CS231656B1 - Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby - Google Patents
Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CS231656B1 CS231656B1 CS333982A CS333982A CS231656B1 CS 231656 B1 CS231656 B1 CS 231656B1 CS 333982 A CS333982 A CS 333982A CS 333982 A CS333982 A CS 333982A CS 231656 B1 CS231656 B1 CS 231656B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- water
- enzymes
- immobilized
- reaction
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000003672 processing method Methods 0.000 title 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 92
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 claims abstract description 7
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 7
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims abstract description 7
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 48
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 10
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 19
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 7
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 abstract 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 6
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 5
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 5
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 5
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100032948 Aspartoacylase Human genes 0.000 description 3
- 101000797251 Homo sapiens Aspartoacylase Proteins 0.000 description 3
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 3
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 3
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 3
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 239000006171 Britton–Robinson buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100108136 Drosophila melanogaster Adck1 gene Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 description 1
- 108700016170 Glycerol kinases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187411 Streptomyces phaeochromogenes Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001743 benzylic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N methyl vinyl ether Chemical compound COC=C XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Vynález se týká enzymových katalyzátorů
pro biotransformace na bázi imobilizovaných
enzymů mikrobiálního, živočišného a rostlinného
původu a způsobu jejich výroby.
Enzymové katalizátory získané postupem podle
vynálezu sestávají z různých enzlmů o
různé čistotě, s výhodou technických nebo
surových enzymových preparátů, nesoucí
zejména hydrolázovou, izomerázovou, lyázovou
nebo racemázovou aktivitu, které jsou
imobilizovány chemicky reaktivním polymerem
rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí
ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně
dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny,
jako například polyethylemin,
hexamethylendiamin, lysin a pólylysin s
bifunčními aldehydy dikarboxylových kyselin,
jako je například glutaraldehyd.
Vzniklé ve vodě nerozpustné částice imobilizovaných
enzymů se dále různým způsobem
zpevňují s cílem získáni dobře sedimentu-
; jících částic s dobrými mechanickými a hydrodynamickými
vlastnostmi a vysokou specifickou
aktivitou požadovaného enzymu.
Způsob výroby imobilizovaných enzymů nevyžaduje
žádných organických sysntetických,
íorg&nických či přírodních ve vodě nerozwtnýcb
nosičů, čímž podstatným způsobem
onomizuje výrobu těchto katalýzátorů.
jymové katalyzátory jsou využitelné pro
' imyelové biotransformaiíe a umožňují vycovat
diskontinuální opakované nebo
tinuálni biotechnologie výroby farmaoeu- cy, potravinářsky či zemědělsky význam-
| \ produktů či meziproduktů.
Description
Vynalez se týká enzymových katalyzátorů pro bi otransformace na bázi imobi 1 izovaných enzymů mikrobiálního, živočišného a rostlinného původu a způsobu jejich výroby. Enzymové katalyzátory získané postupem podle vynálezu sestávají z různých enzymů o různé čistotě, s výhodou technických nebo surových enzymových preparátů, nesoucí zejména hydro 1ázovou, izomerázovou, lyázovou nebo racemázovou aktivitu, které jsou imobilizovány chemicky reaktivním polymerem rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je například polyethylenimin, hexamethy1endiamiη, lysin a polylysin s bifunčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jako je například glutaraldehyd. Vzniklé ve vodě nerozpustné částice imobi 1 izovaných enzymů se dále různým způsobem zpevňují s cílem získání dobře sedimentujících částic s dobrými mechanickými a hydrodynamickými vlastnostmi a vysokou specifickou aktivitou požadovaného enzymu. Způsob výroby imobi 1 izovaných enzymů nevyžaduje žádných organických syntetických, anorganických či přírodních ve vodě nerozpustných nosičů, čímž podstatným způsobem ekonomizuje výrobu těchto katalyzátorů. Enzymové katalyzátory jsou využitelné pro průmyslové biotransformace a umožňují vypracovat diskontinuální opakované nebo kontinuální biotechnologie výroby farmaceuticky, potravinářsky či zemědělsky významných produktů či meziproduktů.
231 656
Vynález se týká enzymových katalyzátorů pro biotransformace na bázi zmobilizovaných enzymů mikrobiálního, živočišného či rostlinného původu a způsobu jejich výroby.
Enzymové katalyzátory podle vynálezu jsou využitelné pro průmyslové biotransformace, resp. umožňují vypracovat dískontinuální nebo kontinuální biotechnologie výroby farmaceuticky, potravinářsky či zemědělsky významných produktů či meziproduktů.
Známé způsoby imobilizace enzymů lze obecně charakterizovat jako fyzikální např. sorpce a inkluze, fyzikálně chemické např. polární vazba a chemické např. kovalentní vazba. K tomuto účelu se používá různých ve vodě nerozpustných syntetických nebo přírodních organických či anorganických materiálů jako nosičů požadované enzymové aktivity. Souhrnně jsou tyto postupy pro vazbu enzymů podrobně zmíněny například v monografiích Immobilized Enzymes /edit. 0. Zaborsky, CRC Press, A Division of the Chemical Rubber Co., USA Cleveland, Ohio, 1974/, Immobilized Enzymes for Industrial Reactors /edit. R.A. Messíng, Acad.Press New York,
San Francisco, London, 1975/, Insolubilized Enzymes /edit. M. Salmona, C. Saronia, S. Garattini, Raven Press, New^York, 1974/ a Industrial Enzymes, Recent Advances /J.C. Johnson, Noyes Data Corporation, Park Ridge, New Yersey, Cemical Technology Review No. 85, USA, 1977/. Jako nosičů pro imobilizaci enzymů je využívána řada syntetických organických inertních či chemicky aktivních polymerů získaných cíleně vedenou polymerací např. na bázi methakrylaldehydu, glycidylmethakrylátu, hydroxyalkylmethakrylátu, přírodních polymerů např. celulózy a jejích derivátů, anorganických materiálů např. skla apod.
Nosiče těchto a podobných typů jsou většinou nákladné přípravky, jejichž cena a dostupnost a jejich případná předchozí modifikace a aktivace různými činidly, limitují přípravu a využiti imobi1 izovaných enzymů. Z uvedených důvodů, zvláště z hlediska průmyslového využití imobi 1 izovaných enzymů, se v posledních několika letech projevuje jak v odborné tak patentové literatuře tendence přecházet od více či méně>definovaných nos ičů na bázi syntetických polymerů nebo porésního skla k materiálům méně nákladným. Z ekonomicky přijatelného hlediska se zdají být přitažlivé různé přírodní materiály, zejména chitin, kolagen a především odpadní biomasa po různých fermentačních výrobách, jejíž cena je převážně nulová. Jde zejména o odpadní kvasinky po výrobě piva, odpadní mycelium po výrobě penicilinu apod., tedy o odpadní buň3
231 856 ky různých mikroorganismů, které lze použit jako nerozpustných nosičů pro převážně kovalentní nebo koordinačně kovalentní vazbu enzymů na povrch jednotlivých buněk či buněčných agregátů.
I v Československé odborné a především patentové literatuře lze v posledních několika letech sledovat posun zájmu vynucený ekonomízací výroby například vypracováním postupu imobilizace enzymu penicilinacylázy pro výrobu 6-aminopeníci1ánové kyseliny na povrch různým způsobem ošetřených či nativních mikrobiálních buněk či jejich fragmentů pomocí bifunkčních aldehydů, zejména glutaraldehydu, za tvorby vzájemně kovalentně prokřížené sítě zmobilizovaného enzymu spolu s buňkami majícími charakter nerozpustnéc ho nosiče, podle čs.autorského osvědčení č. 2O8_931. Podobný způsob, avšak na rozdíl od předchozího způsobu využívající flokulace enzymu s buňkami majícími charakter nosiče a to flokulanty vstupujícími do reakce s bifunkčními aldehydy, je popsán pro imobi lizaci. enzymu amyloglukosidázy v čs. autorském osvědčení č. UStbH přičemž využití tohoto katalyzátoru pro výrobu glukózy a dalších produktu její enzymové přeměny ze škrobu je popsáno v čs. autorském osvědčení č.
H Stejně tak je popsáno kovalentní zesítění různých enzymů pomocí různých bi-resp. polyfunkčních činidel, zejména glutaraldehydu nebo toluendiísokynátu za vzniku ve vodě nerozpustné kovalentně prokřížené sítě enzymově aktivních bílkovin /Jansen E.F. a Olson, A.C; Arch. Biochem. Biophys. j_2_9, 221, 1969/. Tyto postupy nevyžadují ve vodě nerozpustné nosiče vůbec. Na rozdíl od předchozích postupů /vazba na povrchy buněk/, poskytuje posléze zmíněný postup nižší výtěžky imobi 1 izovaného enzymu a obvykle se tyto preparáty vyznačují nižši stabi 1 i tou imobi1 izované enzymové aktivity. Zesítění enzymů pomocí zmíněných velmi reaktivních sítovacíeh činidel vede často k značné případně úplné inaktivaci enzymové aktivity. K potlační silné inaktivace enzymové aktivity při sítění enzymů např. glutaraldehydem se používá konkurenční reakce s přídatnou bílkovinou např. albuminem v průběhu reakce sítění požadovaného enzymu, popřípadě sítění v přítomnosti ř
diaminů např. hexamethylendiaminu /Avrameas, S., Immunochemistry 6, 43, 1969/.
Zvláštním případem je pak využití ve vodě rozpustných chemicky inertních čí chemicky reaktivních polymerů, kdy v prvém případě se jedná např. o sorpcí rozpuštěného enzymu na ve vodě rozpustný polymer, Čímž se vytvoří stabilizovaný ve vodě rozpustný
231 858 komplex enzym/polymer, ve druhém případě se ve vodě rozpustný polymer chemicky aktivuje a po jeho aktivaci se smísí s enzymem, čímž dojde ke kovalentní vazbě enzymu na aktivovaný polymer za vzniku chemicky stabilizovaného avšak ve vodě rozpustného enzymu. Příkladem přípravy stabilizovaných vévodě rozpustných enzymů je glycerolkináza sorbovaná na dextran /USA patentový spis č. 3,962 037/ nebo kovalentně vázaná pěnic i 1inacyláza na kyanobromidem aktivovaný ve vodě rozpustný dextran /NSR DOS 2,312 824/ či tentýž enzym kovalentně vázaný na ve vodě rozpustné kopolyméry maleinahydridu s vinylmethyl etherem, ethylenem, styrenem nebo vinylacetátem. Rovněž je popsán způsob chemické aktivace bílkovin například albuminu glutaraldehydem zá vzniku ve vodě rozpustné chemicky aktivní bílkoviny /Áttalla a Hultin, J.Food.Sci., 42,
7, 19777/. Při využití posléze zmíněných postupů rezultují imobilizované avšak ve vodě rozpustné enzymy, přičemž imobilizované enzymy tím, že zůstávají ve vodě rozpustné nelze využít pro průmyslové bíotransformace běžnými typy reaktorů, jejichž využití je omezeno na speciální typy ul trafi 1tračních reaktorů, což je spojeno se značnými nároky na aparaturní vybavení. Tohoto způsobu imobilizace se v převážné většivě případů používá ke stabilizaci enzymů pro analytickou a k1inicko-diagnostickou praxi.
Zjistili jsme v nedávné době, že lze připravit buněčné katalyzátory využitelné pro bíotransformace na bázi imobi1izovaných prokaryontních či eukaryontních buněk různých druhů mikroorganismů a rostlinných buněk obsahujících různé enzymy pomocí reaktivních ve vodě rozpustných polymerů podle čs. autorského osvědčení č. přičemž resultující částice zmobilizovaných buněk se vyznačují velmi dobrými sedimentačními vlastnostmi, vysokou specifickou aktivitou a vysokým výtěžkem imobilizace. Tento postup byl aplikován v různých modifikacích s cílem principiálního ověření schůdností přípravy imobi 1 izovaných ve vodě nerozpustných enzymových katalyzátorů, jinými slovy namísto enzymově aktivních buněk různých druhů organismů bylo použito různých do různého stupně Čistoty purifikovanýčh enzymů izolovaných z mikrobiálních, rostlinných a živočišných zdrojů.
Naskýtá se| otázka účelnosti využití předmětného postupu pro získání imobi1izovaných enzymů jestliže tento postup principiálně a β dobrými výtěžky lze využít při použití enzymově aktivních buněk, tedy postupu nevyžadujícího předchozí čištění a izolaci požadovaných enzymů z produkčních buněk různých mikroorganismů.
231 BM
Důvody pro využiti předmětného postupu vyplývají z následujících skutečností.
1. Některé enzymy jsou extracelulární, tedy nejsou zadržovápy v produkčních buňkách mikroorganismů, což vylučuje využití imobilizovaných buněk.
2. Rada enzymů, které zůstávají v buňkách a které mají vysokomolekulární substráty /bílkoviny, tuky, polysacharidy/ by byla nevyužita, nebotprostupnostbuněčné stěny u mikroorganismů je omezena na sloučeniny s nízkou molekulovou hnotností, což opět vylučuje v těchto případech využití imobilizovaných buněk.
3. Řada průmyslově vyráběných enzymů je jiného než mikrobiálního původu /např. trypsin, chymotrypsin, papain apod./.
4. Je známo, že cena řady imobilizovaných preparátů enzymů je výrazně ovlivněna cenou nosiče; předmětný způsob podle vynálezu nevyžaduje žádných organických, anorganických či přírodních ve vodě nerozpustných nosičů.
Předmětem vynálezu jsou enzymové katalyzátory pro biotransformace sestávající z enzymů mikrobiálního, rostlinného či živočišného původu imobilizovaných chemicky reaktivním polymerem rozpustným vévodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je například polyethylenimin, hexamethylendiamin, lysin a polylysin, s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jako je například gl utaraldehyd, popřípadě dále mechanicky zpevněné.
Jako enzymový materiál mohou tyto katalyzátory obsahovat mikrobiální, rostlinné či živočišné enzymy o různé čistotě, a s'v hodou technické nebo surové enzymové preparáty nesoucí zejména hydrolázovou,izomerázovou , lyázovout racemázovou a jinou aktivito.
Předmětem vynálezu jé dále způsob výroby uvedených katalyzátorů, jehož podstata spočívá v tom, že se výše uvedené vodné roztoky enzymů o koncentraci bílkovin 5,0 až 500,0 mg/ml imobilizují uvedením ve styk s ve vodě rozpu&tným, chemicky reaktivním polymerem, vzniklým reakcí ve vodě' rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, s výhodou s polyethyleniminem a 8 bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, 8 výhodou s glutaraldehydem, při teplotě v rozmezí 0 až 60 °C ve vodném prostředí, při pH v rozmezí 4,0 až 12,0, přičemž reakce.uvedeného enzymového materiálu s uvedeným polymerem se pro vádí při teplotě v rozmezí -30 až *50 °C vé vodném prostředí a př
231 U6 pH v rozmezí 5,0 až 9,0, vzniklé nerozpustné částice se po oddělení z reakční směsi promyjí vodou nebo pufrem, načež se popřípadě mechanicky zpevňují.
Je výhodné, když se k přípravě ve vodě rozpustného polymeru použije vodný roztok polyethyleniminu s distribucí molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000.
Výhodně se reakce uvedených enzymů s uvedeným polymerem provádí při teplotě 0 až 45 °C, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 g, při filtračním tlaku od 0 do 50 000 KPa, při stání či míchání nebo při přerušovaném míchání a stání reakční směsi.
Částice imobilizovaných enzymů se popřípadě dále mechanicky zpevňují částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, s výhodou acetonem, popřípadě roztoky lepidel v Organických rozpouštědlech nebo jejích směsí s vodou, při teplotách +30 až -25 °C, popřípadě se částice před a/nebo po mechanickém zpevnění vhodným způsobem postformují a parciálně vysuší.
Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že se za pomoci chemicky reaktivních ve vodě rozpustných polymerů /dále jen RRP/ získají imobi 1 izované ve vodě nerozpustné enzymy s dobrou specifickou aktivitou a velmi dobrými sedimentačními vlastnostmi a dobrým výtěžkem imobilizace, který pochopitelně kolísá podle typu enzymu a jeho čistoty od řádově desetin procent až několika desítek procent a to í v případech vysoce citlivých enzymových aktivit ve srovnání s použitím volných velmi reaktivních sítovacích činidel, zejména glutaraldehydu. Mechanismus tvorbv RRP je naznačen v popisu vynálezu ke. AO 231 458 k imobilizaci není třeba žádného ve vodě nerozpustného organického, anorganického či přírodního nosiče.
Postup výroby podle předmětného vynálezu principiálně sestává ze dvou technologických operací. V prvé fázi se připraví chemicky reaktivní ve vodě rozpustný polymer /RRP/, s výhodou reakcí komerčně dostupných flokulantů používaných k Čištění odpadních vod obsahujících frakci polyethyleniminu, např. Sedipur KA nebo Sedipur CL-930 s bifunkčním sítovacím činidlem, např. glutaraldehydem, ve vodném prostředí s výhodou za míchání reakční směsí.
' · *»
Rychlost polymerace lze například sledovat na základě změny absorbance přírůstků koncentrací barevných Schiffových bází ve viditelné oblasti spektra /např. pří 550 nm/, jejichž koncentrace je především závislá na poměru obou reakčních složek, tj. sítovadla: koreagující sloučenině, reakční době a teplotě. Reakci lze
-7231 SM popsat kinetíkou prvého řádu. V druhé fází se do částečně nebo kvantitativně zreagovaného roztoku RRP /podle citlivosti ímobilízovaného enzymu k částečně nezreagovanému glutaraldehydu/, obvykle po 1 až 24 hodinách reakce, vmíchá vodnýt roztok, pož^adovaného enzymu v rozsahu aktuálních koncentrací bílkovin v reakční směsi 5,0 až 500,0 mg/ml, a v závislosti na použité technice ímobilizace, zejména míchání, stání, mrazení, působení filtračního tlaku, odstředivého pole, vytlačování vzniklých částic vhodným zařízením a následného parciálního sušení za sucha či vlhka lze regulovat velikost, tvar, charakter, porozitu a specifickou aktivitu částic imobi 1 izovaných enzymů.
Způsob výrohy imobilizovaných enzymů podle vynálezu rovněž zahrnuje postupy následného ošetření imobilizovaných částic vedoucích k zvýšení jejich mechanické stability a pevnosti, zejména částečné dehydratace částic ošetřením acetonem či jinými organickými rozpouštědly, popřípadě a s výhodou roztoky takových komerčních lepidel v organických rozpouštědlech, které po parciálním zaschnutí vytvoří ochrannou mikrovr&tvu ve vodě nerozpustného filmu na povrchu částice, za individuální volby podmínek ošetření, za předpokladu z technologického hlediska nepříliš významné limitace enzymové reakční rychlosti difúzí.
Pro výrobu imobilizovaných enzymů podle vynálezu lze principiálně použít různé mikrobiální, rostlinné a živočišné enzymy, zejména extracelulárni mikrobiální a rostlinné a živočišné proteázy, například různě čisté preparáty alkalické, neutrální a kyselé proteázy z různých mikrobiálních kmenů například rodu Bacillus, proteázy rostlinné například papain a živočišné například trypsin a chymotrypsin a další hydrolázy mikrobiálního původu izolované do různého stupně čistoty z kultivační kapaliny či z buněk mikroorganismů, jako například enzym penici.l inamidohydroláza a beta-galaktosidáza z buněk E.coli, invertáza z kvasinek, glukózoizomeráza ze Streptomycet a podobně. Výhodné je použití tak zvaných technických, nepříliš čistých preparátů enzymů, kdy obsah daného enzymu v preparátu činí 1,0 až 10,Q Z z* celkového množství bílkovin a kdy se předpokládá využití ve větších objemech výroby pro průmyslové biotransformace. Při přípravě takových imobilizovaných enzymů není na závadu jestliže roztoky technických enzymů obsahují před iuobilizací určitý suspensní podíl buněčného detritu z jednotlivých mikrobiálních buněk či rostlinných nebo živočišných tkání pramenících z procesu izolace, tedy.použijí-li se tak zva-8né surové enzymové preparáty. 231 858
Velikost částic imobi 1 izovaných enzymů získaných postupem podle vynálezu byla posuzována mikroskopicky /optickým mikroskopem/ s použitím kalibrovaného měrného okuláru. Některé preparáty byly posuzovány rastrovacím elektronovým mikroskopem. K analýze velikostí částic bylo použito kovových sít pro sítovou analýzu a vázané enzymy byly děleny podle velikosti použitím tří sad těchto sít, přičemž síta měla otvory o velikosti od 0,1 až do 2,0 mm. Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny tak, že 2,5 vlhké' hmoty preparátu bylo suspendováno v celkovém objemu 25 ml demineralizované vody v kalibrovaném odměrném válci a byl sledován čas potřebný ke kvantitativní sedimentaci částic.
Aktivity zmobilizovaných enzymu byly hodnoceny za. mí cháni a temperace definovaného množství částic v roztoku substrátu za podmínek měření v oblastí kínetiky nultého řádu enzymové reakce a enzymová aktivita resp. specifická aktivita vyjadřována jako množství vytvořených umolů produku resp. produktů/mg nebo gram vlhké hmoty částic, nebo jako procento konverse přeměněného substrátu na produkt, pokud není v příkladech uvedeno jinak.
Po dekantaci a vakuové filtrací částic zmobilizovaných enzymů činila jejich průměrná vlhkost /obsah vody/ 90 Z.
V následujících příkladech provedení se jako látky obsahují cí alespoň dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny používá komerčních flokulantů typu Sedípur a to Sedipur KA nebo Sedípur CL-930, který obsahuje polyethylenimin o molekulové hmotnosti 200 000 až 300 000 v koncentraci přibližně 30 hmotnostních procent, nebo polylysin hydrochlorid o molekulové hmotnosti přibliž ně 40 000 až 50 000.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
-9Příklady provedení
Příklad 1 231 6M
Bylo připraveno 50 ml 2 Z /hmota/objem/ vodného roztoku Sedipuru CL-S30 /BASF, A.G./ v demineralizované vodě. Do tohoto roztoku, jehož pH bylo 6,1 byl přidán 25 Z vodný roztok glutar aldehydu /MERCK/ tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 1,0 Z /objem/objem/. Reakční směs byla umístěna na laboratorní třepací stroj a ve zvolených časových intervalech byla sledována rychlost polymerace spektrofotometricky při 550 nm /Unicam, SP-500, hranaté skleněné kyvety 10 x 10 mm/. Reakce probíhala za nepřetržitého míchání při teplotě místnosti. Hodnoty absorbancí z jednotlívých vzorků odebíraných v závislosti na čase z reakční směsi byly měřeny proti demineralizované vodě. Reakce probíhala 24 h.
0,75 g lyofilizovaného technického preparátu beta-galaktosidázy izolované z buněk Escherichia coli o specifické aktivitě 30/Umol o-nitrofenolu/min/mg bílkovin /37 °C, pH 7,0, substrát o-nitrofenyl beta-D-galaktopyranosid/ bylo rozpuštěno v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,0 na celkový objem roztoku 25 ml; vznikl roztok technického enzymu o celkové koncentraci bílkovin 30 mg/ml
K 25 ml popsaným způsobem připraveného roztoku technické beta-galaktosidázy bylo přidáno 25 ml popsaným způsobem připraveného RRP, reakční směs krátce promíchána a vzniklý precipitát obsahující 15 mg bílkovin/ml byl přelit na misku zhotovenou z hliníkové fólie o 0 20 cm a miska s reakční směsí uložena do mrazícího boxu při teplotě -20 °C po dobu 3 hodin. Po této době byla miska z hoxu vyjmuta, zmrzlý obsah na misce přelit přibližně 50 ml téhož pufru v jakém byl rozpuštěn enzym a obsah ponechán zvolna rozmrazit při teplotě místnosti po dobu 30 min.
Po této době byly vytvořené voluminézní částice přelity do 200 ml téhož pufru a několikrát tímto pufrem dekantovány vždy po kvantitativní sedimentaci částic stáním. Poté byly částice vakuově dobře odsáty na fritě přes filtrační papír a odsáté zváženy /0,92 g/.
0,92 g vlhké hmoty částic zmobilizovaného enzymu, po předchozí mechanické homogenizaci voluminézní hmoty, bylo suspendováno ve 20 ml acetonu předem vychlazeného na -20 °C a po dobu 2 minut intenzivně pomoci vrtulového míchadla mícháno. Po této době byly částice ostře vakuově odsáty e na fritě několikrát
-10231 651 promyty tímtéž pufrem a dobře odsátý a promytý materiál zvážen /0,45 g/.
Specifická aktivita materiálu činila 8,6 ^umol o-nitrofenolu/min/mg vlhké hmoty imobi 1 izovaného enzymu. Materiál byl tvořen voluminézními vločkami béžové barvy o velikosti 0,5 až 2 mm, které sedimentovaly kvantitativně stáním během jedné minuty. Mikroskopický obraz a snímek z rastrovacího elektronového mikroskopu prokázal určitou porozitu částic, které připomínaly svým charakterem polyuretanovou pěnu; částice tvořily amorfní útvary s nepravidelnými okraji.
Příklad 2
Bylo připraveno 50 ml 2 7, /hmota/objem/ vodného roztoku Sedipuru CL-930 v demineralizované vodě. Roztok flokulantu byl vakuově přefiltrován přes porcelánovou fritu S-4 tak, aby byla dokonale odstraněna nerozpustná frakce hydrofilníeh krupiček.
K 50 ml dokonale rozpustného Čirého filtrátu byl přidán 25 Z vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 1,0 X /objem/objem/ a dále bylo postupováno jak je uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že reakce probíhala 3 hodiny za jinak stejných reakčních podmínek a podmínek sledování rychlosti polymerace.
2,5 g lyofilizovaného technického preparátu beta-galaktosidázy jako v příkladu 1 bylo rozpuštěno ve 25 ml fosfátového pufru rovněž jak je uvedeno v příkladu 1. Vznikl roztok technického enzymu o celkové koncentraci bílkovin 100 mg/ml.
K 25 ml roztoku technické beta-galaktosidázy bylo přidáno 25 ml popsaným způsobem připraveného RRP a roztoky promíchány. Reakční směs obsahující 50 mg/ml bílkovin byla umístěna na rotační třepací stroj o počtu otáček 160/min a jednu hodinu nepřetržitě míchána a poté ponechána stát .1 hodinu v klidu při teplotě místnosti. Vzniklé nerozpustné částice byly vakuově přes textilní materiál odsáty a na fritě důkladně promyty dvěma litry 0,05 M fosfátového pufru pH 7,0, znovu důkladně vakuově odsáty a zváženy; bylo získáno 3,75 g vlhké hmoty imobilizovaného enzymu.
Vlhké částice imobi 1 izované beta-galaktosidázy byly suspendovány v acetonu za podmínek a způsobem uvedeným v příkladu 1 a dobře odsátý a stejným způsobem promytý materiál zvážen /1,12 g/.
-11Specifická aktivita materiálu činila 15.1
231 658 umol o-nitrofenolu/min/mg vlhké hmoty iraobi 1 izovaných částic. Materiál byl tvořen nepravidelnými destičkami béžové barvy s distribucí velikosti částic 0,3 oí 2,8 mm, kterg sedimentovaly kvantitativně stáním během několika desítek sekund.
Jeden g vlhké hmoty částic imobi 1 izované beta-ga1aktosidázy byl suspendován ve 25 ml 5 Z /v/v/ roztoku laktózy rozpuštěné v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,0, nádobka umístěna do termostatu při teplotě 37 °C a v čase sledována rychlost enzymové hydrolýzy laktózy na glukózu a galakťózu v průběhu nepřetržitého míchání.
Ke kvantitativní konverzi /100 Z/ laktózy na oba zmíněné monosacharidy došlo za uvedených reakčních podmínek za 3 hodiny. Enzymová hydrolýza s toutéž násadou katalyzátoru byla opakována celkem pětkrát vždy tak, že po skončení reakce byla reakční směs přes husté polyamidové sítko slita, zachycené částice promyty 100 ml zmíněného pufru a znovu suspendovány v čerstvé násadě roztoku laktózy za jinak stejných reakčních podmínek při stejné reakční době. Průměrný stupeň konverse/p^ět opakovaných cyklů použití téže násady imobi 1 izované ga1aktosidázy činil 98,2 Z.
Příklad 3
Bylo připraveno 50 ml RRP postupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že reakční doba polymerace* činila jednu hodinu. Dále bylo připraveno 50 ml roztoku technické pěnici 1inacy1ázy tak, že 6 g 1yofi 1 izovaného enzymu bylo rozpuštěno v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7,6 a doplněno na uvedený objem. Vznikl roztok technického enzymu obsahující 120 mg bílkovin/ml o specifické aktivitě penici 1inacy1ázy 260 yumol 6-aminopenici lánové kyseliny/ /h/mg bílkovin /pH 7,6, teplota 42 °C, substrát K-sůl-benzylpenicilinu/. Enzym byl izolován z buněk vysokoprodukční mutanty E . coli.
Roztok enzymu byl kvantitativně přelit do 200 ml skleněné nádobky, do níž bylo zavedeno vertikální ocelové vrtulové míchadlo a spuštěno míchání o počtu otáček 120/min. Poté byl smíchán roztok RRP s roztokem enzymu v objemovém poměru 1 : 1 na celkový objem 100 ml; aktuální koncentrace bílkovin v reakční směsi činila 60 mg/ml. Reakční směs byla nepřetržitě míchána po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, poté míchadlo vypnuto a vytvořená suspenze ponechána v klidu 30 minut stát, načež byla přelita po
-12231 Ml mírném promíchání na ocelové síto o velikosti ok 0,1 mm a na sítu částice promyty plavením demineralizovanou vodou. Voluminézní částice byly suspendovány ve 100 ml 0,05 M fosfátového pufru pH
7,6 a vakuově dobře odsáty a za míchání suspendovány v 50 ml acetonu předem vychlazeného na teplotu -20 °C. Materiál byl intenzivně míchán po dobu tří minut a poté ostře vakuově odsát, na fritě ještě přibližně 5 min odsáván a poté promyt jedním litrem zmíněného pufru, znovu odsát a zvážen /4,3 g/.
Specifická aktivita materiálu činila 12,6 ^umol 6-APK/h/mg vlhké hmoty imohilizovaných částic. Materiál tvořil světlehnědé částice přibližně sférického tvaru s p'růměrnou distribucí velikosti 0,45 - 2,0 mm a k jeho kvantitativní sedimentaci vedlo stání po dobu několika desítek sekund.
g vlhké hmoty imobi1 izované pěnic i 1inacy1ázy bylo suspendováno v 50 ml 6 Z Ivlvl roztoku K-soli benzylpenici1 inu rozpuštěného v demineralizované vodě a v průběhu nepřetržitého míchání a temperace při 37 °C za kontinuální úpravy pH. na hodnotu 7,8 zředěnou čpavkovou vodou /15 Z v/v/ byla sledována reakční rychlost konverze benzylpěnici 1 inu na 6-APK. Ke kvantitativní konverzí suhstrátu na zmíněný produkt došlo za uvedených reakčních podmínek za 90 minut. Enzymová hydrolýza s toutéž násadou katalyzátoru byla opakována celkem desetkrát vždy tak, že po skončení reakce byla reakční směs přes husté polyamidové sítko slita, zachycené částice promyty 100 ml vody a znovu suspendovány v čerstvé násadě roztoku benzylpenící1 inu za jinak stejných reakčních podmínek při stejné reakční době a postupu enzymové biotransformace. Průměrný stupeň konverze/10 opakovaných.cyklů použití téže násady imobi 1 izované pěnicí 1inacylázy činil 97,3 Z, koncentrace zbytkového penicilinu byla nulová a průměrné množství degradačních produktů penicilinu a 6-APK činilo 2,5 Z.
Příklad 4
Bylo připraveno 50 ml RRP pos,tupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že na místo Sedipuru CL-930 byl použit. Sedípur KA. Dále bylo připraveno 50 ml roztoku technické pěnici iinacylázy o specifické aktivitě a způsobem uvedeným v příkladu 3 s tím rozdílem, že roztok enzymu v pufru obsahoval 60 mg/ml bílkovin.
ml roztoku RRP bylo smícháno s 50 ml roztoku enzymu; vznikla reakční směs o aktuální koncentraci bílkovin.30 mg/ml.
-13231 S5B
Dále bylo pří imobílizací enzymu postupováno jako v příkladu 1 /mražení reakční směsi po dobu tří hodin/. Poté byly vytvořené částice přelity pufrem a několikrát dekantovány přibližně 100 ml 0,05 M fosfátového pufru pH 7,6 vždy po kvantitativní sedimentací částic stáním, dále vakuově dobře přes textilní materiál odsáty a odsáté zváženy /2,3 g/.
Uvedené množství imohi1 izované penicilinacylázy bylo ošetřeno předchlazeným acetonem způsobem uvedeným v příkladu 1 a dobře odsáté a fosfátovým pufrem promyté částice zváženy /1,46 g/ a ostrým kopím homogenizovány na menší kousky. Imobi 1 izovný a ošetřený materiál byl pak ponechán botnat v 50 ml uvedeného pufru přes noc při teplotě +8 °C.
Specifická aktivita materiálu činila 4,5 yumol 6-APK/h/mg vlhké hmoty imobi 1 izovaných částic. Materiál po nabotnání tvořil béžové ohraničené pevné destičky nepravidelného tvaru s průměrnou distribucí velikosti 0,8 «^4,0 mm a sedimentoval kvantitativně stáním během několika sekund.
Jeden gram vlhké hmoty imob i 1 i zovaňíépěnic i 1 inacy 1 áz y bylo suspendováno v 50 ml 6 Z /w/v/ roztoku K-soli desacetoxycefalosporinu - G rozpuštěného v demineralizované. vodě a v průběhu nepřetržitého míchání a temperace pří 37 °C za kontinuální úprav pH · na hodnotu 7,6 zředěným roztokem NaOH /0,1 M/ byla sledována reakční rychlost konverse desacetoxycefalosporinu G na kyselinu 7-rdesace tox.ycef alosporánovou /7-ADCK/. Ke kvantitativní konverzi substrátu na zmíněný produkt došlo za uvedených podmínek zá 150 minut. Enzymová hydrolýza s toutéž násadou katalyzátoru byla opakována celkem třikrát způsobem popsaným v příkladu 3. Průměrný stupeň konverze/3 cykly opakovaného použití téže násady imobilizované penicilinacylázy činil 93,6 Z, koncentrace zbytkového desacetoxycef alosporinu činila 1 Z, průměrné množství degradačních produktů desacetoxycefalosporinu a 7-ÁDCK činilo 4,3 Z.
Příklad 5
Bylo připraveno 100 ml roztoku RRP postupem uvedeným v přikladu 1. Dále byl připraven roztok proteázy živočišného původu takto. 3,0 g suché hmoty lyofi 1 izovaného chymotrypsinu /n.p. Léčiva - SPOFA/ o specifické aktivitě 3,0 j/mg /substrát kasein, teplota 35 °C, pH 8,0/, bylo rozpuštěno ve 40 ml 0,05 M fosfátového pufru o pH 7,6 a za nepřetržitého míchání bylo pH roztoku enzymu
-14231 8M upraveno 10 Z roztokem NaOH na hodnotu 7,2 a doplněno zmíněným pufrem na celkový objem 50 ml. Vznikl roztok proteázy o pH 7,2 a koncentraci bílkovin 60 mg/ml. Roztok byl rozdělen na dvě stejné objemové části /á 25 ml/ a dále postupováno takto.
K 25 ml tohoto roztoku bylo přidáno 25 ml RRP, krátce a rychle promícháno a precípitát přelít na misku zhotovenou z hliníkové fólie a dán zmrazit při teplotě -20 °C do mrazícího boxu po dobu tří hodin; aktuální koncentrace bílkovin v reakční směsi činila 30 mg/ml. Po této době byla miska vyjmuta, obsah přelit stejným fosfátovým pufrem a ponechán rozmrazit při teplotě místnosti, poté materiál několikrát dekantován tímtéž pufrem za mírného míchání tyčinkou, poté kapalina slita a částice zfiltrovány přes kalolisovou plachetku za vakua. Vlhký, dobře odsátý materiál po filtraci ostrým kopím homogenizován na přibližně stejně velké částice a rozdělen na dva stejné hmotnostní podíly.
Jedna část materiálu přelita 50 ml téhož fosfátového pufru a ponechána botnat při +8 °C do druhého dne /vzorek označen a^/. Druhá část byla ošetřena 25 ml acetonu vychlazeného předem na -20 °C za míchání po dobu 2 minut, poté materiál ihned ostře vakuově odsát a odsátý několikrát dekantován tímtéž fosfátovým pufrem, znovu odsát, homogenizován os trým kopím, přelit cca 50 ml téhož pufru a ponechán botnat pří +8 °C do druhého dne /vzorek označen a^l.
K 25 ml roztoku téhož enzymu /druhá objemová část/ bylo při dáno 25 ml téhož roztoku RRP, čímž vznikl roztok o aktuální koncentraci bílkovin v reakční směsí 30 mg/ml a 30 minut byla reakční směs míchána na laboratorní třepačce pří teplotě místnos ti a poté precipítát ponechán při této teplotě stát po dobu dvou hodin. Po této dohě byla reakční směs odstředěna 5 minut pří 5000 g, čirý supernatant slit a sediment rozmíchán ve 100 ml téhož pufru, několikrát tímtéž pufrem dekantován, po dekantaci čás tice přes textilní materiál vakuově odsáty, promyty pufrem a dobře odsáté popsaným způsobem homogenizovány.
Dále byl imobi 1 izovaný materiál ošetřen acetonem, promyt, homogenizován a ponechán botnat způsobem popsaným u vzorku aj v tomto příkladu. Vzorek byl označen b^.
Enzymové aktivity vázaného chymotrypsinu uvedenými způsoby imobilizace jsou shrnuty v následující tabulce.
-15231 3M
| Označení vzorku | ai | a2 | b1 |
| získána vlhké hmoty materiálu /g/ | 2,3 | 1.6 | 1.5 |
| spécifická aktivita | |||
| /j/mg vlhké hmoty/ | 7,3.10-3 | 4,4.10-3 | 0,015 |
| výtěžek imobilizace*^ /2/ | 0,75 | 0,3 | 1.0 |
+ / vztaženo na výchozí rozpustný chymotrypsin.
Všechny získané -imobi 1 izované vzorky chymotrypsinu sedímentovaly kvantitativně během několika desítek sekund, částice proteázy imobi.lizované mražením vykazovaly na snímcích z rastrovacího elektronového mikroskopu nižší porozitu částic ve srovnání se snímky vzorků získaných technikou mícháni/stání s odstředěním , což je v souhlase se zjištěnou specifickou aktivitou imobilízovaných materiálů.
Přiklad 6
Bylo připraveno 50 ml RRP postupem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že reakční doba polymerace činila 16 hodin. Dále byl připraven roztok proteázy rostlinného původu takto. 6,0 g suché hmoty papainu /Fluka, A.G., Švýcarsko/ o specifické aktivitě 1,0 j/mg bylo rozpuštěno v 50 ml 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,6. Vznikl roztok papainu o koncentraci bílkovin 120 mg/ml.
K 50 ml roztoku tohoto enzymu bylo přidáno 50 ml RRP a reakční směs nepřetržitě míchána pomocí vertikálně umístěného ocelového míchadla s intenzitou 60 ot/min při teplotě místnoti po dobu 30 min a poté ponechána 30 minut v klidu. Vzniklá suspenze byla vakuově pře kalolisovou plachetku filtrována, promyta jedním litrem téhož pufru a znovu vakuově odsáta a nerozpustný«materiál zvážen /10,2 g/. Imobi1 izovaný materiál byl po homogenizaci rozdělen na dvě stejné hmotnostní částí /přibližně á 5 g/, přičemž první část byla suspendována v 50 ml předchlazeného acetonu způsobem, který je uveden v příkladu 5 včetně promytí a botnánž, druhá část byla vpravena do injekční stříkačky a vytlačena do formy válcovitých útvarů stříkačkou bez jehly na hliníkovou fólii. Po vytlače-16231 BM ní byl materiál sušen tři hodiny na vzduchu p.ři teplotě místnosti. Po částečném vysušení byl materiál homogenizován nožem na přibližně stejné válečky, tyto přelity 50 ml téhož pufru a ponechány botnat přes noc při +8 °C.
Bylo získáno 3,2 g imobi1izovaného papainu o specifické aktivitě 0,017 j/mg vlhké hmoty v případě prvém /materiál ošetřený acetonem/ a 3,6 g téhož imobilizovaného enzymu o specifické aktivitě 0,0095 j/mg vlhké hmoty v případě druhém /postformovaný, parciálně sušený materiál/. Oba materiály sedimentovaly kvantitativně během několika desítek sekund, průměrná distribuce velikosti částic prvého /ošetřeného/ materiálu činila 0,45 «df * 1,75 mm, u druhého vzorku /postformovaný materiál/ tvořily částice válcovité útvhry přibližně 1,0 1,5 mm silné a 1,5 *4
4,0 mm dlouhé.
Příklad 7
Bylo připraveno 25 ml 0,1 Z /hmota/objem/ vodného roztoku pólylyzinu.HCL o molekulové hmotnosti 40 000 až 50 000 v destilované vodě. Do tohoto roztoku byl přidán 25 Z vodný roztok glutaraldehydu.tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 0,15 procent /objem/objem/. Reakční směs byla umístěna na laboratorní třepačku a ve zvolených časových intervalech byla sledována rychlost polymerace spektrofotometrický při 415 nm.
Reakce probíhala za nepřetržitého míchání při teplotě místností po dobu 4 hodin.
ml surového preparátu invertázy získané rozbitím buněk a částečným odstředěním buněčné detritu odpadních pivovarských kvasinek Saccharomyces car1 sběrgensis o koncentrací bílkovin
11,6 mg/ml a specifické aktivitě 2,8 j/mg /substrát sacharóza, pH 4,9, teplota 30 °C/ bylo smícháno s 25 ml RRP, jehož způsob přípravy byl uveden v předchozím odstavci. Reakční směs byla intenzivně promíchána a přelita na misku zhotovenou z hliníkové fólie a uložena na dobu 4 hodin do 'mrazícího boxu při teplotě -25 °C. Po této době byla miska z mrazícího prostoru vyjmuta a její obsah přelit 0,05 M acetátovým pufrem o pH 4,9 a ponechán samovolně rozmrazit při teplotě místnosti. Vzniklý houbovitý precipitát byl vakuově zfiltróván a vpraven do injekční stříkačky a vytlačen do formy válcovitých útvarů stříkačnou bez jehly . na hliníkovou fólii. Po vytlačení byl materiál sušen 5 hodin na
-1 7231 BSB vzduchu při teplotě místností. Po ěástečhém vysušení byl materiál homogenizován nožem na přibližně stejné válečky, tyto přelity í . . · ml téhož acetátového pufru a ponechány botnat přes noc při.
+ 8 °C.
Bylo získáno 1,04 g postformovaných částic imobi1 izované invertázy ve tvaru válečků..Uvedené množství imobi1 izovaného enzymu bylo suspendováno v 50 ml 10 Z roztoku sacharózy rozpuštěné ve zmíněném acetátovém pufru pH 4,9 a v průběhu nepřetržitého míchání při teplotě 30 °C byla provedena enzymová inverze sacharózy na směs glukózy a fruktózy. Enzymová biotransformace byla kvantitativní za uvedených podmínek reakce za 6 hodin. Tento Λ postup byl opakován třikrát s touže násadou katalyzátoru, přičemž po každém ze skončených cyklů enzymové inverze byl katalyzátor « oddělen přes polyamidové sítko^, promyt zmíněným pufrem a znovu použit. Průměrný stupeň enzymové inverze/3 cykly opakovaného použití téže násady katalyzátoru činil 86,2 Z.
Příklad 8 litrů zahuštěné vodné suspenze buněk Streptomyces phaeochromogenes /40 objemových Z hiomasy/ obssahujících enzym glukózoizomerázu bylo ochlazeno na +5 °C. Poté byla suspenze desintegro vána dvojnásobným průchodem štěrbinovým mechanickým desintegrátorem při tlaku 250 atm. Suspenze mezi jednotlivými desintegracemi byla průběžně chlazena tak, aby maximální teplota desintegrované směsi nepřesáhla 45 °C. Poté byla suspenze odstředěna /Janetzki S-70, 5 000 g, 30 minut/ a zakalený, silně opalescentní supernatant slit. Bylo získáno 2,8 litru surového enzymového preparátu o koncentraci 105,6 mg/ml bílkovin a specifické aktivitě glukózoizomerázy 0,8 yumol fruktózy/min/mg bílkovin /teplota 60 °C, pH 9,3, substrát glukóza/.
Ke 100 ml popsaným způsobem získané surové glukózoizomeráze bylo přidáno 100 ml RRP, jehož způsob přípravy byl uveden v pří« kladu 1 s tím rozdílem, že reakční doba* polymerace či nila jednu hodinu a s tím rozdílem, že koncentrace flókulantu Činila 4 Z * a koncentrace glutaraldehydu 2 Z. Aktuální koncentrace bílkovin v reakční směsi činila 52,8 mg/ml. Reakční směs byla jédnu hodinu nepřetržitě míchána pomocí vrtulového ocelového míchádla o počtu otáček 60/min při teplotě místnosti. Po této době byl vzniklý houbovitý precípitát odstředěn /5 000 g/15 min/, super- 1 8231 an natant slit a vzniklá hmota vpravena ve formě vlhkého koláče do sáčku z kalolisové tkaniny, otvor sáčku přehnut a zajištěn kovovými svorkami, sáček vložen mezi dvě kovové desky ve vodorovné poloze a vystaven krátkodobě hydraulickému tlaku 1,25.10 kPa pomocí hydraulického lisu při teplotě místnosti po dobu 10 minut.
Po této době byla hmota ve formě desky mechanicky rozrušena rozlámáním na menší kousky a vpravena do masového strojku se speciální ocelovou vložkou o velikosti pórů 1 mm a přes tuto vložku vytlačena do formy amorfních granulí. Materiál byl suspendován ve 100 ml 2 Z roztoku lepidla /Kanagomu/ v acetonu předem vychlazeného na teplotu -20 °C a po dobu 2 minut promícháván, poté ostře vakuově odsát přes kalolisovou plachetku a na nuči ještě odsáván po dobu 15 minut. Poté byl materiál přenesen do 100 ml Britton-Robinsonova pufru o pH 8,0 a ponechán botnat při +8 °C přes noc v lednici.
Celkem bylo získáno 8,4 g vlhké hmoty granulovaného pevného > materiálu imobilizované glukózoizomerázy o specifické aktivitě
0,12 yumol fruktózy/mín/mg vlhké hmoty. Materiál sedímentoval kvantitativně během několika sekund. 5 g tohoto materiálu bylo suspendováno v 50 ml 1 M roztoku D-glukózy o pH 9,0. Roztok glukózy byl předem vytemperován na 60 °C. Reakční směs byla nepřetržitě míchána. Po 4 hodinách reakce za uvedených podmínek došlo k izomeraci glukózy na směs fruktózy + glukózy v poměru koncentrací uvedených monosacharidů v uvedeném pořadí 40 : 60 X. Postup byl opakován se stejnou násadou katalyzátoru ještě pětkrát za stejných reakčních podmínek se stejným výsledkem. Katalyzátor byl po opakovaném použití cddělen z reakční směsi a promyt vodou již popsaným způsobem.
Příklad 9
2,5 kg buněčné pasty Alcalígenes metalcaligenes obsahující enzym aspartát amoniak lyázu bylo suspendováno v deminera1 izované vodě na celkový objem 10 litrů. Bďněčná suspenze byla ochlazena na +5 °C a poté dezintegrována při tlaku 250 atm trojnásobným průchodem štěrbinovým mechanickým dezintegrátorem. Suspenze mezi jednotlivými desintegracemi byla průběžně chlazena tak, aby maximální teplota dezintegrované směsi nepřesáhla 35 °C. Poté byla dezintegrovaná suspenze po částech odstředěna způsobem popsaným v příkladu 8. Bylo získáno 5,8 litrů surového roztoku enzymu o kon-19centraci 110 mg/ml bílkovin o specifické aktivitě 165 /umol kys. L-asparagové/min/mg bílkovin /substrát fumaran amonný, teplo ta 37 °C, pH 8,5/.
291 859
Ke 100 ml RRP, jehož způsob přípravy byl uveden v příkladu 1, bylo přidáno 100 ml surového preparátu aspartát amoniak lyázy získané způsobem popsaným v předchozím odstavci. Koncentrace bílkovin v reakční směsi činila 55 mg/ml. reakční směs byla jednu hodinu nepřetržitě míchána, poté odstředěna za podmínek a způsobem manipulace uvedeným v příkladu 8. Dále bylo při zpracování materiálu /působení filtračního tlaku, mletí/ postupováno rovněž způsobem uvedeným v příkladu 8 s tím rozdílem že postformovaný nepromytý granulovaný materiál nebyl ošetřen ani acetonem ani roztokem lepidla v acetonu, nýbrž sušen 5 hodin volně na vzduchu. Po této době byl materiál přenesen do 1,35 M roztoku fumaranu amonného o pH 8,5 a ponechán botnat přes noc při +8 °C.
Celkem bylo získáno 7,5 g granulovaného pevného materiálu imobilizované aspartát amoniak lyázy o specifické aktivitě 750 yusol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty; imobi1 izovaný materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund. 5 g tohoto materiálu bylo suspendováno v 50 ml 1,35 M roztoku fumaranu amonného o pH 8,5. Roztok substrátu byl předem vytemperován na 37 °C. Reakční sjněs byla nepřetržitě míchána. 'BA. 2,5 h reakce za uvedených podmínek došlo ke kvantitativní konversi zmíněného substrátu na produkt, kyselinu L-aparagovou. Postup byl opakován se stejnou násadou katalyzátoru celkem pětkrát za stejných reakčních podmínek. Katalyzátor byl po opakovaném použití oddělen z reakční směsí pomocí polyamidového sítka, na sítku promyt vodou a znovu použít. Průměrný stupeň konverze/5 cyklů opakovaného použití činil 99,6 7».
Claims (7)
1. Enzymové katalyzátory pro biotransformace^ sestávají«4 2 enzymů mikrobiálního, rostlinného či živočišného původu, zmobilizovaných chemicky reaktivním polymerem rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je například polyethylenimin, hexatnethylendiamin, lyein, a polylysin, s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jako je například glutaraldehyd, popřípadě dále mechanicky zpevněných.
2. Enzymové katalyzátory podle hodu 1^vyznačené tím, že uveděný enzymový materiál obsahuje enzymy o různé čistotě, s výhodou technické nebe surové enzymové preparáty, nesoucí výhodně hydrolázovou, izomerázovou, lyázovou nebo racemázovou aktivitu.
o
3. Enzymové katalyzátory podle bodu 1 a 2^ vyznačené tím, že uvedený enzymový materiál je imobilizován chemicky reaktivním polymerem rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí polyethy1eniminu s distribucí jeho molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000 s glutaraldehydem.
4. Způsob výroby enzymových katalyzátorů pro biotransformace podle bodu 1, vyznačený tím, že se vodné roztoky mikrobiálních, rostlinných či živočišných enzymů o koncentraci bílkovin 5,0 až 500,0 mg/ml imobilizují uvedením ve styk s ve vodě rozpustným, chemicky reaktivním polymerem, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, s výhodou polyethyleniminem, s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, s výhodou S glutara1dehydem, při teplotě v rozmezí 0 až 60 °C ve vodném prostředí, pří pH v rozmezí 4,0 až 12,0, přičemž reakce uvedeného enzymového materiálu uvedeným polymerem se provádí při teplotě v rozmezí -30 až +50 °C ve vodném prostředí a při pU v rozmezí 5,0 až 9,0, vzniklé nerozpustné částice se po oddělení z reakční směsi promyjí vodou nebo pufrem, načež se popřípadě mechanicky zpevňují.
-i. I .231 SM
5. Způsob podle bodu. 4, vyznačený tím, že se ve vodě rozpustný polymer připraví z vodného roztoku polyethyleniminu z distribucí molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000 a/nebo z vodného roztoku polylyzinu s distribucí molekulové hmotností 5 000 až 50 000.
o
6. Způsob podle bodu 4 a 5^vyznačující se tím, že se reakce uvede ných enzymových materiálů s uvedenými reaktivními polymery provádí při teplotě 0 až 45 °C, při relativní odstředivé síle
1 až 50 000 g, při filtračním tlaku od 0 do 50 000 KPa, při stání či míchání nebo pří přerušovaném míchání a stání reakční směsi.
7. Způsob podle bodu 4 a 5, vyznačující se tím, že částice imobilizovaných ve vodě nerozpustných enzymů se popřípadě dále mechanicky zpevňují částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, ,s výhodou acetonem, popřípadě roztoky lepidel v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí s vodou, při teplotách +30 až -25 °C, popřípadě se vzniklé částice před a/nebo po mechanickém zpevnění vhodným způsobem posformují a parciálně vysuší.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS333982A CS231656B1 (cs) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby |
| CS874911A CS262238B1 (en) | 1982-05-10 | 1987-06-30 | Mixed immobilized cell and enzyme biocatalyst for the conversion of d-glucose to d-gluconate and saccharose to d-gluconate and d-fructose and process for preparing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS333982A CS231656B1 (cs) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS231656B1 true CS231656B1 (cs) | 1984-12-14 |
Family
ID=5373147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS333982A CS231656B1 (cs) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS231656B1 (cs) |
-
1982
- 1982-05-10 CS CS333982A patent/CS231656B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU712026A3 (ru) | Способ получени иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы | |
| Dumitriu et al. | Polyionic hydrogels obtained by complexation between xanthan and chitosan: their properties as supports for enzyme immobilization | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| US4229536A (en) | Process for preparing immobilized enzymes | |
| US4950596A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| NOUROUZIAN | Enzyme immobilization: the state of art in biotechnology | |
| SU608479A3 (ru) | Способ иммобилизации микробных клеток | |
| KR920009499B1 (ko) | Pva-겔에 의해 고정된 효소를 함유하는 다공성 물질의 제조방법 | |
| US4337313A (en) | Immobilization of biocatalysts | |
| Itoyama et al. | Lipoprotein lipase immobilization onto porous chitosan beads | |
| EP0104571B1 (en) | Immobilization of biocatalysts on granular carbon | |
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| US4276381A (en) | Preparation of immobilized enzymes of microorganisms | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| CS231656B1 (cs) | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby | |
| CS231458B1 (en) | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them | |
| JPS596885A (ja) | 不溶性生体触媒の製法 | |
| JP2781990B2 (ja) | 固定化酵素の製造法 | |
| CA1267618A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| Klein et al. | Polymers for the immobilization of whole cells and their application in biotechnology | |
| US4013511A (en) | Immobilized enzymes | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| US4757008A (en) | Enzyme immobilization in a macroporous non-ionic resin | |
| CS209265B1 (cs) | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. | |
| JPS6167489A (ja) | 枯草菌の固定化細胞、固定化方法及び７‐β‐アシルアミドセフアロスポラン酸からの３‐アセトキシ基の脱離に対する生成物の使用 |