DK169587B1 - Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase - Google Patents
Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase Download PDFInfo
- Publication number
- DK169587B1 DK169587B1 DK076994A DK76994A DK169587B1 DK 169587 B1 DK169587 B1 DK 169587B1 DK 076994 A DK076994 A DK 076994A DK 76994 A DK76994 A DK 76994A DK 169587 B1 DK169587 B1 DK 169587B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glucose isomerase
- isomerase
- solution
- glucose
- enzyme
- Prior art date
Links
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 42
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 34
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 33
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 10
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 abstract description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 47
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 35
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 35
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 29
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 10
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 10
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 8
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 241000187417 Streptomyces rubiginosus Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGLUPDDGTQHFKU-UHFFFAOYSA-M [NH4+].S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mg+] Chemical compound [NH4+].S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mg+] UGLUPDDGTQHFKU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L disodium maleate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[K+].OP([O-])([O-])=O ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
i DK 169587 B1
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen er angivet i krav 2-6.
Anvendelse af glucoseisomerase til isomerisering af glucose til fructose er en kendt industriel metode, ved hvilken enzymet ofte anvendes i immobiliseret form. Ved mange af de kommercielle metoder, som er i anvendelse, frem-10 stilles det immobiliserede enzympræparat ved en separat proces, ved hvilken enten enzymet immobiliseres på bæreren ved hjælp af adsorptionsteknik, eller hele den mikrobielle cellemasse med enzymet immobiliseres, således at der fås en matrix. Reaktorkolonnen fyldes med færdigt, immobiliseret 15 enzym. Når enzymet er opbrugt, tømmes kolonnen og fyldes igen med frisk, immobiliseret enzympræparat.
Det er kendt, at et renset enzym adsorberes langt bedre på en bærer end et ikke-renset råpræparat (US patentskrift nr. 4.347.322). Problemet har været at fremstille et 20 sådant stabilt, let håndterligt enzympræparat, der er let at opbevare, og som kan anvendes til immobilisering af enzymet på bæreren i en kolonne.
Et bundfald eller en krystalmasse, der fås ved glu-coseisomeraserensningsprocesser, der er baseret på fæld-25 ning eller krystallisation, indeholder mindst 60 vægt% vand, der ikke kan fjernes uden at ødelægge enzymstrukturen. Krystalmassen er i sig selv ikke mikrobiologisk stabil, og den er vanskelig at håndtere og dosere. En alternativ metode er at opløse krystalmassen til en opløsning, hvis koncentration 30 fortrinsvis skal være så høj som mulig med henblik på opbevaring, stabilitet og transport. En nærliggende metode ville være at opløse enzymkrystallerne i vand eller i en fortyndet saltopløsning. Det har imidlertid vist sig i praksis, at det på grund af glucoseisomerases forholdsvis ringe 35 opløselighed ikke er muligt at fremstille en tilstrækkelig koncentreret opløsning af isomerasen ved at opløse krystaller DK 169587 B1 2 i vand. Den fortyndede vandige isomeraseopløsning er yderst ustabil og mister sin aktivitet på grund af mikrobiologisk og kemisk forringelse i løbet af få dage.
Det har også været foreslået, at enzymet kunne opløses 5 i et organisk opløsningsmiddel (US patentskrift nr.
4.077.842). Det er imidlertid ikke tilrådeligt at anvende organiske opløsningsmidler i en fremgangsmåde til fødevarefremstilling, og derfor er denne teknik kun dårlig egnet til et enzym, der anvendes direkte til fremstilling af næ-10 ringsmidler. Hvis derimod enzymet ikke skulle anvendes til fødevarer, kunne de stoftyper, der kunne anvendes til opløsning, udvides.
Der findes en righoldig litteratur vedrørende fremstilling, rensning og anvendelse af glucoseisomerase, fordi 15 glucoseisomerase er et af de vigtigste enzymer, der anvendes for øjeblikket. Imidlertid er alle de kendte rensningsprocesser ret komplicerede og giver som regel temmelig lave udbytter.
Rensning af enzymer og proteiner ved hjælp af krystal-20 lisation er i og for sig kendt, og f.eks. i håndbogen Enzymes (M. Dixon og E.,C. Webb, Enzymes, 3. udg., Longman Group Ltd., Bungay 1979, side 1116) vises 192 fotografier af enzymkrystaller. Det er desuden kendt, at ammoniumsulfat i mange tilfælde er egnet som middel til at fremkalde krystal-25 lisation, og det nedsætter opløseligheden. Desuden kan ammoniumsul fatkrystall isat ion ofte udføres ved hjælp af et andet salt eller organisk opløsningsmiddel, såsom acetone eller alkohol. Inden for dette område af kemien medgives det i reglen, at det aldrig er indlysende, at et bestemt 30 enzym eller et andet protein eventuelt kan krystalliseres ved hjælp af et eller andet, i og for sig kendt, fældningsmiddel. Der kendes talrige proteiner og enzymer, som indtil nu ikke har kunnet krystalliseres, selv om rensningsprocesser inden for biokemien har undergået en voldsom udvikling.
35 Læren om enzymkrystallisation (som faktisk måske snarere er en kunst) er således yderst empirisk, og blot fordi visse DK 169587 B1 3 metoder har vist sig at være resultatrige til krystallisering af ét enzym, betyder det ikke, at de samme metoder kan anvendes i bred almindelighed til krystallisation af andre enzymer.
5 Anvendelsen af fraktioneret sulfatfældning (ammonium- og/eller magnesiumsulfat) som rensningsmetode til glucose-isomerase eller som en del af en sådan fremgangsmåde er kendt fra flere publikationer [US patentskrifterne nr. 4.237.231 og 4.077.842, Agr. Biol. Chem. 45, 619-627 (1981), 10 id. 28., 1123-1128 (1965), id. 34, 1795-1804 (1970), id. 29, 1129-1134 (1965), og Biochem. Biophys. Acta. 151. 670-680 (1968)].
De sulfatkoncentrationer, der anvendes ved disse rensningsmetoder til isomeraser, har været forholdsvis høje.
15 Således fældes ved fremgangsmåden ifølge US patentskrift nr. 4.237.231 først de unødvendige proteiner ud fra isomera-seopløsningen ved en mætningsgrad på 40% ammoniumsulfat, og derpå fældes isomerasen selv ved en højere mætningsgrad (op til 60%).
20 Når der anvendes høje ammoniumsulfatkoncentrationer til fraktioneret fældning, udfældes der altid sammen med isomerasen en overflod af andre proteiner, og jo højere ammoniumsulfatkoncentration der anvendes, jo flere yderligere proteiner vil der udfældes, medmindre isomerasen allerede 25 er blevet renset på en eller anden måde ved hjælp af en anden metode.
Ved rensningsprocesser baseret på fraktioneret fældning er resultatet i reglen et amorft bundfald, som er meget vanskeligt eller direkte umuligt at fraskille fra modervæsken 30 i godt udbytte ved hjælp af centrifuger eller separatorer beregnet til industriel brug.
Det amorfe bundfald er som regel en blandet udfældning, som foruden isomerasen også indeholder andre proteiner, især hvis råmaterialet er en mikrobiel cellevæske, som ikke 35 er blevet renset i forvejen. Et sådant amorft bundfald er vanskeligt at adskille fra modervæsken, og udfældningen giver DK 169587 B1 4 ikke den ønskede rensningsvirkning for isomerasens vedkommende.
Krystallisation af glucoseisomeraser ved hjælp af ammoniumsulfat, andre salte eller organiske opløsningsmidler 5 er beskrevet i flere publikationer [Biochem. Biophys. Acta 151. 670-680 (1968), Agr. Biol. Chem. 34/ 1795-1804 (1970), id. 45, 619-637 (1981), og id. 33, 1527-1534 (1969)]. Karakteristiske træk ved de i disse publikationer beskrevne krystallisationsmetoder er lavt udbytte, meget lang krystalli-10 sationstid eller forholdsvis stort forbrug af kemikalier. I alle disse tilfælde har formålet været at fremstille en lille mængde ren isomerase til grundforskningsformål. Iso-merasen er således først blevet renset ved hjælp af en eller anden metode (ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel, 15 DEAE-"Sephadex®,,-søjlechromatografi, ammoniumsulfatfældning, dialyse), hvorefter der er udført krystallisation af den rensede isomerase ud fra ren vandopløsning med ammoniumsulfat, phosphatpuffer eller acetone.
Ingen af de i ovennævnte publikationer beskrevne 20 metoder har været anvendt i industriel målestok på grund af deres ringe økonomi.
Et stabilt glucoseisomerasekoncentrat indeholder glucoseisomerase opløst i en koncentreret vandig opløsning indeholdende sukker eller sukkeralkohol.
25 Det har vist sig, at dette koncentrat er både kemisk og mikrobiologisk stabilt og er særlig anvendeligt til fremgangsmåder, ved hvilke glucoseisomerasen immobiliseres på et bærermateriale. Egnede sukkerarter og sukkeralkoholer er alle sådanne forbindelser, der er let opløselige i vand.
30 Sukkerforbindelser, glycerol, polypropylen eller ethylengly-col er også egnede. Særligt egnede er sukkerforbindelser, som anvendes som næringsmidler i sig selv, samt sukkeralkoholer, der er tilladte fødevareadditiver. Eftersom isomerise-ringsslutproduktet er en glucose-fructose-sirup, er blandin-35 gen af disse sukkerforbindelser, dvs. invertsukker, yderst egnet til formålet.
DK 169587 Bl 5
Det samlede tørstofindhold i koncentratet bør være et sådant, at det i sig selv er mikrobiologisk stabilt, dvs. tørstofindholdet bør være fra ca. 60 til ca. 70 vægt% (dvs. vandets aktivitet skal være tilstrækkelig lav).
5 Glucoseisomerasekoncentratet indeholder 5-20 vægt% glucoseisomerase, fortrinsvis 5-15 vægt% glucoseisomerase, 30-60 vægt% af en i vand opløselig sukker eller sukkeralkohol, såsom glucose, maltose, fructose, saccharose, sorbitol, xylitol eller en blanding heraf, f.eks. invertsukker, 10 glucosesirup eller isomeriseret glucosesirup, ikke over 15 vægt% af et egnet salt, såsom ammonium- og/eller magnesiumsulfat, og/eller en puffer (pH-værdi 5,0-8,0), f.eks. natri-um-kalium-phosphatpuffer, carbonatpuffer eller en puffer fremstillet af et organisk salt (f.eks. et salt af en amino- 15 syre) eller en blanding af puffere, og resten vand.
Koncentratets pH-værdi er 5,0-8,0, og enzymaktiviteten er 500-10.000 GlU/g koncentrat, pH-værdien fortrinsvis 6,0- 8,0 og enzymaktiviteten fortrinsvis 2000-5000 GlU/g koncentration (GIU = glucoseisomeraseenheder).
20 I det følgende er anført nogle eksempler på egende enzymkoncentrater af den nævnte art: 1. 50 vægt% glycerol, 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 25 5 vægt% ammoniumsulfat.
2. 50 vægt% invertsukker, 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 30 1 vægt% puffer (Na-K-phosphat), 4 vægt% ammoniumsulfat.
3. 50 vægt% sorbitol, 40 vægt% vand, 35 10 vægt% enzym.
DK 169587 B1 6 4. 50 vægt% saccharose, 30 vægt% vand, 15 vægt% enzym, 5 vægt% puffer (natriumphosphat).
5
Sammensætningen af koncentratet kan imidlertid varieres efter behov, idet der drages omsorg for, at den samlede koncentration er tilstrækkelig høj, men at opløsningen alligevel i flydende form er let at håndtere.
10 Glucoseisomerasekoncentrater af den her omhandlede art er rene, stabile og lette at håndtere og dosere. Enzymaktiviteten kan justeres. Alt efter anvendelsen ligger et passende aktivitetsinterval fra 2000 til 10.000 GlU/g præparat.
15 Sukkerforbindelserne, sukkeralkoholerne og saltene, der skal anvendes, er fortrinsvis af fødevarekvalitet (f.eks. Food Chemicals Codes-standard). Enzymet skal renses passende ved krystallisation eller ved hjælp af en anden metode.
Et egnet bærermateriale til adsorption af glucoseiso-20 merase er et materiale med ionbytterkapacitet, f.eks. glasperler, ionbytterharpiks eller en bærer baseret på siliciumoxid. Særlig egnede er diethylaminoethyl-(DEAE) -derivater, som vides at adsorbere proteiner, såsom DEAE-cellulose og DEAE-dextran. Der er beskrevet et stort antal bærermaterialer 25 i litteraturen.
Når der anvendes DEAE-cellulose som bærer, er det let at opnå en aktivitet på over 1000 IGIU/g immobiliseret enzym. (IGIU = immobiliseret glucoseisomeraseaktivitet).
En fremgangsmåde til fremstilling af det ovenfor 30 beskrevne stabile glucoseisomerasekoncentrat udføres som følger: (a) tilsætning af et egnet salt til en delvis renset glucoseisomeraseopløsning, der er opnået ved fermentering, så at glucose-isomerasen krystalliseres, 35 (b) afkøling af opløsningen for at fremme glucose- isomerasens krystallisation og fraskillelse af den dannede DK 169587 B1 7 krystalmasse og derefter, eventuelt en eller flere omkry-stallisationer, og (c) tilsætning af en sukker eller en sukkeralkohol eller en koncentreret vandig opløsning deraf til den frem-5 stillede krystalmasse, som opløses, hvorved der fås et stabilt glucoseisomerasekoncentrat.
Ifølge den foreliggende opfindelse kan glucoseisome-rase-enzymet renses yderst effektivt ved at krystallisere det ud fra en saltopløsning. Egnede salte er alle sådanne 10 ikke-toksiske salte, der ikke inaktiverer enzymet. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes ammonium- og/eller magnesiumsulfat.
Fældning af glucoseisomerase ved hjælp af et salt er i og for sig en gængs metode, der er beskrevet i f.eks.
15 Agr. Biol. Chem. 29, 1129-1134 (1965) (Isumre og Sato). Imidlertid har der ikke tidligere været beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken dannelsen af krystaller finder sted. Ved ovennævnte kendte fremgangsmåde dannes et amorft bundfald.
Afhængigt af betingelserne kan der fås enten et amorft 20 bundfald eller et krystallinsk bundfald ud fra isomerasen ved anvendelse af det samme kemiske ammoniumsulfat eller magnesiumsulfat. Det er almindelig kendt, at talrige enzymer opfører sig på samme måde.
Et karakteristisk og overraskende træk ved fremgangs-25 måden er, at glucoseisomerasen udfældes som et krystallinsk stof og før alle andre stoffer, der eventuelt udfældes. Ved fremgangsmåden anvendes nøje udvalgte betingelser og en så lav ammoniumsulfatkoncentration, at ingen andre stoffer udfældes fra opløsningen. I denne henseende afviger frem-30 gangsmåden væsentligt fra det, der er beskrevet i litteraturen på dette område. Tidligere blev glucoseisomerase ikke krystalliseret direkte og alene som eneste fældningskomponent fra en cellevæske eller et cellevæskekoncentrat fra en produktionsmikrobe. Fremgangsmåden giver også et meget højt 35 udbytte, der afviger væsentligt fra det, der tidligere har været anført i litteraturen.
DK 169587 B1 8
Det er almindelig kendt, at enzympræparaters opbevaringskvalitet og -stabilitet kan forøges, f.eks. ved hjælp af glycerol, polyalkoholer og sukkerforbindelser. Sådanne enzympræparater fremstilles i reglen ved at tilsætte det 5 nævnte stof til en koncentreret enzymopløsning.
Det har overraskende vist sig, at når der blandes vandfri polyalkohol eller sukker (fortrinsvis glucose) i en koncentreret isomerase-krystalsuspension eller i en fast krystalmasse med den højest mulige aktivitet på ca. 10.000 10 GlU/g, opløses isomerasekrystallerne, og der fremstilles en ægte klar opløsning. En sådan opløsning er stabil, når dens vandkoncentration er tilstrækkelig lav, og når dens isomera-seaktivitet er tilstrækkelig høj. Opløsningen kan indeholde salte afledt ud fra krystallisationsmetoden eller salte, 15 som er blevet tilsat bagefter, og som i sig selv har en virkning, der forøger den mikrobiologiske stabilitet. Poly-alkoholen eller sukkeret har imidlertid en væsentlig betydning med hensyn til opløsningen af isomerasekrystallerne, for at der kan opnås en så høj isomeraseaktivitet i opløsnin-20 gen som muligt.
I den kendte teknik findes der ingen eksempler på isomerase-opløsninger med en enzymatisk aktivitet, der er så høj som det ovenfor beskrevne glucoseisomerasekoncentrats, og der er heller ikke beskrevet fremgangsmåder til fremstil-25 ling af sådanne opløsninger.
Fremstillingen af glucoseisomerasekoncentratet foretages fortrinsvis på følgende måde hvoraf trin b) - g) illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen: (a) Der fremstilles en cellevæske ud fra organismen 30 Streptomyces rubiginosus ved hjælp af lyse (USA patentskrift nr. 4.410.627) og ud fra cellevæsken fremstilles ved ultrafiltrering et koncentrat indeholdende isomerase som råmateriale til krystallisationsprocessen,· en foretrukket isome-rasekoncentration i koncentratet er 200-800 GlU/g.
35 (b) Isomeraseopløsningens pH-værdi justeres til inter vallet 5,7-8,0, fortrinsvis 7,0.
DK 169587 B1 9 (c) Opløsningen afkøles til ca. 16°C eller derunder.
(d) Der sættes ammonium- og/eller magnesiumsulfat til opløsningen i en koncentration fra ca. 50-170 g pr. liter opløsning. Den mængde sulfat, der skal tilsættes, 5 afhænger af den oprindelige isomerasekoncentration og af krystallisationens sluttemperatur. Den mest foretrukne mængde sulfat, der tilsættes, er sådan en mængde, ved hvilken kun isomerasen krystalliseres, medens de øvrige proteiner endnu ikke begynder at udfældes.
10 (e) Tilsætningen af sulfaterne sker fortrinsvis grad vis, således at tilsætningen af hele mængden varer 2-4 timer, selv om der også kan opnås et acceptabelt resultat ved at tilsætte hele mængden på én gang, men i så tilfælde forbliver størrelsen af isomerasekrystallerne ugunstigt lille.
15 (f) Opløsningen afkøles fortrinsvis i flere timer, fortrinsvis til nær den pågældende blandings frysepunkt, hvilket ved de lavest afprøvede sulfatkoncentrationer er ca. -2°C og ved de højeste -6°C. Afkølingen kan påbegyndes, enten samtidig med at sulfattilsætningen påbegyndes, eller 20 først når sulfattilsætningen er afsluttet; ved hjælp af gradvis afkøling opnås en afkøling-krystallisationsvirkning, som forøger størrelsen af isomerasekrystallerne på en gunstig måde, og desuden har køling en opløselighedssænkende virkning, hvilket igen forøger udbyttet.
25 (g) Isomerasekrystallerne fraskilles fra opløsningen, ved at de får lov at bundfælde sig på bunden af beholderen, ved at de frafiltreres, eller i stor skala bedst ved at de fracentrifugeres ved hjælp af en kontinuerlig separator.
(h) Den fraskilte krystalmasse opløses ved, at der 30 tilsættes et tørt carbonhydrat eller en koncentreret vandig opløsning heraf, hvorved isomerasekrystallerne opløses, og der fås et stabilt glucoseisomerasekoncentrat.
Om ønsket kan krystallisationen gentages, og i så fald bør krystalmassen opløses efter fraskillelsen (trin 35 (g)) i en rigelig mængde vand ved en forholdsvis høj tempera tur (20-30°C). I denne forbindelse er en passende vandmængde DK 169587 B1 10 en sådan, at opløsningens isomeraseaktivitet er 500-2000 GIU/ml, med andre ord, vægten af den vandmængde, der bruges, er i reglen 4-10 gange krystalmassens vægt.
Som udtrykket anvendes her, er GIU forkortelsen for 5 glucoseisomeraseenhed og er den mængde enzym, der omdanner 1 μιηοΐ glucose til fructose pr. minut i en opløsning, der til at begynde med indeholder 2 mol glucose pr. liter, 0,02 mol MgS04 og 0,001 mol CoCl2 pr. liter ved pH-værdien 6,84- 6,85 (0,2 molært natriummaleat) målt ved omgivelsernes tem-10 peratur og ved en temperatur på 60°C. Glucoseisomerasemålin-geme er udført ved hjælp af den metode, der er beskrevet af N.E. Lloyd m.fl. i Cereal Chem. 49, nr. 5, side 544-553 (1972).
Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst 15 ved hjælp af eksempler.
Eksempel 1
Et bad på ca. 40 m3 af mikroorganismen Streptomyces rubiginosus fermenteres som beskrevet i US patentskrift nr.
20 4.410.627. Cellemassen lyseres på kendt måde (samme referen ce) . Celleresterne og andet tørstof fjernes ved filtrering ved hjælp af et gængs tromlefilter med kiseljord, hvorved der fås 32 tons isomeraseholdigt filtrat. Dette filtrat filtreres ved hjælp af et "PCI"-ultrafilter (Patterson-Candy, 25 Inc.), hvorved der fås 3000 kg isomeraseholdigt koncentrat, hvis aktivitet er 960.000.000 GIU. Permeatet, der har passeret ultrafiltreringsmembranen, fjernes.
Der sættes 120 kg magnesiumsulfat og 300 kg ammoniumsulfat ((MgS04)7H20 og (NH4)2S04, fødevarekvalitet) til 30 koncentratet. Blandingen afkøles til 10*C for at fremme krystallisation. De dannede krystaller skilles fra ved dekantering, og krystallisationen gentages ved at tilsætte 411 kg ammoniumsulfat. Krystallerne fraskilles atter ved dekantering. Krystalmassen opløses ved tilsætning af 402 kg vand, 35 og opløsningens pH-værdi justeres ved hjælp af en 1 molær ammoniakopløsning til 6,5. Opløsningen filtreres med et DK 169587 B1 11 pladefilter, og krystallisationen gentages endnu en gang ved hjælp af 16 kg magnesiumsulfat og 40 kg ammoniumsulfat.
Der fås et udbytte på 90 kg krystalmasse, hvoraf 29 kg er enzym, 3,7 kg salte (MgSC>4, (NH3)2S04) og resten vand.
5 Til krystalmassen sættes 45 kg glucose og 45 kg fructose samt 20 kg invertsukker med et tørstofindhold på 70 vægt%.
På denne måde fås 200 kg af et enzympræparat, hvis sammensætning er følgende: 29.2 vægt% vand, 10 52,0 vægt% sukkerforbindelser, 14,5 vægt% glucoseisomerase, 4,3 vægt% salte (magnesium-ammoniumsulfat). Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 4500
GlU/g.
15
Eksempel 2
Der fremstilles et ultrafiltreret fermentat på den i eksempel 1 beskrevne måde. Til 4000 kg ultraf iltreret fermentat sættes 244 kg krystallinsk ammoniumsulfatopløsning, 20 hvori der er opløst 600 kg salt i 900 kg vand. Opløsningen afkøles til 13°C og holdes på denne temperatur i 20 timer.
Den dannede krystalmasse fraskilles ved hjælp af en "West-falia® NA 7"-separator. Krystallerne opløses i vand, og opløsningen filtreres. Filtratetmængden er på 2000 liter.
25 Krystallisationen gentages ved hjælp af 122 kg krystallinsk ammoniumsulfat og ammoniumsulfatopløsning, der indeholder 300 kg ammoniumsulfat opløst i 460 liter vand. Den opnåede krystalmasse fraskilles igen ved hjælp af en separator. Til krystalmassen (525 kg) sættes samme mængde krystallinsk 30 fructose, hvorved massen opløses, og fructosen isomeriseres delvis til glucose. På denne måde fås et stabilt enzymkoncentrat, hvis sammensætning er følgende: 50,0 vægt% sukkerforbindelse (glucose og fructose), 11.2 vægt% enzym, 35 3,5 vægt ammoniumsulfat, 35.3 vægt% vand.
DK 169587 B1 12
Koncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 3000 GIU
pr. g.
5 Eksempel 3
Et ultrafiltreret fermentat fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel l. Til krystallisationen af glucoseisomerasen anvendes 4000 liter ultrafiltreret fermentat med en aktivitet på 2.400.000.000 GIU. Opløsningens pH-10 værdi justeres ved hjælp af en 5%’s NaOH-opløsning til pH
7,0, og opløsningens temperatur justeres til 12°C. Til krystallisationen af glucoseisomerasen sættes 500 kg ammoniumsulfat opløst i 750 liter vand til opløsningen i løbet af to timer med jævn tilledningshastighed. Derpå afkøles opløs-15 ningen til -2°c, og opløsningen omrøres i 24 timer. Glucose-isomerasekrystallerne fraskilles ved hjælp af en "Westfalia® NA-7"-separator. Udbyttet er 390 kg krystalmasse med et tørstofindhold på 23,6 vægt% og en aktivitet på 2.300.000.000 GIU. Der sættes 30 kg natriumchlorid og 180 kg glucose til 20 krystalmassen, og det opnåede enzymkoncentrats pH-værdi justeres ved hjælp af en 5%'s NaOH-opløsning til 7,0. Under disse omstændigheder isomeriseres glucosen delvis. Herved fås 600 kg stabilt enzymkoncentrat, hvis sammensætning er følgende: 25 49,7 vægt% vand, 30,0 vægt% sukkerforbindelser (glucose/fructose), 12,8 vægt% enzym, 2,5 vægt% ammoniumsulfat, 5,0 vægt% natriumchlorid.
30 Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 3400
GlU/g.
Eksempel 4
Der fremstilles et ultrafiltreret fermentat på den i 35 eksempel 1 beskrevne måde. Til krystallisation af glucoseisomerasen anvendes 4000 liter ultrafiltreret fermentat med en DK 169587 B1 13 aktivitet på 2.400.000.000 GIU. Opløsningens pH-værdi justeres ved hjælp af en 5%'s NaOH-opløsning til pH 7,0. Opløsningens temperatur indstilles på 12°C. Til krystallisation af glucoseisomerasen sættes 500 kg ammoniumsulfat opløst i 750 5 liter vand til opløsningen i løbet af to timer med jævn tilledningshastighed. Derpå afkøles opløsningen til -2°C og omrøres i 24 timer. Glucoseisomerasekrystallerne fraskilles ved dekantering. Udbyttet er 230 kg krystalmasse med et tørstofindhold på 40,0 vægt% og en aktivitet på 2.300.000.000 10 GIU. Til krystalmassen sættes 115 kg glucose og 115 kg fructose samt 50 kg invertsukker med et tørstofindhold på 70%.
På denne måde fås 510 kg enzympræparat, hvis sammensætning er følgende: 30.0 vægt% vand, 15 52,0 vægt% sukkerforbindelser (glucose, fructose), 15.1 vægt% enzym, 2,9 vægt% ammoniumsulfat.
Enzymkoncentratets glucoseisomeraseaktivitet er 4500
GlU/g.
20
Eksempel 5
Der fremstilles et ultrafiltreret isomerasekoncentrat på den i eksempel 1 beskrevne måde. Der sættes 50 g ammonium-sulfat til 0,95 liter af et isomerasekoncentrat med en akti-25 vitet på 600 GIU/ml og en temperatur på 25°C. Der dannes intet bundfald i opløsningen på dette stadium. Opløsningen afkøles i løbet af 16 timer til 0°C og holdes på denne temperatur under svag, konstant omrøring.
Isomerasen begynder at krystallisere i løbet af 2 30 dage, og krystallisationen fortsætter, således at 97,5 vægt% af isomerasen foreligger i krystallinsk form i modervæsen efter 5 dages forløb. Krystallerne skilles fra opløsningen ved hjælp af en laboratoriecentrifuge. Herved udvindes 56 g våd krystalmasse.
35 Ifølge dette eksempel er det muligt at krystallisere isomerasen med en meget lav ammoniumsulfatkoncentration i DK 169587 B1 14 forhold til de typiske mængder, der er kendt fra litteraturen. Samtidig er det et eksempel på ren kølekrystallisation.
På baggrund af dette eksempel er det let at forstå, at isome-rasen, hvis fældningen ved hjælp af ammoniumsulfat udføres 5 hurtigt, og bundfaldet derpå fraskilles straks ved hjælp af en centrifuge, f.eks. i løbet af 15 minutter, hvilket er tilfældet ved fremgangsmåden ifølge US patentskrift nr. 4.237.231, forbliver fuldstændig i opløsningen, når ammonium-sulfatkoncentrationen er lav, og der vil, hvis den udfældes, 10 ikke iagttages krystallisation, og fordelene herved forbliver uudnyttede. En krystalmasse fremstillet ifølge det foreliggende eksempel kan opløses nøjagtig på samme måde som i de andre eksempler.
Koncentrater fremstillet som her beskrevet har vist 15 sig at være stabile over for mikrobiel og kemisk inaktivering i tidsrum på op til 10 måneder.
20 25
Claims (7)
1. Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisome-rase, kendetegnet ved, at (a) pH-værdien af et delvist renset glucoseisomerase-5 præparat justeres til et interval fra 5,7 til 8,0, (b) præparatet afkøles til ca. 16°C eller derunder, (c) ammonium- og/eller magnesiumsulfat tilsættes i en koncentration fra ca. 50 til ca. 170 g pr. liter præparat, og 10 (d) der afkøles til nær frysepunktet for blandingen for at lette krystaldannelsen.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den yderligere omfatter, at krystallerne skilles fra opløsningen.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at krystallisation gentages ved at opløse de fraskilte krystaller i en vandmængde, der er fra ca. 4 til ca. 10 gange vægten af krystalmassen, ved en temperatur på fra ca. 20 til ca. 30°C, og trinnene i krav 1 gentages.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trin (c) udføres gradvis, og der tilsættes ammonium- og/eller magnesiumsulfat i fast og/eller flydende form.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- 25 net ved, at trin (d) udføres sideløbende med trin (c).
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til krystallisation af glucoseisomerase, kendetegnet ved, at glucose-isomerasepræparatet er opnået ud fra lyserede celler efterfulgt af ultrafiltrering, 30 (a) pH-værdien justeres til ca.
7,0, (b) præparatet afkøles til ca. 16"C eller derunder, og (c) ammonium- og/eller magnesiumsulfat tilsættes i en mængde fra ca. 50 til 170 g pr. liter præparat i løbet 35 af ca. 2 til ca. 4 timer, i hvilket tidsrum (d) blandingen afkøles til nær dens frysepunkt for at lette krystaldannelsen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI842549A FI842549A (fi) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Stabilt glukosisomeraskoncentrat och foerfarande foer dess framstaellning. |
| FI842549 | 1984-06-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK76994A DK76994A (da) | 1994-06-28 |
| DK169587B1 true DK169587B1 (da) | 1994-12-12 |
Family
ID=8519294
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK8502857D DK8502857A (da) | 1984-06-25 | ||
| DK285785A DK169443B1 (da) | 1984-06-25 | 1985-06-24 | Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| DK076994A DK169587B1 (da) | 1984-06-25 | 1994-06-28 | Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK8502857D DK8502857A (da) | 1984-06-25 | ||
| DK285785A DK169443B1 (da) | 1984-06-25 | 1985-06-24 | Stabilt glucoseisomerasekoncentrat og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699882A (da) |
| EP (1) | EP0166427B1 (da) |
| JP (2) | JP2515283B2 (da) |
| AT (1) | ATE76098T1 (da) |
| AU (1) | AU585866B2 (da) |
| CA (1) | CA1263093C (da) |
| DE (1) | DE3586017D1 (da) |
| DK (3) | DK169443B1 (da) |
| FI (1) | FI842549A (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3343421A (en) * | 1965-01-15 | 1967-09-26 | Norvel L Miller | Method and apparatus for extracting soil gas samples |
| US3447360A (en) * | 1965-07-26 | 1969-06-03 | Independent Exploration Co Of | Method of and apparatus for exploring for deposits of helium and detection of helium in gaseous mixtures |
| US4020697A (en) * | 1975-11-10 | 1977-05-03 | Jander Berthold R | Gas sampling probe |
| FI85285C (fi) * | 1988-05-13 | 1992-03-25 | Stabra Ag | Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. |
| GB8826429D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Univ Leeds Ind Service Ltd | Enzyme stabilisation systems |
| US5120650A (en) * | 1989-10-13 | 1992-06-09 | Stabra Ag | Method for producing crystalline glucose isomerase |
| ES2060360T3 (es) * | 1989-12-21 | 1994-11-16 | Novo Nordisk As | Metodo para la cristalizacion de enzimas. |
| EP0506791B1 (en) * | 1989-12-21 | 1993-09-08 | Novo Nordisk A/S | Enzyme containing preparation and detergent containing such preparation |
| GB9006642D0 (en) * | 1990-03-24 | 1990-05-23 | Gibson Timothy D | Enzyme stabilisation |
| US5801022A (en) * | 1990-08-03 | 1998-09-01 | Vertex Pharmaceuticals, Incorporated | Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin |
| US5618710A (en) * | 1990-08-03 | 1997-04-08 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Crosslinked enzyme crystals |
| GB9508691D0 (en) | 1995-04-28 | 1995-06-14 | Pafra Ltd | Stable compositions |
| MX9702146A (es) * | 1995-07-28 | 1997-06-28 | Gist Brocades Bv | Preparaciones de enzimas estabilizadas con sal. |
| US5889217A (en) * | 1996-05-13 | 1999-03-30 | Rossabi; Joseph | Process and apparatus for obtaining samples of liquid and gas from soil |
| US20090081300A1 (en) * | 2005-11-16 | 2009-03-26 | Pro Natura Gesellschaft Fuer Gesunde Ernaehrung Mb | Agent for use in the case of fructose intolerance |
| NZ567814A (en) * | 2005-11-22 | 2011-03-31 | Genencor Int | In situ fructooligosaccharide production and sucrose reduction |
| AU2006316815A1 (en) * | 2005-11-23 | 2007-05-31 | Pro Natura Gesellschaft Fur Gesunde Ernahrung Mbh | Agent for reducing the useable calorie content of food and for therapeutic reduction of weight, in particular for use in the case of adiposity (obesity) |
| US20090214620A1 (en) * | 2005-11-23 | 2009-08-27 | Pro Natura Gesellschaft Fuer Gesunde Ernaehrung Mb | Agent for use in the case of disorders of blood sugar metabolism, including diabetes |
| PT2340035E (pt) * | 2008-09-04 | 2014-10-20 | Sciotec Diagnostic Technologies Gmbh | Tratamento da malabsorção de frutose |
| GB201409451D0 (en) | 2014-05-28 | 2014-07-09 | Ipabc Ltd | Antimicrobial preparations, methods for preparing the same and uses thereof to combat microorganisms |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2773002A (en) * | 1955-03-31 | 1956-12-04 | Nat Dairy Res Lab Inc | Purification of lactase enzyme and spray-drying with sucrose |
| US3133001A (en) * | 1959-11-26 | 1964-05-12 | Muset Pedro Puig | Stabilization of enzymes |
| US3242056A (en) * | 1962-06-08 | 1966-03-22 | Lysofrance Soc | Thermally stable lysozyme composition and process for preparing same |
| GB1076750A (en) * | 1964-09-16 | 1967-07-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Enzyme preparations in liquid form |
| DE1517787A1 (de) * | 1965-12-06 | 1970-01-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US3413198A (en) * | 1966-06-30 | 1968-11-26 | Calbiochem | Reagents and method for assaying biological samples |
| US3666627A (en) * | 1968-10-14 | 1972-05-30 | Corning Glass Works | Method of stabilizing enzymes |
| US3637640A (en) * | 1970-05-04 | 1972-01-25 | Diagnostic Data Inc | Orgotein stabilized with saccharide process and products |
| CA1004614A (en) * | 1970-07-06 | 1977-02-01 | Standard Brands Incorporated | Recovery of glucose isomerase by membrane filtration |
| DE2038103A1 (de) * | 1970-07-31 | 1972-02-10 | Henkel & Cie Gmbh | Waessrige Reinigungsmittelkonzentrate mit einem Gehalt an stabilisierten Enzymen |
| GB1389147A (en) * | 1972-11-24 | 1975-04-03 | Pfizer | Milk coagulant compositions and preparation thereof |
| JPS5290687A (en) * | 1976-01-27 | 1977-07-30 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Highly active glucoseisomerase concentrate having high storage stabili ty |
| FR2344567A1 (fr) * | 1976-03-17 | 1977-10-14 | Mitsubishi Chem Ind | Procede de preservation de glucose-isomerase et solution de glucose-isomerase |
| US4077842A (en) * | 1976-03-19 | 1978-03-07 | Cory Robert Paul | Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate |
| NL7610608A (nl) * | 1976-09-24 | 1978-03-29 | Akzo Nv | Werkwijze voor het stabiliseren van peroxidase- -bevattende composities. |
| US4152211A (en) * | 1977-08-23 | 1979-05-01 | Novo Industri A/S | Iron containing cell mass glucose isomerase preparation |
| US4237231A (en) * | 1979-11-13 | 1980-12-02 | Uop Inc. | Method of purifying glucose isomerase and a composition for storing same |
| JPS5836954B2 (ja) * | 1980-03-31 | 1983-08-12 | 栄研化学株式会社 | 酵素の安定化剤 |
| GB2090599B (en) * | 1981-01-05 | 1984-06-13 | Novo Industri As | Stabilized plasmin compositions and method for preparation thereof |
| JPS589688A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-01-20 | Toyobo Co Ltd | 安定な酵素組成物 |
| US4618584A (en) * | 1984-12-20 | 1986-10-21 | Nabisco Brands, Inc. | Ultrafiltration purification of glucose isomerase |
-
0
- DK DK8502857D patent/DK8502857A/da unknown
-
1984
- 1984-06-25 FI FI842549A patent/FI842549A/fi not_active Application Discontinuation
-
1985
- 1985-06-21 AU AU43959/85A patent/AU585866B2/en not_active Ceased
- 1985-06-24 CA CA484998A patent/CA1263093C/en not_active Expired
- 1985-06-24 DK DK285785A patent/DK169443B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-25 DE DE8585107850T patent/DE3586017D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 US US06/749,684 patent/US4699882A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-25 AT AT85107850T patent/ATE76098T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-25 EP EP85107850A patent/EP0166427B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-25 JP JP60140085A patent/JP2515283B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-28 DK DK076994A patent/DK169587B1/da active
- 1994-10-04 JP JP6240019A patent/JP2522908B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI842549A0 (fi) | 1984-06-25 |
| DK285785D0 (da) | 1985-06-24 |
| CA1263093A (en) | 1989-11-21 |
| DK76994A (da) | 1994-06-28 |
| DK285785A (da) | 1985-12-26 |
| AU585866B2 (en) | 1989-06-29 |
| ATE76098T1 (de) | 1992-05-15 |
| DK8502857A (da) | 1985-12-26 |
| CA1263093C (en) | 1989-11-21 |
| FI842549A (fi) | 1985-12-26 |
| EP0166427A2 (en) | 1986-01-02 |
| EP0166427B1 (en) | 1992-05-13 |
| DE3586017D1 (de) | 1992-06-17 |
| EP0166427A3 (en) | 1987-02-04 |
| AU4395985A (en) | 1986-01-02 |
| JP2522908B2 (ja) | 1996-08-07 |
| JPH07147980A (ja) | 1995-06-13 |
| US4699882A (en) | 1987-10-13 |
| JP2515283B2 (ja) | 1996-07-10 |
| DK169443B1 (da) | 1994-10-31 |
| JPS6115686A (ja) | 1986-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK169587B1 (da) | Fremgangsmåde til krystallisation af glucoseisomerase | |
| DK169039B1 (da) | I vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseisomerase og fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåder til isomerisering af et subtra t og til kontinuerlig fremstilling af fructose under anvendelse heraf | |
| SU1630617A3 (ru) | Способ получени фруктозилдисахаридов | |
| DK150309B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose | |
| SU1024014A3 (ru) | Способ получени ферментного препарата глюкоизомеразы | |
| US5041377A (en) | Subtilisin crystallization process | |
| DK150310B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose | |
| JPS592695A (ja) | 固定化細菌細胞の使用によるイソマルツロ−ス（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド−Ｄ−フルクト−ス）の製造方法 | |
| EP0873995B1 (en) | Crystalline 1-kestose and process for preparing the same | |
| FI78117C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt glukosisomeraskoncentrat. | |
| US2567000A (en) | Production of dextrose | |
| JP2886921B2 (ja) | スブチリシンの結晶化法 | |
| KR940000634B1 (ko) | 글루코오스 아이소머라아제 농축물 및 이의 제조방법 | |
| US4956290A (en) | Large scale process for the purification of alcohol oxidase | |
| NO753005L (da) | ||
| US3047471A (en) | Method of refining amyloglucosidase | |
| NO137598B (no) | Fremgangsm}te til fremstilling av ren, krystallinsk penicillinacylase | |
| US3311542A (en) | Method of making solid total hydrolyzate of starch | |
| SU1125248A1 (ru) | Способ получени препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы | |
| SU712030A3 (ru) | Способ обработки клеток бактерий,имеющих глюкозоизомеразную активность,перед процессом получени продукта,содержащего фруктозу |