SU712030A3 - Способ обработки клеток бактерий,имеющих глюкозоизомеразную активность,перед процессом получени продукта,содержащего фруктозу - Google Patents

Description

I

Изобретение относитс  к области биохимии .

Известно, что глюкозоизомеразный фермент может быть использован дл  каталитического ускорени  перерабатки глюкозы (декстрозы ) во фруктозу левулезу), котора  обладает более высокой способностью подслащивани , чем исходный материал. Глюкозоизомераза образуетс  главным образом внутри клеток бактернй, которые растут в процессе их производства. Эти клетки отфильтровывают из культуральной среды и непосредственно использук)т в качестве источника глюкозоизомеразы.

Желательно, чтобы клетки бактерий, обладающих активностью глюкозоизомеразы, могли использоватьс  в непрерывном процессе изомерации глюкозы во фруктозу. Предлагались различные способы иммобилизации фермента дл  того, чтобы он мог быть повторно использован в непрерывном процессе.

Известен один из способов обработки клеток бактерий, имеющих глюкозоизомеразную активность 1).

Суть способа заключаетс  в обработке клеток бактерий глутаровым альдегидом. При этом глюкозоизомераза нммобнлнзуетс  в клетках и клетки могут быть использованы в реакторе с перенащиваннем или в колонне изомеризацни. Однако установлено , что если клетки бактерий с иммобилизованной глюкозоизомеразной активностью не будут обработаны перед использованием в качестве катализаторов изомеризации , то они не будут иметь удовлетворительную физическую устойчивость, а это ухудщает гидравлические характеристики колонны, В результате получаемый изомернзованный сироп может иметь нежелательную окраску, а врем  жнзни фермента будет недостаточно продолжительным.

Целью изобретени   вл етс  придание клеткам бактерий физической устойчивости .

Дл  этого клетки бактерий, обладающие глюкозоизомеразной активностью, смешнвают при температуре 10-27°С с водным раствором глюкозы при рН 8,0, измеренном при 25°С дл  гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток

и пропускают через него водный раствор глюкозы при- и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до получени  прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5-8,0, измеренном при 60°С.

Целесообразно, чтобы водный раствор глюкозы имел декстрозный эквивалент 97- 98 и 30-50 вес.°/о сухих веществ, из которых глюкоза составл ет 93-96 вес.%. Можно использовать дл  осуществлени  этого способа клетки бактерий, . обработанные глутаровым альдегидом. Пропускать водный раствор через слой клеток следует снизу вверх при величине расхода 53-61 л/м площади поперечного сечени  в 1 мин. Водный раствор глюкозы может содержать кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний - 0,005-0,007 м/л и 0,01 N лимонную кислоту .

Клетки бактерий с глюкозоизомеразной активностью могут быть получены с помощью хорошо известных способов. Предпочтительные знзимсодержащие клетки получают глубинным выращиванием в аэробных услови х культуры Sfreptornuces olivaceus NNRS 3583 или его мутантов в среде , содержащей соответствующие питательные вещества. Получаемые клетки бактерий отдел ют от культуральной среды фильтро .ванием или центрифугированием.

Дл  иммобилизации глюкозоизомеразы могут быть использованы различные хорошо известные способы. Предпочтительно отделенные клетки бактерий суспендировать в водной среде и смешивать с глутаропым альдегидом в количестве примерно от 0,1 до 60 вес.% (в пересчете на сухое вещество клеток).

Так как обработанные клетки бактерий, содержащие фермент, обычно вырабатывают в ином месте и раньше того вре.мени, когда получают продукт, содержащий фруктозу , то дл  хранени  и транспортировки клетки обычно высушивают. Тако высушивание до величины влагосодержани  примерно 3-10 вес.°/о может быть осуществлено в любом сущильном аппарате при температуре примерно 60-70°С. Получаемые аггломерированные высушенные клетки затем сортируют по размеру дл  последующегоиспользовани  в слое колонны. Аггломерированную высушенную массу клеток обычно раздел ют на небольшие части при минимальном нажиме на клетки. Эти части помещают на сита дл  получени фракции, котора  задерживаетс  на сите 60 меш и проходит через сито 20 меш.

Если приготовленные аггломераты длеток бакте.рий должны использоватьс  в производстве сиропа из глюкозы, содержащего фруктозу, то их перед тем как поместить в колонну, обрабатывают согласно изобретению . Если в колонну загрузить необработайные клетки, то необходимо значительное врем  до того, чтобы реакци  изомеризации стабилизировалась в относительно посто нном состо нии. В течение этого времени получаемый изомеризованный сироп имеет

нежелательную окраску. При этом врем  жизни клеток (физическа  устойчивость) короткое .

Соответственно описан1гому способу клетки прежде всего смешивают с водой или с водным раствором глюкозы. Этот последний раствор может состо ть из глюкозы, растворенной в воде. Предпочтителен состав из осахаренного раствора высококачественной глюкозы, получаемого энзи.матической переработкой крахмала. Этот раствор

глюкозы должен содержать примерно 30- 50 вес.% растворенных твердых веществ, а также твердые вещества должны содержать примерно 93-96 вес.% глюкозы. Глюкозный эквивалент раствора глюкозы составл ет примерно 97-98. Воду или раствор глюкозы используют в количестве примерно 10 вес. ч, на 1 вес. ч. высушенных клеток . Температура воды или раствора глюкозы составл ет примерно 10-27°С. В воде или растворе глюкозы может содержатьс 

5 также кобальт в виде хлорида кобальта в мольной концентрации примерно 0,005, магний в виде гидроокиси магни  в мольной концентрации при.мерно 0,005-0,007 и хелатный и буферный агент (лимонна  кислота) в нop faльнoй концентрации примерно 0,01. Лимонна  кислота  вл етс  предпочтительной потому,что она образует растворимый хелатный комплекс с нонами кобальта и магни  и участвует R образовании буферного действи  воды или раствора глюкозы при желаемой величине р11. Вода или раствор глюкозы должны иметь рН 8,0 измеренный при 25°С. Такую величину рН обычно получают добавлением соответствующего количества едкого натра. Клетки и

о вода или раствор глюкозы поддерживаютс  в ко 1такте при минимальном перемешивании в течение примерно I ч. За это врем  происходит гидратаци  клетки и стабилизаци  величины рН.

Claims (5)

1. Массу, состо щую из клеток и воды или раствора глюкозы, нолученную на указанной стадии, направл ют на соответствующую реакционную колонну с двойными стенками дл  получени  сло , имеющего толO шину в отсто вшемс  состо нии примерно 89-100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным дл  того, чтобы уменьшить вс кое механическое повреждение аггломератов клеток. В одном из вариантов изобретени  раствор глюкозС) того же сос тава, что и описанные выше, с рН 7,5-8,0, замеренным при 60°С, пропускают (при температуре примерно 60°С) снизу вверх через слой клеток нри. расходе примерно 53-6 л/м площади поперечного сечени  сло  в I мин. Это такой расход, который дает увеличение установившегос  объема аггломератов клеток примерно на 50- 60 об.%. О также обеспечивает желаемую классификацию и перегруппировку аггломератов клеток. Когда начинает поступать раст вор глюкозы, в рубашку колоикы пропускают теплоагент с температурой 60°С. Раствор , выход щий из верхней части колонны, имеет значительное количество окрашиваюпцих веществ, так как он содержит различные остатки клеток бактерий. Гор чий раствор глюкозы следует пропускать снизу вверх через колонну до тех пор, пока выход щий поток не станет светлым и пока рН выход щего потока ие установитс  на величине 7,5-8,0, измеренной при 60°С. Это требует раствора в количестве примерно равном 2-3 об. сло  в I ч в течение I-3 ч. Затем подачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отсто тьс . Лл  уменьщени  количества раствора глюкозы, требуемой дл  такой предварительной обработки , слабо окрашенную часть выход щего раствора глюкозы можно использовать повторно . Величина рН рециркулируемого материала должна быть доведена до 7,5-8,0 и замерена при 60°С. В варианте изобретени  клетки в колонне реактора первоначально обрабатывают пропусканием раствора того же состава , что н водный раствор, описанный выше , при температуре примерно 10-27°С и рН 8,0 измеренном при 25°С, снизу вверх через слой клеток до тех пор, пока выход щий раствор не станет светлым, а рН не установитс  8,0 (измер етс  при 25°С). После этого пропускают водный раствор глюкозы того же состава, что и описанный выше раствор глюкозы, снизу вверх через слой при температуре 60°С и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до тех пор, пока вы .ход щий поток не будет иметь такое же содержание глюкозы, что и вход щий поток глюкозы. Во врем  указанной выше обработки водный раствор и водный раствор глюкозы рециркулируют через слой. Величину рН рециркулируемого материала довод т до желаемого уровн  добавлением щелочи. Все растворы глюкозы, которые вступают в контакт с к летками бактерий, имеют глюкозоизомеразную активность, котора  содержит некоторое количество фруктозы, образованной реакцией изомеризации. Следовательно растворы глюкозы, используемые на указанных выше стади х предварительной обработки, могут быть обесцвечены углем, ум гчены ионообменными материалами, а затем использованы в качестве компонентов фруктозосодержащих продуктов. Клетки, обработанные указанным способом , затем могут быть использованы дл  получени  изомеризованного сиропа. Раствор глюкозы описанного состава может быть пропущен нисход щим потоком через слой при величине рН примерно 8,0 и температуре примерно 60°С дл  получени  продукта , содержащего примерно 42-48 вес./о фруктозы, в зависимости от расхода потока . Аггло.мераты клеток, предварительно обработанные по предлагаемому способу, имеют высокую физическую стабильность и хорЬшие гидравлические характеристики, вполFie подход щие дл  использоьлнк  в сравнительно толстых сло х (76-102 см). Использование клеток, обработанных по известны .м способам, должно ограничиватьс  тонкими сло ми (1,3-10,2 см) при крайне большой площади поверхности. Пример . Культуральную среду, содержащую клетки бактерий Streptom ces ofcvaeeusffi}RS3583 , получают выращиванием таких клеток в среде, содержащей ксилозу. Величину рН культуральной среды довод т до 8,2 добавлением гидроокиси натри . Водный раствор глутарового альдегида добавл ют в бродильную среду из расчета 7 вес./о (на сухое вещество к,аеток в среде). Полученную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. В это врем  добавл ют гидроокись натри  дл  поддержани  величины рН на уровне 8,2. Затем клетки профильтровывают, промывают до рН 8,0 и затем высушивают при 60-70°С до содержани  сухих веществ 3- 10 вес./о. Высушенные клетки фракционируют на сите дл  получени  фракции, котора  задерживаетс  ситом 60 меш и проходит через сито 20 меш. Полученные отсортированные и высушенные аггломераты клеток бактерий; содержап1ие иммобилизованную глюкозоизомеразу, затем помешают на хранение при комнатной температуре перед их дальнейшим использо(анием. При необходимости берут 300 г сухих клеток и смешивают с водным раствором глюкозы, полученным энзнматической обработкой крахмала. Этот раствор имеет глюкозный эквивалент 97 и содержит 30 вес растворенных твердых веществ. Твердые вещества содержат 94 вес./о глюкозы. Температура раствора 10- 27°С. Его используют из расчета 10 вес. ч. на I вес. ч. высушенных клеток. В растворе также содержитс  хлорид кобальта в концентрации 0,0005 м/л, гидроокись магни  в концентрации примерно 0,005 - 0,007 м/л и лимонна  кислота в нормальной концентрации примерно 0,01. В него добавл ют гидроокись натри  в количестве, достаточном дл  того, чтобы поддерживать рМ раствора на уровне 8,0, амер емый при 2Г)С. Клетки выдерживают в контакте с pacTfiopoM глюкозы примерно 771 в течение 1 ч, дл  их гидратации и выравнивани  рИ. Полученную массу клеток и раствор глюкозы направл ют в реакционную колонну диаметром 3,75 см , снабженную рубаш кой, и образуют слой клеток толщиной примерно 89-100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным дл  того, чтобы уменьшить вс кое механическое повреждение гидратированных клеток. Раствор глюкозы того же состава, что описанный выше , с рН 7,5-8,0 . (измерен .при 60°С) пропускают при 60°С снизу вверх через слой клеток при расходе потока 53-61 л/м площади поперечного сечени  в 1 мин. При поступлении в раствор глюкозы в слой через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60°С. Гор чий раствор глгокозы пропускают снизу вверх через колонну в течение I ч до тех пор, пока выход щий раствор не становитс  светлым и величина рН не устанавливаетс  на уровне 7,5-8,0 (измер ют при 60°С). Затем подачу раствора глюкозы прекращают и клеткам дают отсто тьс  в течение 15-20 мин. Во врем  указанной обработки раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток. Величину рН рециркулируемого раствора гдюкозы поддерживают равной 7,5-8,0 (измер ют при 60°С) путем добавлени  гидроокиси натри . Во врем  обработки величину рН нельз  уменьшать ниже 7,0,так как это может привести к физическому повреждению аггломератов клеток . После этого слой клеток готов к использованию дл  изомеризации глюкозы во.фруктозу . Раствор глюкозы того же самого состава , что и описанный выше, пропускают самотеком при напоре примерно 10,2-15,2 см через указанный слой при температуре 60°С и расходе примерно равном 1,5 объемам сло  в 1 час. В этом случае расход составл ет примерно 22 л/м площади поперечного сечени  в I ч. Величину рН раствора глюкозы поддерживают равной 8 (замер емой при 60°С) путем добавлени  гидроокиси натри . Получают изомеризованный сироп , содержаний примерно 42-43 вес,% фруктозы в пересчете на вес растворенных твердых веществ, не имеющий окраски и не содержащий псикозы (psicose). Когда расход подачи сиропа глюкозы уменьшают до 1,1 об. сло  в ч (16,3 л/м2 в 1 ч), то получают продукт, содержащий примерно 45-46 вес./о фруктозы (в пересчете на вес растворенных твердых веществ имею ,щим окраски и не содержащий глюкозы. Указанный слой клеток использовали непрерывно лл  изомеризации в течение бо-, лее 1000 ч и при этом активность аггломера-tJB клеток уменьщилксь весьма незначиельно . При использовании клеток, не обрабоанных по описанному способу, они тер ли по меньшей мере половину своей энзимной активности примерно после 500-600 ч непрерывной работы. . Пример 2. Аналогично, примеру I получают порцию отсортированных по размеру аггломератов клеток бактерий (300 г), содержащих иммобилизованную глюкозоизомеразу . Приготавливают водный раствор, содержащий хлорид кобальта в концентрации примерно 0,0005 м/л, гидроокись магни  в концентрации примерно 0,005-0,007 м/л, лимонную кислоту в нормальной концентрации примерно 0,01 и гидроокись натри , в количестве , достаточном дл  поддержани  величины рН на ур рвн х, измер емой при температуре 25°С. Затем высушенные клетки смешивают с этим водным раствором при 10-27°С в количестве 10 вес. ч. воды на I вес. ч. высушенных клеток. Последние поддерживают в контакте с водным раствором в течение примерно I ч. Полученную массу клеток и водного раствора направл ют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубащкой, и образуют слой клеток тол циной примерно 100 см. Водный раствор того же состава с рН 8,0 (измерен при 25°С) пропускают при температуре IО-27°С снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53-6 л/м площади поперечного сечени  в мин. Водный раствор пропускают снизу вверх через колонну примерно в течение I ч до тех пор, пока выход щий поток не станет светлым, а величина рН выход щего потока .не стабилизируетс  на уровне 8,0 (измер ют при 25°С). Подачу водного раствора прекращают. Затем водный раствор, описанный в примере I, при и рН 7,5-8,0 (измер ют при 60°С) пропускают снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53-61 JY площади поперечного сечени  в I мин до тех пор, пока состав выход щего из сло  раствору не будет таким же как и вход щий раствор глюкозы. При поступлении раствора глюкозы в слой клеток через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60°С. Педачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отсто тьс  в течение примерно 15-20 мин. Во врем  указанной обработки водный раствор и последующий раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток. Величины рН рецнркулируемых во.аного раствора и пос.чслурщего раствора глюкозь: поддерживают соответственно на уровне 8,0 (измер ют fipn ) и на уров- не 7,5-8,0 (измер ют при 60С) путем добавлени  гидроокиси натри . Полученный обработанный слой клеток затем используют дл  изомеризации глюкозы во фруктозу способом, описанным в примере 1, дл  получени  изомеризованного сиропа , содержащего примерно 42-43 аес.% фруктозы, не имеющего окраски и не содержащего псикозы. Обработанный указанным способом слой клеток физически устойчив. Формула изобретени  I. Способ обработки клеток бактерий, имеющих глюкозонзомеразную активность, перед процессом получеии  продукта, содержащего фруктозу, отличающийс  тем, что, с целью придани  клеткам бактерий физической устойчивости, смешивают клетки при температуре Ю-27°С с водным раствором глюкозы при рН 8,0, измеренном при 25°С дл  гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток и пропускают через него водный раствор глюкозы при температуре 60°С и рН 7,5-8,0, измеренном при 60°С, до получени  прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5- 8,0,измеренном при .
2. 2.Способ по п. I, отличающийс  тем, что водный раствор глюкозы имеет декстрозный эквибалент 97-98 и 30-50 вес.°/о сухих веществ, из которых глюкоза составл ет 93-96 вес.%.
3. 3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что используют клетки бактерий, обработанные глутаровым альдегидом.
4. 4.Способ по п. , отличающийс  тем, что водный раствор глюкозы пропускают через слой клеток снизу вверх при величине расхода 53-61 л/м площади поперечного сечени  в 1 мин.
5. 5.Способ по п. I, отличающийс  тем, что водный раствор глюкозы содержит кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний - 0,005- 0,007 м/л и 0,01 N лимонную -кислоту. Источники информации, прин тые во BHHivfaHHe при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1376983, кл. С 3 Н, олублик. 1971.