika ville være anderledes, og derfor ville materialets endelige form ikke være så ensartet og sfærisk 15 som ønsket, såfremt der anvendtes en glat plade. Sfæroniserings-apparatet er en kuglefremstillingsmaskine, der hurtigt kan omdanne immobiliserede bakteriecelleekstrudater til små, kompakte og let håndterbare kugler. Ekstrudering af aggregatet ud på den roterende plade bevirker, at det afsættes mod cylin-20 dervæggen i en ringformet form, der under driften af sfæronise-ringsapparatet ses at sno sig som et vævet reb. Denne karakteristiske afsætning af materialet skyldes transporten af ekstru-dat ved hjælp af den vektor, der er et resultat af centrifugal- og tangentialkræfter hen mod periferien af pladen, hvor dens 25 restmoment bevirker, at den stiger op ad den stationære væg og derpå falder ind i eller over massen, når dens moment opløses. Ekstrudat-nudlerne nedbrydes til at begynde med i pellets, og de accelererende og decelererende pellets inden i massen danner et mønster af hastighedsgradienter, der resulterer 30 i de formationer, der ligner et vævet reb. Efter nedbrydning i pellets med kort længde formes ekstrudatet til kugler med en diameter, der ideelt er lig med diameteren af den åbning, gennem hvilken filterkagen af celleaggregatet blev ekstruderet. Denne kugledannelse forårsages af friktionskræfterne på den 35 riflede plade og inter-jpartikelfriktionen i det sig bevægende ekstrudatmateriale. Den sfæroniseringsmaskine, der anvendes i henhold til de følgende eksempler, markedsføres af Fuji Padal 10 DK 171534 B1 o

Co., Ltd., Osaka, Japan, under handelsnavnet Marumerizer Q-230. Dette apparat har en rotor, der har en diameter på 23 cm. Eftersom korrekt sfæronisering af det her omhandlede celleaggregat kræver en tangentialhastighed pA 4,5 til 12 og 5 fortrinsvis på 5 til 9 meter pr. sekund (tangentialhastighed = o/min divideret med produktet af 60,7Tog pladediameteren), bør rotationen af denne specifikke plade ligge fra 500 til 1000 o/min. Hvis rotationshastigheden er for høj, vil pladen simpelthen slynge materialet bort fra pladen så drastisk og kraftigt, at 10 massen vil knuses mod cylindervæggen og danne uønskede partikler, medens en for langsom rotation af pladen ikke vil føre til den ønskede sfæronisering, fordi der i så fald ikke tilvejebringes tilstrækkeligt moment i den roterende masse til kollision og friktion som en størrelsesnedsættende og sfæroniserende 15 kraft. Efter sfæronisering tørres celleaggregatpartiklerne, typisk i en tørrer med fluidiseret lag.

Enzymaktiviteten af de sfæroniserede celleaggregatpar-tikler er stort set ækvivalent med eller højere end aktiviteten af formalede partikler, hvilket viser, at sfæroniseringspro-20 ceduren er fordelagtig med hensyn til tilvejebringelsen af et aggregat med passende biokatalytisk aktivitet. Bortset fra, at der tilvejebringes sfæriske partikler, der i sig selv er lettere at håndtere end partikler med uensartet form, udviser de aggregater, der fremstilles ved denne proces, en større fy-25 sisk sejhed og forlænget enzymproduktivitet i en reaktionsbeholder. Dette er de væsentlige fordele ved den foreliggende opfindelse. Eftersom det tørrede aggregat kan opbevares, indtil det efterfølgende anvendes ved en enzymatisk proces, er dets sejhed efter rehydratisering en nøgleparameter. I de føl-30 gende eksempler er.partikelsejhed udtrykt i relation til modstandsdygtighed mod kompression som målt med en Instron Universal Tester Model 1102. Belastningen på den testcelle, der anvendes i testapparatet, består af en transparent acrylplast-cylinder med en indre diameter på 4,37 cm, en ydre diameter 35 på 6,45 cm og en højde på 21,8 cm. Bunddelen har et trin med en tykkelse på 3,81 cm til dannelse af en understøtning for et mikrofilter. Et passende mikrofilter er et spindehoved, der 11 DK 171534 B1 o anvendes ved tekstilspinding, med 14.500 åbninger, idet hver åbning er ca. 0,2032 mm. Et rustfrit stålstempel af type 304 med diameter 4,3 cm og længde 13,66 cm anbringes således, at det kan bevæge sig koaksialt i den ovennævnte cylinder. Omtrent-5 lige afmærkninger er anbragt langs den belastede celle for at vise en prøvedybde på 10,17 cm. Der er også truffet foranstaltninger til påsættelse af et formindsket tryk eller vakuum på bunden af belastningscellen og til opsamling af enhver væske, der passerer gennem mikrofiltret. Hvis en prøve af bakterie-io celleaggregat anbringes i belastningscellen, og der påsættes tryk på prøven ved hjælp af stemplet, vil prøven blive komprimeret. Det arbejde, der kræves til komprimering af prøven over en given afstand, er et mål for prøvens sejhed. Testapparaturet anvendes ved en rehydratiserings-bestemmelsesprocedure 15 til anvendelse i de efterfølgende eksempler.

Rehydratiserings-sejheds-bestemmelsesproceduren udføres som følger: en 33 vægtprocents vandig opløsning af glucose indstilles på en pH-værdi på 8,1. En portion på 160 g tørret bakteriecelleaggregat blandes med 1300 ml af glucoseopløsnin-2o gen under forsigtig omrøring ved 24°C i 1 time. Den resulterende blanding befries for væske over en 20 mesh US Standard Testing Sieve-sigte i ca. 30 sekunder. De faste stoffer gensuspenderes derpå i en ny portion af glucoseopløsningen og omrøres i 5 minutter ved 24°C. Den resulterende opslæmning får lov at 25 afsætte sig i 5 minutter, hvorpå der drænes for væske som ovenfor. De faste stoffer gensuspenderes derefter i en ny portion af glucoseopløsningen og omrøres i 5 minutter ved 24°C.

Ca. halvdelen af den resulterende opslæmning udhældes derpå i testcellen til en højde på 10,17 cm. Et formindsket tryk 30 eller vakuum på 2,54 cm Hg påsættes dernæst bunden af testcellen i 3 minutter til sugning af væske gennem mikrofilteret, og stemplet seenkes derefter, indtil det netop berører toppen af prøven. Krydshovedet på Instron-instrumentet forbindes til stemplet og indstilles til nedadgående bevægelse med en 35 hastighed på 12,7 cm pr. minut og automatisk tilbagetrækning ved en penetration på 2,54 cm. Hastigheden for aflæsningsdiagrammet indstilles på 12,7 cm pr. minut. Modstanden fra enzymlaget

O

12 DK 171534 B1 mod stemplet i relation til stemplets vej i nedadgående bevægelse aflæses på diagrammet. Modstandskraften udtrykkes derpå som en kvadratisk funktion af den af stemplet tilendebragte afstand. Sejheden af det hydratiserede enzymlag repræsenterer 5 arbejde udført af stemplet mod laget. Jo højere enzymlagets modstand mod kompressionen er, desto større er arbejdsværdien og dermed også aggregatets sejhed. Sejheden af aggregatet er af særlig betydning ved omdannelsen i fikseret lag af glucose til fructose, fordi en almindelig levetid for en glucoseisomerase-10 -enzymlagskolonnereaktionsbeholder sædvanligvis er længere end 80 dage. I dette tidsrum skal enzympartiklerne modstå sådanne kræfter som vægten af det øvre enzymlag og den nedadtrækkende kraft af siruppen. Som et resultat heraf kan det ældede enzymlag bryde sammen til tilstopning af reaktionsbeholderen eller 15 revne til frembringelse af strømnings-kanaldannelse. I begge tilfælde er resultatet ødelæggende for den økonomiske drift af reaktionsbeholderen. Et enzymlag med seje partikler kan imidlertid forblive intakt eller kun undergå mindre deformation under ældningsperioden uden negativ påvirkning af den fysiske struk-20 tur eller den biokemiske kapacitet af reaktionsbeholderen.

Det har vist sig, at sejheden af sfæriske aggregater kan forøges ved tilsætning af et bindemiddel til materialet efter filtrering, men inden ekstrudering af filterkagen. Et materiale, der er velanvendeligt som bindemiddel i dette 25 materiale, bør tilvejebringe intra-bindingskohæsivitet inden i en partikel, men ikke inter-bindings-adhæsivitet eller -klæbrighed, der kan bevirke klumpdannelse under sfæronisering.

Det ønskede bindemiddel tjener som en lim til at holde massen inden i partiklerne tæt sammen efter tørring og dermed også til for-30 øgelse af partiklernes sejhed. Eksempler på egnede bindemiddel-materialer er natriumalginat, johannesbrødtræ-gummi, xanthan--gummi, carboxymethylcellulose, kappa-carrageenan og guar--gummi. I almindelighed falder egnede bindemiddelmateria-ler i kategorien af naturlige gummier, herunder tangekstrakter 35 såsom alginat og carrageenan, frøgummier såsom guar- og johan-nesbrødtræ-gummi, cellulosederivater såsom carboxymethylcellulose og mikrokrystallinsk cellulose, og mikrobielle gummiarter

O

13 DK 171534 B1 såsom xanthan. Disse er GRAS ("Generally Recognized As Safe") og anvendes ofte ved næringsmiddelbehandling.

Under sfæroniserings- eller tørringstrinnet kan der dannes fine partikler af celleaggregatet. Disse fine partikler 5 kan recirkuleres ved, at man blander dem med den fugtige filterkage og bindemiddel inden ekstrudering. Hvis mængden af filterkage, der indeholder en fugtighedsmængde i området fra 68 til 76%, tages som 100 vægtenheder, vil de yderligere tilsatte fine partikler, der er mindre end 60 mesh (us Sieve 10 Series) og fortrinsvis mindre end 100 mesh, være fra 2,0 til 0,6 enheder. Tilsætningen af fine partikler kan nedsætte fug-tighedsniveauet for filterkagen og tilvejebringe friktion til forøgelse af sfæroniseringen uden frembringelse af uønsket varme under ekstrudering.

15 Det har vist sig, at det er nødvendigt at formale fil terkagen forud for ekstrudering og inden tilsætning af gummiet og/eller recirkulerede fine partikler, når disse anvendes. Formalingsoperationen ændrer formen og teksturen af filterkagen fra en bred, tynd, sædvanligvis rektangulær masse til krummer 20 med en partikkelstørrelse ikke over 60 mesh. Denne fremgangsmåde forbedrer den homogene blanding af gummiarter og recirkulerede fine partikler forud for ekstruderingstrinnet. Selv når der ikke tilsættes recirkulerede fine partikler og et bindemiddel, hindrer formalingen dannelsen af for mange fine partikler under 25 sfæroniseringen således, at der derfor kan opnås et sejt og ensartet produkt ved hjælp af ekstruderings-, sfæroniserings-og tørringsprocessen.

Den måde, på hvilken den foreliggende opfindelse udøves i praksis, illustreres nærmere i de følgende eksempler, i hvilke, 30 ligesom i beskrivelsen, alle sigtestørrelser er angivet i overensstemmelse med US Standard Sieve Series.

Eksempel 1

En kultur af en Streptomyces olivaceus-mutant NRRL 3916 35 dyrkes i en omrystet og beluftet fermenteringsbeholder indeholdende et egnet næringsmedium, der er beskrevet i US-PS 3.625.828. Den resulterende fermenteringsvæske indeholdende en bakteriecel-

O

14 DK 171534 B1 lemasse indstilles på en pH-værdi på 8-9 ved tilsætning af egnede pufferstoffer.

En opløsning af polyamin-polymer fremstilles ved fortynding af 7910 g Betz 118O-opløsning indeholdende 2373 g 5 polymer med destilleret vand til dannelse af 27 liter fortyndet opløsning, hvis pH-værdi indstilles på 9. En opløsning af glutaraldehyd fremstilles ved fortynding af 12080 ml 25 vægtprocents glutaraldehyd indeholdende 3017 g aktivt materiale med destilleret vand til dannelse af 27 liter fortyn- 10 det opløsning. De to opløsninger blandes derpå, og der tilsættes destilleret vand til et totalt rumfang på 190 liter. pH-vær- dien indstilles på 9, og reaktionen får lov at finde sted ved en temperatur på ca. 25°C i ca. 0,5 timer til dannelse af et reaktionsprodukt i opløsning. Denne opløsning sættes til den 15 ovenfor beskrevne fermenteringsvæske i en mængde på 15 ml pr. gram tør cellevægt til tilvejebringelse af 42,5 vægtprocent totalt reaktionsprodukt, beregnet på den tørre vægt af bakteriecellerne, til dannelse af et bakteriecelleaggregat. Efter ca. 30 minutters reaktionstid ved 25°C og en pH-værdi på 20 8-9 anbringes den behandlede væske indeholdende bakterie- celleaggregatet i en holdetank, hvorfra den ledes til et roterende vakuumfilter. Den resulterende, fugtige filterkage, der indeholder 75 vægtprocent fugtighed, opdeles i 5 portioner.

2

En af de 5 portioner udskæres i små stykker på ca. 1 cm 25 i et Hobart-lydløst huggeapparat (Model 84145) , og stykkerne ekstruderes derpå gennem en dyse med åbninger med 1,59 mm diameter under anvendelse af en 3:1-kompressions-ekstrudersnekke med en snekkeomdrejning på 100 o/min. Det resulterende ekstru-dat tørres dernæst ved 60°C i 2-4 timer og formales gennem en 30 Homoloid-maskine med en sigte med åbninger på ca. 3,18 mm (model J fra W.J. Fitzpatrick Company) til opnåelse af partikler med en størrelse mindre end 16 mesh. Partikler med overstørrelse resulterende fra den første formaling recirkuleres og formales, indtil alle formalede partikler er mindre end 16 mesh. De 35 formalede partikler undersøges derpå med hensyn til størrelsesfordeling, efterfulgt af opsamling af den ønskede størrelsesfraktion, der passerer gennem en 16 mesh U.S. Standard Testing

O

15 DK 171534 B1

Sieve Screen, men tilbageholdes af en 24 mesh sigte. De fine partikler, der passerer gennem 24 mesh-sigten, opsamles til yderligere anvendelse. Den således fremstillede -16+24 mesh--fraktion betegnes 1A. Dens glucoseisomerase-aktivitet måles 5 ved den bestemmelsesmetode, der er beskrevet i US-PS 3.779.869, og findes at være 500 glucoseisomerease-enheder (GIU pr. gram eller svarende til 1 umol fructose pr. minut pr. gram enzym). Desuden måles partiklernes sejhed ved den tidligere beskrevne rehydratiserings-sejheds-bestemmelsesmetode.

10 En anden portion af den fugtige filterkage behandles nøjagtig på samme måde som kontrolprøven, men med den undtagelse, at de opsamlede partikler er -16+48 mesh. Denne prøve betegnes IB.

En tredie prøve af filterkagen behandles med en Hobart-15 -kødformaler gennem en dyse med 133 åbninger med diameter 3,18 mm, efterfulgt af blanding med recirkulerede fine partikler fra den foregående batch (partikkelstørrelse mindre end 100 mesh) og guar-gummi i en Hobart-blander (model C-100)' i 3-5 minutter ved afsætning ved lav hastighed. Sammensætningen af blandingen 20 er 1000 g filterkage, 60 g recirkulerede fine partikler og 2 g guar-gummi. Blandingen ekstruderes derpå gennem en dyse med 60 åbninger med 1 mm diameter under anvendelse af en 3:l-*kom-pressions-ekstrudersnekke med en snekkeomdrejning på 100 o/min. Disse resulterende ekstrudater med en længde fra ca. 50,8 til 25 ca. 304,8 mm chargeres til en sfæroniseringsmaskine med en riflet plade med diameter 23 cm, der er riflet med en konfiguration med 2 mm afstand og 1 mm højde. Pladen med en diameter på 23 cm roteres med en hastighed på 700 o/min. til tilvejebringelse af en tangentialhastighed på 8,4 meter pr. sekund 30 i 3 minutter, hvorpå det sfæroniserede ekstrudat udtømmes fra maskinen gennem en åbning ved hjælp af centrifugalkraft. Fugtighedsniveauet for de resulterende kugler er 70,6%. En tørrer med fluidiseret lag fra Aeromatic AG (model Strea 1) anvendes til tørring af produktet med en indgangslufttempera-35 tur på 68°C. De færdige, tørrede kugler indeholder 8,1% fugtighed og betegnes som prøve 1C. Den fjerde portion af den 16 DK 171534 B1

O

fugtige filterkage behandles på nøjagtig samme måde som prøve IC, men med den undtagelse, at blandingen ekstruderes gennem en dyse med 60 åbninger med diameter 0,7 mm, og prøven betegnes ID. Den femte portion af filterkagen behandles på samme måde 5 som 1C, men med den undtagelse, at der ikke tilsættes nogen gummi eller recirkulerede fine partikler. Denne prøve betegnes 1E.

Disse fem prøver underkastes den rehydratiserings--sejheds-bestemmelse, der er beskrevet i det foregående, og der 10 fås de i tabel la angivne resultater.

15 20 25 30 35 17 DK 171534 B1 cm in cs r* 4J * % * * <D ό v in in h tji tu m n cn h «. x: ^ 1 1 k-noip 0 <U —

Pn W

+>

<D

P —

•H D

> \ © m cn o o

•HD O O © CM CN

-p h in ι/t ^ m m S2 Q) —

Ό »H

1 r4 g 4-1 >1 CO N h in λ; m o --·-' 30)0 o id o in o τ3 to h minoot^-io 0 tn \ Μ β O' Λ E'-' τ) ω i ,C H ID ID σ CP ·& ». «. fc •H 4-> m m Ο O r-l 44 cp— r~- r~ t-· CP U C df> ft) 3 «I -H ^ W Cn 44 >4 r4

0) I

X) 0) <1> H

»0 HC Jl

Eh 3HH-

M 44 4k* E

U -Hf3 OOOOO

•H 0) 4-> >4 ID ID

Ό Ό >4 O' 0) Ο (0 w 05 U ft 18 DK 171534 B1

O

De data, der er angivet i tabel la, viser, at enzym-aktiviteten af de formalede såvel som af de sfæroniserede partikler ikke udviser nogen signifikant forskel. Disse partiklers sejhed falder imidlertid inden for et bredt område. Idet 5 sejheden af prøve 1A (-16+24 formalet) tages som basis, er sejheden af IB (-16+48 formalet) 34,2% mindre, medens sejheden for 1C (-16+48 sfæroniseret) og ID (-16+48 sfæroniseret) og 1E (-16+48 sfæroniseret) er henholdsvis 35,5%, 25,2% og 11,7% større end sejheden for kontrolprøven. Det fremgår, at alle 10 de sfæroniserede prøver har en højere værdi end de formalede prøver, og at disse sfæroniserede, fugtige prøvepartikler har et fugtighedsindhold på fra 70,6 til 71,9% inden tørringsprocessen. De totale partikelstørrelsesfordelingsprofiler for disse prøver inden sigtning er angivet i tabel Ib. De viste 15 data indicerer, at et af de enestående karakteristika for sfæroniseringsprocessen er fremstillinaen af en højere andel i et snævrere partikelstørrelsesområde. Prøve 1C giver 77,5% i området -16+24 mesh, og prøve ID giver 96,7% i området -24+48 mesh. Der iagttages imidlertid en større fraktion af 20 fine partikler i understørrelse fra den sfæroniserede prøve 1E. Denne prøve indeholder intet bindemiddel, og de fine partikler recirkuleres heller ikke. Det bør bemærkes, at såfremt der ønskes et snævert størrelsesområde med formalede partikler, f.eks. -24+48 mesh, kræves der en recirkulation gennem en 25 formalingsproces, hvilket resulterer i en uønsket høj fraktion af fine partikler og tilførsel af mere varme end ønskeligt til processen.

30 35

Større Mindre end -16 -20 -24 -28 -35 end

Prøve 16 mesh +20 +24 +28 +35 +48 48 mesh 19 DK 171534 B1

O

Tabel Ib 5 1A & IB 0 35,5 28 15,1 8,4 4,7 8,3 1C 0 22,2 55,3 5,5 9,2 6,5 1,3 ID 0 0,7 0,6 19,8 70,1 6,8 2 10 1E 0 0 48 12,7 4,8 4,0 30,5 15

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer virkningen af forskellige 20 bindemidler, herunder naturligt gummi og cellulosederivater, og et indifferent fyldstof såsom mikrokrystallinsk cellulose (Avicel fra FMC Corporation), på dannelsen og sejheden af det sfæriske aggregat.

En immobiliseret glucoseisomerase-filterkage med 25 72,9% fugtighed, der er fremstillet på nøjagtig samme måde som den filterkage, der anvendes i eksempel 1, deles i 9 dele, der behandles på følgende måde:

Prøve 2A fremstilles ud fra 1000 g kage udskåret i små stykker og blandet med 112 g recirkulerede fine partikler, 30 der er opnået ved anvendelse af samme batch af filterkage og gennemførelse af et tørringstrin ved 60°C i 2 timer med påfølgende formaling til en størrelse mindre end 100 mesh, samt 70 ml vand i en Hobart-blander. Blandingen ekstruderes, tørres, formales, sigtes og bedømmes såvel biologisk som mekanisk ved 35 den metode, der er beskrevet i forbindelse med fremstillingen af prøve 1A.

O

20 DK 171534 B1

Prøve 2B fremstilles på samme måde som prøve 2A, men med den undtagelse, at halvdelen af de recirkulerede fine partikler (56 g) erstattes med cellulose.

Prøve 2C fremstilles på samme måde som prøve 1C, men 5 med den undtagelse, at 56 g cellulose, 7 g natriumalginat, 56 g recirkulerede fine partikler og 70 ml vand blandes med den formalede filterkage i blandeapparatet, og størrelsen af det tørre produkt, der bedømmes, er -16+24 mesh. Prøverne 2D, 2E, 2F og 2H fremstilles på nøjagtig samme måde som prøve 2C, 10 men med den undtagelse, at de anvendte bindemidler er henholdsvis johannesbrødtræ-gummi, xanthan-gummi, carboxymethylcellu-losé og guar-gummi. Prøve 2G fremstilles under anvendelse af 8 g kappa-carrageenan. Prøve 21 fremstilles under anvendelse af 7 g johannesbrødtræ-gummi, men ekstruderes gennem en dyse 15 med 60 åbninger med diameter 0,7 mm og sigtes til en størrelse på -16+48 mesh. Sfæroniseringsbetingelserne for prøverne 2C til 21 er angivet i tabel Ilb.

Prøve 2A anvendes i dette tilfælde som en kontrolprøve til sammenligning med de øvrige prøver. Prøve 2B, der formales 20 på samme måde som prøve 2A, viser næsten samme sejhed som kontrollen. Fugtigheden før tørring og det tørre produkts bulkmassefylde er for disse prøver næsten ens, med den undtagelse, at enzymaktiviteten i prøve 2B fortyndes noget af cellulosen. Andre prøver, til hvilke der sættes bindemidler og udføres ef-25 terfølgende sfæronisering, viser næsten samme fugtighedsniveau som 2A og 2B. Deres bulkmassefylde ligger imidlertid i området fra 71,8 til 76,7 g pr. 100 ml sammenlignet med 64,9 g pr. 100 ml for kontrolprøven 2A. Bulkmassefylden er vægten af en prøve på 100 ml, udmålt fra en 100 ml gradueret cylinder.

30 De sfæroniserede partikler viser en højere bulkmassefylde end formalede partikler på grund af deres sfæriske form, der omfatter den samme masse som det formalede modstykke, men med mindre overfladeareal. Sejheden af disse prøver forøges mindst 25%, idet den største forøgelse er 174%. Sfæroniseringen udføres 35 ved en pladerotationshastighed på fra 750 til 900 o/min, med en varighed på fra 2 til 10 minutter. Afprøvningsresultater for de aggregater, der fremstilles ifølge dette eksempel, fremgår af tabellerne Ila og Ilb.

21 DK 171534 B1 +>

0) fO

O' 0) $Λ- oo M -r-> af> I * 0 cu ·— (no* vomm o in lo ti οι r·* r* ^ vo h h n

rH

I — *H O' > \ i—i o vd m oo æ *d o id

•H D Γ' CM rH CM ΙΟ rH m CM CM

40 40 h in in in m m m in m in M 0) U < 40 *— Ή r—I **1 i E '2 3 4J o\ h r> cm io m οί m oo E O' Μ I O - >· - - - - - gi

310)0)0 tt id <£> ro in *j* rs Η 3 M

floi WflH vd id t" t·" p~ r- r* p* t-» O' G

OH mh\ 13 M 3 <0 >1 O' «θ'

b -Q E^H M I

40 S

, S " O' M *

H U tT Λ C

40 ©. G ID O 00 00 00 00 ID CO 00 ID K ·

0"H -H - - - - ' ' - ‘ ' 0) G M

3J-I ΟΟΟΟΡ» f~— f— I— 00 P~ Ρ» CO) 0) ti Ό M VD ID ID ID 10 ID ID ID ID GQ)40

Q) ^ G O' G

op £ 4J λ ίο ε 0 m io

•n G -H

40 I G Ό

Gr" H o tfi T3 |H CM I g r-t c E ooo ooo ooo ns g •HG'— r- t" p- r~ t" p~ r~ r- r- θ' Dj

Eh > o α p- g -

G Q JX O

Η (N i

H G Μ ϋ G

I G G « cm G

rH 0) "H rH 40 E

0) hum G

3 -H ^ CM 10 10 ID ID ID 10 10 10 GO) i-l G 0) 40 tP i—i in m m λ in m m m -hwo)

Eh Μ *T3 IH — rH O' O H

•H 0) G rH iH iH

U h α G 3 3 1 Ή J3 3 Ή

1 -H 0) O

0) rH Η υ ID

Ό fl) 40 H

CO--' G >ι Ό •Η Ό O1 I I r~ P- f" P- αο t" r-~ G .C 0) ffl -Η I 40 g

X E UG

CM g G

£< w ·· X >1 G G O Ό to > ja o $ n c

rH —. ti G G

3 tJ I ID ID ID ID ID 10 10 ø Ch O

i—i ^ in m m in m m m m i g

rH Mb G

G G cm c

U > G

a *· g •H O' I M g i m og tn

E G OOO OOO OOO IH 3 G

>,40 G —> OOO OOO OOO O' M

N rH O' O OOO OOO OOO rH I G

G-HG*— iHrHrH rH rH rH rH rH rH O C Ό W IH X Ό G 3 X Ό Λ Μ X Ή 40 4> ·—· -— *·~* r~.r-.r-* r*. —* r-x g G Μ ·*ρ -31 τρ τρ ^Ρ *Ρ Μ· Η1 (Ο G G Ο*

,!0) CM CM CM CM CM CM CM CM M1 OXG

<HW + + + + + + + + + Gl

G rH ID ID ID ID ID ID VO ID ID *H W H

4< G — rH rH rH H rH rH rH rH rH CQ CM CM

G-HMoG I I I III III

> 40 H 1/) — — — — X X

·©. M -G G X

M G 4> E < CQ U O W b USM

Oh di W —' CM CM CM CM CM CM CM CM CM

22 DK 171534 B1

O

Tabel Ilb Sfæronisering

Prøve o/min. Varighed (min.) 2C 750 2 5 2D 750 2 2E 750 3 2F 750 3 2G 750 2 2H 750 4 10 21 750/900 5/5

Dette eksempel viser, at en række forskellige bindemidler, herunder naturlige gummiarter og cellulosederivater, kan anvendes sammen med et fyldstof, f.eks. cellulose, som 15 en del af materialet til forbedring af sfæroniseringsproces-sen. Endvidere viser resultaterne, at sejheden af alle de sfæroniserede partikler er større end sejheden for den formalede kontrolprøve.

20 Eksempel 3

Dette forsøg benyttes til undersøgelse af virkningen af bindemidler på sejheden af aggregatet med og uden tilsætning af recirkulerede fine partikler. En filterkage af immo-biliseret enzym med 71,9% fugtighed deles i 5 dele. Prøve 3A 25 fremstilles under anvendelse af samme fremgangsmåde som anvendt til fremstilling af prøve 2A. Prøverne 3B, 3C, 3D og 3E fremstilles under anvendelse af den fremgangsmåde, der benyttes til fremstilling af prøve 1C. Sammensætningen af hver enkelt prøve og prøvernes fysisk-biokemiske egenskaber tillige 30 med sfæroniseringsbetingelserne er angivet i tabellerne Illa og Hib.

35 23 DK 171534 B1

P

O Ό σ» ο) 'S j3 —> i σ\ σ\ ro » ·

M *(—» c#p «s< σι ro -P

0 o> — iH nj fn w c

•H

CP

i—I

tP (0 1 +>\ C"\ OO (N O (N g HOS ro ro -s* ί* σν 3 •P -P h inminm^· -h

X -H O P

< > w -P

<0

— C

I Η I

røg ω 4J (0 0) ro

Ai g Ό o VO UO H "if 3> 3 I HO " - » - - -

Ό AS >i rH σ> vo vo vo r- -H

0 h p\ m r~ t- r- r~ g P 3 (1) tP g λλ n« 9

tP

Ό P

0) « Λ CP 3 - CP.C 'ΦΗΐηοοσ» Cp -p P -H <-» -*>·-' i c 4J ,Ό- P <#> CO 00 I—I Ή 'S' Q Ή p" vo vo r~ r- vo ro g 3 «· -- IP -P - •Η Ό i o 1 g SZ ro ru >e<

0) Φ P 3 tP

H C 0) CP -H

3ΉΗ I P

X Uh X C tP <0 (0 P -H *— O vo I ivo 3 C > htHO-p&v vo m m X -h

μ ϋ Ό P —· -P Λ P

H 0) 0) (C C H 0) oc p CP 3 h w

rH X H *H

0) I c A U rH o 3 X ro O p EH I rH A tø 0)0) r- ro i— tp nj u-t

O3r> I *· - *. OEhW

C fl s vo m (N vo ·

Η -Η — CO c O O O O

co g ro -H m m in in g r— Γ" t— t— • · \ 0) 0) o

Cl) > o -s

rH P

O'- vo cu rH cp i i i i m rH — p Q) 0) u > A 0) >

I p «L CO Ό Q W

IP O p ro ro ro ro

g Q) OOOOO UH CP

S +J 0) o o o o o

NHCPtP O O O O O H

C -H 3 ·— rH i—I rH rH i—t 0) W UH .X Ό Ό Ή

E

Λ Λ 0)

HT CO 00 00 »O

10) fN OM TJ> rr -<Τ C

(PrH 0) + + + + + Ή O .0 rH VO VO VO VO VO (0

X 0) r— rH rH 1—I rHrH

0) -Η P A I I I || X

> -P P Cl) — — — --- P S 0) pm-pg < co u o w CP CP ci) — ro ro ro ro ro

O

24 DK 171534 B1

Fugtighedsindholdet for alle sfæroniserede partikler ligger fra 64,9 til 71,8%. Bulkmassefylden for disse sfæroniserede partikler ligger fra 76,1 til 77,9 g pr. 100 ml.

Aktiviteten af alle prøverne er den samme, nemlig omkring 540 5 GlU/g, idet dog prøve 3E (492 GlU/g) synes at være fortyndet ved tilsætningen af cellulose. Sejheden af de sfæroniserede prøver viser en forøget værdi på fra 49 til 139% ved sammenligning med kontrolprøven. Sfæroniseringsbetingelserne anvendt ifølge dette eksempel er som angivet i tabel Illb fastlagt 10 ved 750 o/min. med en varighed på fra 2 til 4 minutter. Virkningen af oindemidler i disse prøver er en forøgelse af dannelsen af kugler og af disses sejhed, selv uden tilsætning af recirkulerede fine partikler (jfr. prøverne 3C og 3D).

15 Eksempel 4 I dette eksempel studeres virkningen af anvendelsen af enkelte og blandede bindemidler på produktets sejhed. En filterkage med 71,2% immobiliseret enzym opdeles i 6 dele. Sammensætningen af prøverne fremgår af tabel IVa. Prøve 4A, der an-20 vendes som kontrolprøve, fremstilles ved samme fremgangsmåde som anvendt for prøve 2A, medens fremgangsmåden for så vidt angår prøverne 4B, 4C, 4D, 4E og 4F er den samme som anvendt for prøve 2C. Aktiviteten og sejheden for disse partikler fremgår af tabel IVa. Sejheden af prøverne 4C og 4D er ca. 175% 25 højere end for kontrollen, medens sejheden for prøverne 4B, 4E og 4F er ca. 80% højere end for kontrollen. Sejhedsresulta-terne for prøverne 4C og 4D viser, at der ikke opnås nogen kumulativ eller synergistisk effekt ved anvendelse af 2 bindemidler sammenlignet med enkeltsystemet. Resultaterne opnået 30 med prøverne 4B, 4E og 4F viser ombytteligheden mellem guar-gummi og johannesbrødtræ-gummi, muligvis på grund af ensartetheden i råmaterialeoprindelse og kemisk struktur. Den biokatalytiske aktivitet af alle prøverne er meget ensartet. Bulkmassefylden af kontrolprøven er 63,8 g pr. 100 ml, medens de 35 sfæroniserede prøver viser et massefyldeområde fra 75,8 til 81,2 g pr. 100 ml. Sfæroniseringsbetingelserne for disse prøver fremgår af tabel IVb 25 DK 171534 B1

-P I

«Ό O

D ® ^ ifi O CO I ·η

»Λ'·' i r* t" p·» co t" D

P 'PI <#> rH H Ti tr> 0 O'" 0 fe CO -

•P I

-P (0 P

<D C ro 4J ^ j

HD ιΛ(ΝΟΓΜθσι D D

> \ rj. m ^3· rr m «c hi •HD Tf -3· TJ. -C}. Tf TJ< (O fe -PH £ x u 3

< *" -H

P *H

-p i H C 3 ·

1 E ID C

-P to ® oo (N co r· in vc Ul h

Αί (0 Ό O «· ρ E

3 E H o m h in o σ> O (0 w Ό .* >1H w oo r CO Γ' oo -3 OHP\ -HD Όιη P 3 0 D El ® - fe .0 to ^ EW -C m n ^ m ro

3 ^ D

(0 Ό D H

>0) I - D P

hx:d ft -p -o c <o DC Γ^ΓΜΗΙΟ ΓΊ P (ti > -H >

rH -Η H -··.*- - +»C HP

Φ -P P <*> O O O O Ό -H 0) Λ DPPW ΰ t' r io Is r» S D H w

(03¾¾. PH ® -H

Eh fe Η -Ρ Λ (0 Λ C

Dl g (0 O

® 3 Eh P

I C H ft Φ Φ P C P (p · h c o . (0 -P t n c

3 HH J3C0 -H O o O o O

Αί η aJ OC E O o o in m

p h —» o m m m m in -n \ r-~ r-^ CO ΓΗ Φ -P D lOHHHHH ID O

OOP-' « Φ Φ (0 tj> t3< 05 P O.

·· + K d)

IH ’ > H

Φ Φ ττ η SE

T3 Ό —' i m «3· -f rs + ρ E ® C Ό D <N H fe 3 > Η-Η— D S CQ U Q fe fe CO E pi· ρ v ^ v ·» <i id fy h fe > P g · I 3 4J i ip »0 3 E ® o o o o o o ρ ·©. d

5-1-P O— O O O O O O O PI

nhdd o o o o O o IW-Q-ft

C H (0 w HHHHHH CO P

ΗΡΛ! Η Φ -P

d) C Ό Ό C S Ό (0 P H -C Λ

^ rx ^ ^ ^ EOtO

9 00 CO 00 CO CO ® ·ΓΊ ®

Id) (N Ό· ί ^ xr »O C

Dh m + + + + + + CDC

O d) Η ID ID ID VØ 10 10 -H (0 Αί Φ ^ HHHHHH CD <N £

0)H PJJ I I I I I I X

> Jj P Dl «.PS.® Ρ (0 -Ρ E < CQ U O fe fe fe Dj CO ^ Tf -f rr Jf -i jf

O

26 DK 171534 B1

Eksempel 5

Dette eksempel viser fordelen ved sfæroniserede partikler i forhold til det tilsvarende formalede produkt med hensyn til produktets totale tilgængelige aktivitet ud-5 trykt ved en MIGIObestemmelse (Modified Immobilized Glucose Isomerase Column). Kumulativ produktivitet udtrykkes i gram fructose pr. gram enzym samt i halveringslevetiden. De eksperimentelle resultater er samlet i den følgende tabel V.

Til fremstilling af partiklerne behandles en batch af 10 immobiliseret filterkage med et fugtighedsindhold på 72,3% i overensstemmelse med den procedure, der er beskrevet for prøve 1A, men med den undtagelse, at den valgte partikel-størrelse er mindre end 28, men større end 35 mesh (-28+35).

Denne prøve betegnes 5A. En del af kagen behandles på samme 15 måde som prøve ID, men med den undtagelse, at der som gummiart anvendes johannesbrødtræ-gummi, at mængden af recirkule-rede fine partikler er 30 g, og at deres størrelsesområde er -28+23 mesh. Denne prøve betegnes 5B. En anden batch af filterkagen med et fugtighedsniveau på 70,0% behandles også på 20 samme måde som prøve 5A og betegnes 6A. En portion af denne batch af filterkage behandles som 5B, idet der dog anvendes en mængde fine partikler på 60 g. Prøven betegnes 6B. MIGIC og den kumulative produktivitets-bestemmelse udføres på følgende måde: 25

Princip

Den her beskrevne procedure er beregnet til bestemmelse af immobiliseret glucoseisomerase fra Streptomyces olivaceus var. Bestemmelsen skal tilvejebringe den samlede middelmængde 30 af glucoseisomerase ved en 42%'s fructoseomdannelse. Bestemmelsen er baseret på den enzymatiske isomerisering af et defineret glucosesubstrat til fructose ved en kolonnereaktion ved 60°C og en pH-værdi på 7,8 (målt ved 25°C) under definerede betingelser. Omdannelseshastigheden af glucose til fructose bestem-35 mes polarimetrisk. 1 MIGIC-enhed (Modified Immobilized Glucose Isomerase Column) er defineret som den aktivitet, der vil føre 27 DK 171534 B1

O

til dannelse af 1 /unol fructose pr. minut under betingelserne for bestemmelsen.

Substrat- og enzymfremstilling 5 En dobbeltenzym-dextrosesirup indeholdende 71% faste stoffer med 95% DE indkøbes fra Royal Glucose Corn Products. Siruppen fortyndes til 31% faste stoffer, demineraliseres og suppleres med 50 dpm magnesiumion, 250 dpm sulfit og 125 dpm propyl-para-hydroxybenzoat. Denne væske anvendes til enzym-10 fremstilling og som et substrat for enzymsystemet. 25 g tør, immobiliseret glucoseisomerase sættes til et 500 ml bægerglas indeholdende 200 ml i forvejen fremstillet sirup. Blandingen får lov at henstå i 2 timer. Glucoseisomerasen gensuspenderes hver halve time med en omrørerstav* og pH-værdien 15 genindstilles pÅ 7,8. Efter 2 timer omrøres den rehydratise-rede glucoseisomerase forsigtigt med en overhead-omrører på en varm plade og ækvilibreres langsomt til 60°C.

En kappeklædt kolonne (1,5 x 100 cm, fra Glenco Scientific, Inc., Houston, TX) samles og forbindes til et 20 med konstant temperatur cirkulerende vandbad (60°C - 0,1°C).

Der anbringes Pyrex-glasuld med en dybde på 2 cm over kolonneudløbet. Over glasulden anbringes der ca. 1 cm glaskugler med diameter 0,5 mm. Til toppen af kolonnen sættes der den ækvili-brerede glucoseisomerase under anvendelse af en tilsætnings-25 tragt. Den hydratiserede glucoseisomerase får lov at afsætte sig i kolonnen ved tyngdekraftens hjælp. Isomerase, der hænger ved det indre af tragten, bør vaskes ned i kolonnen med yderligere ækvilibreret glucosesubstrat.

Når glucoseisomerasen befinder sig i kolonnen, forbin-30 der man substrat-reservoiret til den med vandkappe udstyrede kolonne ved 60°C. Kolonnens udløb forbindes ved 60°C gennem en peristaltisk pumpe til en egnet 3 liters opsamlingsbeholder.

35

O

28 DK 171534 B1

Bestemmelsesmetode

Substratets strømningshastighed indstilles ved at lade den peristaltiske pumpe arbejde fra udløbet med en hastighed på fra 2 til 4 ml pr. minut. Udløbet kontrolleres 3 gange i 5 de første 24 timer til indstilling af strømningshastigheden og derpå 12 timer senere. Prøven får lov at henstå ved stuetemperatur i 1 time. Koncentrationen af faste stoffer i prøverne bestemmes ved hjælp af brydningsindekset. Den relative omdannelse af glucose til fructose beregnes på basis af den opti-10 ske drejning af glucosesubstratet og den udstrømmende væske ved polarimetri med bekræftelse ved hjælp af væskechromatogra-fi frem til målet på 42%. Der anvendes et computerprogram til normalisering af den opsamlede udstrømmende væske til 42% fructose og tilsvarende tørt fast stof pr. dag pr. gram enzym. 15 Der kan opnås ekstrapolation af tørt fast stof pr. dag pr. gram enzym til tiden nul, hvis MIGIC-bestemmelsen (Modified Immobilized Glucose Isomerase Column) gennemføres i mere end 5 dage. MIGIC-enheden pr. gram af enzymet er lig med tørt fast stof pr. dag pr. gram af enzymet til tiden nul multipli-20 ceret med en faktor på 1,619. Denne faktor er lig med: (gram tørt fast stof pr. dag) x (dag pr. 24 timer) x (timer pr. 60 minutter) x (0,42 g fructose pr. gram tørt fast stof) x (mol fructose pr. 180,16 gram fructose) x (106 /imol pr. mol). Den totale produktivitet er defineret som de akkumulerede 25 gram tørre faste stoffer pr. gram enzym i et bestemt tidsrum. Den kan også udtrykkes som akkumulerede gram fructose pr. gram enzym i tidsrummet.

Med henvisning til tabel V er halveringslevetiden for en enzymreaktionsbeholder defineret som det tidsrum, der kræ-30 ves til nedsættelse af aktiviteten af reaktionsbeholderen til det halve af dens oprindelige aktivitet.

De i tabel V angivne data viser, at prøve 5B er overlegen i forhold til prøve 5A med hensyn til GIU/gram (19,1% højere), MIGIC (59,4% højere) og halveringslevetid (6,6% høje-35 re). Det ses også, at 6B er overlegen i forhold til 6A med 17% med hensyn til GIU, 11,2% højere med hensyn til MIGIC og 60% højere med hensyn til halveringslevetid. Den kumulative produktivitet i reaktionsbeholderen for 5B ved afslutningen

O

29 DK 171534 B1 af 43 dage, på hvilket tidspunkt forsøget afsluttes, er 36,7% bedre end for 5A, medens den for 6B efter 58 dage er 28,7% bedre end for 6A. Dette eksempel illustrerer fordelen ved anvendelse af sfæroniserede glucoseisomerasepartikler 5 med hensyn til udstrakt kumulativ produktivitet i forhold til den formalede kontrol i 2 særskilte tilfælde.

10 15 20 25 30 35 30 DK 171534 B1

-P

d) 4->

•H

>

•H

P 4J Ρ' P*

<D

Cn S3 -— I vo i oo

Ό.'ΰ op I ro i (N

P O O P Ua CU

I----

N ω <D CL) QJ

C O' S' O' tr Q) <0 (0 d) fd 4-> Ό Ό Ό Ό

0) U

-P \ ro ro oo oo •HQ) >*r ld ir> > > W w w — «—

•Η ·Η O

4-> 4J 4-> CTi 00 00 P- tC X U - - - H 3 3 i—i o ro r~ 3 Ό P CO O UO P)

g OP p- o σ (N

3 P i—I Ή « au >

iH

O) I

£3 0) Ό

<0 > -H

EΗ H +) m <d .c > Q) — Q) H 0) o pi ro ro 4J ω Cn| ro ro ro uo W LP rt P C T> s -π >— a> a> tu p > > Η Ό H $.

iH O P 0 P

u * papa H rH H 00 00 4J 4)

U O VD 00 <P C4->C4J

H iH rH O 0) O Q) S X p x p Q) d)

4J 10 4-1 W

O0 03 Q) H 0) -H

S - H C H C

U rHOooro <tJ O dJ O

\ σνοσιοο ÉP6P

O ro «τ uo PWPW

h O *h O *h U U4 CO iH U)

II II II II

O < CQ < CQ

1(0 r-s r- ΙΠ ΙΙΊ Φ O

P h in uo uo uo

(0 0) ro ro ro ro X

CU P + + + + p CO 00 00 00

03¾ PI PJ PJ PI

° 4JX .L W ir -L

0) Η A

> Q) (0 < CQ < CQ

S 0> uo uo vo vo p η ε a 4-i

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af bakteriecel-leaggregater, kendetegnet ved, at man a) tilvejebringer et vandigt medium indeholdende 5 levedygtige celler af en enzymproducerende mikroorganisme, b) indfører en tværbunden polyamin, der er reaktionsproduktet af (i) et langkædet polyamin-kationisk flokkule-ringsmiddel, der er en epihalohydrin-polyamin-copolymer, og (ii) et tværbindingsmiddel for flokkuleringsmidlet, i det 10 vandige medium til flokkulering af cellerne og dannelse af et celle-tværbunden polyamin-aggregat, c) fjerner aggregatet fra det vandige medium ved tilstrækkelig filtrering til dannelse af en filterkage indeholdende fra 68 til 76 vægtprocent vand, 15 d) formaler filterkagen til partikler, der ikke er større end svarende til 60 mesh (250 /zm) , e) ekstruderer filterkagen gennem en åbning, der omtrentlig er lig med diameteren af det sfærisk formede celleaggregat, der skal fremstilles, ud på den roterende 20 plade i et sfæroniseringsapparat, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor anbragt i en cylinder således, at cylinderen tilvejebringer en stationær sidevæg for pladen og samtidig tillader denne at rotere frit, f) roterer pladen med en tangential hastighed på fra 25 4,5 til 12 meter pr. sekund i et tidsrum, der er tilstrække- ' ligt til, at det ekstruderede aggregat afsættes mod cylinder væggen og formes til adskilte sfæriske partikler af celleaggregatet , og g) udtager det sfærisk formede bakteriecelleaggregat 30 fra sfæroniseringsapparatet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at den enzymproducerende mikroorganisme er i stand til at producere glucoseisomerase.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-35 net ved, at polyamin-flokkuleringsmidlet er en vandopløselig kationisk polymer opnået ved polymerisation af en epiha- 32 DK 171534 B1 lohydrin med en alkylen-polyamin med formlen R1R2NRNH2, hvor R betyder alkylen med fra 2 til 6 carbonatomer, og R1 og R2 hver for sig betyder alkyl med fra 1 til 6 carbonatomer, idet molforholdet mellem epihalohydrin og polyamin 5 ligger fra 0,60:1 til 2,7:1, hvorhos polymerisationen omfatter omsætning med alkylen-polyaminen af fra 50 til 90% af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reaktionen får lov at fortsætte, indtil reaktionsmediet opnår en i det væsentlige ensartet viskositet, og omsætning af 10 den resterende mængde epihalohydrin portionsvis til opnåelse af den kationiske polymer, hvorhos polymerisationstemperaturen ligger fra 60 til 120°C.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at tværbindingsmidlet er glutar- 15 aldehyd, et cyanursyrehalogenid eller en kombination deraf.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at tværbindingsmidlet er glutaraldehyd.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af bakteriecel-leaggregater, kendetegnet ved, at man 20 a) tilvejebringer et vandigt medium indeholdende levedygtige celler af en enzymproducerende mikroorganisme, b) indfører en tværbunden polyamin, der er reaktions-produktet af (i) et langkædet polyamin-kationisk flokkule-ringsmiddel, der er en epihalohydrin-polyamin-copolymer, og 25 (ii) et tværbindingsmiddel for flokkuleringsmidlet, i det vandige medium til flokkulering af cellerne og dannelse af et celle-tværbundet polyamin-aggregat, c) fjerner aggregatet fra det vandige medium ved tilstrækkelig filtrering til dannelse af en filterkage indehol- 30 dende fra 68 til 76 vægtprocent vand, d) formaler filterkagen til partikler, der ikke er større end svarende til 60 mesh (250 μιτι) , og til den formalede filterkage sætter en naturlig gummiart, et cellulosederivat eller en mikrobiel gummiart som bindemiddel, 35 e) blander kombinationen af formalet filterkage og naturlig gummiart til dannelse af en homogen blanding, som DK 171534 B1 33 ekstruderes gennem en åbning, der omtrentlig er lig med diameteren af det sfærisk formede celleaggregat, der skal fremstilles, ud på den roterende plade af et sfæroniserings-apparat, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor 5 anbragt i en cylinder således, at cylinderen tilvejebringer en stationær sidevæg for pladen og samtidig tillader denne at rotere frit, f) roterer pladen med en tangentialhastighed på fra 4,5 til 12 meter pr. sekund i et tidsrum, der er tilstræk- 10 keligt til, at den ekstruderede blanding afsættes mod cylindervæggen og formes til adskilte sfæriske partikler, og g) udtager de sfæriske partikler fra sfæroniseringsap-paratet.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg-15 net ved, at bindemidlet er en naturlig gummiart udvalgt blandt alginat, carrageenan, guar-gummi og johannesbrødtræ-gummi.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at bindemidlet er et cellulosederivat valgt 20 blandt carboxymethylcellulose og mikrokrystallinsk cellulose.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at bindemidlet er en mikrobiel gummi-art.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de sfæriske partikler tørres i et tørreorgan 25 med fluidiseret lag efter deres fjernelse fra sfæroniserings-apparatet, ved hvilket tørringstrin der dannes fine partikler af de tørrede partikler, og at de fine partikler sættes til uekstruderet, formalet filterkage og blandes grundigt dermed inden ekstruderingen. 30 35