CS263016B1 - Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy - Google Patents
Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CS263016B1 CS263016B1 CS874910A CS491087A CS263016B1 CS 263016 B1 CS263016 B1 CS 263016B1 CS 874910 A CS874910 A CS 874910A CS 491087 A CS491087 A CS 491087A CS 263016 B1 CS263016 B1 CS 263016B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- water
- biocatalyst
- solution
- enzyme
- optionally
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 7
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims abstract description 10
- -1 4-carboxybutanamido Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract 1
- 241001648319 Toronia toru Species 0.000 abstract 1
- YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N 0.000 abstract 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 abstract 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 2
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 description 1
- 241001478312 Comamonas sp. Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- KIDBBTHHMJOMAU-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCO KIDBBTHHMJOMAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení
se
týká
zrnitého
biokatalyzá
toru
na
bázi
imobilizovaného
enzymu
hydro
lázy
7/3
-(4-karboxybutanamido)
oefalospo
ranové
kyseliny
k
enzymové
výrobě
7-amino-
cefalosporánové
kyseliny
podle
čs.
autor
ského
osvědčení
č.
231
656
a
způsob
jeho
výroby.
Biokatalyzátor
je
připravitelný
na
bázi
zesítěné
hydrolázy
7
fi-(4-karboxy
butanamido)
cefalosporánové
kyseliny
nás
ledným
zpracováním
vodným
roztokem
gluta-
raldehydu
a/nebo
polyethyleniminu
nebo
bílkovin
mikrobiálního,
rostlinného
nebo
živočišného
původu
a
vodným
roztokem
gluta-
raldehydu,
separací
a
mechanickou
homogeni
zací
vzniklého
produktu
a
jeho
případným
parciálním
sušením,
popřípadě
ieho
násled
ným
suspendováním
v
ochlazených
organických
rozpouštědlech
neomezeně
mísitelnýoh
s
vodou
a/nebo
jejioh
směsi
s
vodou,
opětovnou
se
parací
a
popřípadě
dalším
parciálním
suše
ním
a
konečně
jeho
promytím
vodou
nebo
pufrem.
Description
Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy
Řešení se týká zrnitého biokatalyzátoru na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7/3 -(4-karboxybutanamido) oefalosporanové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení č. 231 656 a způsob jeho výroby. Biokatalyzátor je připravitelný na bázi zesítěné hydrolázy 7fi-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho případným parciálním sušením, popřípadě ieho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelnýoh s vodou a/nebo jejioh směsi s vodou, opětovnou separací a popřípadě dalším parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.
263 016 . Vynález se týká zrnitého biokatalyzátoru na bázi imobilizované ho enzymu hydrolázy 7 ^3-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny a způsobu jeho přípravy v závislosti na čs. autorském osvědčení č. 231 656.
7/3-(4-karboxibutanamido)cefalosporánová kyselina (dále jen glutaryl-7-ACK) je meziprodukt dvoustupňové přípravy 7-aminocefalosporánové kyseliny (dále jen 7-ACK) z cefalosporinu C. 7-ACK slouží jako farmaceuticky významný meziprodukt pro výrobu polosyntetických cefalosporinů jako je cefalotin a cefazolin.
V patentové literatuře je popsána řada způsobů imobilizace buněk nebo enzymů pro průmyslové biotransformace, využívající nejrůznější nosiče a způsoby imobilizace. Existují též způsoby imobilizace, které nevyžadují použití nosiče vůbec, jako jsou např. univerzální postupy využívající chemicky reaktivních polymerů rozpustných ve vodě pro imobilizaci různých prokaryontních a eukaryontních buněk s různou enzymovou aktivitou (čs. autorské osvědčení č.
231 458). Za použití chemicky reaktivních polymerů ve vodě rozpustných byl vypracován též jednoduchý a univerzální postup výroby imobilizovaných enzymů jako jsou např. hydrolázy, izomerázy, racemázy, lyázy a oxydoreduktázy podle čs. autorského osvědčení č. 231 656. Citovaným postupem lze pomocí reaktivních rozpustných polymerů (dále jen RRP), s výhodou připravitelných reakcí komerčně dostupných flokulantů obsahujících frakci polyethyleniminu s bifunkčním sítovacím činidlem,například glutaraldehydem a rozpustnými preparáty enzymů různé čistoty a kvality, připravit ve vodě nerozpustný enzym, ve formě částic biokatalyzátoru s dobrými sedimentačními vlastnostmi, vysokou filtrabilitou a specifickou aktivitou požadovaného enzymu.
Pro enzymovou hydrolýzu glutaryl-7-ACK na 7-ACK je popsáno kromě nativních buněk s aktivitou hydrolázy Ί-β-(4-karboxybutanami-2263 016 do) cefalosporánové kyseliny (dále jen hydrolázy glutaryl-7-ACK), rovněž použití biokatalyzátorů na bázi imobilizovaných buněk s touto aktivitou, jako jsou buňky z rodu Comamonas či Pseudomonas zabudované v celulózoacetátových kapsulích (Japonský patentový spis č. 76 70 884), nebo buňky Pseudomonas sp. imobilizované pomocí reaktivních rozpustných polymerů (čs. autorské osvědčení č. 251 111 závislé na čs. autorském osvědčení č. 231 458).
Využití biokatalyzátorů na bázi imobilizovaných technických nebo do různého stupně čistoty izolovaných enzymů je pro přeměnu glutaryl-7-ACK principiálně výhodnější, nebot buňky produkčních kmenů mohou obsahovat další enzymové aktivity nežádoucí z hlediska přípravy 7-ACK, nebot atakují 7-acylcefemsloučeniny jiným a nežádoucím způsobem, jako jsou například esterázy, katalýzující tvorbu deacetylovaných derivátů glutaryl-7-ACK a 7-ACK nebo 3-laktamázy.
V patentové literatuře je popsáno několik způsobů využití hydrolázy glutaryl-7-ACK izolované z kmene rodu Comamonas sp. a Pseudomonas, zejména Pseudomonas ovalíš, imobilizované pomocí glutaraldehydu na různé nosiče jako bazický iontoměnič Amberlit Ira-940, nebo kopolymer akrylonitrilu a methakrylátu (Japonské patentové spisy č. 78 59 095, č. 81 85 298 a č. 78 139 791). Všechny tyto způsoby vyžadují však imobilizaci na částice ve vodě nerozpust ných nosičů nebo způsoby imobilizace do sítě vznikajícího polymeru, přičemž je známo, že náklady na výrobu imobilizovaných preparátů enzymů jsou výrazně ovlivněny cenou a dostupností použitých nosičů. Další nevýhodou těchto postupů je, že dosahované specifické aktivity získaných imobilizovaných materiálů na bázi tohoto imobilizovaného enzymu jsou velmi nízké a nedovolují reálný předpoklad průmyslové realizace.
Postup podle předmětného vynálezu odstraňuje zmíněné nevýhody, nebot nevyžaduje žádných organických, anorganických či přírodních ve vodě nerozpustných nosičů.
Sítění enzymových molekul hydrolázy glutaryl-7-ACK do formy vzájemně kovalentně prokřížené sítě pomocí běžných sítovacích činidel (glutaraldehyd, toluendiizokyanát apod.) není možné, nebot tento enzym je vysoce citlivý k poměrně agresivním účinkům těchto činidel a dochází i při použití jejich velmi nízkých koncentrací k nevratné inaktivaci tohoto enzymu. Proto, aby nedošlo k inaktivaci tohoto enzymu v průběhu imobilizace, je nutné pracovat s reaktiv nimi, ve vodě rozpustnými polymery, které vznikly například reakcí kationaktivních flokulantů, obsahujících frakci polyethyleniminu s glutaraljehydem odděleně, načež vzniklé částice lze poté dosítit
3263 016 a zpevnit pulzním přidáním nízkých koncentrací volného glutaraldehydu, nebo přidat ve vodě rozpustnou látku, která vstupuje do reakce s glutaraldehydem, např. polyethylenimin nebo roztok bílkovin a vzniklou směs voluminézních částic spolu s koreagujícími rozpuštěnými látkami kovalentriě zesítit. Při tomto předmětném postupu je pokles aktivity hydrolázy glutaryl-7-ACK podstatně nižší, částice jsou pevnější a vykazují vysokou stabilitu enzymové aktivity.
Předmětem vynálezu tedy je zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovného enzymu hydrolázy 7 (i-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-amicefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení 231 656 připravitelný z částic biokatalyzátoru na bázi zesítěné hydrolázy 7 {3-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho parciálním sušením, popř. jeho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelných s vodou a/nebo jejich směsmi s vodou, opětovnou separací a parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.
Podle vynálezu se tento biokatalyzátor vyrábí tak, že se do nepřetržitě míchané reakční směsi částic po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,0 až 8,5, s výhodou 7,5, přidá vodný roztok glutaraldehydu v rozmezí jeho koncentrací 0,01 až 1,0 % objem/objem, nebo vodný roztok polyethhyleniminu nebo vodný roztok bílkovin a následně vodný roztok glutaraldehydu, znovu se upraví pH reakční směsi v rozmezí uvedených hodnot a reakční směs se nepřetržitě míchá po dobu 10 minut až 5 hodin, nebo se ponechá v klidu, popřípadě se ponechá zmrznout, načež se částice separují, mechanicky homogenizují a parciálně suší, nebo se za míchání ošetří ochlazeným acetonem nebo ethanolem a/nebo jejich směsmi s vodou, znovu separují a parciálně suší po dobu 1 až 24 hodin při teplotě 10 až 40 ’c, poté se bioktalyzátor suspenduje ve vodě nebo v pufru, několikrát- dekantuje a promyje, ponechá nabobtnat a separuje.
Částice biokatalyzátoru získané podle předmětného postupu mají vysokou sedimentační rychlost, dobrou filtrovatelnost a vysokou aktivitu hydrolázy glutary1-7-ACK. Tyto vlastnosti a zvláště skutečnost úplné absence nežádoucích enzymových aktivit, dovolují reálný předpoklad jeho využití pro výrobu 7-ACK při těchto jeho přednostech:
a) vyšší stupeň teoretické konverze substrátu na produkt,
-4263 016
b) vyšší výtěžek 7-ACK v izolaci,
c) vyšší kvalita 7-ACK,
d) nepřítomnost degradačních produktů v izolované 7-ACK.
Aktivita hydrolázy glutaryl-7-ACK byla zjišťována měřením rychlosti hydrolýzy glutaryl-7-ACK na 7-ACK v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0 při teplotě 37 ’C v oblasti enzymové kinetiky nultého řádu. 7-ACK byla stanovena spektrofotometricky za použití p-dimethylaminobenzaldehydu, který reaguje se 7-ACK za vzniku barevné Schiffovy báze podle čs. autorského osvědčení č. 111 959, v modifikaci podle Balasinghama a sp. (Biochim. Biophys. Acta, 276, 250, 1972).
Jedna jednotka enzymové aktivity (U) je takové množství enzymu které odpovídá tvorbě jednoho ^umolu 7-ACK za minutu za výše uvedených podmínek reakce. Specifická aktivita výchozího a imobilizovaného materiálu je vyjadřována jako U . g”1 bílkovin resp. suché hmoty.
7-ACK byla v reakční směsi sledována dále chromatograficky za použití tenké vrstvy celulózy (Polygram cell - 300) v systému n-pro panol-voda (7:3) s ninhydrinovou detekcí (R^ 0,5) nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC).
Vynález je dále doložen v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
Příklady provedení
Příklad 1
Jeden litr roztoku technické hydrolázy glutaryl-7-ACK bez aktivity nespecifických esteráz, obsahující 3 g bílkovin . litr a celkové množství 800 U . litr”^ bylo pomalu a po částech přidáváno do nepřetržitě míchané reakční směsi reaktivního rozpustného polymeru (RRP) vzniklého reakcí kationaktivních flokulantů obsahujících frakci polyethyleniminu a glutaraldehydu podle čs. autorského osvědčení č. 231 656.
Po vpravení veškerého množství roztoku enzymu bylo pH reakční směsi v průběhu nepřetržitého míchání upraveno na hodnotu 7,5 20 % vodným roztokem hydroxidu sodného. K vzniklé suspenzi voluminézních částic byl postupně a pomalu přidáván 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,5 % (objem/objem). Poté bylo opět uvedeným roztokem a způsobem upraveno pH reakční směsi na hodnotu 7,5 a směs byla míchána po dobu jedné hodiny.
-5263
Poté byly částice odděleny filtrací, vlhký voluminézní koláč byl vpraven do kuchyňského robotu na strouhanou housku, jehož buben byl opatřen řeznými otvory 0,5 až 1 mm. Homogenizovaný materiál ve formě granulí byl suspendován do směsi ethanol : voda (1:2) při teplotě -5 *C, krátce promíchán pomocí rychloběžného vrtulového míchadla, ihned a ostře vakuově odsát a částice sušeny ve vakuové sušárně při teplotě 30 *C po dobu 2 hodin. Poté byl materiál suspen dován v pitné vodě, několikrát vodou dekantován, přičemž poslední dekantace byly prováděny destilovanou vodou. Promyté částice byly separovány vakuovou filtrací.
Bylo získáno 29,5 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině
22,5 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 60,2 U . g”1.
g glutaryl-7-ACK (čistota 95,4 %) bylo rozpuštěno za úpravy pH 1 N roztokem NaOH na hodnotu pH 7,0 v 90 ml 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,0 a přidáno 10 g vlhké hmoty získaného biokatalyzátoru a směs byla míchána při teplotě 35 *C za kontinuální úpravy pH roztokem alkálie na hodnotu 7,0 po dobu 60 minut. Bylo dosaženo 90 % teoretické konverze substrátu na 7-ACK. Popsaný postup byl opakován celkem 5 x vždy se stejnou násadou částic téhož biokatalyzátoru a průměrný stupeň konverze substrátu na 7-ACK/5 cyklů opakovaného použití činil 89,3 %.
Příklad 2
Jeden litr roztoku technického enzymu byl smíchán s 0,8 litry RRP stejným způsobem jako v příkladu 1. Roztok technického enzymu vykazoval stejnou aktivitu a koncentraci bílkovin. Poté bylo přidáno v průběhu nepřetržitého míchání 10 ml 10 % vodného roztoku polyethyleniminu s molekulovou hmotností 30 000 až 40 000, pH bylo upraveno na hodnotu 7,5 20 % vodným roztokem NaOH, přidán vodný roztok glutaraldehydu tak, aby výsledná koncentrace v reakční směsi činila 0,5 % a pH bylo opět upraveno popsaným způsobem. Další postup přípravy biokatalyzátoru byl stejný jak je uvedeno v příkladu 1.
Bylo získáno 32,2 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 23,8 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 53,3 U . g 1.
Dále byla provedena enzymová konverze substrátu na produkt za podmínek a způsobem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že namísto fosfátového pufru bylo k rozpuštění substrátu použito dešti· lované vody. Bylo dosaženo 87,3 % teoretické konverze glutaryl-7-ACK, průměrný stupeň konverze v 5 opakovaných cyklech použití téže násady biokatalyzátoru činil 86,3 % teorie.
-6Příklad 3
263 016
Byl smíchán jeden litr roztoku technického enzymu stejných kvalit a stejným způsobem jako v příkladu 1 s RRP. K reakční směsi byl navíc přidán vodný roztok bílkovin (technická vaječná bílkovina) tak, aby výsledná koncentrace celkových bílkovin činila 50 g . 1 \ Po vpravení roztoku bílkovin bylo pH v průběhu nepřetržitého míchání upraveno popsaným způsobem a ke vzniklé suspenzi částic byl přidán 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho aktuální koncentrace v reakční směsi byla 1 % (objera/objem). Dále byl postup přípravy biokatalyzátoru stejný jako v příkladu 1.
Bylo získáno 70,3 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině
24.3 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 29,8 U . g
Příklad 4
Byl připraven biokatalyzátor stejným způsobem jak je uvedeno v příkladu 2 s tím rozdílem, že jako výchozí enzymový materiál byl použit roztok technické hydrolázy glutaryl-7-ACK bez aktivity nespecifických esteráz, získaný zahuštěním na rotačním vakuové odpařovači při teplotě 38 *C, obsahující 30 g bílkovin . litr-1 a celkovém množství tohoto enzymu 7 100 U . litr 1. Bylo získáno
56.4 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 24 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 314,7 U . g
Příklad 5
Jeden litr roztoku technického enzymu, který byl zahuštěn způsobem popsaným v příkladu 4, byl smíchán s RRP způsobem jako v příkladu 1; pH reakční směsi bylo v průběhu nepřetržitého míchání upraveno popsaným způsobem na hodnotu 7,8, směs byla důkladně homogenizována a poté mražena v tenké vrstvě při -20 *C po dobu 5 hodin. Poté byla směs rozmražena, částice suspendovány do 0,1 % vodného roztoku glutaraldehydu a po 30 minutách mícháni při teplotě místnosti byla suspenze zředěna destilovanou vodou a částice separovány vakuovou filtrací. Vlhký voluminézní koláč byl mechanicky homogenizován a sušen při 30 °C 3 hodiny za vakua. Poté byly částice suspendovány v destilované vodě, dekantovány, promyty a separovány způsobem uvedeným v příkladu 1.
Bylo získáno 55,3 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině
24,6 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 307 U . g 1.
-ΊPříklad 6 263 β1θ
Jeden litr vodného roztoku technické hydrolázy, který byl zahuštěn způsobem popsaným v příkladu 4, obsahující koncentraci bílkovin a aktivitu, která je rovněž uvedena v příkladu 4, byl smíchán s RRP způsobem uvedeným v příkladu 1 včetně způsobu úpravy pH.
K vzniklé suspenzi voluminézních částic byl postupně přidán 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,25 %.(objem/objem). Dále bylo postupováno v imobilizaci postupem uvedeným v příkladu 5.
Bylo získáno 55,5 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 24,6 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 312 U . g-l.
Příklad 7
Bylo smícháno 950 ml roztoku technického enzymu stejných kvalit a stejným způsobem s RRP jako v příkladu 1. Dále bylo v imobilizací postupováno stejným způsobem jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že pH reakční směsi bylo upraveno na hodnotu 7,0, aktuální koncentrace přidaného roztoku glutaraldehydu činila 0,05 % (objem/objem). Dále bylo v imobilizaci pokračováno mražením reakční směsi způsobem uvedeným v příkladu 5, včetně dekantace, promytí a separace.
Bylo získáno 26,4 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 22,8 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 70 U . g
Claims (2)
1. Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7p-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení č. 231 656 připravitelný z částic biokatalyzátoru na bázi zesítěné hydrolázy 7/3-(4-karbpxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho parciálním sušením, popřípadě jeho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelných s vodou a/nebo jejich směsmi s vodou, opětovnou separací a popřípadě dalším parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.
2. Způsob výroby biokatalyzátoru podle bodu 1, vyznačený tím, že do nepřetržitě míchané reakční směsi částic se po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,0 až 8,5, s výhodou 7,5 přidá vodný roztok glutaraldehydu v rozmezí jeho koncentrací 0,01 až 1,0 % objem/ob jem, nebo vodný roztok polyethyleniminu nebo vodný roztok bílkovin a následně, vodný roztok glutaraldehydu, znovu se upraví pH reakční směsi v rozmezí uvedených hodnot a reakční směs se nepřetržitě míchá po dobu 10 minut až 5 hodin, nebo se ponechá v klidu, popřípadě se nechá zmrznout, načež se částice separují, mechanicky homogenizují a popřípadě suší, nebo se za míchání ošetří ochlazeným acetonem nebo ethanolem a/nebo jejich směsmi s vodou, znovu separují a popřípadě parciálně suší po dobu jedné až 24 hodin při teplotě 10 až 40 *C, poté se biokatalyzátor suspenduje ve vodě nebo v pufru, několikrát dekantuje a promyje, ponechá nabobtnat a separuje.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS874910A CS263016B1 (cs) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS874910A CS263016B1 (cs) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS491087A1 CS491087A1 (en) | 1988-08-16 |
| CS263016B1 true CS263016B1 (cs) | 1989-04-14 |
Family
ID=5392879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS874910A CS263016B1 (cs) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS263016B1 (cs) |
-
1987
- 1987-06-30 CS CS874910A patent/CS263016B1/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS491087A1 (en) | 1988-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU712026A3 (ru) | Способ получени иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы | |
| MARGOLIN et al. | Enzymes in polyelectrolyte complexes: The effect of phase transition on thermal stability | |
| US3619371A (en) | Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto | |
| US4461832A (en) | Preparation of an enzymatically active formulation embedded in silica gel | |
| US4950596A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| US4760024A (en) | Immobilization of enzymes | |
| US4892825A (en) | Immobilization of biologically active material with glutaraldehyde and polyazetidine | |
| US4188263A (en) | Carrier-bound acylases | |
| Iyengar et al. | Urease bound to chitin with glutaraldehyde | |
| CS263016B1 (cs) | Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy | |
| US4250263A (en) | Method of purification of thermally stable enzymes | |
| CA1267618A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| US4608340A (en) | Immobilized aminoacylase enzyme | |
| JPH0325159B2 (cs) | ||
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| SU1731815A1 (ru) | Способ получени иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью | |
| SU1228788A3 (ru) | Способ получени иммобилизованной аминоацилазы | |
| JPS5876089A (ja) | 酵素もしくは微生物の固定化方法 | |
| JPH01256389A (ja) | 固定化生体触媒の製造方法 | |
| Jensen et al. | Preparation and properties of insoluble forms of bacteriophage T4 lysozyme and chicken egg white lysozyme | |
| CZ126093A3 (en) | Process for preparing hydrolase of 7-(4-caboxybutanamido) cephalosporanic acid | |
| EP0028942A2 (en) | Process for the production of an immobilized enzyme system and the purification of glucose isomerase | |
| CS251111B3 (cs) | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7-/?-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020630 |