JP2522908B2 - グルコ―ス・イソメラ―ゼ結晶化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、殺菌剤を加えなくても
化学的、微生物学的に安定であり、反応器カラム内の担
体上に固定化するのに非常に有用なグルコース・イソメ
ラーゼ酵素の濃縮物に関する。本発明はまた該濃縮物の
製法に関する。

【０００２】

【従来技術および課題】グルコースのフルクトースへの
異性化のためのグルコース・イソメラーゼの使用は、よ
く知られた工業的方法であり、該酵素は、しばしば固定
化形で使用される。使用されている多くの商業的方法で
は、固定化酵素調製物は別の工程で製造され、該工程に
おいては、酵素は吸着技術により担体上に固定化される
か、酵素と共に全微生物細胞塊を固定してマトリックス
を形成させる。反応器カラムを用意した固定化酵素で組
立てる。酵素を使い果たしたら、該カラムを空け、再び
新しい固定化酵素調製物で組立てる。精製した酵素の方
が未精製の粗調製物より担体上に吸着され易いというこ
とが知られている(米国特許第４３４７３２２号)。問題
は、そのような、安定な、取扱い易く、保存し易いカラ
ム内の担体上に固定するために使用できる酵素調製物を
製造することである。

【０００３】沈澱または結晶化に基づくグルコース・イ
ソメラーゼ精製方法から得られた沈澱または結晶塊は少
なくとも６０重量％の水を含有し、それは酵素構造の破
壊なしには除去することができない。そのような結晶塊
は微生物学的に安定でなく、取扱いや使用が困難であ
る。別法として、該結晶塊を溶解して溶液とすることが
あり、その濃度は貯蔵、安定性、輸送の見地からできる
だけ高くするのが望ましい。自明な方法は該酵素結晶を
水または希薄塩溶液中に溶解することであろう。しか
し、実際にはグルコース・イソメラーゼの比較的低い溶
解性のために、結晶を水に溶かして十分な濃度のイソメ
ラーゼ溶液を調製することは不可能であることが判明し
ている。イソメラーゼの希薄水溶液は非常に不安定であ
り、微生物学的および化学的劣化の結果、数日間でその
活性を失う。

【０００４】該酵素は有機溶媒に溶解しうることも示唆
されている(米国特許第４０７７８４２号)。しかし、食
品製造工程において有機溶媒を使用することは望ましく
なく、したがって、この技術は食品製造に直接使用され
る酵素には適当ではない。しかし、該酵素が食品に使用
されないならば、溶解に有用な物質の種類は拡張されう
る。グルコース・イソメラーゼは現在使用されている最
も重要な酵素の１つであるため、グルコース・イソメラ
ーゼの調製、精製および使用に関する文献が多数存在す
る。しかし、発表されている精製方法は全て非常に複雑
で、一般に、かなり低収率である。

【０００５】結晶化による酵素および蛋白質の精製は、
それ自体公知であり、例えば、便覧エンザイムズ[ディ
クソン，エムおよびウェブ，イー・シー、エンザイム
ズ、第３版、ロングマン・グループ・リミテッド、ブン
ガイ(Ｄixon, Ｍ．and Ｗebb,Ｅ．Ｃ．, Ｅnzymes, ３
rd ed．, Ｌongman Ｇroup Ｌtd．, Ｂungay)１９７
９、１１１６頁]には、１９２枚の酵素結晶の写真が示
されている。さらに、硫酸アンモニウムは、いくつかの
場合、結晶化を促し、溶解性を減少させる薬剤として適
していることが知られている。加えて、硫酸アンモニウ
ム結晶化はしばしば、ある種の他の塩あるいはアセトン
またはアルコールのような有機溶媒により行なうことが
できる。この分野では、ある酵素または他のある蛋白質
がそれ自体は公知のある沈澱剤により結晶化されうるこ
とは決して自明でないということが一般に認められてい
る。生化学における精製方法が広大な発展を遂げても、
まだ、その結晶化がうまくいっていない多くの蛋白質お
よび酵素が知られている。すなわち、酵素結晶化の「科
学」(それは事実上むしろ芸術といってよい。)は非常に
経験的であり、ある種の方法が１つの酵素の結晶化にう
まくいくことが示されても、同じ方法が他の酵素の結晶
化に一般的適用性を有するわけではない。

【０００６】グルコース・イソメラーゼ精製方法または
そのような方法の一部として分別硫酸塩(硫酸アンモニ
ウムおよび／またはマグネシウム)沈澱の使用がいくつ
かの刊行物から知られている[米国特許第４２３７２３
１号、米国特許第４０７７８４２号、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Ａgr．Ｂi
ol．Ｃhem．)、４５(１９８１)６１９〜６２７、同２８
(１９６５)１１２３〜１１２８、同３４(１９７０)１７
９５〜１８０４、同２９(１９６５)１１２９〜１１３
４、バイオヒミカ・バイオフィズィカ・アクタ(Ｂiochi
m．Ｂiophys．Ａcta．)、１５１(１９６８)６７０〜６
８０]。これらのイソメラーゼ精製方法に使用される硫
酸塩濃度は相対的に高い。例えば、米国特許第４２３７
２３１号による方法では、４０％硫酸アンモニウムの飽
和度で不必要な蛋白質が該イソメラーゼ溶液から最初に
沈澱し、次いでイソメラーゼ自体がより高い飽和度(６
０％まで)で沈澱する。

【０００７】高い硫酸アンモニウム濃度が分別沈澱に使
用される場合、他の多数の蛋白質が常にイソメラーゼと
ともに沈澱する。もしも、イソメラーゼが他の方法で既
にある程度精製されていないならば、使用する硫酸アン
モニウム濃度が高くなればなるほど、さらに多数の蛋白
質が沈澱してくる。分別沈澱に基づく精製方法において
は、得られる物は通常無定形沈澱であり、工業用の遠心
分離機またはセパレータにより良好な収率で母液から分
離することは非常に困難であり、または不可能でさえあ
る。該無定形沈澱は通常、混合析出物であり、特に、原
料物質が微生物細胞液であり、予め精製されていない場
合、イソメラーゼの他に、他の蛋白質も含む。そのよう
な無定形沈澱は母液から分離することが難しく、沈澱法
はイソメラーゼに関しては所望の精製効果を与えない。

【０００８】硫酸アンモニウム、他の塩または有機溶媒
によるグルコース・イソメラーゼの結晶化は、いくつか
の刊行物に記載されている[バイオヒミカ・バイオフィ
ズィカ・アクタ(Ｂilchim．Ｂiophys．Ａcta．)、１５
１(１９６８)６７０〜６８０、アグリカルチュラル・ア
ンド・バイオロジカル・ケミストリー(Ａgr．Ｂiol．Ｃ
hem．)、３４(１９７０)１７９５〜１８０４、同４５
(１９８１)６１９〜６２７、同３３(１９６９)１５２７
〜１５３４]。これらの刊行物に記載された結晶化方法
の特徴的な点は低収率であり、非常に長い結晶化時間で
あり、または科学薬品の相対的に高い消耗である。これ
らの場合のいずれにおいても基礎的研究目的用の少量の
純粋なイソメラーゼを調製することを目的としている。
例えば、イソメラーゼは最初ある種の方法(有機溶媒で
の抽出、ＤＥＡＥ−セファデックス−カラムクロマトグ
ラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、透析)により精製さ
れ、その後、精製イソメラーゼの純水溶液からの結晶化
が硫酸アンモニウム、リン酸塩緩衝剤またはアセトンを
用いて行なわれている。前記刊行物に記載された方法は
どれも経済性が低いため、工業的規模で使用されていな
い。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は濃厚水性ポリヒ
ドロキシ化合物含有溶液に溶解したグルコース・イソメ
ラーゼを含有することで特徴づけられる安定なグルコー
ス・イソメラーゼ濃縮物に関する。本発明による濃縮物
は科学的にも微生物学的にも安定であり、特にグルコー
ス・イソメラーゼを担体に固定化する方法に有用である
ということが判明した。好適なポリヒドロキシ含有化合
物は、例えば、炭水化物およびポリオールのような水に
容易に溶けるそのような全ての化合物である。糖、グリ
セロール、ポリプロピレングリコールまたはエチレング
リコールもまた好適である。そのまま食品に使用されて
いる糖ならびに食品添加物として許容されている糖アル
コールが特に好適である。異性化の最終生成物はグルコ
ース−フルクトース・シロップであるので、これらの糖
の混合物、すなわち、転化糖が該目的に非常に好適であ
る。該濃縮物中の総乾燥固形分は本質的に微生物学的に
安定な程度でなければならない。すなわち、乾燥固形分
は約６０〜７０重量％であるべきである(すなわち、水
分の作用が十分低くなくてはならない)。

【００１０】本発明によるグルコース・イソメラーゼ濃
縮物は５〜２０重量％のグルコース・イソメラーゼ、好
ましくは、５〜１５重量％のグルコース・イソメラー
ゼ、３０〜６０重量％の、例えば、グルコース、マルト
ース、フルクトース、シュークロース、ソルビトール、
キシリトールまたはそれらの混合物、例えば転化糖、グ
ルコース・シロップまたは異性化グルコース・シロップ
のような水溶性炭水化物、１５重量％以下の適当な塩、
例えば、硫酸アンモニウムおよび／またはマグネシウ
ム、および／または緩衝剤(pＨ５.０〜８.０)、例え
ば、ナトリウム−カリウム−リン酸緩衝剤、炭酸塩緩衝
剤または有機塩(例えばアミノ酸塩)で調製された緩衝剤
または緩衝剤の混合物を含有し、残部が水である。該濃
縮物のpＨは５.０〜８.０であり、酵素活性は５００〜
１００００ＧＩＵ／g濃縮物である。好適には、pＨは
６.０〜８.０であり、酵素活性は２０００〜５０００Ｇ
ＩＵ／g濃縮物である(ＧＩＵ＝グルコース・イソメラー
ゼ単位)。

【００１１】次に、本発明による好適な酵素濃縮物の数
例を示す。 １． ５０重量％ グリセロール １０重量％ 水 １５重量％ 酵素 ５重量％ 硫酸アンモニウム ２． ５０重量％ 転化糖 ３０重量％ 水 １５重量％ 酵素 １重量％ 緩衝剤(Ｎa−Ｋ−リン酸塩) ４重量％ 硫酸アンモニウム ３． ５０重量％ ソルビトール ４０重量％ 水 １０重量％ 酵素 ４． ５０重量％ シュークロース ３０重量％ 水 １５重量％ 酵素 ５重量％ 緩衝剤(リン酸ナトリウム)

【００１２】しかしながら、総濃度が十分に高く、か
つ、液状の溶液が取扱い易いということを考慮しなが
ら、必要に応じて濃縮物の組成を変えてもよい。本発明
によるグルコース・イソメラーゼ濃縮物は純粋で、安定
であり、取扱いおよび使用が容易である。酵素活性は調
節することができる。実用の観点からは、好適な活性範
囲は２０００〜１００００ＧＩＵ／g調製物である。用
いる糖、糖アルコールおよび塩は好適には食品用(例え
ば、フード・ケミカルズ・コード標準品)である。酵素
は結晶化その他の方法で十分に精製されるべきである。
グルコース・イソメラーゼ吸着用の好適な担体はアニオ
ン交換能を有する材料、例えば、ガラスビーズ、イオン
交換樹脂またはシリカ・ベース担体である。特に好適に
はＤＥＡＥ−セルロースおよびＤＥＡＥ−デキストラン
のような蛋白質を吸着することで知られているジエチル
アミノエチネ(ＤＥＡＥ)誘導体である。文献に記載され
た多数の担体がある。ＤＥＡＥ−セルロースを担体とし
て使用する場合、１０００ＩＧＩＵ／g固定化酵素(ＩＧ
ＩＵ＝固定化グルコース・イソメラーゼ活性)以上の高
活性を得ることが容易である。

【００１３】本発明は、また前記の安定なグルコース・
イソメラーゼ濃縮物の製造方法に関する。該方法は、 a)グルコース・イソメラーゼを結晶化するため、好適な
塩を発酵から得た部分的に精製されたグルコース・イソ
メラーゼ溶液へ加え、 b)グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため該
溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、次いで、所望
ならば、１または数回再結晶し、 c)炭水化物またはその濃厚水溶液を得られた結晶塊に加
え、溶解し、それによって安定なグルコース・イソメラ
ーゼ濃縮物を得ることを特徴とする。 本発明によれば、該イソメラーゼ酵素を塩溶液から結晶
化することにより非常に効率よく精製することができ
る。好適な塩は、該酵素を不活性化しない非毒性塩の全
てである。本発明による方法では硫酸アンモニウムおよ
び／またはマグネシウムが使用される。

【００１４】塩によるグルコース・イソメラーゼの沈澱
は、それ自体は公知の方法で、例えば、アグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Ａgr．
Ｂiol．Ｃhem．)、２９(１９６５)pp．１１２９〜１１
３４(イスムレおよびサトー(Ｉsumre and Ｓato))に
記載されている。しかし、結晶形成が起こるそのような
方法は以前には記載されていない。前記の方法では、無
定形沈澱が形成される。条件により、同じ化学薬品であ
る硫酸ナトリウムまたはマグネシウムを使用することに
より無定形沈澱または結晶沈澱のどちらかを得ることが
できる。多数の酵素が同様な行動をとることが一般に知
られている。本発明による方法の特徴的な驚くべき特色
は、沈澱する可能性がある他の全ての物質以前に、イソ
メラーゼが結晶物質として沈澱するということである。
該方法では、正確に選択した条件および他の物質が該溶
液から沈澱しない低濃度の硫酸アンモニウムが使用され
る。この点で該方法は当該分野の文献に記載されている
こととは基本的に異なる。以前には、グルコース・イソ
メラーゼは産生微生物の細胞液または細胞液濃縮物から
唯一の沈澱成分として直接、単独で結晶化されたことは
ない。該方法はまた、より以前に文献で述べられたこと
と基本的に異なる非常に高い収率を与える。

【００１５】酵素調製物の保存特性および安定性を、例
えば、グリセロール、ポリアルコールおよび糖により増
加できることが一般に知られている。そのような酵素調
製物は通常、前記物質を濃縮酵素溶液へ加えることによ
り調製される。乾燥無水ポリアルコールまたは糖(好ま
しくは、グルコース)を濃縮イソメラーゼ結晶懸濁液中
に混合するか、または約１００００ＧＩＵ／gの最高可
能活性を有する固体結晶塊中に混合すると、驚くべきこ
とに、イソメラーゼ結晶が溶解し、純水な透明溶液を生
じることが判明した。そのような溶液は、その水分濃度
が十分低く、そのイソメラーゼ活性が十分高いと、安定
である。該溶液は結晶化工程に由来する塩または後で加
えられた塩を含有してもよく、塩自体は微生物学的安定
性を増加させる効果を有する。しかし、該溶液につい
て、可能な限り高いイソメラーゼ活性を達成するために
イソメラーゼ結晶を溶解させる観点からは、ポリオール
および糖が基本的に重要である。先行文献には、本発明
による生成物と同じ程度の高い酵素活性を有するイソメ
ラーゼ溶液の例は全くないし、そのような溶液の調製方
法も記載されていない。

【００１６】グルコース・イソメラーゼ濃縮物の調製は
好適には次のように行なわれる。 a)溶菌によりストレプトマイセス・ルビギノサス(Ｓtre
ptomyces rubiginosus)から細胞液を調製し(米国特許
第４４１０６２７号)、該細胞液から限外濾過によりイ
ソメラーゼ含有濃縮物を調製し、結晶化工程用の原料物
質とする。該濃縮物の好適なイソメラーゼ濃度は２００
〜８００ＧＩＵ／gである。 b)該イソメラーゼ溶液のpＨは５．７〜８．０の範囲、
好適にはpＨ７．０に調製される。 c)該溶液は１６℃またはそれ以下に冷却される。 d)硫酸アンモニウムおよび／またはマグネシウムが、好
ましくは、１リットル当たり５０〜１７０gで該溶液に
加えられる。加えられる硫酸塩の量は最初のイソメラー
ゼ濃度および最終の結晶化温度に依存する。加えられる
硫酸塩の最適量はイソメラーゼだけが結晶化し、他の蛋
白質がまだ沈澱を始めないような量である。

【００１７】e)たとえ、一度に全量を加えることにより
許容しうる結果が得られるとしても(そのような場合イ
ソメラーゼ結晶の大きさは、好ましくないくらい小さい
ままである)、硫酸塩の添加は好適には、全量の添加に
２〜４時間を要するように徐々に行なう。 f)該溶液は好適には数時間、好ましくは、関与する混合
物の凝固点近くまで冷却する。凝固点は試験した最低硫
酸塩濃度で約−２℃、最高硫酸塩濃度で−６℃である。
冷却は硫酸塩添加開始と同時か、硫酸塩添加完了してか
ら開始することができる。徐々に冷却することにより、
冷却が溶解度低下効果を有し、それによっても収率が増
加するという事実の他に、イソメラーゼ結晶の大きさを
有利に増加させるという冷却結晶化効果が得られる。 g)イソメラーゼ結晶は、それらを容器の底へ沈降させる
か、濾過するか、または大規模の時は、最適には、連続
セパレータにより遠心分離することにより溶液から分離
される。 h)分離した結晶塊は、乾燥炭水化物またはその濃厚水溶
液を加えることにより溶解され、それにより該イソメラ
ーゼ結晶が溶解して安定なグルコース・イソメラーゼ濃
縮物が製造される。

【００１８】所望により、結晶化を繰り返してもよく、
その場合、該結晶塊は分離(工程g)後、比較的高温(２０
〜３０℃)で多量の水に溶解しなければならない。この
点で、好適な水量は溶液のイソメラーゼ活性が５００〜
２０００ＧＩＵ／mlとなる量、換言すると、使用する水
量の重量が典型的には結晶塊の重量の４〜１０倍となる
量である。本明細書において、ＧＩＵはグルコース・イ
ソメラーゼ単位の省号であり、室温および６０℃で測定
した。pＨ６．８４〜６．８５(０．２Ｍマレイン酸ナト
リウム)で最初に１リットル当たり２モルのグルコー
ス、１リットル当たり０．０２モルの硫酸マグネシウム
および０．００１モルのＣＯＣl₂を含有する溶液中で１
分当たり１マイクロモルのグルコースをフルクトースへ
変換する酵素の量である。グルコース・イソメラーゼ測
定はエヌ・イー・ロイドら、シリアル・ケミストリー
(Ｎ．Ｅ．ＬＬoyd, et al．, Ｃereal Ｃhem．)４
９、Ｎo．５pp．５４４〜５５３(１９７２)に開示され
た方法により行なった。

【００１９】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。 実施例１ 約４０m³のストレプトマイセス・ルビギノサスの槽を米
国特許第４４１０６２７号の記載に従って発酵する。細
胞塊を公知の方法(同参考文献)で溶解する。細胞残渣お
よび他の固体物質を通常の珪藻土ドラム濾過器により濾
去し、それにより３２トンのイソメラーゼ含有濾液を得
る。この濾液をＰＣＩ(パターソン−キャンディ,インコ
ーポレーテッド(Ｐatterson−Ｃandy, Ｉnc．))限外濾
過器で濾過し、それにより３０００kgのイソメラーゼ含
有濃縮物を得る。その活性は９６０,０００,０００ＧＩ
Ｕである。限外濾過膜を通過した透過液を除去する。１
２０kgの硫酸マグネシウムおよび３００kgの硫酸アンモ
ニウム(ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよび(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、食品
用)を該濃縮物に加える。結晶化を促進するため混合物
を１０℃に冷却する。生成した結晶をデカンテーション
で分離し、４１１kgの硫酸アンモニウムを加えて結晶化
を繰り返す。結晶を再度デカンテーションで分離する。

【００２０】４０２kgの水を加えて結晶塊を溶解し、１
Ｍのアンモニア溶液により該溶液のpＨを６．５に調製
する。該溶液をプレート濾過器で濾過し、１６kgの硫酸
マグネシウムおよび４０kgの硫酸アンモニウムを使用し
て結晶化を再度繰り返す。２９kgの酵素、３．７kgの塩
(ＭgＳＯ₄, (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄)および残部が水からなる収
量９０kgの結晶塊を得る。該結晶塊へ４５kgのグルコー
スおよび４５kgのフルクトースならびに７０重量％の乾
燥固形分を有する２０kgの転化糖を加える。このように
して２００kgの酵素調製物が得られる。その組成は次の
とおりである。 ２９．２重量％ 水 ５２．０重量％ 糖 １４．５重量％ グルコース・イソメラーゼ ４．３重量％ 塩(硫酸マグネシウム−硫酸アンモニウ
ム) 該酵素濃縮物のグルコース・イソメラーゼ活性は４５０
０ＧＩＵ／gである。

【００２１】実施例２ 実施例１に記載した方法で限外濾過した発酵物を調製す
る。限外濾過発酵物４０００kgに、結晶硫酸アンモニウ
ム２４４kgおよび水９００kgに塩６００kgを溶解した硫
酸アンモニウム溶液を加える。該溶液を１３℃に冷却
し、この温度で２０時間保つ。生成した結晶塊をウエス
トファリア・エヌ・エー７(ＷestfaliaＮＡ７)セパレー
タにより分離する。結晶を水に溶解し、該溶液を濾過す
る。濾液量は２０００リットルである。結晶硫酸アンモ
ニウム１２２kgおよび水４６０リットルに硫酸アンモニ
ウム３００kgを溶解した硫酸アンモニウム溶液を用いて
結晶化を繰り返す。得られた結晶塊を再度セパレータで
分離する。結晶塊(５２５kg)へ同量の結晶フルクトース
を加える。これにより該塊が溶解し、フルクトースの一
部がグルコースに異性化する。この方法で安定な酵素濃
縮物が得られる。その組成は次のとおりである。 糖(グルコースおよびフルクトース) ５０．０重量％ 酵素 １１．２重量％ 硫酸アンモニウム ３．５重量％ 水 ３５．３重量％ 該濃縮物のグルコース・イソメラーゼ活性は３０００Ｇ
ＩＵ／gである。

【００２２】実施例３ 実施例１に記載した方法で限外濾過発酵物を調製する。
２,４００,０００,０００ＧＩＵ活性を有する４０００
リットルの限外濾過した発酵物をグルコース・イソメラ
ーゼの結晶化に用いる。５％ＮaＯＨ溶液により該溶液
のpＨをpＨ７.０に調整し、溶液の温度を１２℃に調整
する。グルコース・イソメラーゼの結晶化のために、７
５０リットルの水に溶解した５００kgの硫酸アンモニウ
ムを該溶液へ等供給速度で２時間を要して加える。次い
で該溶液を−２℃に冷却し、２４時間撹拌する。グルコ
ース・イソメラーゼ結晶をウエストファリア・エヌ・エ
ー−７セパレータにより分離する。２３.６重量％の乾
燥固形分および２,３００,０００,０００ＧＩＵの活性
を有する結晶塊３９０kgを得る。３０kgの塩化ナトリウ
ムおよび１８０kgのグルコースを該結晶塊へ加え、得ら
れた酵素濃縮物のpＨを５％ＮaＯＨ溶液で７.０に調整
する。これらの条件下でグルコースが一部異性化され
る。この方法で、６００kgの安定な酵素濃縮物が得られ
る。その組成は次のとおりである。 ４９．７重量％ 水 ３０．０重量％ 糖(グルコース／フルクトース) １２．８重量％ 酵素 ２．５重量％ 硫酸アンモニウム ５．０重量％ 塩化ナトリウム 該酵素濃縮物のグルコース・イソメラーゼ活性は３４０
０ＧＩＵ／gである。

【００２３】実施例４ 実施例１に記載した方法で限外濾過した発酵物を調製す
る。２,４００,０００,０００ＧＩＵ活性を有する４０
００リットルの限外濾過した発酵物をグルコース・イソ
メラーゼの結晶化に用いる。５％ＮaＯＨ溶液により該
溶液のpＨをpＨ７に調整し、溶液の温度を１２℃に調整
する。グルコース・イソメラーゼの結晶化のために、７
５０リットルの水に溶解した５００kgの硫酸アンモニウ
ムを該溶液へ等供給速度で２時間で加える。次いで該溶
液を−２℃に冷却し、２４時間撹拌する。グルコース・
イソメラーゼ結晶をデカンテーションで分離する。４
０.０重量％の乾燥固形分および２,３００,０００,００
０ＧＩＵの活性を有する結晶塊２３０kgを得る。１１５
kgのグルコースおよび１１５kgのフルクトースならびに
７０％の乾燥固形分を有する５０kgの転化糖を該結晶塊
へ加える。この方法で、５１０kgの酵素調製品物が得ら
れる。その組成は次のとおりである。 ３０.０重量％ 水 ５２.０重量％ 糖(グルコース、フルクトース) １５.１重量％ 酵素 ２.９重量％ 硫酸アンモニウム 該酵素濃縮物のグルコース・イソメラーゼ活性は４５０
０ＧＩＵ／gである。

【００２４】実施例５ 実施例１に記載した方法で限外濾過した発酵物を調製す
る。６００ＧＩＵ／mlの活性を有し２５℃の温度の０.
９５リットルのイソメラーゼ濃縮物へ５０gの硫酸アン
モニウムを加える。この段階では溶液中に沈澱は生成し
ない。該溶液を１６時間で０℃に冷却し、連続的に穏や
かに撹拌しながら、その温度に保持する。イソメラーゼ
が２日で結晶し始める。結晶化を継続し、５日後に９
７.５重量％のイソメラーゼが結晶形になり、２.５重量
％のイソメラーゼがまだ母液中に溶解している。結晶を
実験室用遠心分離機で溶液から分離する。それによって
５６gの湿潤結晶塊を回収する。この実施例によれば、
文献で知られている典型的な量と比べて非常に低濃度の
硫酸アンモニウムでイソメラーゼを結晶させることがで
きる。同時にこれは純粋な冷却結晶化の実施例である。
この実施例に鑑み、もし、硫酸アンモニウムによる結晶
化を迅速に行ない、次いで、沈澱を直ちに、例えば１５
分で遠心分離機により分離したならば、米国特許第４２
３７２３１号の方法のごとく、硫酸アンモニウム濃度が
低いと、イソメラーゼは完全に溶液中に残存し、もし、
沈澱しても結晶化は観察されず、その利点が利用されな
いことが容易に理解できる。この実施例に従って調製さ
れた結晶塊は、その他の実施例と全く同様に溶解でき
る。本発明方法により調製された濃縮物は１０カ月間は
微生物学的および化学的不活性化に対して安定であるこ
とが証明されている。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、グルコース・イソメラ
ーゼの結晶化方法が提供される。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a)部分的に精製されたグルコース・イソ
   メラーゼ調製物のpＨを約５.７〜約８.０の範囲に調整
   し、 b)該調製物を約１６℃またはそれ以下に冷却し、 c)調製物を１リットル当たり約５０〜約１７０gの濃度
   で硫酸アンモニウムおよび／または硫酸マグネシウムを
   加え、 d)結晶生成を促進するため該混合物の凝固点付近まで冷
   却することを特徴とするグルコース・イソメラーゼ結晶
   化方法。
2. 【請求項２】 a)溶解した微生物細胞から得られ、限外
   濾過に付したグルコース・イソメラーゼ調製物を供給
   し、 b)pＨを約７.０に調整し、 c)該調製物を約１６℃またはそれ以下に冷却し、 d)約２〜約４時間にわたって調製物１リットル当たり約
   ５０〜１７０gの量で硫酸アンモニウムおよび／または
   硫酸マグネシウムを加え、その間、該混合物を、結晶生
   成を促進するためさらに混合物の凝固点付近に冷却する
   ことからなることを特徴とするグルコース・イソメラー
   ゼの結晶化方法。