CS263016B1 - The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation - Google Patents

The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation Download PDF

Info

Publication number
CS263016B1
CS263016B1 CS874910A CS491087A CS263016B1 CS 263016 B1 CS263016 B1 CS 263016B1 CS 874910 A CS874910 A CS 874910A CS 491087 A CS491087 A CS 491087A CS 263016 B1 CS263016 B1 CS 263016B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
water
glutaraldehyde
biocatalyst
solution
hydrolase
Prior art date
Application number
CS874910A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CS491087A1 (en
Inventor
Kamila Rndr Plhackova
Vladimir Rndr Csc Vojtisek
Alexandra Rndr Pisarikova
Vladimir Clen Kores Krumphanzl
Roman Rndr Csc Zeman
Miroslav Rndr Barta
Augustin Doc Ing Csc Martvon
Ladislav Ing Csc Welward
Alzbeta Ing Krempova
Original Assignee
Plhackova Kamila
Vojtisek Vladimir
Alexandra Rndr Pisarikova
Krumphanzl Vladimir
Roman Rndr Csc Zeman
Barta Miroslav
Martvon Augustin
Welward Ladislav
Alzbeta Ing Krempova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plhackova Kamila, Vojtisek Vladimir, Alexandra Rndr Pisarikova, Krumphanzl Vladimir, Roman Rndr Csc Zeman, Barta Miroslav, Martvon Augustin, Welward Ladislav, Alzbeta Ing Krempova filed Critical Plhackova Kamila
Priority to CS874910A priority Critical patent/CS263016B1/en
Publication of CS491087A1 publication Critical patent/CS491087A1/en
Publication of CS263016B1 publication Critical patent/CS263016B1/en

Links

Landscapes

  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká zrnitého biokatalyzá ­ toru na bázi imobilizovaného enzymu hydro ­ lázy 7/3 -(4-karboxybutanamido) oefalospo ­ ranové kyseliny k enzymové výrobě 7-amino- cefalosporánové kyseliny podle čs. autor ­ ského osvědčení č. 231 656 a způsob jeho výroby. Biokatalyzátor je připravitelný na bázi zesítěné hydrolázy 7 fi-(4-karboxy ­ butanamido) cefalosporánové kyseliny nás ­ ledným zpracováním vodným roztokem gluta- raldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem gluta- raldehydu, separací a mechanickou homogeni ­ zací vzniklého produktu a jeho případným parciálním sušením, popřípadě ieho násled ­ ným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelnýoh s vodou a/nebo jejioh směsi s vodou, opětovnou se ­ parací a popřípadě dalším parciálním suše ­ ním a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.The solution relates to a granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7/3-(4-carboxybutanamido) cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-amino-cephalosporanic acid according to Czechoslovak patent certificate No. 231 656 and a method of its production. The biocatalyst can be prepared on the basis of cross-linked hydrolase of 7-[beta]-(4-carboxy butanamido) cephalosporanic acid by subsequent treatment with an aqueous solution of glutaraldehyde and/or polyethyleneimine or proteins of microbial, plant or animal origin and an aqueous solution of glutaraldehyde, separation and mechanical homogenization of the resulting product and its possible partial drying, or its subsequent suspension in cooled organic solvents that are completely miscible with water and/or their mixtures with water, repeated separation and possibly further partial drying and finally its washing with water or buffer.

Description

Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravyGranular biocatalyst based on immobilized enzyme hydrolase 7- (4-carboxybutanamido), cephalosporic acid for enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and process for its preparation

Řešení se týká zrnitého biokatalyzátoru na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7/3 -(4-karboxybutanamido) oefalosporanové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení č. 231 656 a způsob jeho výroby. Biokatalyzátor je připravitelný na bázi zesítěné hydrolázy 7fi-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho případným parciálním sušením, popřípadě ieho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelnýoh s vodou a/nebo jejioh směsi s vodou, opětovnou separací a popřípadě dalším parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.The present invention relates to a granular biocatalyst based on immobilized 7/3 - (4-carboxybutanamido) oephalosporanic acid hydrolase enzyme for the enzymatic production of 7-aminocephalosporanoic acid according to U.S. Pat. No. 231 656 and method of its production. The biocatalyst can be prepared on the basis of cross-linked 7β- (4-carboxybutanamido) cephalosporic acid hydrolase by subsequent treatment with an aqueous solution of glutaraldehyde and / or polyethyleneimine or proteins of microbial, vegetable or animal origin and an aqueous solution of glutaraldehyde, separation and mechanical homogenization of the product, optionally by subsequently suspending in cooled organic solvents unrestrictedly miscible with water and / or a mixture thereof with water, re-separating and optionally further drying, and finally washing it with water or buffer.

263 016 . Vynález se týká zrnitého biokatalyzátoru na bázi imobilizované ho enzymu hydrolázy 7 ^3-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny a způsobu jeho přípravy v závislosti na čs. autorském osvědčení č. 231 656.263 016. The present invention relates to a granular biocatalyst based on immobilized 7β 3- (4-carboxybutanamido) cephalosporanoic acid hydrolase enzyme for the enzymatic production of 7-aminocephalosporanoic acid and a process for its preparation according to U.S. Pat. Certificate No. 231 656.

7/3-(4-karboxibutanamido)cefalosporánová kyselina (dále jen glutaryl-7-ACK) je meziprodukt dvoustupňové přípravy 7-aminocefalosporánové kyseliny (dále jen 7-ACK) z cefalosporinu C. 7-ACK slouží jako farmaceuticky významný meziprodukt pro výrobu polosyntetických cefalosporinů jako je cefalotin a cefazolin.7 / 3- (4-carboxibutanamido) cephalosporic acid (glutaryl-7-ACK) is an intermediate of the two-step preparation of 7-aminocephalosporanoic acid (7-ACK) from cephalosporin C. 7-ACK serves as a pharmaceutically important intermediate for the production of semi-synthetic cephalosporins such as cephalotin and cefazoline.

V patentové literatuře je popsána řada způsobů imobilizace buněk nebo enzymů pro průmyslové biotransformace, využívající nejrůznější nosiče a způsoby imobilizace. Existují též způsoby imobilizace, které nevyžadují použití nosiče vůbec, jako jsou např. univerzální postupy využívající chemicky reaktivních polymerů rozpustných ve vodě pro imobilizaci různých prokaryontních a eukaryontních buněk s různou enzymovou aktivitou (čs. autorské osvědčení č.A number of methods of immobilizing cells or enzymes for industrial biotransformations using a variety of carriers and methods of immobilization are described in the patent literature. There are also immobilization methods that do not require the use of a carrier at all, such as universal procedures using chemically reactive water-soluble polymers to immobilize various prokaryotic and eukaryotic cells with different enzyme activity (cf.

231 458). Za použití chemicky reaktivních polymerů ve vodě rozpustných byl vypracován též jednoduchý a univerzální postup výroby imobilizovaných enzymů jako jsou např. hydrolázy, izomerázy, racemázy, lyázy a oxydoreduktázy podle čs. autorského osvědčení č. 231 656. Citovaným postupem lze pomocí reaktivních rozpustných polymerů (dále jen RRP), s výhodou připravitelných reakcí komerčně dostupných flokulantů obsahujících frakci polyethyleniminu s bifunkčním sítovacím činidlem,například glutaraldehydem a rozpustnými preparáty enzymů různé čistoty a kvality, připravit ve vodě nerozpustný enzym, ve formě částic biokatalyzátoru s dobrými sedimentačními vlastnostmi, vysokou filtrabilitou a specifickou aktivitou požadovaného enzymu.231 458). Using chemically reactive water-soluble polymers, a simple and versatile process for the production of immobilized enzymes such as hydrolase, isomerase, racemase, lyase and oxydoreductase according to U.S. Pat. By the above process, water-insoluble, water-insoluble enzymes of various purity and quality can be prepared using reactive soluble polymers (RRP), preferably obtainable by reacting commercially available flocculants containing a polyethyleneimine fraction with a bifunctional crosslinking agent such as glutaraldehyde and soluble enzyme preparations of different purity and quality. enzyme, in the form of biocatalyst particles with good sedimentation properties, high filterability and specific activity of the desired enzyme.

Pro enzymovou hydrolýzu glutaryl-7-ACK na 7-ACK je popsáno kromě nativních buněk s aktivitou hydrolázy Ί-β-(4-karboxybutanami-2263 016 do) cefalosporánové kyseliny (dále jen hydrolázy glutaryl-7-ACK), rovněž použití biokatalyzátorů na bázi imobilizovaných buněk s touto aktivitou, jako jsou buňky z rodu Comamonas či Pseudomonas zabudované v celulózoacetátových kapsulích (Japonský patentový spis č. 76 70 884), nebo buňky Pseudomonas sp. imobilizované pomocí reaktivních rozpustných polymerů (čs. autorské osvědčení č. 251 111 závislé na čs. autorském osvědčení č. 231 458).For the enzymatic hydrolysis of glutaryl-7-ACK to 7-ACK, in addition to the native cells with the activity of--β- (4-carboxybutanami-2263 016 do) cephalosporic acid hydrolase (hereinafter glutaryl-7-ACK hydrolase), the use of biocatalysts for a base of immobilized cells with this activity, such as cells of the genus Comamonas or Pseudomonas incorporated in cellulose acetate capsules (Japanese Patent Publication No. 76 70 884), or Pseudomonas sp. immobilized with reactive soluble polymers (Author's Certificate No. 251 111 dependent on Author's Certificate No. 231 458).

Využití biokatalyzátorů na bázi imobilizovaných technických nebo do různého stupně čistoty izolovaných enzymů je pro přeměnu glutaryl-7-ACK principiálně výhodnější, nebot buňky produkčních kmenů mohou obsahovat další enzymové aktivity nežádoucí z hlediska přípravy 7-ACK, nebot atakují 7-acylcefemsloučeniny jiným a nežádoucím způsobem, jako jsou například esterázy, katalýzující tvorbu deacetylovaných derivátů glutaryl-7-ACK a 7-ACK nebo 3-laktamázy.The use of biocatalysts based on immobilized technical or isolated enzymes of varying degrees of purity is, in principle, more advantageous for the conversion of glutaryl-7-ACK, since the production strain cells may contain other enzymatic activities undesirable for 7-ACK preparation. , such as esterases, catalysing the formation of deacetylated derivatives of glutaryl-7-ACK and 7-ACK or 3-lactamase.

V patentové literatuře je popsáno několik způsobů využití hydrolázy glutaryl-7-ACK izolované z kmene rodu Comamonas sp. a Pseudomonas, zejména Pseudomonas ovalíš, imobilizované pomocí glutaraldehydu na různé nosiče jako bazický iontoměnič Amberlit Ira-940, nebo kopolymer akrylonitrilu a methakrylátu (Japonské patentové spisy č. 78 59 095, č. 81 85 298 a č. 78 139 791). Všechny tyto způsoby vyžadují však imobilizaci na částice ve vodě nerozpust ných nosičů nebo způsoby imobilizace do sítě vznikajícího polymeru, přičemž je známo, že náklady na výrobu imobilizovaných preparátů enzymů jsou výrazně ovlivněny cenou a dostupností použitých nosičů. Další nevýhodou těchto postupů je, že dosahované specifické aktivity získaných imobilizovaných materiálů na bázi tohoto imobilizovaného enzymu jsou velmi nízké a nedovolují reálný předpoklad průmyslové realizace.Several methods of using glutaryl-7-ACK hydrolase isolated from a strain of the genus Comamonas sp. and Pseudomonas, especially Pseudomonas oval, immobilized with glutaraldehyde to various carriers such as Amberlit Ira-940 basic ion exchanger, or acrylonitrile methacrylate copolymer (Japanese Patent Nos. 78 59 095, 81 85 298 and 78 139 791). All of these methods, however, require immobilization to particles of water-insoluble carriers or methods of immobilization to the polymer-forming network, whereby the cost of producing immobilized enzyme preparations is known to be significantly influenced by the cost and availability of the carriers used. Another disadvantage of these processes is that the specific activity of the obtained immobilized materials based on this immobilized enzyme is very low and does not allow a realistic assumption of industrial realization.

Postup podle předmětného vynálezu odstraňuje zmíněné nevýhody, nebot nevyžaduje žádných organických, anorganických či přírodních ve vodě nerozpustných nosičů.The process of the present invention eliminates these disadvantages since it requires no organic, inorganic or natural water-insoluble carriers.

Sítění enzymových molekul hydrolázy glutaryl-7-ACK do formy vzájemně kovalentně prokřížené sítě pomocí běžných sítovacích činidel (glutaraldehyd, toluendiizokyanát apod.) není možné, nebot tento enzym je vysoce citlivý k poměrně agresivním účinkům těchto činidel a dochází i při použití jejich velmi nízkých koncentrací k nevratné inaktivaci tohoto enzymu. Proto, aby nedošlo k inaktivaci tohoto enzymu v průběhu imobilizace, je nutné pracovat s reaktiv nimi, ve vodě rozpustnými polymery, které vznikly například reakcí kationaktivních flokulantů, obsahujících frakci polyethyleniminu s glutaraljehydem odděleně, načež vzniklé částice lze poté dosítitCrosslinking of glutaryl-7-ACK hydrolase enzyme molecules to form a covalently cross-linked network using conventional cross-linking agents (glutaraldehyde, toluene diisocyanate, etc.) is not possible as this enzyme is highly sensitive to the relatively aggressive effects of these agents and occurs at very low concentrations to irreversibly inactivate this enzyme. Therefore, in order not to inactivate this enzyme during immobilization, it is necessary to work with reactive water-soluble polymers formed, for example, by reacting cationic flocculants containing the polyethyleneimine fraction with glutaraldehyde separately, after which the resulting particles can be cross-linked

3263 016 a zpevnit pulzním přidáním nízkých koncentrací volného glutaraldehydu, nebo přidat ve vodě rozpustnou látku, která vstupuje do reakce s glutaraldehydem, např. polyethylenimin nebo roztok bílkovin a vzniklou směs voluminézních částic spolu s koreagujícími rozpuštěnými látkami kovalentriě zesítit. Při tomto předmětném postupu je pokles aktivity hydrolázy glutaryl-7-ACK podstatně nižší, částice jsou pevnější a vykazují vysokou stabilitu enzymové aktivity.3263 016 and solidify by pulse addition of low concentrations of free glutaraldehyde, or add a water-soluble substance that reacts with glutaraldehyde, such as polyethyleneimine or a protein solution, and crosslink the resulting mixture of volumetric particles together with the reacting solutes. In the present process, the decrease in glutaryl-7-ACK hydrolase activity is substantially lower, the particles are more solid and exhibit high enzyme activity stability.

Předmětem vynálezu tedy je zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovného enzymu hydrolázy 7 (i-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-amicefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení 231 656 připravitelný z částic biokatalyzátoru na bázi zesítěné hydrolázy 7 {3-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho parciálním sušením, popř. jeho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelných s vodou a/nebo jejich směsmi s vodou, opětovnou separací a parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.Accordingly, the present invention provides a granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 (i- (4-carboxybutanamido) cephalosporanoic acid hydrolase enzyme for the enzymatic production of 7-amicephalosporanoic acid according to U.S. Patent 231,656) obtainable from the biocatalyst particles based on crosslinked hydrolase 7 {3- (4). -carboxybutanamido) cephalosporanoic acid by subsequent treatment with an aqueous solution of glutaraldehyde and / or polyethylenimine or proteins of microbial, vegetable or animal origin and an aqueous solution of glutaraldehyde, separation and mechanical homogenization of the resulting product and its partial drying or subsequent suspension in non-cooled organic solvents water and / or mixtures thereof with water, re-separation and partial drying, and finally washing it with water or buffer.

Podle vynálezu se tento biokatalyzátor vyrábí tak, že se do nepřetržitě míchané reakční směsi částic po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,0 až 8,5, s výhodou 7,5, přidá vodný roztok glutaraldehydu v rozmezí jeho koncentrací 0,01 až 1,0 % objem/objem, nebo vodný roztok polyethhyleniminu nebo vodný roztok bílkovin a následně vodný roztok glutaraldehydu, znovu se upraví pH reakční směsi v rozmezí uvedených hodnot a reakční směs se nepřetržitě míchá po dobu 10 minut až 5 hodin, nebo se ponechá v klidu, popřípadě se ponechá zmrznout, načež se částice separují, mechanicky homogenizují a parciálně suší, nebo se za míchání ošetří ochlazeným acetonem nebo ethanolem a/nebo jejich směsmi s vodou, znovu separují a parciálně suší po dobu 1 až 24 hodin při teplotě 10 až 40 ’c, poté se bioktalyzátor suspenduje ve vodě nebo v pufru, několikrát- dekantuje a promyje, ponechá nabobtnat a separuje.According to the invention, the biocatalyst is produced by adding an aqueous solution of glutaraldehyde in the concentration range of 0.01 to 1 to a continuously stirred reaction mixture of the particles after adjusting the pH in the range 6.0 to 8.5, preferably 7.5. 0% v / v, or an aqueous solution of polyethhylenimine or an aqueous solution of proteins, followed by an aqueous solution of glutaraldehyde, re-adjust the pH of the reaction mixture within the stated values and stir continuously for 10 minutes to 5 hours, or leave to stand, optionally allowed to freeze, whereupon the particles are separated, mechanically homogenized and partially dried, or treated with cooled acetone or ethanol and / or mixtures thereof with water, with separation, re-separated and partially dried for 1 to 24 hours at 10 to 40 ° c, then the biocatalyst is suspended in water or buffer, decanted several times and washed, allowed to swell and separate.

Částice biokatalyzátoru získané podle předmětného postupu mají vysokou sedimentační rychlost, dobrou filtrovatelnost a vysokou aktivitu hydrolázy glutary1-7-ACK. Tyto vlastnosti a zvláště skutečnost úplné absence nežádoucích enzymových aktivit, dovolují reálný předpoklad jeho využití pro výrobu 7-ACK při těchto jeho přednostech:The biocatalyst particles obtained according to the present process have a high sedimentation rate, good filterability and high glutary-1-7-ACK hydrolase activity. These properties, and in particular the complete absence of undesirable enzyme activities, allow a realistic assumption of its use in the production of 7-ACK with the following advantages:

a) vyšší stupeň teoretické konverze substrátu na produkt,a) higher degree of theoretical conversion of substrate to product,

-4263 016-4263 016

b) vyšší výtěžek 7-ACK v izolaci,b) higher yield of 7-ACK in isolation,

c) vyšší kvalita 7-ACK,c) higher quality 7-ACK,

d) nepřítomnost degradačních produktů v izolované 7-ACK.d) absence of degradation products in isolated 7-ACK.

Aktivita hydrolázy glutaryl-7-ACK byla zjišťována měřením rychlosti hydrolýzy glutaryl-7-ACK na 7-ACK v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0 při teplotě 37 ’C v oblasti enzymové kinetiky nultého řádu. 7-ACK byla stanovena spektrofotometricky za použití p-dimethylaminobenzaldehydu, který reaguje se 7-ACK za vzniku barevné Schiffovy báze podle čs. autorského osvědčení č. 111 959, v modifikaci podle Balasinghama a sp. (Biochim. Biophys. Acta, 276, 250, 1972).Glutaryl-7-ACK hydrolase activity was determined by measuring the rate of hydrolysis of glutaryl-7-ACK to 7-ACK in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 at 37 ° C in the region of zero order enzyme kinetics. 7-ACK was determined spectrophotometrically using p-dimethylaminobenzaldehyde, which reacted with 7-ACK to form a colored Schiff base according to U.S. Pat. No. 111,959, modified by Balasingham et al. (Biochim. Biophys. Acta, 276, 250 (1972)).

Jedna jednotka enzymové aktivity (U) je takové množství enzymu které odpovídá tvorbě jednoho ^umolu 7-ACK za minutu za výše uvedených podmínek reakce. Specifická aktivita výchozího a imobilizovaného materiálu je vyjadřována jako U . g”1 bílkovin resp. suché hmoty.One unit of enzyme activity (U) is the amount of enzyme that corresponds to the formation of one µmole of 7-ACK per minute under the above reaction conditions. The specific activity of the starting and immobilized material is expressed as U. g ” 1 proteins respectively. dry matter.

7-ACK byla v reakční směsi sledována dále chromatograficky za použití tenké vrstvy celulózy (Polygram cell - 300) v systému n-pro panol-voda (7:3) s ninhydrinovou detekcí (R^ 0,5) nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC).The 7-ACK was further monitored in the reaction mixture using a thin layer of cellulose (Polygram cell-300) in a n-pro panol-water (7: 3) system with ninhydrin detection (R ^ 0.5) or high pressure liquid chromatography (HPLC). ).

Vynález je dále doložen v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.The invention is further illustrated in the examples without limiting them.

Příklady provedeníExamples

Příklad 1Example 1

Jeden litr roztoku technické hydrolázy glutaryl-7-ACK bez aktivity nespecifických esteráz, obsahující 3 g bílkovin . litr a celkové množství 800 U . litr”^ bylo pomalu a po částech přidáváno do nepřetržitě míchané reakční směsi reaktivního rozpustného polymeru (RRP) vzniklého reakcí kationaktivních flokulantů obsahujících frakci polyethyleniminu a glutaraldehydu podle čs. autorského osvědčení č. 231 656.One liter of non-specific esterase glutaryl-7-ACK technical hydrolase solution containing 3 g of protein. liter and a total of 800 U. liter was added slowly and in portions to the continuously stirred reaction mixture of the reactive soluble polymer (RRP) formed by the reaction of the cationic flocculants containing the polyethyleneimine and glutaraldehyde fraction according to U.S. Pat. Certificate No. 231 656.

Po vpravení veškerého množství roztoku enzymu bylo pH reakční směsi v průběhu nepřetržitého míchání upraveno na hodnotu 7,5 20 % vodným roztokem hydroxidu sodného. K vzniklé suspenzi voluminézních částic byl postupně a pomalu přidáván 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,5 % (objem/objem). Poté bylo opět uvedeným roztokem a způsobem upraveno pH reakční směsi na hodnotu 7,5 a směs byla míchána po dobu jedné hodiny.After all of the enzyme solution had been incorporated, the pH of the reaction mixture was adjusted to 7.5 with 20% aqueous sodium hydroxide while stirring continuously. A 25% aqueous solution of glutaraldehyde was added gradually and slowly to the resulting suspension of the voluminous particles so that its final concentration in the reaction mixture was 0.5% (v / v). Thereafter, the pH of the reaction mixture was adjusted to 7.5 with the solution and method, and the mixture was stirred for one hour.

-5263-5263

Poté byly částice odděleny filtrací, vlhký voluminézní koláč byl vpraven do kuchyňského robotu na strouhanou housku, jehož buben byl opatřen řeznými otvory 0,5 až 1 mm. Homogenizovaný materiál ve formě granulí byl suspendován do směsi ethanol : voda (1:2) při teplotě -5 *C, krátce promíchán pomocí rychloběžného vrtulového míchadla, ihned a ostře vakuově odsát a částice sušeny ve vakuové sušárně při teplotě 30 *C po dobu 2 hodin. Poté byl materiál suspen dován v pitné vodě, několikrát vodou dekantován, přičemž poslední dekantace byly prováděny destilovanou vodou. Promyté částice byly separovány vakuovou filtrací.Then the particles were separated by filtration, and the wet voluminous cake was introduced into a food processor into a grated bread roll, the drum of which was provided with cutting holes of 0.5 to 1 mm. The homogenized granular material was suspended in ethanol: water (1: 2) at -5 ° C, stirred briefly with a high-speed propeller stirrer, immediately and sharply vacuum-dried, and dried in a vacuum oven at 30 ° C for 2 hours. hours. Subsequently, the material was suspended in drinking water, decanted several times with water, the last decanting being carried out with distilled water. The washed particles were separated by vacuum filtration.

Bylo získáno 29,5 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině29.5 g wet mass of dry matter biocatalyst was obtained

22,5 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 60,2 U . g”1.22.5% and a specific activity of glutaryl-7-ACK hydrolase 60.2 U. g ” 1 .

g glutaryl-7-ACK (čistota 95,4 %) bylo rozpuštěno za úpravy pH 1 N roztokem NaOH na hodnotu pH 7,0 v 90 ml 0,05 M fosfátovém pufru o pH 7,0 a přidáno 10 g vlhké hmoty získaného biokatalyzátoru a směs byla míchána při teplotě 35 *C za kontinuální úpravy pH roztokem alkálie na hodnotu 7,0 po dobu 60 minut. Bylo dosaženo 90 % teoretické konverze substrátu na 7-ACK. Popsaný postup byl opakován celkem 5 x vždy se stejnou násadou částic téhož biokatalyzátoru a průměrný stupeň konverze substrátu na 7-ACK/5 cyklů opakovaného použití činil 89,3 %.g glutaryl-7-ACK (95.4% purity) was dissolved by adjusting the pH with 1 N NaOH to pH 7.0 in 90 mL of 0.05 M phosphate buffer pH 7.0 and adding 10 g wet mass of the obtained biocatalyst and the mixture was stirred at 35 ° C while continuously adjusting the pH with an alkaline solution to 7.0 for 60 minutes. 90% of the theoretical conversion of the substrate to 7-ACK was achieved. The described procedure was repeated a total of 5 times with the same batch of particles of the same biocatalyst and the average conversion rate of the substrate to 7-ACK / 5 cycles of reuse was 89.3%.

Příklad 2Example 2

Jeden litr roztoku technického enzymu byl smíchán s 0,8 litry RRP stejným způsobem jako v příkladu 1. Roztok technického enzymu vykazoval stejnou aktivitu a koncentraci bílkovin. Poté bylo přidáno v průběhu nepřetržitého míchání 10 ml 10 % vodného roztoku polyethyleniminu s molekulovou hmotností 30 000 až 40 000, pH bylo upraveno na hodnotu 7,5 20 % vodným roztokem NaOH, přidán vodný roztok glutaraldehydu tak, aby výsledná koncentrace v reakční směsi činila 0,5 % a pH bylo opět upraveno popsaným způsobem. Další postup přípravy biokatalyzátoru byl stejný jak je uvedeno v příkladu 1.One liter of the technical enzyme solution was mixed with 0.8 liters of RRP in the same manner as in Example 1. The technical enzyme solution showed the same activity and protein concentration. 10 ml of a 10% aqueous polyethyleneimine solution having a molecular weight of 30,000 to 40,000 were added while stirring continuously, the pH was adjusted to 7.5 with a 20% aqueous NaOH solution, and an aqueous solution of glutaraldehyde was added so that the final concentration in the reaction mixture was 0.5% and the pH was again adjusted as described. The next procedure for the preparation of the biocatalyst was the same as in Example 1.

Bylo získáno 32,2 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 23,8 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 53,3 U . g 1.32.2 g of wet mass of the biocatalyst with a dry matter content of 23.8% and a specific activity of glutaryl-7-ACK hydrolase of 53.3 U were obtained. g 1 .

Dále byla provedena enzymová konverze substrátu na produkt za podmínek a způsobem uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že namísto fosfátového pufru bylo k rozpuštění substrátu použito dešti· lované vody. Bylo dosaženo 87,3 % teoretické konverze glutaryl-7-ACK, průměrný stupeň konverze v 5 opakovaných cyklech použití téže násady biokatalyzátoru činil 86,3 % teorie.Further, the enzyme conversion of the substrate to the product was carried out under the conditions and method set forth in Example 1 except that distilled water was used instead of the phosphate buffer. 87.3% of the theoretical conversion of glutaryl-7-ACK was achieved, with an average conversion rate of 5 repetitive cycles using the same biocatalyst feed of 86.3%.

-6Příklad 3-6Example 3

263 016263 016

Byl smíchán jeden litr roztoku technického enzymu stejných kvalit a stejným způsobem jako v příkladu 1 s RRP. K reakční směsi byl navíc přidán vodný roztok bílkovin (technická vaječná bílkovina) tak, aby výsledná koncentrace celkových bílkovin činila 50 g . 1 \ Po vpravení roztoku bílkovin bylo pH v průběhu nepřetržitého míchání upraveno popsaným způsobem a ke vzniklé suspenzi částic byl přidán 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho aktuální koncentrace v reakční směsi byla 1 % (objera/objem). Dále byl postup přípravy biokatalyzátoru stejný jako v příkladu 1.One liter of technical enzyme solution of the same quality and in the same manner as in Example 1 was mixed with RRP. In addition, an aqueous protein solution (technical egg protein) was added to the reaction mixture to give a total protein concentration of 50 g. After incorporation of the protein solution, the pH was adjusted as described during continuous mixing, and a 25% aqueous glutaraldehyde solution was added to the resulting suspension of particles to bring the actual concentration in the reaction mixture to 1% (v / v). Furthermore, the procedure for preparing the biocatalyst was the same as in Example 1.

Bylo získáno 70,3 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině70.3 g of wet dry matter biocatalyst was obtained

24.3 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 29,8 U . g24.3% and a specific activity of glutaryl-7-ACK hydrolase of 29.8 U. G

Příklad 4Example 4

Byl připraven biokatalyzátor stejným způsobem jak je uvedeno v příkladu 2 s tím rozdílem, že jako výchozí enzymový materiál byl použit roztok technické hydrolázy glutaryl-7-ACK bez aktivity nespecifických esteráz, získaný zahuštěním na rotačním vakuové odpařovači při teplotě 38 *C, obsahující 30 g bílkovin . litr-1 a celkovém množství tohoto enzymu 7 100 U . litr 1. Bylo získánoA biocatalyst was prepared in the same manner as in Example 2 except that a glutaryl-7-ACK technical hydrolase solution without non-specific esterase activity obtained by concentration on a rotary evaporator at 38 ° C containing 30 g was used as the starting enzyme material. protein. liter -1 and a total amount of this enzyme of 7 100 U. liter 1 . It was obtained

56.4 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 24 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 314,7 U . g56.4 g of wet biocatalyst with a dry matter content of 24% and a specific activity of glutaryl-7-ACK hydrolase 314.7 U. G

Příklad 5Example 5

Jeden litr roztoku technického enzymu, který byl zahuštěn způsobem popsaným v příkladu 4, byl smíchán s RRP způsobem jako v příkladu 1; pH reakční směsi bylo v průběhu nepřetržitého míchání upraveno popsaným způsobem na hodnotu 7,8, směs byla důkladně homogenizována a poté mražena v tenké vrstvě při -20 *C po dobu 5 hodin. Poté byla směs rozmražena, částice suspendovány do 0,1 % vodného roztoku glutaraldehydu a po 30 minutách mícháni při teplotě místnosti byla suspenze zředěna destilovanou vodou a částice separovány vakuovou filtrací. Vlhký voluminézní koláč byl mechanicky homogenizován a sušen při 30 °C 3 hodiny za vakua. Poté byly částice suspendovány v destilované vodě, dekantovány, promyty a separovány způsobem uvedeným v příkladu 1.One liter of the technical enzyme solution, which was concentrated as described in Example 4, was mixed with RRP as in Example 1; The pH of the reaction mixture was adjusted to 7.8 during continuous stirring as described, the mixture was thoroughly homogenized and then frozen in a thin layer at -20 ° C for 5 hours. After the mixture was thawed, the particles were suspended in a 0.1% aqueous glutaraldehyde solution and after stirring at room temperature for 30 minutes, the suspension was diluted with distilled water and the particles separated by vacuum filtration. The wet voluminous cake was mechanically homogenized and dried at 30 ° C for 3 hours under vacuum. Then, the particles were suspended in distilled water, decanted, washed and separated as in Example 1.

Bylo získáno 55,3 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině55.3 g of wet mass of dry matter biocatalyst were obtained

24,6 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 307 U . g 1.24.6% and a specific activity of glutaryl-7-ACK hydrolase 307 U. g 1 .

-ΊPříklad 6 263 β1θ -ΊExample 6 263 β1θ

Jeden litr vodného roztoku technické hydrolázy, který byl zahuštěn způsobem popsaným v příkladu 4, obsahující koncentraci bílkovin a aktivitu, která je rovněž uvedena v příkladu 4, byl smíchán s RRP způsobem uvedeným v příkladu 1 včetně způsobu úpravy pH.One liter of an aqueous hydrolase solution, which was concentrated as described in Example 4, containing the protein concentration and activity also shown in Example 4, was mixed with the RRP as described in Example 1, including the pH adjustment method.

K vzniklé suspenzi voluminézních částic byl postupně přidán 25 % vodný roztok glutaraldehydu tak, aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,25 %.(objem/objem). Dále bylo postupováno v imobilizaci postupem uvedeným v příkladu 5.A 25% aqueous solution of glutaraldehyde was gradually added to the resulting suspension of the voluminous particles to give a final concentration in the reaction mixture of 0.25% (v / v). The immobilization was carried out as described in Example 5.

Bylo získáno 55,5 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 24,6 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 312 U . g-l.55.5 g of wet mass of biocatalyst with a dry matter content of 24.6% and a specific activity of glutaryl-7-ACK 312 U hydrolase were obtained. g - l.

Příklad 7Example 7

Bylo smícháno 950 ml roztoku technického enzymu stejných kvalit a stejným způsobem s RRP jako v příkladu 1. Dále bylo v imobilizací postupováno stejným způsobem jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že pH reakční směsi bylo upraveno na hodnotu 7,0, aktuální koncentrace přidaného roztoku glutaraldehydu činila 0,05 % (objem/objem). Dále bylo v imobilizaci pokračováno mražením reakční směsi způsobem uvedeným v příkladu 5, včetně dekantace, promytí a separace.950 ml of a technical enzyme solution of the same quality and in the same manner were mixed with RRP as in Example 1. The immobilization was carried out in the same manner as in Example 1, except that the pH of the reaction mixture was adjusted to 7.0, the actual concentration of the added solution. glutaraldehyde was 0.05% (v / v). Further, immobilization was continued by freezing the reaction mixture as described in Example 5, including decanting, washing and separating.

Bylo získáno 26,4 g vlhké hmoty biokatalyzátoru o sušině 22,8 % a specifické aktivitě hydrolázy glutaryl-7-ACK 70 U . g26.4 g of wet mass of the biocatalyst with a dry matter content of 22.8% and a specific activity of glutaryl-7-ACK 70 U hydrolase were obtained. G

Claims (2)

1. Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7p-(4-karboxybutanamido) cefalosporánové kyseliny k enzymové výrobě 7-aminocefalosporánové kyseliny podle čs. autorského osvědčení č. 231 656 připravitelný z částic biokatalyzátoru na bázi zesítěné hydrolázy 7/3-(4-karbpxybutanamido) cefalosporánové kyseliny následným zpracováním vodným roztokem glutaraldehydu a/nebo polyethyleniminu nebo bílkovin mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu a vodným roztokem glutaraldehydu, separací a mechanickou homogenizací vzniklého produktu a jeho parciálním sušením, popřípadě jeho následným suspendováním v ochlazených organických rozpouštědlech neomezeně mísitelných s vodou a/nebo jejich směsmi s vodou, opětovnou separací a popřípadě dalším parciálním sušením a konečně jeho promytím vodou nebo pufrem.A granular biocatalyst based on immobilized 7β- (4-carboxybutanamido) cephalosporanoic acid hydrolase enzyme for the enzymatic production of 7-aminocephalosporanoic acid according to c. No. 231,656, obtainable from the particles of a biocatalyst based on cross-linked 7 / 3- (4-carbopoxybutanamido) cephalosporic acid hydrolase by subsequent treatment with an aqueous solution of glutaraldehyde and / or polyethyleneimine or proteins of microbial, vegetable or animal origin and an aqueous solution of glutaraldehyde, separation and mechanical treatment. by homogenizing the resulting product and partially drying it, optionally by subsequently suspending it in cooled organic solvents unrestrictedly miscible with water and / or mixtures thereof with water, re-separating and optionally further partial drying and finally washing it with water or buffer. 2. Způsob výroby biokatalyzátoru podle bodu 1, vyznačený tím, že do nepřetržitě míchané reakční směsi částic se po úpravě pH v rozmezí hodnot 6,0 až 8,5, s výhodou 7,5 přidá vodný roztok glutaraldehydu v rozmezí jeho koncentrací 0,01 až 1,0 % objem/ob jem, nebo vodný roztok polyethyleniminu nebo vodný roztok bílkovin a následně, vodný roztok glutaraldehydu, znovu se upraví pH reakční směsi v rozmezí uvedených hodnot a reakční směs se nepřetržitě míchá po dobu 10 minut až 5 hodin, nebo se ponechá v klidu, popřípadě se nechá zmrznout, načež se částice separují, mechanicky homogenizují a popřípadě suší, nebo se za míchání ošetří ochlazeným acetonem nebo ethanolem a/nebo jejich směsmi s vodou, znovu separují a popřípadě parciálně suší po dobu jedné až 24 hodin při teplotě 10 až 40 *C, poté se biokatalyzátor suspenduje ve vodě nebo v pufru, několikrát dekantuje a promyje, ponechá nabobtnat a separuje.2. A process according to claim 1, characterized in that an aqueous solution of glutaraldehyde is added to the continuously stirred particulate reaction mixture after adjusting the pH in the range of 6.0 to 8.5, preferably 7.5, in a concentration range of 0.01. up to 1.0% v / v, or an aqueous polyethyleneimine solution or an aqueous protein solution, followed by an aqueous glutaraldehyde solution, re-adjusting the pH of the reaction mixture within the range indicated and stirring continuously for 10 minutes to 5 hours, or The mixture is left to stand, optionally allowed to freeze, whereupon the particles are separated, mechanically homogenized and optionally dried, or treated with cooling acetone or ethanol and / or mixtures thereof with water, separated again and optionally partially dried for one to 24 hours. at 10 to 40 ° C, then the biocatalyst is suspended in water or buffer, decanted several times and washed, swollen and separated .
CS874910A 1987-06-30 1987-06-30 The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation CS263016B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS874910A CS263016B1 (en) 1987-06-30 1987-06-30 The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS874910A CS263016B1 (en) 1987-06-30 1987-06-30 The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS491087A1 CS491087A1 (en) 1988-08-16
CS263016B1 true CS263016B1 (en) 1989-04-14

Family

ID=5392879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS874910A CS263016B1 (en) 1987-06-30 1987-06-30 The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS263016B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
CS491087A1 (en) 1988-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU712026A3 (en) Method of preparing immobilized enzyme glucoisomerase preparate
US3619371A (en) Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
US4461832A (en) Preparation of an enzymatically active formulation embedded in silica gel
WO1989000195A1 (en) Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine
KR910002854B1 (en) Enzyme Fixation Method
US4760024A (en) Immobilization of enzymes
US4188263A (en) Carrier-bound acylases
Iyengar et al. Urease bound to chitin with glutaraldehyde
Babu et al. Studies on improved techniques for immobilizing and stabilizing penicillin amidase associated with E. coli cells
CS263016B1 (en) The granular biocatalyst based on the immobilized enzyme hydrolase 7 - (4-carboxybutanamido), cephalosporanic acid for the enzymatic production of 7-aminooephalosporanic acid and its preparation
Vretblad et al. Preparation and properties of an immobilized Barley β‐amylase
US4250263A (en) Method of purification of thermally stable enzymes
US4608340A (en) Immobilized aminoacylase enzyme
CA1267618A (en) Stabilization of intracellular enzymes
JPH0325159B2 (en)
CS203607B1 (en) Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase
US3745088A (en) Active water-insoluble enzymes
SU1228788A3 (en) Method of producing immobilized aminoacylase
SU1731815A1 (en) Method for preparation of immobilized cells, showing glucoisomerase activity
CZ126093A3 (en) Process for preparing hydrolase of 7-(4-caboxybutanamido) cephalosporanic acid
Jensen et al. Preparation and properties of insoluble forms of bacteriophage T4 lysozyme and chicken egg white lysozyme
CS251111B3 (en) Method of strengthening and stabilizing biocatalyst particles for the enzymatic conversion of 7 - [(4-carboxybutanamido) -cephalosporanic acid to 7-aminocephalosporanic acid
Melius et al. Immobilization of lipase to cyanogen bromide activated polysaccharide carriers
JPH01256389A (en) Production of immobilized biocatalyst
JPH0638748A (en) Enzyme for fragmentation of n-acetylheparosane, production of preparation containing said enzyme and fragmentation method using said enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20020630