DK169443B1 - Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents
Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK169443B1 DK169443B1 DK285785A DK285785A DK169443B1 DK 169443 B1 DK169443 B1 DK 169443B1 DK 285785 A DK285785 A DK 285785A DK 285785 A DK285785 A DK 285785A DK 169443 B1 DK169443 B1 DK 169443B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glucose isomerase
- glucose
- weight
- approx
- concentrate
- Prior art date
Links
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 33
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 51
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 43
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 claims description 42
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 30
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 25
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 25
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 17
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 17
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 17
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 17
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 8
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims description 3
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 10
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 abstract description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 52
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 52
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 52
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 36
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187417 Streptomyces rubiginosus Species 0.000 description 1
- UGLUPDDGTQHFKU-UHFFFAOYSA-M [NH4+].S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mg+] Chemical compound [NH4+].S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mg+] UGLUPDDGTQHFKU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L disodium maleate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[K+].OP([O-])([O-])=O ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
i DK 169443 B1
Den foreliggende opfindelse angår et stabilt glucose-isomerasekoncentrat, som er kemisk og mikrobiologisk stabilt uden tilsætning af mikrobiocider, og som er meget anvendeligt som sådant til immobilisering af enzymet på et bærermateriale 5 i en reaktorkolonne. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant koncentrat.
Anvendelse af glucoseisomerase til isomerisering af glucose til fructose er en kendt industriel metode, ved hvilken enzymet ofte anvendes i immobiliseret form. Ved 10 mange af de kommercielle metoder, som er i anvendelse, fremstilles det immobiliserede enzympræparat ved en separat proces, ved hvilken enten enzymet immobiliseres på bæreren ved hjælp af adsorptionsteknik, eller hele den mikrobielle cellemasse med enzymet immobiliseres, således at der fås en 15 matrix. Reaktorkolonnen fyldes med færdigt, immobiliseret enzym. Når enzymet er opbrugt, tømmes kolonnen og fyldes igen med frisk, immobiliseret enzympræparat.
Det er kendt, at et renset enzym adsorberes langt bedre på en bærer end et ikke-renset råpræparat (US patent-20 skrift nr. 4.347.322). Problemet har været at fremstille et sådant stabilt, let håndterligt enzympræparat, der er let at opbevare, og som kan anvendes til immobilisering af enzymet på bæreren i en kolonne.
Et bundfald eller en krystalmasse, der fås ved glu-25 coseisomeraserensningsprocesser, der er baseret på fældning eller krystallisation, indeholder mindst 60 vægt% vand, der ikke kan fjernes uden at ødelægge enzymstrukturen. Krystalmassen er i sig selv ikke mikrobiologisk stabil, og den er vanskelig at håndtere og dosere. En alternativ metode er 30 at opløse krystalmassen til en opløsning, hvis koncentration fortrinsvis skal være så høj som mulig med henblik på opbevaring, stabilitet og transport. En nærliggende metode ville være at opløse enzymkrystallerne i vand eller i en fortyndet saltopløsning. Det har imidlertid vist sig i prak-35 sis, at det på grund af glucoseisomerases forholdsvis ringe opløselighed ikke er muligt at fremstille en tilstrækkelig DK 169443 B1 2 koncentreret opløsning af isomerasen ved at opløse krystaller i vand. Den fortyndede vandige isomeraseopløsning er yderst ustabil og mister sin aktivitet på grund af mikrobiologisk og kemisk forringelse i løbet af få dage.
5 Det har også været foreslået, at enzymet kunne opløses i et organisk opløsningsmiddel (US patentskrift nr.
4.077.842). Det er imidlertid ikke tilrådeligt at anvende organiske opløsningsmidler i en fremgangsmåde til fødevarefremstilling, og derfor er denne teknik kun dårlig egnet 10 til et enzym, der anvendes direkte til fremstilling af næringsmidler. Hvis derimod enzymet ikke skulle anvendes til fødevarer, kunne de stoftyper, der kunne anvendes til opløsning, udvides.
Der findes en righoldig litteratur vedrørende frem-15 stilling, rensning og anvendelse af glucoseisomerase, fordi glucoseisomerase er et af de vigtigste enzymer, der anvendes for øjeblikket. Imidlertid er alle de kendte rensningsprocesser ret komplicerede og giver som regel temmelig lave udbytter.
20 Rensning af enzymer og proteiner ved hjælp af krystal lisation er i og for sig kendt, og f.eks. i håndbogen Enzymes (M. Dixon og E.,C. Webb, Enzymes, 3. udg., Longman Group Ltd., Bungay 1979, side 1116) vises 192 fotografier af enzymkrystaller. Det er desuden kendt, at ammoniumsulfat i 25 mange tilfælde er egnet som middel til at fremkalde krystallisation, og det nedsætter opløseligheden. Desuden kan am-moniumsulfatkrystallisation ofte udføres ved hjælp af et andet salt eller organisk opløsningsmiddel, såsom acetone eller alkohol. Inden for dette område af kemien medgives 30 det i reglen, at det aldrig er indlysende, at et bestemt enzym eller et andet protein eventuelt kan krystalliseres ved hjælp af et eller andet, i og for sig kendt, fældningsmiddel. Der kendes talrige proteiner og enzymer, som indtil nu ikke har kunnet krystalliseres, selv om rensningsprocesser 35 inden for biokemien har undergået en voldsom udvikling. Læren om enzymkrystallisation (som faktisk måske snarere er 3 DK 169443 B1 en kunst) er således yderst empirisk, og blot fordi visse metoder har vist sig at være resultatrige til krystallisering af ét enzym, betyder det ikke, at de samme metoder kan anvendes i bred almindelighed til krystallisation af andre en-5 zymer.
Anvendelsen af fraktioneret sulfatfældning (ammonium-og/eller magnesiumsulfat) som rensningsmetode til glucose-isomerase eller som en del af en sådan fremgangsmåde er kendt fra flere publikationer [US patentskrifterne nr.
10 4.237.231 og 4.077.842, Agr. Biol. Chem. 45, 619-627 (1981), id. 28, 1123-1128 (1965), id. 34/ 1795-1804 (1970), id. 29, 1129-1134 (1965), og Biochem. Biophys. Acta. 151. 670-680 (1968)].
De sulfatkoncentrationer, der anvendes ved disse 15 rensningsmetoder til isomeraser, har været forholdsvis høje. Således fældes ved fremgangsmåden ifølge US patentskrift nr. 4.237.231 først de unødvendige proteiner ud fra isomera-seopløsningen ved en mætningsgrad på 40% ammoniumsulfat, og derpå fældes isomerasen selv ved en højere mætningsgrad (op 20 til 60%).
Når der anvendes høje ammoniumsulfatkoncentrationer til fraktioneret fældning, udfældes der altid sammen med isomerasen en overflod af andre proteiner, og jo højere ammoniumsul fatkoncent rat ion der anvendes, jo flere yderligere 25 proteiner vil der udfældes, medmindre isomerasen allerede er blevet renset på en eller anden måde ved hjælp af en anden metode.
Ved rensningsprocesser baseret på fraktioneret fældning er resultatet i reglen et amorft bundfald, som er meget 30 vanskeligt eller direkte umuligt at fraskille fra modervæsken i godt udbytte ved hjælp af centrifuger eller separatorer beregnet til industriel brug.
Det amorfe bundfald er som regel en blandet udfældning, som foruden isomerasen også indeholder andre proteiner, 35 især hvis råmaterialet er en mikrobiel cellevæske, som ikke er blevet renset i forvejen. Et sådant amorft bundfald er DK 169443 B1 4 vanskeligt at adskille fra modervæsken, og udfældningen giver ikke den ønskede rensningsvirkning for isomerasens vedkommende.
Krystallisation af glucoseisomeraser ved hjælp af 5 ammoniumsulfat, andre salte eller organiske opløsningsmidler er beskrevet i flere publikationer [Biochem. Biophys. Acta 151. 670-680 (1968), Agr. Biol. Chem. 34, 1795-1804 (1970), id. 45, 619-637 (1981), og id. 33, 1527-1534 (1969)]. Karakteristiske træk ved de i disse publikationer beskrevne kry-10 stallisationsmetoder er lavt udbytte, meget lang krystallisationstid eller forholdsvis stort forbrug af kemikalier. I alle disse tilfælde har formålet været at fremstille en lille mængde ren isomerase til grundforskningsformål. Iso-merasen er således først blevet renset ved hjælp af en eller 15 anden metode (ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel, DEAE-"Sephadex®"-søj lechromatograf i, ammoniumsul fat fældning, dialyse), hvorefter der er udført krystallisation af den rensede isomerase ud fra ren vandopløsning med ammoniumsulfat, phosphatpuffer eller acetone.
20 Ingen af de i ovennævnte publikationer beskrevne metoder har været anvendt i industriel målestok på grund af deres ringe økonomi.
Den foreliggende opfindelse angår et stabilt glucose-isomerasekoncentrat, som er ejendommeligt ved, at det udgøres 25 af fra ca. 5 til ca. 20 vægt% glucoseisomerase opløst i en koncentreret vandig opløsning indeholdende fra ca. 30 til ca. 60 vægt% sukker eller sukkeralkohol ved en pH-værdi fra ca. 5 til ca. 8 samt et salt i en koncentration på ikke mere end ca. 15 vægt%.
30 Det har vist sig, at koncentratet ifølge opfindelsen er både kemisk og mikrobiologisk stabilt og er særlig anvendeligt til fremgangsmåder, ved hvilke glucoseisomerasen immobiliseres på et bærermateriale. Egnede sukkerarter og sukkeralkoholer er alle sådanne forbindelser, der er let 35 opløselige i vand. Sukker forbindelser, glycerol, polypropylen eller ethylenglycol er også egnede. Særligt egnede er sukker- 5 DK 169443 B1 forbindelser, som anvendes som næringsmidler i sig selv, samt sukkeralkoholer, der er tilladte fødevareadditiver. Eftersom isomeriseringsslutproduktet er en glucose-fructose-sirup, er blandingen af disse sukkerforbindelser, dvs. in-5 vertsukker, yderst egnet til formålet.
Det samlede tørstofindhold i koncentratet bør være et sådant, at det i sig selv er mikrobiologisk stabilt, dvs. tørstofindholdet bør være fra ca. 60 til ca. 70 vægt% (dvs. vandets aktivitet skal være tilstrækkelig lav).
10 Fra GB nr. 1.076.750-A kendes enzympræparater i væske form. Disse præparater udgøres af mindst ét enzym af mikrobiologisk oprindelse og en vandig opløsning af en sukkeralkohol i en koncentration på mere end 50 vægt%. Sukkeralkoholen kan være glucose, fructose eller saccharose. Eksempler 15 på enzymer er protease, lipase, allurase, glucanase, hemi-cellurase, glucoseoxydase, flavorase, ribonuclease og adenyl-syredeaminase. Koncentrationen af enzymet er fra 0,15 til 3,0 vægt%. Præparaterne er imidlertid ikke angivet at kunne indeholde glucoseisomerase, og enzymkoncentrationerne deri 20 er langt lavere end i koncentratet ifølge opfindelsen.
Glucoseisomerasekoncentratet ifølge opfindelsen indeholder 5-20 vægt% glucoseisomerase, fortrinsvis 5-15 vægt% glucoseisomerase, 30-60 vægt% af en i vand opløselig sukker eller sukkeralkohol, såsom glucose, maltose, fructose, sac-25 charose, sorbitol, xylitol eller en blanding heraf, f.eks. invertsukker, glucosesirup eller isomeriseret glucosesirup, ikke over 15 vægt% af et egnet salt, såsom ammonium- og/eller magnesiumsulfat, og/eller en puffer (pH-værdi 5,0-8,0), f.eks. natrium-kalium-phosphatpuffer, carbonatpuffer eller 30 en puffer fremstillet af et organisk salt (f.eks. et salt af en aminosyre) eller en blanding af puffere, og resten vand.
Koncentratets pH-værdi er 5,0-8,0, og enzymaktiviteten er 500-10.000 GlU/g koncentrat, pH-værdien fortrinsvis 6,0-35 8,0 og enzymaktiviteten fortrinsvis 2000-5000 GlU/g kon centration (GIU - glucoseisomeraseenheder).
DK 169443 B1 6
Foretrukne koncentrater ifølge opfindelsen indeholder: 50 vægt% glucose eller fructose eller en blanding deraf, 15 vægt% glucoseisomerase, 5 5 vægt% ammonium- eller magnesiumsulfat, 30 vægt% vand, eller 50 vægt% af en blanding af glucose og fructose, 6,7 vægt% glucoseisomerase, 10 3,5 vægt% ammoniumsulfat, 39,8 vægt% vand.
I det følgende er anført nogle eksempler på egende enzymkoncentrater ifølge opfindelsen: 1. 50 vægt% glycerol, 15 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 5 vægt% ammoniumsulfat.
2. 50 vaegt% invertsukker, 20 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 1 vægt% puffer (Na-K-phosphat), 4 vaegt% ammoniumsulfat.
25 3. 50 vægt% sorbitol, 40 vægt% vand, 10 vægt% enzym.
4. 50 vægt% saccharose, 30 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 5 vægt% puffer (natriumphosphat).
Sammensætningen af koncentratet kan imidlertid varie-35 res efter behov, idet der drages omsorg for, at den samlede koncentration er tilstrækkelig høj, men at opløsningen alli- DK 169443 B1 ’7 gevel i flydende form er let at håndtere.
Glucoseisomerasekoncentrater ifølge opfindelsen er rene, stabile og lette at håndtere og dosere. Enzymaktiviteten kan justeres. Alt efter anvendelsen ligger et passende 5 aktivitetsinterval fra 2000 til 10.000 GlU/g præparat.
Sukkerforbindelserne, sukkeralkoholerne og saltene, der skal anvendes, er fortrinsvis af fødevarekvalitet (f.eks. Food Chemicals Codes-standard). Enzymet skal renses passende ved krystallisation eller ved hjælp af en anden metode.
10 Et egnet bærermateriale til adsorption af glucoseiso- merase er et materiale med ionbytterkapacitet, f.eks. glasperler, ionbytterharpiks eller en bærer baseret på siliciumoxid. Særlig egnede er diethylaminoethyl-(DEAE)-derivater, som vides at adsorbere proteiner, såsom DEAE-cellulose og 15 DEAE-dextran. Der er beskrevet et stort antal bærermaterialer i litteraturen.
Når der anvendes DEAE-cellulose som bærer, er det let at opnå en aktivitet på over 1000 IGIU/g immobiliseret enzym. (IGIU - immobiliseret glucoseisomeraseaktivitet).
20 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstil ling af det ovenfor beskrevne stabile glucoseisomerasekoncen-trat indeholdende glucoseisomerase opløst i en koncentreret vandig opløsning indeholdende sukker eller sukkeralkohol. Denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 25 (a) et egnet salt i en koncentration på ca. 15 vægt% eller derunder sættes til en delvist renset glucoseisomerase-opløsning, der er opnået ved fermentering, således at gluco-seisomerasen krystalliserer ved en temperatur på ca. 25"C eller derunder, 30 (b) opløsningen afkøles for at fremme glucoseisomera- sens krystallisation, og den dannede krystalmasse fraskilles, hvorefter der eventuelt gennemføres en eller flere omkrystallisationer, og (c) en sukker eller en sukkeralkohol eller en kon-35 centreret vandig opløsning deraf sættes til den opnåede krystalmasse, som opløses, hvorved der fås et stabilt glu- DK 169443 B1 8 coseisomerasekoncentrat af fra ca. 5 til ca. 20 vægt% glucoseisomerase, fra ca. 30 til ca. 60 vægt% sukker eller sukkeralkohol og et salt i en koncentration på ikke mere end ca. 15 vægt-%, ved en pH-værdi på fra ca. 5 til ca. 8.
5 Glucoseisomeraseenzymet kan renses yderst effektivt ved at krystallisere det ud fra en saltopløsning. Egnede salte er alle sådanne ikke-toksiske salte, der ikke inak-tiverer enzymet. Ved fremgangsmåden anvendes der ammonium-og/eller magnesiumsulfat.
10 Fældning af glucoseisomerase ved hjælp af et salt er i og for sig en gængs metode, der er beskrevet i f.eks. Agr. Biol. Chem. 29, 1129-1134 (1965) (Isumre og Sato). Imidlertid har der ikke tidligere været beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken dannelsen af krystaller finder sted. Ved 15 ovennævnte kendte fremgangsmåde dannes et amorft bundfald.
Afhængigt af betingelserne kan der fås enten et amorft bundfald eller et krystallinsk bundfald ud fra isomerasen ved anvendelse af det samme kemiske ammoniumsulfat eller magnesiumsulfat. Det er almindelig kendt, at talrige enzymer 20 opfører sig på samme måde.
Et karakteristisk og overraskende træk ved fremgangsmåden er, at isomerasen udfældes som et krystallinsk stof og før alle andre stoffer, der eventuelt udfældes. Ved fremgangsmåden anvendes nøje udvalgte betingelser og en så lav 25 ammoniumsulfatkoncentration, at ingen andre stoffer udfældes fra opløsningen. I denne henseende afviger fremgangsmåden væsenligt fra det, der er beskrevet i litteraturen på dette område. Tidligere blev glucoseisomerase ikke krystalliseret direkte og alene som eneste fældningskomponent fra en cel-30 levæske eller et cellevæskekoncentrat fra en produktionsmikrobe. Fremgangsmåden giver også et meget højt udbytte, der afviger væsentligt fra det, der tidligere har været anført i litteraturen.
Der kan således udføres krystallisation af glucose-35 isomerase ved en fremgangsmåde, ved hvilken 9 DK 169443 B1 (a) pH-værdien af et delvist renset glucoseisomerase-praeparat justeres til et interval fra ca. 5,7 til ca. 8,0, (b) præparatet afkøles til ca. 16°C eller derunder, (c) ammonium-* og/eller magnesiumsulfat tilsættes i 5 en koncentration fra ca. 50 til ca. 170 g pr. liter præparat, og (d) der afkøles til nær frysepunktet for blandingen for at lette krystaldannelsen.
Det er almindelig kendt, at enzympræparaters opbeva-10 ringskvalitet og -stabilitet kan forøges, f.eks. ved hjælp af glycerol, polyalkoholer og sukkerforbindelser. Sådanne enzympræparater fremstilles i reglen ved at sætte det nævnte stof til en koncentreret enzymopløsning.
Det har overraskende vist sig, at isomerasekrystal-15 lerne opløses, når der blandes vandfri sukkeralkohol eller sukker (fortrinsvis glucose) i en koncentreret isomerasekry-stal suspens ion eller i en fast krystalmasse med den højst mulige aktivitet på ca. 10.000 GlU/g, og der fremkommer en ægte, klar opløsning. En sådan opløsning er stabil, når 20 dens vandkoncentration er tilstrækkelig lav, og når dens isomeraseaktivitet er tilstrækkelig høj. Opløsningen kan indeholde salte stammende fra krystallisationsmetoden eller salte, som er blevet tilsat bagefter, og som i sig selv har en virkning, der forøger den mikrobiologiske stabilitet.
25 Sukkeralkoholen eller sukkeret har imidlertid en væsentlig betydning med hensyn til opløsingen af isomerasekrystalleme, for at der kan opnås en så høj isomeraseaktivitet i opløsningen som muligt.
I den kendte teknik findes der ingen eksempler på 30 isomeraseopløsninger med en enzymatisk aktivitet, der er så høj som hos produktet ifølge den foreliggende opfindelse, og der er heller ikke beskrevet fremgangsmåder til fremstilling af sådanne opløsninger.
Fremstillingen af glucoseisomerasekoncentratet fore-35 tages fortrinsvis på følgende måde: (a) Der fremstilles en cellevæske ud fra organismen DK 169443 B1 10
Streptomyces ribiginosus ved hjælp af lyse ‘(US patentskrift nr. 4.410.627), og ud fra cellevæsken fremstilles ved ultrafiltrering et koncentrat indeholdende isomerase som råmateriale til krystallisationsprocessen; en foretrukken isomera-5 sekoncentration i koncentratet er 200-800 GlU/g.
(b) Isomeraseopløsningens pH-værdi justeres til intervallet 5,7-8,0, fortrinsvis 7,0.
(c) Opløsningen afkøles til 16°C eller derunder.
(d) Der sættes ammonium- og/eller magnesiumsulfat 10 til opløsningen, fortrinsvis 50-170 g pr. liter opløsning.
Den mængde sulfat, der skal tilsættes, afhænger af den oprindelige isomerasekoncentration og af krystallisationens slut-temperatur. Den mest foretrukne mængde sulfat, der tilsættes, er sådan en mængde, ved hvilken kun isomerasen krystallise-15 res, medens de øvrige proteiner endnu ikke begynder at udfæl des.
(e) Tilsætningen af sulfaterne sker fortrinsvis gradvis, således at tilsætningen af hele mængden varer 2-4 timer, selv om der også kan opnås et acceptabelt resultat ved at 20 tilsætte hele mængden på én gang, men i så tilfælde forbliver størrelsen af isomerasekrystallerne ugunstigt lille.
(f) Opløsningen afkøles fortrinsvis i flere timer, fortrinsvis til nær den pågældende blandings frysepunkt, hvilket ved de lavest afprøvede sulfatkoncentrationer er 25 ca. -2"C og ved de højeste -6'C. Afkølingen kan påbegyndes, enten samtidig med at sulfattilsætningen påbegyndes, eller først når sulfattilsætningen er afsluttet; ved hjælp af gradvis afkøling opnås en afkøling-krystallisationsvirkning, som forøger størrelsen af isomerasekrystallerne på en gunstig 30 måde, og desuden har køling en opløselighedssænkende virkning, hvilket igen forøger udbyttet.
(g) Isomerasekrystallerne fraskilles fra opløsningen, ved at de får lov at bundfælde sig på bunden af beholderen, ved at de frafiltreres, eller i stor skala bedst ved at de 35 fracentrifugeres ved hjælp af en kontinuerlig separator.
(h) Den fraskilte krystalmasse opløses ved, at der DK 169443 B1 11 tilsættes et tørt carbonhydrat eller en koncentreret vandig opløsning heraf, hvorved isomerasekrystallerne opløses, og der fås et stabilt glucoseisomerasekoncentrat.
Om ønsket kan krystallisationen gentages, og i så 5 fald bør krystalmassen opløses efter fraskillelsen (trin (g)) i en rigelig mængde vand ved en forholdsvis høj temperatur (20-30eC). I denne forbindelse er en passende vandmængde en sådan, at opløsningens isomeraseaktivitet er 500-2000 GIU/ml, med andre ord, vægten af den vandmængde, der bruges, 10 er i reglen 4-10 gange krystalmassens vægt.
Som udtrykket anvendes her, er GIU forkortelsen for glucoseisomeraseenhed og er den mængde enzym, der omdanner 1 μιηοΐ glucose til fructose pr. minut i en opløsning, der til at begynde med indeholder 2 mol glucose pr. liter, 0,02 15 mol MgS04 og 0,001 mol C0CI2 pr. liter ved pH-værdien 6,84- 6,85 (0,2 molært natriummaleat) målt ved omgivelsernes temperatur og ved en temperatur på 60°C. Glucoseisomerasemålin-gerne er udført ved hjælp af den metode, der er beskrevet af N.E. Lloyd m.fl. i Cereal Chem. 49., nr. 5, side 544-553 20 (1972).
Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler.
Eksempel 1 25 Et bad på ca. 40 m3 af mikroorganismen Streptomyces rubiginosus fermenteres som beskrevet i US patentskrift nr. 4.410.627. Cellemassen lyseres på kendt måde (samme reference) . Celleresterne og andet tørstof fjernes ved filtrering ved hjælp af et gængs tromlefilter med kisel jord, hvorved 30 der fås 32 tons isomeraseholdigt filtrat. Dette filtrat filtreres ved hjælp af et "PCI"-ultrafilter (Patterson-Candy, Inc.), hvorved der fås 3000 kg isomeraseholdigt koncentrat, hvis aktivitet er 960.000.000 GIU. Permeatet, der har passeret ultrafiltreringsmembranen, fjernes.
35 Der sættes 120 kg magnesiumsulfat og 300 kg ammonium sulfat ((MgS04)7H20 og (NH4)2S04, fødevarekvalitet) til 12 DK 169443 B1 koncentratet. Blandingen afkøles til 10°C for at fremme krystallisation. De dannede krystaller skilles fra ved dekantering, og krystallisationen gentages ved at tilsætte 411 kg ammoniumsulfat. Krystallerne fraskilles atter ved dekante-5 ring. Krystalmassen opløses ved tilsætning af 402 kg vand, og opløsningens pH-værdi justeres ved hjælp af en 1 molær ammoniakopløsning til 6,5. Opløsningen filtreres med et pladefilter, og krystallisationen gentages endnu en gang ved hjælp af 16 kg magnesiumsulfat og 40 kg ammoniumsulfat.
10 Der fås et udbytte på 90 kg krystalmasse, hvoraf 29 kg er enzym, 3,7 kg salte (MgS04, (NH3)2S04) og resten vand.
Til krystalmassen sættes 45 kg glucose og 45 kg fructose samt 20 kg invertsukker med et tørstofindhold på 70 vægt%.
På denne måde fås 200 kg af et enzympræparat, hvis sammen-15 sætning er følgende: 29,2 vægt% vand, 52,0 vægt% sukkerforbindelser, 14,5 vægt% glucoseisomerase, 4,3 vægt% salte (magnesium-ammoniumsulfat).
20 Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 4500
GlU/g.
Eksempel 2
Der fremstilles et ultrafiltreret fermentat på den i 25 eksempel 1 beskrevne måde. Til 4000 kg ultra filtreret fermentat sættes 244 kg krystallinsk ammoniumsulfatopløsning, hvori der er opløst 600 kg salt i 900 kg vand. Opløsningen afkøles til 13*C og holdes på denne temperatur i 20 timer.
Den dannede krystalmasse fraskilles ved hjælp af en "West-30 falia® NA 7"-separator. Krystallerne opløses i vand, og opløsningen filtreres. Filtratetmængden er på 2000 liter. Krystallisationen gentages ved hjælp af 122 kg krystallinsk ammoniumsulfat og ammoniumsulfatopløsning, der indeholder 300 kg ammoniumsulfat opløst i 460 liter vand. Den opnåede 35 krystalmasse fraskilles igen ved hjælp af en separator. Til krystalmassen (525 kg) sættes samme mængde krystallinsk DK 169443 B1 13 fructose, hvorved massen opløses, og fructosen isomeriseres delvis til glucose. På denne måde fås et stabilt enzymkoncentrat, hvis sammensætning er følgende: 50.0 vægt% sukkerforbindelse (glucose og fructose), 5 11,2 vægt% enzym, 3.5 vægt ammoniumsulfat, 35,3 vægt% vand.
Koncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 3000 GIU
pr. g.
10
Eksempel 3
Et ultrafiltreret fermentat fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Til krystallisationen af glucoseisomerasen anvendes 4000 liter ultrafiltreret fermen-15 tat med en aktivitet på 2.400.000.000 GIU. Opløsningens pH-værdi justeres ved hjælp af en 5%'s NaOH-opløsning til pH
7,0, og opløsningens temperatur justeres til 12°C. Til krystallisationen af glucoseisomerasen sættes 500 kg ammoniumsulfat opløst i 750 liter vand til opløsningen i løbet af 20 to timer med jævn tilledningshastighed. Derpå afkøles opløsningen til -2°C, og opløsningen omrøres i 24 timer. Glucose-isomerasekrystallerne fraskilles ved hjælp af en "Westfalia® NA-7"-separator. Udbyttet er 390 kg krystalmasse med et tørstofindhold på 23,6 vægt% og en aktivitet på 2.300.000.000 25 GIU. Der sættes 30 kg natriumchlorid og 180 kg glucose til krystalmassen, og det opnåede enzymkoncentrats pH-værdi justeres ved hjælp af en 5%'s NaOH-opløsning til· 7,0. Under disse omstændigheder isomeriseres glucosen delvis. Herved fås 600 kg stabilt enzymkoncentrat, hvis sammensætning er 30 følgende: 49.7 vægt% vand, 30.0 vægt% sukkerforbindelser (glucose/fructose), 12.8 vægt% enzym, 2.5 vægt% ammoniumsulfat, 35 5,0 vægt% natriumchlorid.
14 DK 169443 B1
Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 3400
GlU/g.
Eksempel 4 5 Der fremstilles et ultrafiltreret fermentat på den i eksempel 1 beskrevne måde. Til krystallisation af glucoseiso-merasen anvendes 4000 liter ultrafiltreret fermentat med en aktivitet på 2.400.000.000 GIU. Opløsningens pH-værdi justeres ved hjælp af en 5%'s NaOH-opløsning til pH 7,0. Opløsnin-10 gens temperatur indstilles på 12"C. Til krystallisation af glucoseisomerasen sættes 500 kg ammoniumsulfat opløst i 750 liter vand til opløsningen i løbet af to timer med jævn tilledningshastighed. Derpå afkøles opløsningen til -2°C og omrøres i 24 timer. Glucoseisomerasekrystallerne fraskilles 15 ved dekantering. Udbyttet er 230 kg krystalmasse med et tørstofindhold på 40,0 vægt% og en aktivitet på 2.300.000.000 GIU. Til krystalmassen sættes 115 kg glucose og 115 kg fructose samt 50 kg invertsukker med et tørstofindhold på 70%.
På denne måde fås 510 kg enzympræparat, hvis sammensætning 20 er følgende: 30.0 vægt% vand, 52.0 vægt% sukkerforbindelser (glucose, fructose), 15.1 vægt% enzym, 2,9 vægt% ammoniumsulfat.
25 Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 4500
GlU/g.
Eksempel 5
Der fremstilles et ultrafiltreret isomerasekoncentrat 30 på den i eksempel 1 beskrevne måde. Der sættes 50 g ammoniumsulfat til 0,95 liter af et isomerasekoncentrat med en aktivitet på 600 GIU/ml og en temperatur på 25eC. Der dannes intet bundfald i opløsningen på dette stadium. Opløsningen afkøles i løbet af 16 timer til 0°C og holdes på denne tempe-35 ratur under svag, konstant omrøring.
Isomerasen begynder at krystallisere i løbet af 2 DK 169443 B1 15 dage, og krystallisationen fortsætter, således at 97,5 vægt% af isomerasen foreligger i krystallinsk form i modervæsen efter 5 dages forløb. Krystallerne skilles fra opløsningen ved hjælp af en laboratoriecentrifuge. Herved udvindes 56 g 5 våd krystalmasse.
Ifølge dette eksempel er det muligt at krystallisere isomerasen med en meget lav ammoniumsulfatkoncentration i forhold til de typiske mængder, der er kendt fra litteraturen. Samtidig er det et eksempel på ren kølekrystallisation.
10 På baggrund af dette eksempel er det let at forstå, at isomerasen, hvis fældningen ved hjælp af ammoniumsulfat udføres hurtigt, og bundfaldet derpå fraskilles straks ved hjælp af en centrifuge, f.eks. i løbet af 15 minutter, hvilket er tilfældet ved fremgangsmåden ifølge us patentskrift nr.
15 4.237.231, forbliver fuldstændig i opløsningen, når ammonium sul fatkoncentrationen er lav, og der vil, hvis den udfældes, ikke iagttages krystallisation, og fordelene herved forbliver uudnyttede. En krystalmasse fremstillet ifølge det foreliggende eksempel kan opløses nøjagtig på samme måde som i de 20 andre eksempler.
Koncentrater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har vist sig at være stabile over for mikrobiel og kemisk inaktivering i tidsrum på op til 10 måneder.
25 30 35
Claims (12)
1. Stabilt glucoseisomerasekoncentrat, kendetegnet ved, at det udgøres af fra ca. 5 til ca. 20 vægt% glucoseisoiaerase opløst i en koncentreret vandig opløs- 5 ning indeholdende fra ca. 30 til ca. 60 vægt% sukker eller sukkeralkohol ved en pH-værdi fra ca. 5 til ca. 8 samt et salt i en koncentration på ikke mere end ca. 15 vægt%.
2. Koncentrat ifølge krav l, kendetegnet ved, at glucoseisomeraseindholdet er fra ca. 5 til ca. 15 10 vægt%, og at pH-værdien er fra ca. 6 til ca. 8.
3. Koncentrat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at saltet er ammonium- og/eller magnesiumsulfat.
4. Koncentrat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sukkeret eller sukkeralkoholen er valgt blandt glu- 15 cose, maltose, fructose, saccharose, sorbitol, xylitol og blandinger deraf, såsom invertsukker, glucosesirup og isom-eriseret glucosesirup.
5. Koncentrat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder 50 vægt% glucose eller fructose eller 20 blandinger deraf, 15 vægt% glucoseisomerase, 5 vægt% ammonium- eller magnesiumsulfat og 30 vægt% vand.
6. Koncentrat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder 50 vægt% af en blanding af glucose og fructose, 6,7 vægt% glucoseisomerase, 3,5 vægt% ammonium- 25 sulfat og 39,8 vægt% vand.
7. Fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt glucoseisomerasekoncentrat indeholdende glucoseisomerase opløst i en koncentreret vandig opløsning indeholdende sukker eller sukkeralkohol, kendetegnet ved, 30 (a) et egnet salt i en koncentration på ca. 15 vægt% eller derunder sættes til en delvist renset glucoseisomerase-opløsning, der er opnået ved fermentering, således at gluco-seisomerasen krystalliserer ved en temperatur på ca. 25°C eller derunder, 35 (b) opløsningen afkøles for at fremme glucoseisomera- sens krystallisation, og den dannede krystalmasse fraskilles, DK 169443 B1 hvorefter der eventuelt gennemføres en eller flere omkrystallisationer, og (c) sukker eller en sukkeralkohol eller en koncentreret vandig opløsning deraf sættes til den opnåede kry-5 stalmasse, som opløses, hvorved der fås et stabilt glucose-isomerasekoncentrat af fra ca. 5 til ca. 20 vægt% glucose-isomerase, fra ca. 30 til ca. 60 vægt% sukker eller sukkeralkohol og et salt i en koncentration på ikke mere end ca. 15 vægt%, ved en pH-værdi på fra ca. 5 til ca. 8.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at det egnede salt er ammoniumsulfat og/eller magnes iumsulfat.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at glucoseisomerasen er delvist renset ved ultra- 15 filtrering.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at (a) krystallinsk ammoniumsulfat og derpå en vandopløsning af ammoniumsulfat sættes til den ultrafiltrerede gluco- 20 seisomerase, der er opnået ved fermentering, således at glucoseisomerasen krystalliserer, (b) den opnåede opløsning afkøles for at fremme gluco-seisomerasens krystallisation, den dannede krystalmasse fraskilles, krystallerne omkrystalliseres ved at opløse dem 25. vand, den dannede opløsning filtreres, krystallinsk ammoniumsulfat og en vandig ammoniumsulfatopløsning tilsættes, hvorefter den dannnede krystalmasse fraskilles, og (c) krystallinsk fructose sættes til den opnåede krystalmasse, som opløses, hvorved der fås et stabilt kon- 30 centrat af glucoseisomerase.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at omkrystallisationen foretages én eller flere gange.
12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendete g- 35 net ved, at (a) magnesiumsulfat og ammoniumsulfat sættes til den DK 169443 B1 ultrafiltrerede glucoseisomeraseopløsning, der er opnået ved fermentering, således at glucoseisomerasen krystalliserer, (b) opløsningen afkøles for at fremme glucoseisomera-5 sens krystallisation, de dannede krystaller fraskilles ved dekantering, krystallerne omkrystalliseres ved tilsætning af vand, magnesiumsulfat og ammoniumsulfat, krystallerne fraskilles ved dekantering, pH-værdien indstilles på 6,5 ved tilsætning af fortyndet ammoniak, og der krystalliseres 10 endnu engang ved tilsætning af magnesiumsulfat og ammoniumsulfat, hvorved der fås en krystalmasse, og (c) glucose og fructose samt vand sættes til krystalmassen, der opløses, hvorved der fås et stabilt koncentrat af glucoseisomerase.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI842549 | 1984-06-25 | ||
| FI842549A FI842549A (fi) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Stabilt glukosisomeraskoncentrat och foerfarande foer dess framstaellning. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK285785D0 DK285785D0 (da) | 1985-06-24 |
| DK285785A DK285785A (da) | 1985-12-26 |
| DK169443B1 true DK169443B1 (da) | 1994-10-31 |
Family
ID=8519294
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK8502857D DK8502857A (da) | 1984-06-25 | ||
| DK285785A DK169443B1 (da) | 1984-06-25 | 1985-06-24 | Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| DK076994A DK169587B1 (da) | 1984-06-25 | 1994-06-28 | Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK8502857D DK8502857A (da) | 1984-06-25 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK076994A DK169587B1 (da) | 1984-06-25 | 1994-06-28 | Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699882A (da) |
| EP (1) | EP0166427B1 (da) |
| JP (2) | JP2515283B2 (da) |
| AT (1) | ATE76098T1 (da) |
| AU (1) | AU585866B2 (da) |
| CA (1) | CA1263093A (da) |
| DE (1) | DE3586017D1 (da) |
| DK (3) | DK169443B1 (da) |
| FI (1) | FI842549A (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3343421A (en) * | 1965-01-15 | 1967-09-26 | Norvel L Miller | Method and apparatus for extracting soil gas samples |
| US3447360A (en) * | 1965-07-26 | 1969-06-03 | Independent Exploration Co Of | Method of and apparatus for exploring for deposits of helium and detection of helium in gaseous mixtures |
| US4020697A (en) * | 1975-11-10 | 1977-05-03 | Jander Berthold R | Gas sampling probe |
| FI85285C (fi) * | 1988-05-13 | 1992-03-25 | Stabra Ag | Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. |
| GB8826429D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Univ Leeds Ind Service Ltd | Enzyme stabilisation systems |
| US5120650A (en) * | 1989-10-13 | 1992-06-09 | Stabra Ag | Method for producing crystalline glucose isomerase |
| JPH05502584A (ja) * | 1989-12-21 | 1993-05-13 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵素含有調製品及び該調製品を含有する洗剤 |
| ATE96167T1 (de) * | 1989-12-21 | 1993-11-15 | Novo Nordisk As | Verfahren zur kristallisation von enzymen. |
| GB9006642D0 (en) * | 1990-03-24 | 1990-05-23 | Gibson Timothy D | Enzyme stabilisation |
| US5801022A (en) * | 1990-08-03 | 1998-09-01 | Vertex Pharmaceuticals, Incorporated | Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin |
| US5618710A (en) * | 1990-08-03 | 1997-04-08 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Crosslinked enzyme crystals |
| GB9508691D0 (en) * | 1995-04-28 | 1995-06-14 | Pafra Ltd | Stable compositions |
| ATE268817T1 (de) * | 1995-07-28 | 2004-06-15 | Basf Ag | Salz-stabilisierte enzymzubereitung |
| US5889217A (en) * | 1996-05-13 | 1999-03-30 | Rossabi; Joseph | Process and apparatus for obtaining samples of liquid and gas from soil |
| EP3318271A1 (en) * | 2005-11-16 | 2018-05-09 | Pro Natura Gesellschaft für Gesunde Ernährung mbH | Agent for use in the case of fructose intolerance |
| DK1951885T3 (da) * | 2005-11-22 | 2021-06-07 | Danisco Us Inc | Fructooligosaccharidfremstilling in situ og saccharosereduktion |
| JP2009519900A (ja) * | 2005-11-23 | 2009-05-21 | プロ・ナトゥーラ・ゲゼルシャフト・ヒューア・ゲズンデ・エルネールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 特に、脂肪過多症（肥満）の症例での使用のための、食物の有効カロリー量を減少させるための、および治療的体重減少のための薬剤 |
| US20090214620A1 (en) * | 2005-11-23 | 2009-08-27 | Pro Natura Gesellschaft Fuer Gesunde Ernaehrung Mb | Agent for use in the case of disorders of blood sugar metabolism, including diabetes |
| PL2340035T3 (pl) * | 2008-09-04 | 2015-02-27 | Stada Arzneimittel Ag | Leczenie upośledzenia wchłaniania fruktozy |
| GB201409451D0 (en) | 2014-05-28 | 2014-07-09 | Ipabc Ltd | Antimicrobial preparations, methods for preparing the same and uses thereof to combat microorganisms |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2773002A (en) * | 1955-03-31 | 1956-12-04 | Nat Dairy Res Lab Inc | Purification of lactase enzyme and spray-drying with sucrose |
| US3133001A (en) * | 1959-11-26 | 1964-05-12 | Muset Pedro Puig | Stabilization of enzymes |
| US3242056A (en) * | 1962-06-08 | 1966-03-22 | Lysofrance Soc | Thermally stable lysozyme composition and process for preparing same |
| GB1076750A (en) * | 1964-09-16 | 1967-07-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Enzyme preparations in liquid form |
| DE1517787A1 (de) * | 1965-12-06 | 1970-01-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US3413198A (en) * | 1966-06-30 | 1968-11-26 | Calbiochem | Reagents and method for assaying biological samples |
| US3666627A (en) * | 1968-10-14 | 1972-05-30 | Corning Glass Works | Method of stabilizing enzymes |
| US3637640A (en) * | 1970-05-04 | 1972-01-25 | Diagnostic Data Inc | Orgotein stabilized with saccharide process and products |
| CA1004614A (en) * | 1970-07-06 | 1977-02-01 | Standard Brands Incorporated | Recovery of glucose isomerase by membrane filtration |
| DE2038103A1 (de) * | 1970-07-31 | 1972-02-10 | Henkel & Cie Gmbh | Waessrige Reinigungsmittelkonzentrate mit einem Gehalt an stabilisierten Enzymen |
| GB1389147A (en) * | 1972-11-24 | 1975-04-03 | Pfizer | Milk coagulant compositions and preparation thereof |
| JPS5290687A (en) * | 1976-01-27 | 1977-07-30 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Highly active glucoseisomerase concentrate having high storage stabili ty |
| FR2344567A1 (fr) * | 1976-03-17 | 1977-10-14 | Mitsubishi Chem Ind | Procede de preservation de glucose-isomerase et solution de glucose-isomerase |
| US4077842A (en) * | 1976-03-19 | 1978-03-07 | Cory Robert Paul | Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate |
| NL7610608A (nl) * | 1976-09-24 | 1978-03-29 | Akzo Nv | Werkwijze voor het stabiliseren van peroxidase- -bevattende composities. |
| US4152211A (en) * | 1977-08-23 | 1979-05-01 | Novo Industri A/S | Iron containing cell mass glucose isomerase preparation |
| US4237231A (en) * | 1979-11-13 | 1980-12-02 | Uop Inc. | Method of purifying glucose isomerase and a composition for storing same |
| JPS5836954B2 (ja) * | 1980-03-31 | 1983-08-12 | 栄研化学株式会社 | 酵素の安定化剤 |
| GB2090599B (en) * | 1981-01-05 | 1984-06-13 | Novo Industri As | Stabilized plasmin compositions and method for preparation thereof |
| JPS589688A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-01-20 | Toyobo Co Ltd | 安定な酵素組成物 |
| US4618584A (en) * | 1984-12-20 | 1986-10-21 | Nabisco Brands, Inc. | Ultrafiltration purification of glucose isomerase |
-
0
- DK DK8502857D patent/DK8502857A/da unknown
-
1984
- 1984-06-25 FI FI842549A patent/FI842549A/fi not_active Application Discontinuation
-
1985
- 1985-06-21 AU AU43959/85A patent/AU585866B2/en not_active Ceased
- 1985-06-24 CA CA000484998A patent/CA1263093A/en not_active Expired
- 1985-06-24 DK DK285785A patent/DK169443B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-25 JP JP60140085A patent/JP2515283B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 DE DE8585107850T patent/DE3586017D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 AT AT85107850T patent/ATE76098T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-25 EP EP85107850A patent/EP0166427B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 US US06/749,684 patent/US4699882A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-06-28 DK DK076994A patent/DK169587B1/da active
- 1994-10-04 JP JP6240019A patent/JP2522908B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK285785D0 (da) | 1985-06-24 |
| CA1263093C (en) | 1989-11-21 |
| ATE76098T1 (de) | 1992-05-15 |
| AU4395985A (en) | 1986-01-02 |
| FI842549A (fi) | 1985-12-26 |
| DE3586017D1 (de) | 1992-06-17 |
| JPS6115686A (ja) | 1986-01-23 |
| US4699882A (en) | 1987-10-13 |
| DK8502857A (da) | 1985-12-26 |
| EP0166427A3 (en) | 1987-02-04 |
| DK169587B1 (da) | 1994-12-12 |
| DK76994A (da) | 1994-06-28 |
| AU585866B2 (en) | 1989-06-29 |
| DK285785A (da) | 1985-12-26 |
| EP0166427A2 (en) | 1986-01-02 |
| CA1263093A (en) | 1989-11-21 |
| FI842549A0 (fi) | 1984-06-25 |
| JPH07147980A (ja) | 1995-06-13 |
| EP0166427B1 (en) | 1992-05-13 |
| JP2522908B2 (ja) | 1996-08-07 |
| JP2515283B2 (ja) | 1996-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK169443B1 (da) | Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf | |
| SU1630617A3 (ru) | Способ получени фруктозилдисахаридов | |
| SU1635905A3 (ru) | Способ получени сукралозы | |
| DK150309B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose | |
| US5811280A (en) | Cross-linked glucose isomerase | |
| KR101981388B1 (ko) | D-사이코스 결정을 제조하는 방법 | |
| SU1024014A3 (ru) | Способ получени ферментного препарата глюкоизомеразы | |
| US5041377A (en) | Subtilisin crystallization process | |
| DK150310B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose | |
| US6479657B1 (en) | Crystalline 1-kestose and process for preparing the same | |
| FI78117B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt glukosisomeraskoncentrat. | |
| US2567000A (en) | Production of dextrose | |
| US3689362A (en) | Enzymatic method for manufacture of fructose | |
| KR940000634B1 (ko) | 글루코오스 아이소머라아제 농축물 및 이의 제조방법 | |
| EP0404817B1 (en) | Subtilisin crystallization process | |
| US3047471A (en) | Method of refining amyloglucosidase | |
| NO753005L (da) | ||
| NO137598B (no) | Fremgangsm}te til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase | |
| KR20170005502A (ko) | D-사이코스 결정을 제조하는 방법 | |
| SU1125248A1 (ru) | Способ получени препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы | |
| JPH10248560A (ja) | 固定化酵素及びトレハロースの製造方法 | |
| JPH04117297A (ja) | 転化糖の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |