JPS6115686A - 安定なグルコース・イソメラーゼ濃縮物およびその製法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、殺菌剤を加えなくても化学的、微生物学的に
安定であり、反応器力ンム内の担体上に固定化するのに
非常に有用なグルコース・イソメラーゼ酵素の濃縮物に
関する。本発明はまた該濃縮物の製法に関する。

発明の背景 グルコースのフルクトースへの異性化のためのグルコー
ス・イソメラーゼの使用は、よく知られた工業的方法で
あり、該酵素は、しばしば固定化形で使用される。使用
されている多くの商業的方法では、固定化酵素調製物は
別の工程で製造され、該工程においでは、酵素は吸−着
技術により担体上に固定化されるか、酵素と共に全微生
物細胞塊を固定してマトリックスを形成させる。反応器
カラムを用意した固定化酵素で組立てる。酵素を使い果
したら、該カラムを空け、再び新しい固定化酵素調製物
で組立てる。

精製した酵素の方が未精製の粗調製物より担体上に吸着
され易いということが知られでいる（米国特許第４３４
７３２２号）。問題は、そのような、安定な、取扱い易
く、保存し易いカラム内の担体上に固定するために使用
できる酵素調製物を製造することである。

沈澱または結晶化にもとすくグルコース・イソメラーゼ
精製方法から得られた沈澱または結晶塊は少なくとも６
０重量％の水を含有し、それは酵素構造の破壊なしには
除去することができない。

そのような結晶塊は微生物学的に安定でなく、取扱いや
使用が困難である。別法としで、該結晶塊を溶解して溶
液とすることがあり、その濃度は貯蔵、安定性、輸送の
見地からできるだけ高くするのが望ましい。自明な方法
は該酵素結晶を水または希薄塩溶液中に溶解するこｔで
あろう。しかし、実際にはグルコース・イソメラーゼの
比較的低い溶解性のために、結晶を水に溶して十分な濃
度のイソメラーゼ溶液を調製することは不可能であるこ
とが判明している。イソメラーゼの希薄水溶液は非常に
不安定であり、微生物学的および化学的劣化の結果、数
日間でその活性を失う。

該酵素は有機溶媒に溶解しうることも示唆されている（
米国特許第４０７７８４２号）。しかし、食品製造工程
においで有機溶媒を使用することば望ましくなく、した
がって、この技術は食品製造に直接使用される酵素には
適当ではない。しかし、該酵素が食品に使用されないな
らば、溶解に有用な物質の種類は拡張されうる。

グルコース・イソメラーゼは現在使用されている最も重
要な酵素の１つであるため、グルコース・イソメラーゼ
の調製、精製および使用に関する文献が多数存在する。

しかし、発表されている精製方法は全て非常に複雑で、
−・般に、かなり低収率である。

結晶化による酵素および蛋白質の精製は、それ自体公知
であり、例えば、便覧エンザイ゛ムズ〔ディクソン、エ
ムおよびウェブ、イー・シーエンザイムズ、第３版、ロ
ングマン・グループ・リミテッド、ブンガイ（Ｄｉｘｏ
ｎ、　Ｍ、ａｎｄ　Ｗｅｂｂ、　Ｅ、　Ｃ，。

Ｅｎｚｙｍｅｓ、　３　ｒｄ　ｅｄ　＋１　Ｌｏｎｇｍ
ａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ、　。

Ｂｕｎｇａｙ　）１９７９．１１１６頁〕には、１９２
枚の酵素結晶の写真が示されている。さらに、硫酸アン
モニウムは、いくつかの場合、結晶化を促し、溶解性を
減少させる薬剤として適していることが知られている。

加えで、硫酸アンモニウム結晶化はしばしば、ある種の
他の塩あるいはアセトンまたはアルコールのような有機
溶媒により行なうことができる。この分野では、ある酵
素または他のある蛋白質がそれ自体は公知のある沈澱剤
により結晶化されうることは決して自明てないというこ
とが一般に認められでいる。生化学における精製方法が
広大な発展を遂げても、まだ、その結晶化がうまくいっ
ていない多くの蛋白質および酵素が知られている。すな
わち、酵素結晶化の「科学」（それはｔ突上むしろ芸術
といっでよい。）は非常に経験的てあり、ある種の方法
か１つの酵素の結晶化にうまくいくことが示されでも、
同じ方法が他の酵素の結晶化に一般的適用性を有するわ
けてはない。

グルコース・イソメラーゼ精製方法またはそのような方
法の一部として分別硫酸塩（硫酸アンモニウムおよび／
またはマグネシウム）沈澱の使用がいくつかの刊行物か
ら知られている〔米国特許第４２３７’　２３１号、米
国特許第４０７７８４２号、アグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ
　、Ｃｈｅｍ、　）　、　４５　（１９８１）６１９〜
６２７、同２８（１９６５）ｔｔ２３〜１１２８、同３
４　（１９７０）　１７９５〜１８０４、同２９　（１
９６５）　１１２９〜１１３４、バイオヒミカ・バイオ
フイズイ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、　）　、　１５１（１９６８）６７０〜
６８０　′Ｊ。

これらのイソメラーゼ精製方法に使用される硫酸塩濃度
は相対的に高い。例えば、米国特許第４２３７２３１号
による方法では、４０％硫酸アンモニウムの飽和度で不
必要な蛋白質が該イソメラーゼ溶液から最初に沈澱し、
次いでイソメラーゼ自体がより高い飽和度（６０％まで
）で沈澱する。

高い硫酸アンモニウム濃度が分別沈澱に使用される場合
、他の多数の蛋白質が常にイソメラーゼとともに沈澱す
る。もしもイソメラーゼが他の方法で既にある程度精製
されでいないならば、使用する硫酸アンモニウム濃度が
高くなればなるほど、さらに多数の蛋白質が沈澱してく
る。

分別沈澱にもとずく精製方法においでは、得られる物は
通常無定形沈澱であり（工業用の遠心分離機またはセパ
レータにより良好な収率で母液から分離することは非常
に困難であり、または不可能でさえある。

該無定形沈澱は通常、混合析出物であり、特に、原料物
質が微生物細胞液であり、予め精製されでいない場合、
イソメラーゼの他に、他の蛋白質も含む。そのような無
定形沈澱は母液から分離することが難しく、沈澱法はイ
ソメラーゼに関゛しては所望の精製効果を与えない。

硫酸アンモニウム、他の塩または有機溶媒によるグルコ
ース・イソメラーゼの結晶化は、いくつかの刊行物に記
載されでいる〔バイオヒミカ・バイオフイズイカ・アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、）　１５１　（１９６８）　６７０〜６８０
　、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミス１−　！７−（Ａｇｒ、　ＢｉｏＪ、　ｃｈｅｍ、
　）　、　３４　（１９７０）１７９５〜１８０４、同
４５（１９８１）６１９〜６２７、同３３　（１９６９
）　１５２７〜１５３４　］。

これらの刊行物に記載された結晶化方法の特徴的な点は
低収率であり、非常に長い結晶化時間であり、または化
学薬品の相対的に高い消耗である。

これらの場合のいずれにおいても基礎的研究目的用の少
量の純粋なイソメラーゼを調製することを目的としてい
る。例えば、イソメラーゼは最初ある種の方法（有機溶
媒での抽出、ＤＥＡＥ−セファデックス−カラムクロマ
トグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、透析）により精
製され、その後、精製イソメラーゼの純水溶液からの結
晶化が硫酸アンモニウム、リン酸塩緩衝剤またはアセト
ンを用いて行なわれている。

前記刊行物に記載された方法はどれも経済性が低いため
、工業的規模で使用されていない。

発明の概要 本発明は？ｌＡＭ水性ポ水性ポリヒト化キシ化合物含有
溶液したグルコース・イソメラーゼを含有スることで特
徴づけられる安定なグルコースイソメラーゼ濃縮物に関
する。

本発明による濃縮物は化学的にも微生物学的にも勇→庫
畔Ｎ頗に本安定であり、特にグルコース・イソメ長−ゼ
を担体に固定化する方法に有用であるということが判明
した。好適なポリヒドロキシ含有化合物は、例えば、炭
水化物およびポリオールのような水に容易に溶けるその
ような全ての化合物である。糖、グリセロール、ポリプ
ロピレングリコールまたはエチレングリコールもまた好
適である。そのまま食品に使用されている糖ならびに食
品添加物として許容されでいる糖アルコールが特に好適
である。異性化の最終生成物はグルコース−フルクトー
ス・シロップであるので、これらの糖の混合物、すなわ
ち、転化糖が該目的に非常に好適である。

該濃縮物中の総乾燥固形分は本質的に微生物学的に安定
な程度でなければならない。すなわち、乾燥固形分は約
６０〜７０重量％であるべきである（すなわち、水分の
作用が十分低くなくてはならない）。

本発明によるグルコース・イソメラーゼ濃縮物は５〜２
０重量％のグルコースイソメラーゼ、好ましくは、５〜
１５重量％のグルコースイソメラーゼ、３０〜６０重量
％の、例えば、グルコース、マルトース、フルクトース
、シュークロース、ソルビトール、キシリトールまたは
それらの混合物、例えば転化糖、グルコース・シロップ
または異性化グルコース・シロップのような水溶性炭水
化物、１５重量％以下の適当な塩ζ例えば、硫酸アンモ
ニウムおよび／またはマグネシウム、および／または緩
衝剤（ＰＨ５，０〜８．０）、例えば、ナビリウムーカ
リウムーリン酸緩衝剤、炭酸塩緩衝剤または有機塩（例
えばアミノ酸塩）で調製された緩衝剤または緩衝剤の混
合物を含有し、残部が水である。

該濃縮物のｐＨは５．０〜８．０であり、酵素活性は５
（１０〜１（１０（１０　Ｇ　Ｉ　Ｕ　／　ｇ濃縮物で
ある。好適には、ｐＨは６．０〜８．０であり、酵素活
性は２（１００〜５（１００　Ｇ　Ｉ　Ｕ、／　ｇ濃縮
物である（ＧＩＵ−グルコース・イソメラーゼ単位）。

発明の詳説 次に、本発明による好適な酵素濃縮物の数例を示す。

１．５０重量％グリセロール １０重量％水 １５重量％酵素 ５重量％硫酸アンモニウム ２．５０重叶％転化糖 ３０重量％水 １５重量％酵素 １重量％緩衝剤（Ｎａ−に−リン酸塩）４重量％硫酸ア
ンモニウム ３．５０重社％ソルビトール ４０重砒％水 １０重駿％酵素 ４．５０重量％シュークロース ３０重量％水 １５重量％酵素 ５重量％緩衝剤（リン酸ナトリウム） しかしながら、総濃度が十分に高く、かつ、液状の溶液
が取扱い易いということを考慮しながら、必要に応じて
濃縮物の組成を変えてもよい。

本発明によるグルコース・イソメラーゼ濃縮物は純粋で
、安定であり、取扱いおよび使用が容易である。酵素活
性は調節することができる。実用の観点からは、好適な
活性範囲は２（１００〜１（１０（１０Ｇ　Ｉ　Ｕ　／
　ｇ　調製物である。

用いる糖、糖アルコールおよび塩は好適には食品用（例
えば、フード・ケミカルズ・コード標準品）である。酵
素は結晶化その他の方法で十分に精製されるへきである
。

グルコース・イソメラーゼ吸着用の好適な担体はアニオ
ン交換能を有する材料、例えば、ガラスピーズ、イオン
交換樹脂またはシリカ・ベース担体である。特に好適に
はＤＥＡＥ−セルロースおよびＤＥＡＥ−デキストラン
のような蛋白質を吸着することで知られでいるジエチル
アミノエチル（ＤＥＡＥ　）誘導体である。文献に記載
された多数の担体がある。

ＤＥＡＥセルロースを担体として使用する場合１（１０
０１ＧＩＵ／ｇ　　固定化酵素（ＩＧＩＵ−固定化グル
コース・イソメラーゼ活性）以上の高活性を得ることが
容易である。

本発明は、また前記の安定なグルコース・イソメラーゼ
濃縮物の製造方法に関する。該方法は、ａ）グルコース
・イソメラーゼを結晶化するため、好適な塩を発酵から
得た部分的に精製されたグルコース・イソメラーゼ溶液
へ加工、ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進
するため該溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、次
いで、所望ならば、■または数回再結晶し、Ｃ）炭水化
物またはその濃厚水溶液を得られた結晶塊に加え、溶解
し、それによって安定なグルコース・イソメラーゼ濃縮
物を得る ことを特徴とする。

本発明によれば、該イソメラーゼ酵素を塩溶液から結晶
化することにより非常に効率よく精製することができる
。好適な塩は、該酵素を不活性化しない非毒性塩の全て
である。本発明による方法では硫酸アンモニウムおよび
／またはマグネシウムが使用される。

塩によるグルコース・イソメラーゼの沈澱は、それ自体
は公知の方法で、例えば、アグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、）、　２９　（１９６５）　ＰＰ−１１２
９〜１１３４（イスム１）およびサトー（Ｉｓｕｍｒｅ
ａｎｄ　５ａｔｏ　）　）に記載されている。しかし、
結晶形成が起こるそのような方法は以前には記載されで
いない。前記の方法では、無定形沈澱が形成される。

条件により、同じ化学薬品である硫酸ナトリウムまたは
マグネシウムを使用することにより無定形沈澱または結
晶沈澱のどちらかを得ることができる。多数の酵素が同
様な行動をとることが一般に知られている。

本発明による方法の特徴的な驚（べき特色は、沈澱する
可能性がある他の全ての物質以前に、インメラーゼが結
晶物質として沈澱するということである。該方法では、
正確に選択した条件および他の物質が該溶液から沈澱し
ない低濃度の硫酸アンモニウムが使用される。この点で
該方法は当該分野の文献に記載されていること六は基本
的に異る。以前には、グルコース・イソメラーゼは産生
微生物の細胞液または細胞液濃縮物から唯一の沈澱成分
として直接、単独で結晶化されたことはない。該方法は
また、よりＰＬ＠に文献で述べられたことと基本的に異
なる非常に高い収率を与える。

酵素調製物の保存特性および安定性を、例えば、グリセ
ロール、ポリアルコールおよび糖により増加できること
が一般に知られでいる。そのような酵素調製物は通常、
前記物質を濃縮酵素溶液へ加えることにより調製される
。

乾燥無水ポリアルコールまたは糖（好ましくは、グルコ
ース）を濃縮インメラーゼ結晶懸濁液中に混合するか、
または約１ｏｏｏｏＧＩＵ／ｇ　　の最高可能活性を有
する固体結晶塊中に混合すると、驚くべきことに、イン
メラーゼ結晶が溶解し、純粋な透明溶液を生じることが
判明した。そのような溶液は、その水分濃度が十分低く
、そのインメラーゼ活性が十分高いと、安定である。該
溶液は結晶化工程に由来する塩または後で加えられた塩
を含有してもよく、塩自体は微生物学的安定性を増加さ
せる効果を有する。しかし、該溶液について、可能な限
り高いインメラーゼ活性を達成するためにインメラーゼ
結晶を溶解させる観点からは、ポリオールおよび糖が基
本的に重要である。

先行文献には、本発明による生成物と同じ程度の高い酵
素活性を有するインメラーゼ溶液の例は全くないし、そ
のような溶液の調製方法も記載されていない。

グルコース・イソメラーゼ濃縮物の調製は好適には次の
ように行なわれる。

ａ）　溶菌によりストレプトマイセス・ルビギノサス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ
　）　　から細胞液を調製しく米国特許第４４１０６２
７号）、該細胞液から限外ｒ過によりインメラーゼ含有
濃縮物を調製し、結晶化工程用の原料物質とする。該濃
縮物の好適なインメラーゼ濃度は２（１０〜８（１０Ｇ
　Ｉ　Ｕ　／　ｇ　である。

ｂ）該インメラーゼ溶液のｐＨは５．７〜８．０の範囲
、好適にはｐＨ７，０に調整される。

Ｃ）該溶液は１６℃またはそれ以下に冷却される。

ｄ）硫酸アンモニウムおよび／またはマグネシウムが、
好ましくは、ＩＩ！当たり５０〜１７０ｇで該溶液に加
えられる。加えられる硫酸塩の量は最初のインメラーゼ
濃度およδ最終の結晶化温度に依存する。加えられる硫
酸塩の最適盪はインツラーゼだけが結晶化し、他の蛋白
質がまだ沈澱を始めないような情である。

ｅ）たとえ、一度に全歌を加えることにより許容しうる
結果が得られるとしても（そのような場合インメラーゼ
結晶の大きさは、好ましくないくらい小さいままである
）、硫酸塩の添加は好適には、全阻の添加に２〜４時間
を要するように徐々に行なう。

ｆ）該溶液は好適には数時間、好ましくは、関与する混
合物の凝固点近くまで冷却する。凝固点は試験した最低
硫酸塩濃度で約−２℃、最高硫酸塩濃度で一６℃である
。冷却は硫酸塩添加開始と同時か、硫酸塩添加完了して
から開始することができる。徐々に冷却することにより
、冷却が溶解度低下効果を有し、それによっても収率が
増加するという事実の他に、イソメラーゼ結晶の大きさ
を有利に増加させるという冷却結晶化効果が得られる。

ｇ）イソメラーゼ結晶は、それらを容器の底へ沈降させ
るか、濾過するか、または大規模の時は、最適には、連
続セパレータにより遠心分離することにより溶液から分
離される。

ｈ）分離した結晶塊は、乾燥炭水化物またはその濃厚水
溶液を加えることにより溶解され、それにより該イソメ
ラーゼ結晶が溶解して安定なグルコース・イソメラーゼ
濃縮物が製造される。

所望により、結晶化を繰り返えしてもよく、その場合、
該結晶塊は分離（工程ｇ）後、比較的高温（２０〜３０
℃）で多量の水に溶解しなければならない。この点で、
好適な水量は溶液のイソメラーゼ活性が５（１０〜２（
１００ＧＩＵ／ｒｎｌとなる量、換言すると、使用する
水量の重量が典型的には結晶塊の重量の４〜１０倍とな
る量である。

本明細書において、ＧＩＵはグルコース・イソメラーゼ
単位の省号であり、室温および６０℃で測定した、ｐＨ
６，８４〜６．８５　（０，’２　Ｍマレイン酸ナトリ
ウム）で最初に１１当たり２モルのグルコース、１１当
たり０．０２モルの硫酸マグネシウムおよびｏ、ｏｏｉ
モルのＣＯＣｌ２　　を含有する溶液中で１分光たり１
マイクロモルのグルコースをフルクトースへ変換する酵
素の量である。グルコースイソメラーゼ測定はエヌ・イ
ー・ロイドら、シリアル・ケミストリー（Ｎ、Ｅ、　Ｌ
Ｌｏｙｄ、　　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ、、）　４９　、　Ｎｏ、　５
　ｐｐ、　　５４４−５５３（１９７２）に開示された
方法により行なった。

実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 約４０ｉのストレプトマイセス・ルビギノサスの槽を米
国特許第４４１０６２７号の記載に従って発酵する。細
胞塊を公知の方法（同参考文献）で溶解する。細胞残渣
および他の固体物質を通常の珪藻土ドラム濾過器により
戸去し、それにより３２トンのインメラーゼ含有ρ液を
得る。こ１２）ｒ液をＰＣＩ（パターソンー牛ヤンデイ
インコーポレーテッド（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ−Ｃａｎｄ
ｙ、　Ｉｎｃ、）　）限外を過器で濾過し、それにより
３（１００ｋｇのイソメラーゼ含有濃縮物を得る。その
活性は９６０．（１００，０ＯＯＧＩＵである。限外濾
過膜を通過した透過液を除去する。

１２０ｋｇ　の硫酸マグネシウムおよび３（１０ｋｇの
硫酸アンモニウム（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０および
（Ｎ１１４）２ＳＯ４、食品用）を該濃縮物に加える。

結晶化を促進するため混合物を１０℃に冷却する。

生成した結晶をデカンテーションで分離し、４１．１ｋ
ｇの硫酸アンモニウムを加えて結晶化を繰り返す。結晶
を再度デカンテーションで分離する。

４０２ｋｇの水を加えて結晶塊を溶解し、ＩＭのアンモ
ニア溶液により該溶液のｐＨを６．５に調整する。該溶
液をプレー）濾過器で濾過し、１６ｋｇの硫酸マグネシ
ウムおよび４０ｋｇの硫酸アンモニウムを使用して結晶
化を再度繰り返す。

２９ｋｇの酵素、３．７ｋｇの塩（Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　
。

（Ｎ１（４）　２　”　０４　）および残部が水からな
る収量頒ｋｇの結晶塊を得る。該結晶塊へ４５ｋｇのグ
ルコースおよび４５ｋｇのフルクトースならひに７０重
量％の乾燥固形分を有する２　０　ｋｇの転化糖を加え
る。このようにして２（１０ｋｇの酵素調製物が得られ
る。その組成は次のとおりである。

２９．２重量％　水 ５２．０重量％糖 １４．５重量％　クルコース・イソメ・ラーゼ４．３重
量％　塩（硫酸マグネシウム−硫酸アンモニウム） 該酵素濃縮物のクルコースイソメラーゼ活性は４５ｏｏ
ＧＩＵ／ｇである。

実施例２ 実施例１に記載した方法で限外濾過した発酵物を調製す
る。限外−過発酵物４（１００　ｋｇに、結晶硫酸アン
モニウム２４４　ｋｇおよび水９（１０ｋｇに塩６０（
１ｋｇを溶解した硫酸アンモニウム溶液を加える。該溶
液を１３℃に冷却し、この温度で２０時間保つ。生成し
た結晶塊をウエストファリア−エｓｚ　・ｘ−７（Ｗｅ
ｓｔｆａｌｉａ　ＮＡ３）セパレータにより分離する。

結晶を水に溶解し、該溶液をろ過する。沖液量は２（１
００／である。結晶硫酸アンモニウム１２２ｋｇおよび
水４６０１に硫酸アンモニウム３ｏ　ｏ　ｋｇ　＊溶解
した硫酸アンモニウム溶・液を用いて結晶化をくり返す
。得られた結晶塊を再度セパレータで分離する。結晶塊
（５２５ｋｇ）へ同量の結晶フルクトースを加える。こ
れにより該塊が溶解し、フルクトースの一部がグルコー
スに異性化する。この方法で安定な酵素濃縮物が得られ
る。その組成は次のとおりである。

糖（グルコースおよびフルクトース） ５０．０重量％ 酵素　　　　　　　　　　　　　　１１．２重量％硫酸
アンモニウム　　　　　　　３．５重量％水　　　　　
　　　　　　　　　　３５．３重量％該濃縮物のグルコ
ースイソメラーゼ活性はａｏｏｏＧＩＵ／ｇである。

実施例３ 実施例１に記載した方法で限外沖過発酵物を調製する。

２，４（１０，（１００，（１００　ＧＩＵ活性を有す
る４（１００１！の限外澱過した発酵物をグルコース・
イソメラーゼの結晶化に用いる。５％ＮａＯＨ溶液によ
り該溶液のｐＨをｐＨ７，０に調整し、溶液の温度を１
２℃に調整する。グルコース・イソメラーゼの結晶化の
ために、７５０１２）水に溶解した５　（１０　ｋｇの
硫酸アンモニウムを該溶液へ等供給速度で２時間を要し
て加える。次いで該溶液を−２℃に冷却し、２４時間攪
拌す′る。グルコース・イソメラーゼ結晶をウエストフ
ァリア・エヌ・ニー−７セパレータにより分離する。

２３．６重量％の乾燥固形分および２，３（１０，（１
００，０ＯＯＧＩＵの活性を有する結晶塊３９０　ｋｇ
を得る。３０ｋｇの塩化ナトリウムおよび１８０　ｋｇ
のグルコースを該結晶塊へ加え、得られた酵素濃縮物の
ｐＨを５％ＮａＯＨ溶液で７０に調整する。これらの条
件下でグルコースが一部異性化される。この方法で、６
（１０　ｋｇの安定な酵素濃縮物が得られる。

その組成は次のとおりである。

４９．７重量％　水 ３０．０重１％　糖（クルコース／フルクトース）１２
．８重量％　酵素 ２．５重量％　硫酸アンモニウム ５．０重量％　塩化ナトリウム 該酵素濃縮物のグルコースーイソメラーゼ活性はａ４ｏ
ｏＧＩＵ／ｇ　　である。

実施例４ 実施例１に記載した方法で限外諷過した発酵物を調製す
る。２，４（１０，（１００，０ＯＯＧＩＵ活性を有す
る４（１００／の限外ρ過した発酵物をグルコース・イ
ソメラーゼの結晶化に用いる。５％Ｎ　ａ　ＯＨ溶液に
より該溶液のｐＨをｐＨ７に調整し、溶液の温度を１２
℃に調整する。グルコース・イソメラーゼの結晶化のた
めに、７５０１２）水に溶解した５（１０ｋｇの硫酸ア
ンモニウムを該溶液へ等供給速度で２時間で加える。次
いで該溶液を一２℃に冷却し、２４時間攪拌する。グル
コース・イソメラーゼ結晶をデカンテーションで分離す
る。４０゜０重量％の乾燥固形分および２，３（１０．
（１００，（１００ＧＩＵの活性を有する結晶塊２３０
ｋｇを得る。

１１５ｋｇのグルコースおよび１１５ｋｇ　　のフルク
トースならびに７０％の乾燥固形分を有する５０ｋｇの
転化糖を該結晶塊へ加える。この方法で、が ５１０　ｋｇ　　の酵素調製品物得られる。その組成は
△ 次のとおりである。。

３０．０重用％　水 ５２．０重量％　糖（クルコース、フルクトース）１５
．１重量％　酵素 ２．９重ｉ％　硫酸アンモニウム 該酵素濃縮物のグルコースーイソメラーゼ活性は４５（
１０ＧＩＵ／ｇである。

実施例５ 実施例１に記載した方法で限外広過した発酵物を調製す
る。６（１０　Ｇ　Ｉ　Ｕ／ｒｎｌの活性を有し２５℃
の温度の０．９５１！のイソメラーゼ濃縮物へ５０ｇの
硫酸アンモニウムを加える。この段階では溶液中に沈澱
は生成しない。該溶液を１６時間で０℃に冷却し、連続
的に穏やかに攪拌しながら、その温度に保持する。

イソメラーゼが２日で結晶し始める。結晶化を継続し、
５日後に９７．５重量％のイソメラーゼが結晶形になり
、２，５重量％のイソメラーゼがまだ母液中に溶解して
いる。結晶を実験室用遠心分離機で溶液から分離する。

それによって５６ｇの湿潤結晶塊を回収する。

この実施例によれば、文献で知られでいる典型的な量と
比べて非常に低濃度の硫酸アンモニウムでイソメラーゼ
を結晶させることができる。同時にこれは純粋な冷却結
晶化の実施例である。この実施例にかんがみ、もし硫酸
アンモニウムによる結晶化を迅速に行ない、次いで、沈
澱を直ちに、例えば１５分で遠心分離機により分離した
ならば、米国特許第４２３７２３１号の方法のごとく、
硫酸アンモニウム濃度が低いと、イソメラーゼは完全に
溶液中に残存し、もし、沈澱しても結晶化は観察されず
、その利点が利用されないことが容易に理解できる。こ
の実施例に従って調製された結晶塊は、その他の実施例
と全く同様に溶解できる。

本発明方法により調製された濃縮物は１０力月間は微生
物学的および化学的不活性化に対して安定であることが
証明されている。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）濃厚水性ポリヒドロキシ化合物含有溶液中に溶解
   したグルコース・イソメラーゼからなることを特徴とす
   る安定なグルコース・イソメラーゼ濃縮物。
2. （２）約５〜約８のｐＨで、約５〜約２０重量％のグル
   コース・イソメラーゼおよび約３０〜約６０重量％の炭
   水化物を含有する前記第（１）項の濃縮物。
3. （３）グルコース・イソメラーゼ含量が約５〜約１５％
   であって、ｐＨが約６〜約８である前記第（２）項の濃
   縮物。
4. （４）約１５重量％またはそれ以下の濃度で塩を含有す
   る前記第（３）項の濃縮物。
5. （５）該塩が硫酸アンモニウムおよび／またはマグネシ
   ウムである前記第（４）項の濃縮物。
6. （６）該ポリヒドロキシ化合物がグルコース、マルトー
   ス、フルクトース、サッカロース、ソルビトール、キシ
   リトールおよび転化糖、グルコース・シロップまたは異
   性化グルコース・シロップのようなそれらの混合物から
   なる群から選択される前記第（１）項の濃縮物。
7. （７）５０重量％のグルコースおよびフルクトース、１
   ５重量％のグルコース・イソメラーゼ、５重量％の硫酸
   アンモニウムまたはマグネシウム、および３０重量％の
   水を含有する前記第（２）項の濃縮物。
8. （８）５０重量％のグルコースおよびフルクトース混合
   物、６．７重量％のグルコース・イソメラーゼ、３．５
   重量％の硫酸アンモニウムおよび３９．８重量％の水を
   含有する前記第（２）項の濃縮物。
9. （９）ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化するため
   に、発酵から得た部分精製グルコース・イソメラーゼに
   適当な塩を加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
   該溶液を冷却し、生成した結晶を分離し、次いで、所望
   により、１または数回再結晶し、ｃ）ポリヒドロキシ化
   合物またはそれらの濃厚水性溶液を得られた結晶塊へ加
   えて溶解し、それによって安定なグルコース・イソメラ
   ーゼ濃縮物を得る ことを特徴とする濃厚水性ポリヒドロキシ化合物含有溶
   液中に溶解したグルコース・イソメラーゼを含有する安
   定なグルコース・イソメラーゼ濃縮物の製法。
10. （１０）グルコース・イソメラーゼを限外ろ過で部分的
    に精製する前記第（９）項の方法。
11. （１１）ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化するた
    めに、結晶硫酸アンモニウム、次いで、硫酸アンモニウ
    ム水溶液を発酵から得た限外ろ過したグルコースイソメ
    ラーゼに加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
    、得られた溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、該
    結晶を水に溶解して再結晶し、生成した溶液をろ過し、
    結晶硫酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウム水溶液を
    加え、次いで生成した結晶塊を分離し、 ｃ）結晶フルクトースを得られた結晶塊へ加えて溶解し
    、それによりグルコース・イソメラーゼの安定な濃縮物
    を得る前記第（１０）項の方法。
12. （１２）再結晶を１回またはそれ以上行なう前記第（１
    １）項の方法
13. （１３）ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化させる
    ために硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムを、発
    酵から得た限外ろ過したグルコース・イソメラーゼ溶液
    へ加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
    該溶液を冷却し、生成した結晶をデカンテーションで分
    離し、水、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムを
    加えることにより該結晶を再結晶し、デカンテーション
    で結晶を分離し、希アンモニアを加えることによりｐＨ
    を６．５に調整し、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモ
    ニウムを加えることにより再度結晶化し、それにより結
    晶塊を得、 ｃ）該結晶塊へ水ならびにグルコースおよびフルクトー
    スを加えて溶解し、それによりグルコースイソメラーゼ
    の安定な濃縮物を得る 前記第（１０）項の方法
14. （１４）ａ）部分的に精製されたグルコースイソメラー
    ゼ調製物のｐＨを約５．７〜約８．０の範囲に調整し、 ｂ）該調製物を約１６℃またはそれ以下に冷却し、 ｃ）調製物１ｌ当たり約５０〜約１７０ｇの濃度で硫酸
    アンモニウムおよび／またはマグネシウムを加え、 ｄ）結晶生成を促進するため該混合物の凝固点付近まで
    冷却する ことを特徴とするグルコース・イソメラーゼ結晶化方法
    。
15. （１５）該溶液から該結晶を分離することを含む前記第
    （１４）項の方法
16. （１６）約２０〜３０℃の温度で結晶塊の重量の約４〜
    １０倍量の水に分離した結晶を溶解し、前記第（１４）
    項の工程を繰り返すことにより結晶化を繰り返す前記第
    （１５）項の方法。
17. （１７）工程（ｃ）を徐々に行ない、硫酸アンモニウム
    および／またはマグネシウムを固体および／または液体
    形で加える前記第（１４）項の方法。
18. （１８）工程（ｄ）を工程（ｃ）に付随させて行なう前
    記第（１４）項の方法、
19. （１９）ａ）溶解した微生物細胞から得られ、限界ろ過
    に付したグルコース・イソメラーゼ調製物を供給し、 ｂ）ｐＨを約７０に調整し、 ｃ）該調製物を約１６℃またはそれ以下に冷却し、 ｄ）約２〜約４時間にわたって調製物１ｌ当たり約５０
    〜１７０ｇの量で硫酸アンモニウムおよび／または硫酸
    マグネシウムを加え、その間、該混合物を、結晶生成を
    促進するためさらに混合物の凝固点付近に冷却すること
    からなることを特徴とするグルコース・イソメラーゼの
    結晶化方法。