CS251111B3

CS251111B3 - Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7-/?-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu

Info

Publication number: CS251111B3
Application number: CS79085A
Authority: CS
Inventors: Kamila Plhackova; Tomas Guttmann; Miroslav Barta; Vladimir Vojtisek; Antonie Jakubova; Michal Bucko; Emil Miklas
Original assignee: Kamila Plhackova; Tomas Guttmann; Miroslav Barta; Vladimir Vojtisek; Antonie Jakubova; Michal Bucko; Emil Miklas
Priority date: 1982-01-14
Filing date: 1985-02-05
Publication date: 1987-06-11

Abstract

Řešení se týká zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7- /9 - (4-karboxybutanamido) -cefalosporanové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu, připraveného podle čs. autorského osvědčení č. 231458, při kterém se vodné roztoky 7-/9-( 4-karboxybutanamido) -cefalosporánové kyseliny uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru na bázi buněk mikroorganismů, obsahujících enzym hydrolázu 7-2-(4- -karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny např. Pseudomonas sp. CCM 3635. Způsob stabilizace částic spočívá v tom, že se do míchané směsi částic biokatalyzátoru s uvedenou enzymovou aktivitou přidá po úpravě pH na 6,5 až 8,5 vodný roztok glutaraldehyrfu a/nebo vodný roztok technické nebo čisté bílkoviny živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu, načež se reakční směs popřípadě došití dalším přídavkem glutaraldehydu a nechá se zmrznout a/nebo se vzniklé částice oddělí a usuší. Po rozmělně ní a nabobtnání se promyté částice použijí pro přípravu 7-aminocefalosporánové kyseliny .

Description

Vynález se týká způsobu zpevňování částic biokatalyzátoru připraveného podle základního autorského osvědčení č. 231458 imobilizovanými bakteriálními buňkami a stabilizace enzymu hydrolázy 7-/?-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny v těchto částicích, které slouží k enzymové přeměně 7-aminocefem sloučenin, zejména 7-J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, za vzniku 7-aminocefalosporánové kyseliny a jejích derivátů.

Produkty enzymové přeměny vzniklé jednorázovým, mnohonásobným opakováným, nebo kontinuálním stykem těchto zpevněných a stabilizovaných částic s vodnými roztoky 7-aminocefem sloučenin, zejména s roztoky 7-J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny za vzniku 7-amínocefalosporánové kyseliny (dále jen 7-ACK), mohou sloužit jako zdroje pro výrobu polosyntetických cefalosporinů,

7-/J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánovou kyselinu eventuálně její deriváty, lze získat z cefalosporinů C nebo příslušných derivátů bud chemicky (japonské patentové spisy č. 77 77,078 a 78 114,891), nebo enzymově, působením oxidázy D-aminokyselin, nebo aktivovanými buňkami mikrobiálních producentů tohoto enzymu, jako je Trigonopsis variabilis a zástupci rodů Fusarium, Aspergillus, Candida a jiné (např. britský patentový spis č. 1 272 769, japonské patentové spisy č. 77 44,695, 76 88,694, 77 125,696 a 80 23,966).

V patentové literatuře je popsána řada způsobů imobilizace buněk s penicilín amidázovou aktivitou, nebo penicilín amidázy izolované z produkčních buněk Tyto katalyzátory jsou použitelné k enzymové přeměně /ů-laktamových antibiotik, zejména k enzymové výrobě 6-aminopenicilánové kyseliny z benzylpenicilinu. Jedná se zejména o způsoby imobilizace popsané v Čs. autorských osvědčeních č. 197101, 200802, 201621, 203607,

208931 a 209265. Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru k enzymové přeměně ₍j-laktamových antibiotik je popsán v popise vynálezu k čs. autorskému osvědčení č. 241730. Způsoby využití těchto biokatalyzátorů jsou popsány v popisech vynálezů k čs. autorským osvědčením č. 209676, 211175 a 213099 pro výrobu 6-aminopenicilánové kyseliny z benzylpenicilinu a 7-aminodeacetoxycefalosporánové kyseliny z N-fenylacetamido deacetoxycefalosporinu (čs. autorské osvědčení č. 218023).

Je známo, že k přípravě 7-aminocefem sloučenin obecného vzorce I

HjN-,CH₂X ^(I)'

COOH ve kterém X značí atom vodíku, skupinu -OH, COOH nebo nukleogilní skupinu, z jejich 7-acylamínoderívátů obecného vzorce II

COOH ve kterém R značí např. skupinu -(CH₂)^-COOll o X značí totéž co ve vzorci I lze použít hydrolázu izolovanou z kmene Comamonas a imobilizovanou na porézním kopolymeru nebo iontoměnné pryskyřici (japonské patentové spisy č. 78 59,095 a 81 85,298), nebo buňky Pseudomonas ovalíš ATCC 950 imobilizované v polyakrylnylonu (japonský patentový spis č. 78 940,93).

Pro přípravu 7-amínocefem sloučenin vzorce I, lze rovněž využít intaktní nebo desintegrované buňky kmene Pseudomonas sp. CCM 3635, který byl získán podle čs. autorského osvědčení Č. 239293. Nativní nebo desintegrované buňky obsahující tuto specifickou enzymovou aktivitu lze však použít pro příslušnou reakci pouze jednorázově.

V čs. autorském osvědčení č. 231458 je popsán do značné míry univerzální způsob imobilizace celých nativních buněk, individuálně zesítěných, popřípadě permeabilizovaných buněk a desintegrovaných suspenzí, obsahujících různé enzymy, zejména hydrolázy, lyázy, oxidázy, racemázy, dekarboxylazy a jiné enzymy, nebo části či celé sekvence enzymově aktivních metabolických drah, a - · itk u buněk mikroorganismů (bakterií, aktinomycet kvasinek a jiných imper ťekt n í 'i. · Jd , tak u buněk vyšších organismů, zejména buněk vyšších hub a rostlinných buněk.

Citovaným způsobem, kteiy spočívá na vzájemné chemické imobilizaci různých buněk nesoucích různé enzymy pomoci reaktivních ve vodě rozpustných polymerů (dále jen RRP) , lze vytvořit částice biokatalyzátorů, které mají vysokou specifickou enzymovou aktivitu a dobré sedimentační vlastnosti, jsou však měkké a musí se různým způsobem zpevňovat, bud použitím lepidel rozpuštěných v organických rozpouštědlech např. acetonu nebo postformac voluminézních částic do formy granulí nebo válečků a jejích následným sušením.

První způsob zpevňování má za následek vytvoření difúzní bariéry pro substrát a produkty do a z částice snížením jejich pórozity (parciálním zalepení pórů částic), druhý způsob vede k tvorbě velkých částic,* řádově 1 až 10 mm, čímž se odstraní počáteční výhoda vysoké specifické aktivity původně vzniklých menších částic (závislost velikosti částice na specifickém povrchu).

K enzymům, které nejsou extrémně citlivé k jinak poměrně agresivním účinkům bifunkčních sířovacích činidel, jako je např. glutaraldehyd, patří i enzym hydroláza 7-y-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny. Použití individuálně zesítěných buněk však vyžaduje vracení materiálu do reaktoru pomocí odstředivek, čímž dochází k značným manipulačním ztrátám katalyzátoru při jeho opakovaném použití a diktuje pouze využití vsádkového reaktoru

Nyní bylo zjištěno, že v závislosti na způsobu výroby imobilizovaných buněk popsaného v čs. autorském osvědčení č. 231458, lze chemickým v kombinaci s mechanickým způsobem zpevňovat a stabilizovat částice biokatalyzátoru s hydrolázou 7-·.·-(4-karboxybutanamido) -cefalosporánové kyseliny, přičemž získaný materiál je použitelný k enzymové přeměně 7-aminocefem sloučenin, zejmén a 7-ύ-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu v průmyslovém měřítku. Technologie zpevňování a stabilizace částic podle předmětného vynálezu je jednoduchá, nevyžaduje zvláštních a drahých surovin, nevyžaduje žádných ve vodě nerozpustných nosičů a speciální technologické a strojní zařízení.

Výše uváděné nevýhody byly odstraněny vypracováním způsobu zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7-/j-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu, připravéného podle čs. autorského osvědčení č. 231458, při kterém se vodné roztoky 7-aminocefem sloučenin, zejména 7-j-(4-karboxybutanamido) -cefalosporánové kyselina, uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru, jehož podstata spočívá v tom, že do nepřetržitě míchané směsi částic biokatalyzátoru na bázi intaktních nebo zesítěných buněk mikroorganismů, obsahujících enzym hydrolázu 7-j-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, výhodně Pseudomonas sp. CCM 3635, se po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,5 až 8,5 přidá vodný roztok glutaraldehydu anebo vodný roztok technické nebo čisté bílkoviny živočišného, rostlinného anebo mikrobiálního původu, jako je technická vaječná bílkovina nebo desintegrovaná suspenze buněk mikroorganismů, výhodně buněk obsahujících enzym hydrolázu 7-,j-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, načež se nepřetržitě míchaná směs ještě popřípadě došiti dalším přídavkem glutaraldehydu a reakční směs se nechá zmrznout, anebo se vzniklé částice od reakční kapaliny oddělí filtrací, popřípadě suspendují za intenzivního míchání v podchlazených organických rozpouštědlech, s výhodou v ledovém etanolu, filtrací znovu oddělí a popřípadě suší po homogenizaci volně na vzduchu při teplotě místnosti 1 až 24 hodin, poté se částice suspendují ve studené vodě nebo pufru, několikrát dekantují vodou nebo pufrem a ponechají bobtnat při teplotách v rozmezí 5 až 20 °C.

Uvedeným způsobem získané a stabilizované částice biokatalyzátoru se uvedou ve styk s vodnými roztoky 7-aminocefem sloučenin, zejména 7-/J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánovou kyselinu a v průběhu nepřetržité úpravy pH reakční směsi v rozmezí hodnot 7,0 až 8,0 přítokem alkálie se provádí diskontinuální opakovaná nebo enzymová hydrolýza při teplotách 10 až 45 °C, s výhodou 35 °C, načež se po proběhlé konverzi z přefiltrované a vychlazené kapaliny oddělené od částic katalyzátoru izoluje 7-aminocefalosporánová kyselina. Kromě čistých forem substrátu lze použít i reakční směs získanou óeaminací cefalosporinu C v přítomnosti azidu sodného či jiných inhibitorů katalázy a buněk nebo bezbuněčných extraktů či buněčných katalyzátorů kmene Trigonopsis variabilis s aktivitou axidázy D-amino kyselin.

Částice biokatalyzátoru získané podle předmětného vynálezu jsou pevné, velmi rychle sedimentují útvary nepravidelné velikosti a tvaru s vysokou stabilitou hydrolázy 7-,J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, což je doloženo v následujících příkladech provedení. Jejich pevnost a dobré sedimentační vlastnosti umožňují jejich diskontinuální opakované nebo kontinuální využití v běžných typech reaktorů.

Jako výchozí enzymově aktivní buněčný materiál byl použit é-laktamáza negativní kmen Pseudomonas sp. CCM 3635, který byl získán podle čs. autorského osvědčení č. 239293. Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru podle předmětného vynálezu však nevylučuje použití jiných kmenů získaných např. mutagenními zásahy, selekcí a nahromačlováním či genovou manipulací pro průmyslové použití ve formě imobilizovaných biokatalyzátorů. Částice biokatalyzátoru lze uchovávat při teplotě 5 °C ve vodné suspenzi nebo v odsáté formě ve vlhkém stavu se zabráněním vyschnutí.

Pro přípravu nativních buněk byla použita živná půda a podmínky kultivace, jak je uvedeno v čs. autorském osvědčení č. 239293. Buňky byly z fermentační tekutiny shromážděny odstředěním (5 000 otáček za minutu, 30 minut), promyty 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 a získaná buněčná pasta byla použita pro přípravu biokatalyzátoru.

Enzymová aktivita získaných částic byla hodnocena spektrofotometricky za použití p-dimetylaminobenzaldehydu, který reaguje s 7-ACK stejně jako 6-APK za vzniku barevné Schiffovy báze, podle čs, patentového spisu č. 116959 v modifikaci podle Balasinghama a sp. (Biochim. Biophys. Acta, 276 , 250 , 1972), .měřením rychlosti 7-J-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny (dále jen glutaryl-7-ACK) v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0 a teplotě 37 °C za míchání v oblasti enzymové kinetiky nultého řádu.

Jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje vznik jednoho mikromolu 7-ACK v jednom mililitru za minutu při teplotě 37 °C a pH 7,0. Jako kritérium účinností biokatalyzátoru byla považována konverze 1% roztoku glutaryl-7-ACK, která byla rovněž stanovena chromatograficky na tenké vrstvě celulózy (Polygram Cel 300) za použití systému n-propanol - voda (7 : 3) s ninhydrinovou detekcí (R_f 0,5).

V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1

216 g vlhké buněčné hmoty (pasty) Pseudomonas sp. CCM 3 635 s uvedenou hydrolázovou aktivitou, získané centrifugací kultury po kultivaci (5 000 otáček za minutu, 30 minut) o specifické aktivitě 3.10 j/mg suché hmoty buněk·, bylo suspendováno v 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,0 a doplněno tímto pufrem na objem 720 ml. K suspenzi za míchání při teplotě místnosti bylo postupně přidáno 30 ml 25% glutaraldehydu a nepřetržitě mícháno 3 hodiny. Poté byla uspenze odstředěna za podmínek uvedených výše a buňky dvakrát promyty trojnásobným objemem destilované vody.

g získané zesítěné a promyté buněčné pasty bylo suspendováno ve 40 ml destilované vody a za intenzivního míchání přidáno 40 ml reaktivního ve vodě rozpustného polymeru (dále jen RRP) postupem podle čs. autorského osvědčení č. 231458. RRP byl získán předchozí jednohodinovou polymerací 8 % (hmota/objem) flokulantu (Sedipur CL-930, BASF-NSR) a 2 % glutaraldehydu za míchání při teplotě 25 °C. Směs po homogenizaci byla dále mražena v tenké vrstvě při -20 °C pět hodin. Vzniklé částice byly promyty vodou, odsáty přes textilní materiál a rozmělněny. Částice vykazovaly aktivitu 1,8.10 j/mg suché hmoty (obsah suché hmoty 23 %).

1,2 g glutaryl-7-ACK (85 % čisté látky) bylo rozpuštěno za úpravy pH 1 N NaOH na hodnotu 7,0 v 90 ml destilované vody a přidáno 10 g vlhké hmoty agregátů a směs byla míchána při teplotě 35 °C za kontinuální úpravy pH 1 N NaOH na hodnotu 7,0 dvě hodiny. Dosažený stupeň konverze činil 80 % teorie. Tento postup byl opakován pětkrát s průměrným stupněm konverze 79,6 % teorie.

Příklad 2

0,5 litru suspenze nativních buněk Pseudomonas sp. CCM 36 35, obsahující přibližně

500 mg vlhké hmoty buněk v mililitru 0,05 M fosfátového pufru o pH 7,0 bylo desintegro_2 váno čtyřnásobným průchodem při maximálním tlaku 6.10 Pa. Po každém cyklu byla suspenze ochlazena na 10 až 15 °C. Stupeň desintegrace byl hodnocen mikroskopicky. Do 25 ml desintegrované suspenze bylo vmícháno 2 g technické vaječné bílkoviny.

g zesítěných buněk, připravených způsobem popsaným v příkladu 1, bylo suspendováno v 70 ml RRP, získaného předchozí polymerací 4 % flokulantu (Sedipur CL-930) a 2 % glutaraldehydu postupem podle čs. autorského osvědčení č. 231458, za intenzivního míchání a pH směsi bylo upraveno 4% NaOH na 7,5. Viskózní suspenze byla míchána po dobu jedné hodiny a poté bylo přidáno do směsi 25 ml desintegrovaných buněk s bílkovinou, jejichž příprava je uvedena výše. Suspenze byla 30 minut míchána a poté bylo přidáno 5 ml 25% glutaraldehydu a mícháno nepřetržitě jednu hodinu. Poté byl materiál vakuově odsát přes textilní materiál, promyt vodou a ponechán schnout 24 hodin při teplotě místnosti.

Poté byl suspendován ve vodě několikrát dekantován a ponechán bobtnat 24 hodin, _2 poté byl odsát a promyt. Specifická aktivita získaných částic byla 0,8.10 j/mg suché hmoty (obsah 22 % suché hmoty).

1,2 g glutaryl-7-ACK bylo rozpuštěno do objemu 80 ml v destilované vodě za úpravy pH 1 N NaOH na 7,0. Poté bylo přidáno 20 g vlhké hmoty částic a mícháno za teploty 35 °C a kontinuální úpravy pH na 7,0 přídavkem alkálií po dobu 2 hodiny. Stupeň konverze na 7-ACK byl 70 %. Postup byl opakován celkem třikrát s průměrným výtěžkem 69,3 % teorie.

Příklad 3 g zesítěných buněk, připravených způsobem v příkladu 1 bylo suspendováno v 50 ml RRP připraveného stejným způsobem jako v příkladu 2? pH homogenní suspenze, která byla intenzívně míchána, bylo upraveno 4% NaOH na 7,5 a iiskózní suspenze byla míchána po dobu jedné hodiny postupem podle čs. autorského osvědčení.č. 231458.

Do reakční směsi bylo za míchání přidáno 50 ml desintegrované suspenze buněk, připravené způsobem popsaným v příkladu 2 bez přidání vaječné bílkoviny. Další postup v přípravě biokatalyzátoru byl shodný jako v příkladu 2· Specifická aktivita částic byla 1,2.10 j/mg suché hmoty (22 % suché hmoty).

Roztok glutaryl-7-ACK byl připraven způsobem popsaným v příkladu 2. K 80 ml roztoku bylo přidáno 20 g vlhké hmoty agregátů a směs byla míchána za podmínek jako v příkladu 2 po době jedné hodiny. Stupeň konverze na 7-ACK byl 72 %. Tento postup se stejnou násadou částic byl proveden celkem pětkrát s průměrným stupněm konverze 73,2 % teorie/pět cyklů opakovaného použití.

Claims

Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7-3-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu, připraveného podle autorského osvědčení č. 231458, při kterém se vodné roztoky 7-amí.nocefem sloučenin, zejména 7-/?-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru, vyznačený tím, že se do nepřetržitě míchané směsi částic biokatalyzátoru na bází intaktních nebo zesítěných buněk mikroorganismů, obsahujících enzym hydrolázu 7-j-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, výhodně Pseudomonas sp. CCM 3635, po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,5 až 8,5 přidá vodný roztok glutaraldehydu a nebo vodný roztok technické nebo čisté bílkoviny živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu, jako je technická vaječná bílkovina, nebo desintegrovaná suspenze mikroorganismů, výhodně buněk obsahujících enzym hydrolázu 7-3-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny, načež se nepřetržitě míchaná směs ještě popřípadě došiti dalším přídavkem glutaraldehydu a reakční směs se nechá zmrznout, a/nebo se vzniklé částice od reakční kapaliny oddělí filtrací, popřípadě suspendují za intenzivního míchání v podchlazených organických rozpouštědlech, s výhodou v ledovém acetonu nebo etanolu, filtrací znovu oddělí a popřípadě suší po homogenizaci volně na vzduchu při teplotě místnosti 1 až 24 hodin a poté se částice suspendují ve studené vodě nebo pufru, několikrát dekantují vodou nebo pufrem a ponechají bobtnat při teplotě v rozmezí 5 až 20 °C.