JPH05501242A - 酵素結晶成長方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素結晶成長方法 発明の技術分野 本発明は、酵素結晶の成長方法に関するものである。

発明の背景技術 Ｘ線結晶学などの研究用にタンパク質や酵素の大形単結晶を生成する方法につい て記した文献は数多くある。これらのうち最も基本的な方法としては、数日、数 週間あるいは数カ月かけてサンプルから水分を蒸発させ極ゆっくりと酵素を濃縮 する方法がある。結晶成長ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｒｙｓｔａｌ 　Ｇｒｏｗｔｈ）第９０巻（１９８ｇ）１−３６８頁にこれらの方法に関する論 文が記載されており、その中でこれらの生成方法および研究方法は生物学的高分 子（ｉａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の晶出には効果的でかあると論じられてい る。しかしながら、これら従来の方法は大形で均一な酵素結晶の予備生成あるい は産業規模での生産には適用することができない。

小形分子の有機および無機合成物の晶出に関しては多量の文献や情報がある。多 くの小形分子合成物に関し、一般の蒸発あるいは冷却回分結晶法（ｅｖａｐｏｒ ａｔＩｏｎ　ｏｒ　ｃｏｏｌｉｎｇｂａｔｃｈ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏ ｎ）による大形で均一な結晶の生成方法が知られている。選択的に晶出器がら小 形結晶を分離し、その後所望の大きさの結晶の採取を行う方法が数多くある。

通常、これらの方法には所望の大きさの結晶が生成されるまであるレベルの過飽 和状態を維持する技術が用いられている。晶出一般に関しては、理論的また実用 的な知識が豊富にあるにもかかわらず、大きさで結晶を分類し、大形結晶の生産 を可能とする結晶成長処理は、生物学的高分子の晶出１０２５例（ｅｘａｍｐｌ ｅｓ）以外には適用されてぃながった。

（Ｇ、Ｌ、Ｇ１１ｌｉｌａｎｄ著生物学的高分子結晶デーし　タベース：晶出戦 略（Ａ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　１ａｅｒｏＩｏＩｅｃｕｌｅ　ｃｒｙｓｔａｌ ｌｉｚａｔｉｏｎ　ｄａｔａｂａｓｅ：　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ａ　ｃｒｙ ｓｔａｌｌｌｚａｔｌｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ）の基礎　結晶成長ジャーナル（ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ）　９０巻（１９８８） ５１−５９頁）グルコース異性化酵素の工業規模での回分結晶法が米国特許Ｎｏ 、４．６９９．８８２に開示されている。この方法では、適度の濃度のアンモニ ア硫酸塩で酵素を晶出する。

１　こうして晶出された結晶の粒径は通常１−１００マイクロメータの範囲にわ たっており、粒径分布あるいは平均粒径の制御は行われていない。この方法は、 大規模生産には適しているが、例えば０．５ｍｍ−１ｍｍの大きさの結晶の生成 あるいは固体不活性材料（ｓｏｌｉｄ　１ｎｅｒｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ）の表 面における大形結晶の晶出には適していない。

従って、本発明は大形酵素結晶の工業規模での生成を可能とすることを目的とす る。このように大形の結晶が生成できれば、結晶を分離管（ｃｏｌｕｍｎｓ）内 で直接使用することが可能となり（これら結晶が基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）中 で不溶である場合）、また結晶が小さい場合に発生する詰まりゃ流れ抵抗の問題 が発生しないという利点がある。さらに、スクリーニング、または沈降法および 円心分離法により大形の結晶として生成された酵素をアモルファス沈澱物あるい は気泡壁（通常０．１−１μｍの大きさ）などの固体小形有機堆積物を含む物質 （不純物）から容易に分離することが可能であり、この結果生産時の収量が増大 する。

さらに、本発明は不活性物質の表面に酵素を結晶層として堆積させる方法を提供 することを目的としており、特定の反応を触媒するのに被膜物質を使用すること が可能である。核（ｎｕｃｌｅｉ＞などの異物を晶出に使用することにより驚く ほど新規な固定化酵素（１＊ｍｏｂｉ１１ｚｅｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ）生成方法が 見いだされる利点がある。また本明細書において開示されている方法は上記のよ うな固形物表面での大形の酵素結晶塊の成長に極めて有用である。固形物表面で 大形酵素を成長させることにより、工業プロセス用の簡略な酵素の回収、固定化 方法が得られる。

発明の開示 本発明に係る結晶、もしくは結晶被膜固形物（ｃｒｙｓｔａｌ　ｃｏａｔｅｄ　 ５ｏｌｉｄｓ）を用いることにより上記効果が得られる。

本発明によれば、単結晶あるいは固形物上に堆積した結晶のように比較的大形の 酵素結晶か生成される。第一の実施例によれば、冷却結晶成長チャンバ（晶出器 ）には飽和溶液あるいは結晶性酵素の微細懸濁液（ｆｉｎｅ　５ｕｓｐｅｎｓｉ ｏｎｓ）が注入されている。前記溶液（もしくは懸濁液）は直ちに冷却され酵素 結晶の晶出を開始する。チャンバ内の液体の一部は常時排出されており、懸濁液 内で新たに生成された結晶の一部も排出される。該液体の排出は分級器（ｃｌａ ｓｓｉｆｙｉｎｇ　ｄｅｖｉｃｅ）を経て行われる。前記分級器は、比較的大形 の結晶の通過を阻止し、比較的小形の結晶のみを透過させる。

比較的小形の結晶を担持している液体を、酵素結晶が分解されるよう再度加熱し 、分解された酵素は冷却結晶成長チャンバに戻され、該チャンバにて再度晶出さ れる。すなわち、前回生成され、分級器を経ても結晶成長チャンバから流出しな かった比較的大形の結晶上の少なくとも一部に酵素が再晶出する。このように、 晶出、粒径分級、再加熱、小形結晶を含有する酵素の再循環といった連続操作に より比較的大形の酵素結晶の成長が可能となる。小形結晶を含有する酵素を排出 し、分解した状態で再度循環させることにより過飽和状態の結晶成長チャンバ内 の液体環境が一定に保たれる。結晶の粒径が最終目的に合った大きさになった時 に、大形結晶を収穫（回収）する。この実施例では、粒径が０．５−１ｍｍの範 囲の大形酵素結晶が生成された。

この大形結晶は、沈降法あるいは円心分離法などの従来の方法で連続的に収集す ることが可能であり、工業規模での加工に適用できる。

第二実施例において、固定した、結合が疎、または易流動的で、不溶性であり、 実質的に不活性な物質を晶出チャンバ内に注入する。該チャンバ内において晶出 酵素の一部が、晶出の核となる前記物質の表面上に堆積する。固形物質がチャン バ内に固定されている場合、未堆積結晶を含有する液体を分級器を通過させずに 前記晶出器から連続して排出させることが可能である。該液体は加熱され、結晶 の相当部分は分解されて再度晶出器へ戻される。前記晶出器においては、固形物 質の表面で直接酵素は晶出し、このようにして結晶層が積層される。被膜固形物 質が易流動的粒子（ｆｕｌｌｙ　ｆｌｏａｔｉｎｇ　ｐａｒｔｌｃＩｅｓ）から 構成されている場合、スクリーンなどの分級器ではその他の非堆積結晶を除去し 、再分解し、前回同様チャンバに戻す間、粒子を晶出器内に保持しておかなくて はならない。不活性物質を用いる上記実施例のいずれかにおいては、晶出器内が 過飽和状態である限り前記物質の表面は所望の厚さに被膜することが可能である 。前記実施例において、前記酵素がいったん堆積すると、グルタルアルデヒドの ような薬剤と架橋結合して前記固形物質に固定されてしまう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の第一実施例の処理を表す概略図である。

第２図は、本発明の第二実施例の処理を表す概略図である。

第３図は、本発明の第三実施例の処理を表す概略図である。

発明の好適実施例の詳細な説明 図面、特に第１および２図には、単純な円筒状のビーカーまたは容器からなる晶 出チャンバ１が示されている。前記チャンバには結晶性酵素２の飽和溶液または 微細懸濁液が注入されている。前記晶出チャンバ１（晶出器）には撹拌子１１が 設けられており、好ましくは熱媒体２１が注入されている冷却ジャケット１８で 冷却して、結晶３の生成が行われる選択温度（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｅｍｐｅｒ ａｔｕｒｅ）を一定に保っ◎結晶の生成が行われている時流体（Ｉｆｑｕｉｄ　 ５ｔｒｅａｔａ）　５はポンプ４によって晶出器１から分級器６へと常時排出さ れている。該分級器は、篩（第１図参照）、沈降器１２（第２図参照）、脱水サ イクロン、または液体中に懸濁している固体粒子を分級するための従来装置から なる。分級器６は、比較的大形の結晶の通過を阻止し、小形の結晶を透過させる 。比較的小形の結晶を含有する分離液はチューブ１９を経て熱交換器９に送られ 、液体中の結晶の相当部分もしくは全てが分解するよう該熱交換器において該分 離液を加熱する。図からも分かるように、前記熱交換器は、温度制御された単純 な水層であり、該水層において酵素を溶融するのに十分な熱が液体１０と酵素を 含有した流体５との間で伝達される。次に、分解酵素を含有した流体はチューブ ２０を経て晶出器１に再循環される。バッチ（ｂａｔｃｈ）内に前記流体が混入 すると撹拌子１１は晶出器の温度を急激に低下させる。こうして、新規結晶が生 成され、一部は分級器６を通過できなかった前回生成分の結晶８上で成長する。

この方法を用いて、全ての結晶性酵素が、チャンバ１から流出することが出来な い比較的大形の結晶選択群（ｓｅｌｅｃｔｇｒｏｕｐ）表面に堆積してしうまで 高濃度の過飽和状態を維持する。

上記の処理は、例えばグルコース異性化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｓｏ＋ｍｅｒ ａｓｅ）　、西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈｐｅｒｏ ｘｉｄａｓｅ）　、大麦ベータアミラーゼ（ｂａｒｌｅｙ　ｂｅｔａ　ａｍｙｌ ａｓｅ）　、鶏卵の白身から抽出したリソチーム（ｌｙｓｏｚｙ■ｅ　ｆｒｏｍ ｈｅｎ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ）　、豚の膵臓から抽出したアルファアミラーゼ（ ａｌｐｈａ　ａｓｙｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐｏｒｃｌｎｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ） 　、ヘモグロビン、兎の骨格筋のアルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ　ｏｆ　ｒａ ｂｂｉｔ　５ｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ）などの結晶性酵素に幅広く適用す ることができる。

また、溶解度を低減させ、酵素を晶出させるため硫酸アンモニウムや硫酸マグネ シウムなどのある特定の種類の塩を晶出処理の初めもしくは途中において使用す ることも可能である。このような方法は、例えばグルコース異性化酵素に適用す ることが可能である。グルコース異性化酵素を用いた研究から約１．５％の硫酸 マグネシウム濃度で結晶の溶解度が最低となることが測定された。硫酸マグネシ ウム濃度を増加すると、グルコース異性化酵素の溶解度は前記最低溶解度よりも 大きくなる。一方、硫酸アンモニウムを使用した場合、タンパク質に関する一般 的な塩折式％式％）（１） ＡＳＢは酵素によって異なる定数、 ■は媒質のイオン強度（塩濃度と直接比例した）、によれば、塩濃度が増加する につれグルコース異性化酵素の溶解度は低下する。

硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムの全ての濃度レベルにおいて、温度の 上昇に伴い溶解度が向上している。

このように、本発明に係る方法では小形結晶の分解に加熱法を適用することが可 能である。

晶出に使用する塩および塩濃度の適正値は酵素の性質によって異なる。さらに、 結晶生成物に対して行う結晶後処理（ｐｏｓｔ　ｃｒｙｓｔａｌｌｌｚａｔＩｏ ｎ　ｔｒｅａｔｍｅｒ＋ｔ）によっても選択する塩は異なってくる。例えばグル タルアルデヒドで結晶が架橋結合している場合、架橋結合に参与するアンモニウ ムイオンとして硫酸アンモニウムが好ましい場合もある。（本出願において参照 文献として添付されている同時継続出願中の米国特許出願Ｎｏ、３５０．７２０ を参照）。

本発明に係る結晶成長用の核形成座（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ）とし て機能する種結晶（ｓｅｅｄ　ｃｒｙｓｔａｌｓ）を、上述したような「塩析」 法など従来技術において周知の酵素沈澱あるいは酵素晶出法で生成することが可 能である。しかしながら、本発明の処理の始動用（ｓｔａｒｔ−ｕｐ）に種結晶 を予め生成しておくことも可能である。このような種結晶は、本明細書で開示し ている方法を用い前回行った晶出時に生成しておくこともできる。あるいは、本 発明の方法において種結晶として十分に機能する大きさを備えた結晶が十分な量 形成されるまで溶解酵素を穂立飼料（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｆ’ｅｅｄ）と して徐々に冷却飽和溶液中に添加して種結晶を初めに生成することも可能である 。この処理は、本発明の晶出チャンバの外部で別途行うことができる。

再分解と再循環が行われる比較的小形の粒子の径は選択が自由である。溶解度が 平衡した状態（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　ｅｑｕｌｌｉｂｌｌｕ＊）では、成長チ ャンバ内の結晶数が少なくなると結晶は必ず大形化することが判明した。このよ うに、比較的大形の酵素結晶を成長させるには、再分解されることがなく、成長 チャンバ内に注入する初期（種）結晶の数はかなり少ない数にしておかなくては ならない。こうすることにより、再循環中に残余酵素物質は比較的小数の種結晶 上に堆積し、最終的には小数ながらも比較的大形の結晶が生成されることになる 。晶出した酵素バッチ中に存在する結晶の数を判断するのは実際には極めて困難 である。しかしながら、本発明の方法によれば、このようなバッチ中の結晶数に 関係なく初期結晶の数は急速に減少する。結晶の最終的な粒径は、装置のサイズ 、循環速度、酵素の全体量、分級器の遮断力（ｓｃｒｅｅｎｌｎｇ　ｃａｐａｂ ｉｌｉｔｙ）によって決まる。篩を使用する場合、当然のことながら網目の大き さは限定される（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ４ｖｅ）。また、第２図に示す広口径沈 降器１２を使用する場合、チューブの大きさく幅と高さ）は、所定流量で決まる 。前記流量は、比較的大形の（重い）結晶が流体５の甲に流れ込まないように設 定されている。

懸濁された比較的小形の粒子の排出、再分解、成長チャンバへの帰還を行うため の前記流量は、成長工程自体とは全く無関係であり、一般に物質移動や熱移動と いった条件で決まる。物質移動や熱移動といった制限の中で、前記小形粒子の排 出、再分解、帰還を早く行うほど、大形結晶の成長も早まる。

最終的に生成される結晶の大きさは、装置のサイズ、撹拌子の速度および循環速 度に影響される。分級器内の循環速度が一定の場合、最終生成結晶の平均粒径は 撹拌速度の連続関数となる。速度が増加すると結晶の最終粒径も増加する。

どのような条件を選択するかは、晶出する酵素あるいは高分子の性質による。以 下に説明する好適生成方法の条件は、グルコース異性化酵素に特に適しているが 、本発明の方法の基本原理は結晶性タンパク質に適用することも可能である。こ れら酵素固有の溶解度、結晶性特性（ｃｒｙｓｔａｌ　１ｚａｂｉｌｉｔｙ　ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を考慮するため、他の酵素の場合の条件は調整 する必要がある。これらの特性のほとんどは一般に周知であるか、もしくはその 設定が容易に可能である。晶出させる酵素の種類の如何にかかわらず最も重要な ことは、溶解度が増加するような条件で酵素の循環を行う装置を設計する場合、 あらゆる温度条件での酵素の溶解度特性を考慮しておかなくてはならない。温度 が上昇するにつれ問題のタンパク質の溶解度が低下するような場合は、分解温度 を晶出温度より低くすることもある。晶出チャンバ内の酵素の溶解度を低減させ るための薬剤の種類や量は厳密なものではない。

グルコース異性化酵素の好適な結晶方法においては、酵素の濃度は、−リットル 当たり蛋白質が約１ｇから約４００ｇとなる割合であり、最も好ましくは一すッ トル当たり約５０ｇから約２００ｇとなる割合である。該酵素の濃度は、−リッ トル当たりタンパク質が１ｇから４００ｇの範囲の割合で変更することが可能で ある。硫酸マグネシウムを１ｋｇ当たり約２０ｇから約１５Ｃ１ｇの割合で、好 ましくは約１０％の濃度で混合添加する。晶出器の温度を、約６℃から約２５℃ 、最も好ましくは約８℃から約２０℃に保つ。溶解温度は、約２０℃から約６０ ℃であり、最も好ましくは約４０℃から約５０℃（あるいは前記晶出器の温度以 上）である。循環流量、撹拌、大きさは広い範囲で変更することが可能である。

一般に、循環速度は一時間当たり約１−４晶出器バツチ量（ｃｒｙｓｔａｌｌ’ １ｚｅｒ　ｂａｔｃｈ　ｖｏｌｕＩｌｅ）である。

第３図には本発明の第三の実施例が示されている。この実施例では、チャンバ１ には、ビード（ｂｅａｄｓ）　Ｉ　３などの不溶性固形物質が注入されている。

前記物質の表面に結晶性酵素１５が堆積する。処理中、前記不溶性固形物質の表 面は酵素が堆積する際の核形成座の役割を果たしているように見える。処理が進 むに従い晶出した酵素が固形物質の表面上に被膜形成される。このようにして、 所望の厚さの酵素の層を成長させることができる。図に示されているように、固 形物質はビードもしくは球形をしているが、どのような形状でも構わない。例え ば、固形物質はシート状、格子状、あるいは繊維状でもよい。前記固形物質は処 理条件に影響されない（不活性）適切な不溶性物質で構成されている。すなわち 、ガラス、金属、高重合体（ポリスチレン、ポリアクリル、テフロン、ポリアミ ド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、イオン交換レジン、セルロースなど は全てこの固形物質に適している。

被膜酵素の回収にはチャンバから分離可能な不溶性の固形物質を使用するのが便 利である。このため、結合が粗なビード（ｌｏｏｓｅ　ｂｅａｄｓ）が特に好ま しい。しかしながらまた、固形物質をチャンバ内に固定もしくは排出可能に固定 することも可能である。この場合、成長結晶塊（ｇｒｏｗｉｎｇ　ｃｒｙｓｔａ １■ａＳＳ）と、チャンバ内のほかの場所で形成される小形結晶とを分離する分 級器を設置する必要がなくなる。さらに、重量と大きさにもよるが、ビードを用 いた場合でも分級器は不要となる。

酵素がいったん固形物質表面に堆積した後、特定の酵素に適用可能な方法を用い て該酵素を固定することができる。

すなわち、酵素をグルタルアルデヒドで架橋結合することが可能である。必要で あれば、このように生成された複合物をさらに被膜したり、あるいはカプセル内 に封入することも可能である。

最も好適な方法において、以下の一般的な変数を使用する。

一すットル当たり２ｇから約１００ｇの酵素を含んだ酵素溶液を約２℃から約７ ℃の範囲の温度で晶出チャンバ内に保持する。前記溶液に硫酸アンモニウム（５ −１５重量％）あるいは硫酸マグネシウム（約１重量％−約５重量％）を添加し てもよい。被膜される物質は、移動自在な粒子あるいは固定物のように晶出チャ ンバ内に滴下される。

前記品出チャンバは常に撹拌されており、溶液を含んだ小形結晶は常時排出され ており、熱交換器内を搬送される。

該熱交換器は、溶液の温度を約３０℃から約５０℃の範囲にまで加熱し、小形酵 素結晶を分解する。次に、前記溶液は晶出チャンバに戻される。該チャンバでは 、溶液が添加されたことにより晶出溶液の過飽和状態が維持される。熱交換器内 での循環速度としては、一時間当たり約１−約６バツチ量が好ましい。最も好ま しくは、被膜される遊離粒子を遮断でき、可能な限り最も大きな格子を備えた篩 を通過させて液体を含んだ小形結晶を排出する。

本発明の基本原理は、幅広い種類において、酵素結晶の生成に適用することが可 能である。グルコース異性化酵素は当該明細書で開示している方法に特に適して いるため以下に説明する実験例においてもモデルとして使用している。

本発明を限定するものではないが、以下の実験例においてグルコース異性化酵素 を例証する。

実験例 実験例１−３は０．５−１０リツトルバツチで実施した。

大粒径結晶（０，５−１，０ｍｍ）のグルコース異性化酵素を全体量として約０ ．１−５Ｋｇ（湿量基準）生成した。

本発明の方法には規模の上での上限や下限はない。本発明は、数ミリメータ規模 の実験や立方メーター規模の工業生産のいずれにも適用できる。

第１実験例 出発原料の準備 グルコース異性化酵素の濃度を米国特許Ｎｏ、４，４１０．６２７に開示されて いる方法で以下のように生成する。

赤褐色ストレプトミセス属放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｂｆｇｌｎ ｏｓｕｓ）を回分発酵で３６立方メ一ター発酵させた。バッチ内の細胞塊（ｃｅ ｌｌ　ｍａｓｓ）を分離し、細胞内異性化酵素（ｌｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　 ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を放出させる。細胞破壊屑（ｃｅｌｌｄｅｂｒｌｓ）をろ 過し、溶液を含んだ透明な酵素を回収する。

前記溶液を限外ろ過し、レチン酸基（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を含んだ酵素、通常 １．６立方メーターを実験例における方法では異性化酵素を含む濃縮物として使 用しており、アリコート濃縮物が実験例では使用された。先行技術（米国特許４ ゜６０４．１９９参照）に開示されているように濃縮物の一部は晶出し、該結晶 を以下に簡単に説明する一部の実験で使用した。前記濃縮物に１０重量％の硫酸 アンモニウムを添加した。グルコース異性化酵素は不均質結晶族（ｈｅｔｅｒｏ ｇｅｎｕｏｕｓ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｆａｍｉｌｙ）として晶出された。該生成物 には１マイクロメータから５０マイクロメータの範囲の大きさを有する結晶が含 まれていた。前記結晶は、粘性固形沈澱物として円心分離で回収した。実験例の 一部においてこの沈澱物を出発原料として使用した。

結晶成長工程 異性化酵素タンパク質３６ｇ（グルコース異性化酵素活性単位（ｇｌｕｃｏｓｅ 　ｌ５ＯＩｅｒａＳｅ　：ａＣｌｌＶｌｔｙ　ｕｎｌｔ）を約１４０万（１，４ ｍ１ｌｌｉｏｎ）　Ｇ　Ｉ　Ｕ）含有したグルコース異性化酵素濃縮物１．８リ ツトルを晶出器（径１５０ｃｍ、高さ１７０ｃｍ）内に注入した。羽根車で撹拌 を開始し、その速度は処理全体を通じて１１００ｒｐの速度に保たれていた。次 に、硫酸アンモニウム（０，２ｋｇ）を添加して分解する。

前記晶出器は温度１０℃の外部水槽で冷却される。ポンプを始動する。流量は時 間当たり４リツトルに調整されている。晶出混合物は、径が４．５ｃｍで高さが １８ｃｍの円筒形沈降チューブ内を移動する。該混合物は、次に温度５０℃の水 槽内に浸漬された熱交換器内部を流動する。熱交換器の内部容積は３９ｍ１で、 径は４ｍｍである。前記結晶を熱交換器で分解し、溶液は晶出器へと戻される。

当初、晶出器内に現れる結晶の大きさは全て５０マイクロメータ以下であった。

連続して分解を行い、熱交換器内部を循環させることにより高濃度の過飽和状態 が維持される。過飽和状態のため、晶出器内に残留した結晶全てを容易に連続成 長させることができる。しかしながら、小形結晶中の多くは沈降器チューブ内部 を流動し、分解された状態にある。このため、結晶が大形化するにつれ分解回路 を流動しなくなる。最も大形の結晶の場合、その沈降速度は沈降器チューブ内で の線流れ速度（ｌｉｎｅａｒ　ｆｌｏｗ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）よりも大きくなる ことが確認された。このような結晶の場合、分解熱交換器に流入することは実際 にはなかった。

以上の工程を繰り返した場合、次のことが観測される。

すなわち、結晶の平均粒径は連続的な成長を示していた。

初めの３−４時間で、概して時間当たり５０マイクロメータの成長が確認された 。当初、無数あった小形結晶（１−５０マイクロメータ）は、工程が後半になる に従い極めて小さくなり、実質的に無視できる量となって消滅した。以下に示す 表１からも分かるように、２５時間経過後、グルコース異性化酵素の９５％以上 は、径７００−１１００マイクロメータの結晶となって晶出した。結晶の大きさ が非常に大きく、無視できる程度の量の結晶が熱交換器内部を移動するようにな った時に結晶の成長は実質的に終了する。

工程の終盤では晶出した異性化酵素の全てが大形の結晶になった。

２５時間経過後、ポンプおよび撹拌動作を停止させ、結晶を晶出器内部に沈澱さ せた。三十分後、デカント法により母液を除去する。異性化酵素結晶沈澱物を含 有したソリッド水（ｓｏｌｉｄ　ｗａｔｅｒ）の重量は１００ｇであった。初期 の異性化酵素の９５％以上は結晶沈澱物中に存在していた。

表１ 第１実験例における結晶成長 結晶粒径 時間　単位、マイクロメータ 第２実験例 高温、高結晶密度での晶出処理 この実験は、前記第１実験例と同じ装置を用いて行った。

晶出器内でグルコース異性化酵素結晶沈澱物５３０ｇと水道水１３５０グラムを 混合した。異性化酵素結晶が全て分解されるまで熱交換器内部を循環させ、撹拌 して２７℃の温度まで加熱した。４０分で終了するこの処理の期間中は晶出器は 冷却しなかった。硫酸アンモニウム１５０グラムが溶液中に溶解し、濃度は１０ ％となった。

晶出器を１８℃になるまで水槽で冷却する。前記溶液は、５０℃の水槽に浸漬さ れた熱交換器内を時間当たり７リントルの流量で吸入排出される。熱交換器から 流入してくる溶液の加温効果のため晶出器内の溶液の温度は２１℃となった。

晶出器の内部温度が２１℃まで低下すると即座に晶出が開始される。当初、結晶 は急激に成長し、１時間後の最も大形の結晶の粒径は３００マイクロメータであ った。異性化酵素がいったん大形結晶に変換されると成長速度は急激に低下する 。２０時間後、はとんどの結晶の粒径は約５００マイクロメータから９００マイ クロメータの範囲であった。第１実験例と同様に３０分沈降させた後、デカント 法により大形の結晶が回収された。結晶沈澱物の重量は４００グラムで、該重量 は結晶重量ベースで７５％の収率である。本実験例においては、比較的高い温度 を使用しているため回収されなかった異性化酵素の多（は母液中に溶解してしま った。（母液中の異性化酵素は冷却、再晶出により回収された。） 第３実験例 装置のほとんどは、第１実験例とほぼ同じものを使用したが、その大きさは異な っている。前記晶出器は、内容量２０リツトルのポリエチレンコンテナである。

液体か緩やかに回転するよう晶出器内の溶液は、羽根車で優しく撹拌した。前記 溶液は、４ｍｍ径の通常のチューブを介して撹拌器の軸近傍まで搬送され、４７ ℃の水槽内の加熱コイルを経て吸入排出される。加熱された後、前記溶液は１０ ℃の水槽内に浸漬された冷却コイル内を通過する。こうして冷却された溶液は晶 出器に戻される。

この処理では、グルコース異性化酵素６．２ｋｇ分を使用した。前記晶出器に１ ０％硫酸アルミニウム溶液１２゜５キログラムを添加し、撹拌し、均質懸濁液（ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｓｕｓｐｅｎｓ　Ｉｏｎ）を生成した。処理全体を通じ て、撹拌速度は１８０ｒｐｍに保たれ、羽根車は底から１ｃｍの高さに調整した 。前記溶液は、時間当たり５リツトルの流量で熱交換器内を吸入排出される。前 記晶出器の内部温度は１２℃であった。

第１実験例に記された工業規模の回収処理で発生した結晶の粒径は１マイクロメ ータから１００マイクロメータの範囲であった。実際には、この処理の開始段階 で溶解した結晶はない。しかしながら、晶出器の表面もしくは中心部から溶液を 排出するに従い、小形の結晶は徐々に消滅した。

晶出器のコンテナー自体が沈降器の役割を果たしたのである。小形の結晶は溶解 回路内の流体により容易に搬送されることが確認された。液体の回転動作を利用 することにより分離効果が向上した。

この処理は１２０時間継続された。結局、晶出された異性化酵素の粒径分布は極 めて範囲の狭いものであり、すなわち、結晶の粒径は１５０マイクロメータから ２１０マイクロメタであった。また、小形の結晶は観察されなかった。

結晶を沈降させ、母液はデカント法で除去した。この結果、回収された結晶の重 量は６．１ｋｇであった。

第４実験例 グルコース異性化酵素結晶（３６％の酵素タンパク質と６４％の水分を含有して いる）５００グラムと１０％硫酸アンモニウム溶液２０００ｍ１を混合した。こ の混合液を晶出器内に注入する。この懸濁液を、三枚羽根で径が１１ｃｍのステ ンレススチール製のプロペラで撹拌した。晶出器の温度は、温度を８℃に保たれ た外部冷却漕を用いて１６℃に維持した。該懸濁液は、５０℃の水槽内に浸漬さ れた熱交換器を介して吸入排出される。流量は、時間当たり３リツトルであった 。この工程を２４時間継続した。懸濁液を含有した結晶は別に取っておき、他の 実験で使用した。

前記プロペラは、結晶性異性化酵素の透明層で被膜された。前記層の重量は約３ グラムである。前記酵素層は、温度４℃の１０％硫酸アンモニウム中のグルタル アルデヒド溶液中に４時間浸漬すると架橋結合される。こうして架橋結合された 酵素の層はプロペラ上にしっかりと固着する。

酵素被膜されたプロペラは、１０％グルコースの４００ｍ１試料中で撹拌するこ とにより酵素作用を示す。４０”Ｃで１時間撹拌した後の試料中の果糖含有物は 約４％であった。

第５実験例 第４実験例で使用したものと同一の装置を使用した。グルコース異性化酵素結晶 （湿量基準、６０％の水分）５３０グラムを晶出器内に注入した。１３５０グラ ムの水を添加し、混合物を常時撹拌し、結晶層てが分解するまで３０℃で加熱し た。硫酸アンモニウム１５０ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。次に前記晶 出器内の温度を低下させ、外部冷却漕で２３℃に保った。前記酵素溶液を、５０ ℃の水槽内に浸漬された熱交換器内を時間当たり８リツトルの流量で吸入排出す る。熱交換器内部を通過した結晶は全て溶解した。処理全体を通じて撹拌器の撹 拌速度は１１００ｒｐであった。

処理は２５時間継続された。この間、晶出器の内容物は別の容器に移しておいた 。遊離した液体（ｌｏｏｓｅ　１ｉｑｕｉｄ）を全て除去するため前記晶出器を ぬぐい取り、検量した。晶出器の内壁は結晶性グルコース異性化酵素からなるガ ラス状の層で被膜されていた。晶出器の自重を差引き、酵素の層の重量を算出し たところ結晶は３９グラム湿量であった。

酵素層は以下に示す架橋結合により固定されていた。すなわち、前記晶出器内部 を氷のように冷たい（１’Ｃ）１０％硫酸アンモニウムで満たす。該硫酸アンモ ニウムは、異性化酵素層が溶解するのを防ぐため前回グルコース異性化酵素結晶 で飽和させたものである。５０％グルタルアルデヒドを５０ｍ１添加し、架橋結 合が発生するまで混合物を３時間撹拌した。架橋結合が発生すると、晶出器の中 身を取りだし、可溶物（ｓｏｌｕｂｌｅｓ）が全て取り除かれるまで水で洗浄し た。この結果、異性化酵素は、ステンレススチール製容器の壁面に黄色みがかっ た茶色のガラスのような層を形成する。

晶出器にｐＨ値７．５で３０％グルコース溶液を２リツトルを注入すると該酵素 層は酵素作用を示す。前記溶液から試料を採取し、果糖の検定を行った。この結 果、連続的に果糖が増加していくのが確認された。３時間経過した時点で、果糖 濃度は１３％、またグルコースの濃度は１７％であった。

第６実験例 ３５℃まで加熱して１２％硫酸アンモニウム溶液１０１００Ｏ中にグルコース異 性化酵素結晶（前回同様湿量）３００グラムを溶解させ、粒径が３００マイクロ メータから５００マイクロメータ（平均４００）の範囲のガラスビード（ｇｌａ ｓｓ　ｂｅａｃｌｓ）　５０　ｇを添加した。ビードの沈降を防ぐためプロペラ を用いて前記晶出器内部の混合物を１２ｏ「ｐｒｎの速度で撹拌した。懸濁液を ２０℃の温度になるまで冷却し、晶出を開始した。前記溶液は、温度５０℃の水 槽内に浸漬された篩および熱交換器内を時間当たり１リツトルの流量で循環する 。遊離結晶は全てヒーター内で溶解した。この処理を１８時間継続した。前記ガ ラスビードは、厚さ１００マイクロメータの結晶性グルコース異性化酵素の層で 被膜された。

この実験例からガラス表面で酵素が晶出することが明かとなった。しかしながら 、本実験例の酵素の層は他の実験例の場合はど力学的には安定していないことが 確認された。

撹拌時間を延長すると、酵素層はビードから剥離してしまった。

第７実験例 前記晶出器内でグルコース異性化酵素（湿量基準）５５０グラムと１０％硫酸ア ンモニウム溶液２０００ｍ１を混合する。複合球形ビード１００グラム（充填層 容量（ｐａｃｋｅｄ　ｂｅｄ　ＶＯＩＬＪＩ６）　１３０　ｍ　ｌ　）を添加し た。該ビードは次のような構造を有している。

−径　５００−８００マイクロメータ ー　コア球体　ポリスチレンとワックスを溶融したちの−短繊維天然セルロース の表面層は溶解したポリスチレンにより前記コア球体に接着されている−　セル ロース含有量２０重量％ −前記セルロースの繊維の長さ、５０マイクロメ一タ未満 処理全般を通じて、前記混合物は１１００ｒｐの速度で撹拌した。当初、温度を １６℃に調整し、処理の後半では徐々に１１℃まで低下させた。前記溶液の吸入 排出は、５０℃の水槽内に浸漬された篩（流量は徐々に減少させた）と熱交換器 を介して、当初は時間当たり７リツトルの流量で行い、後半は時間当たり３リツ トルの流量で行った。この処理で要した時間は全体としては４７時間であった。

最後には、異性化酵素のほとんどがビードの表面に略完全な球形の層状に積層し た。前記複合ビード表面に積層した酵素結晶層の鋭いエツジは、処理の最中に間 断なく摩耗され、比較的滑らかな球形層が形成された。しかしながら、光学もし くは走査型電子顕微鏡の高倍率（１００ｘ以上）では、前記球形層の表面全体が グルコース異性化酵素の通常の結晶面で被われているのが観察された。前記酵素 被膜にガラス状の透明感があることから前記層には結晶性があることが判明した 。

以下のように、架橋結合によって前記球形層表面に酵素は固定されていた。

高濃度の懸濁液を生成するため母液１１００ｍｌを別の容器に移す。架橋結合処 理期間中の混合物の温度は４℃に保たれていた。リジン塩酸塩１２０グラムを添 加し、撹拌しながら溶解させる。処理中のｐＨ値を６−８の範囲に維持するため りん酸カリウム（ｄｆｐｏｔａｓｓｌｕ＊　ｈｙｄｒｏｇｅｎｎ　ｐｈｏｓｐｈ ａｔｅ）　１モルを添加した。さらに、５０％グルタルアルデヒド２５０ｍ１を 添加する。その後、混合物を３時間率撹拌する。母液を別の容器に移し、視認可 能な着色された液体および小形粒子の全てが取り除かれるまで５００マイクロメ ータの径の標準的筋を用いて生成物を水洗した。水が完全になくなると商の表面 に球形の生成粒子が流出された。

生成物の重量は５５０ｇで、沈降バルク容積（ｓｅｄ　１Ｉｌｅｎｔｅｄｂｕｌ ｋ　ｖｏｌｕｍｅ）は４００ｍ１であった。生成物は、非常に均一な茶色の球体 であった。前記球体の９５％の粒径は９゜Ｏから１１００マイクロメータの範囲 である。複合粒子が小形になるほどその被膜層の厚さが増し、粒径が大きくなる ほど異性化酵素の層は薄くなることが判明した。このように、生成物の粒径分布 の範囲は、初期のコア粒子よりも狭いものであった。

前記生成物の試料５グラムと６０℃の４０％グルコース１００ｍ１とを混合撹拌 することにより酵素作用があることが実験から明かとなった。混合物中の果糖の 含有量は２時間の間に１８％まで増加した。

第８実験例 複合キャリヤ１００グラムを被膜用核として使用した。

前記キャリヤは以下のような組成、形状を備えている。

−２５％本繊維セルロース −２５％二酸化チタン −接着剤として５０％ポリスチレン −粒径３５０−８５０マイクロメータ　−粒子形状は不定形　−当該物質は米国 特許Ｎｏ、４．３５５．１１７中の第１実験例（しかしながら、ジエチルアミノ クロリド塩酸塩は顆粒を誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）　していない。）晶出 器内において、グルコース異性化酵素結晶（湿量基準）２００グラムと１０％硫 酸アンモニウム１８００ｍｌを前記キャリヤと混合する。処理全体を通じて、該 混合物は１１００ｒｐの速度で撹拌された。当該液体を、５０’Ｃの水槽内に浸 漬されたスクリーンと熱交換器を介して時間当たり２リツトルの流量で吸引排出 した。前記晶出器の内部温度は８℃に保たれていた。

当該処理は２４時間後に停止された。その後、晶出器の内容物は３００マイクロ メータの径を有する篩に注入排出され、母液を取り除いた。篩上の生成物を分析 するとグルコース異性化酵素であった。前記生成物には、キャリヤの表面に被膜 した結晶異性化酵素１５０グラムが含有されており、残りの５０グラムの酵素は 篩から排出された母液内に存在していた。顕微鏡で観察すると、前記酵素は、黒 っぽい不透明なキャリヤ粒子上にガラスのように透明な層を形成しているように 見えた。

該酵素は、グルタルアルデヒドにより前記粒子表面に架橋結合して固定されてい た。グルコースと混合し、また果糖への転化を観察すると酵素作用が確認された 。

第９実験例 硫酸マグネシウム媒質中での晶出方法 第１実験例と同様にグルコース異性化濃縮物を生成する。

硫酸マグネシウム（乾燥物質として計算）１．２８グラムを添加し、温度２５℃ の濃縮物１リツトル中に溶解させる。

前記混合物を間断なく撹拌し、５℃まで冷却する。この結果、グルコース異性化 酵素が急速に晶出され、３時間後にはオリジナル活量（ｏｒｉｇｉｎａｌ　ａｃ ｔｉｖｉｔｙ）の９７％が晶出し、３％が依然母液中に存在していた。これ以外 に沈澱もしくは晶出した物質はなにもなかった。前記結晶異性化酵素は、第１実 験例に記載された円心分離法により回収された。この結晶沈澱物は硫酸マグネシ ウム媒質試験で出発原料として使用した。

結晶成長方法 第２図の装置を以下の方法に使用した。グルコース異性化酵素結晶１ｋｇを２％ 硫酸マグネシウム溶液５リツトル中で懸濁させた。前記小形結晶は、温度を５０ ”Ｃに維持した水槽内に浸漬された加熱コイル内を循環する。循環速度は時間当 たり１５リツトルであった。晶出器は１６℃に保たれていた。この処理は２０時 間継続された。特に、この処理の後得られた結晶の粒径は全て５００マイクロメ ータから７００マイクロメータの範囲にあった。

第１０実験例 第１図の装置を以下の方法で使用した。晶出器内の反応混合物は以下のとうりで あった。

グルコース異性化酵素結晶３．４ｋｇ 第８実験例に記載されている複合キャリヤ３．９ｋｇ２％硫酸マグネシウム１５ リツトル 前記晶出器の温度は１６℃に保つ。遊離異性化酵素結晶を含有する母液を、５０ ℃に維持された水槽中に浸漬された加熱コイル内を循環させる。２４時間以内に 、異性化酵素蛋白質の８０％がキャリヤ表面に結晶層として堆積した。

母液はデカント法で除去した。酵素被膜された物質を架橋結合処理し、キャリヤ 上の酵素を固定した。架橋結合した最終生成物のタンパク質含有量は２１％であ った。第７実験例と同様に試験すると、前記生成物に酵素作用が確認された。

第９及び第１０実験例から本発明の方法は異なる媒質を使用した場合にも機能す ることが判明した。当然の結果、酵素の溶解度を低下させる化学的および物理的 条件は全て本発明の方法において機能するよう調整することが可能である。

上記開示された本発明の改良、変更などは当該技術分野に精通した者であれば容 易に考えられる。しかしながら、上記明細書は以下の請求の範囲で規定されてい る本発明の思想を同等制限するものではない。

ｒｃ″ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．結晶生成を行わせるため結晶性酵素溶液を十分低温に保つ段階と、比較的小 形の酵素結晶を含有する流体と前記溶液とを分離し、前記冷却された溶液を過飽 和状態に維持する段階と、前記小形結晶が略溶解するよう前記流体を加熱する段 階と、次の晶出を行うため溶解された酵素を有する前記流体を前記溶液に帰還さ せる段階とから構成されていることを特徴とする均一で比較的大形の結晶性酵素 の結晶を生成する方法。 ２．前記結晶性酵素溶液は約２℃から約２５℃の温度範囲に保たれていることを 特徴とする請求の範囲第１項記載の結晶生成方法。 ３．前記結晶性溶液には、１リットル当たり約１グラムから約４００グラムの範 囲の蛋白質が含有されていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の結晶生成 方法。 ４．前記加熱温度は約２５℃から約６０℃の範囲にあることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の結晶生成方法。 ５．酵素溶解度低減剤を前記過飽和酵素溶液中に添加することを特徴とする請求 の範囲第１項記載の結晶生成方法。 ６．前記酵素溶解度低減剤は塩であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の 結晶生成方法。 ７．前記塩は硫酸マグネシウムまたは硫酸アンモニウムであることを特徴とする 請求の範囲第６項記載の結晶生成方法。 ８．前記酵素はグルコース異性化酵素であることを特徴とする請求の範囲第７項 記載の結晶生成方法。 ９．（１）結晶成長チャンバに結晶性酵素の飽和溶液もしくは微細懸濁液を注入 する段階と、 （２）前記結晶成長チャンバ内の前記溶液もしくは懸濁液の温度を結晶生成を行 うのに十分な低温に保つ段階と、 （３）分離段階であり、懸濁された結晶を含有する前記冷却された液体の一部を 粒径分級手段内を連続循環させて比較的小形の結晶と比較的大形の結晶とを分離 し、これにより前記比較的小形の結晶は流体として前記チャンバから流出し、前 記比較的大形の結晶は前記チャンバ内に残留する分離段階と、 （４）前記流体の中に懸濁されている結晶が略溶解されるよう比較的小形の酵素 結晶を含有している前記流体を加熱する段階と、 （５）前記チャンバ内の前記液体を過飽和状態に保つため溶解された酵素を有す る前記加熱された流体を前記結晶成長チヤンバに帰還させる段階と、（６）前記 結晶成長チャンバ内の結晶が所望の大きさに成長するまで前記第２段階から第５ 段階までを継続する段階と、 （７）所望の大きさに成長した酵素の比較的大形の結晶を回収する段階とから構 成されていることを特徴とする比較的大形で均一な結晶性酵素の結晶を成長させ る方法。 １０．前記晶出チャンバの温度は約８℃から約２０℃の範囲にあることを特徴と する請求の範囲第８項記載の結晶成長方法。 １１．前記結晶性溶液には１リットル当たり５０グラムから約２００グラムの蛋 白質が含有されていることを特徴とする請求の範囲第９項記載の結晶成長方法。 １２．前記加熱温度は約３０℃から約５０℃の範囲であることを特徴とする請求 の範囲第８項記載の結晶成長方法。 １３．前記結晶性酵素の溶解度を低減させるため前記過飽和溶液または前記微細 懸濁液に塩を添加することを特徴とする請求の範囲第８項記載の結晶成長方法。 １４．前記塩は硫酸マグネシウムまたは硫酸アンモニウムであることを特徴とす る請求の範囲第１３項記載の結晶成長方法。 １５．前記結晶性溶液に約５重量％から約１５重量％の濃度で硫酸アンモニウム を添加することを特徴とする請求の範囲第１４項記載の結晶成長方法。 １６．前記結晶性溶液に約１重量％から約５重量％の濃度で硫酸マグネシウムを 添加することを特徴とする請求の範囲第１４項記載の結晶成長方法。 １７．前記結晶性酵素はグルコース異性化酵素であることを特徴とする請求の範 囲第１４項記載の結晶成長方法。 １８．チャンバ内に過飽和結晶性酵素溶液を保持する段階であり、前記過飽和結 晶性酵素溶液においては、結晶生成が行われるよう前記溶液の温度は十分低温に 保たれている過飽和結晶性酵素溶液保持段階と、分級器内を通過させて液体を含 む小形結晶を前記チャンバから連続排出する段階と、 前記小形結晶が溶解するよう前記液体を加熱する段階と、 前記液体を前記チャンバに帰還させる段階と、前記チャンバ内の前記結晶を沈降 させ、収集する段階とから構成されることを特徴とする大形酵素結晶生成方法。 １９．（１）結晶性酵素の飽和溶液または微細懸濁液を内包している結晶成長チ ャンバ内に不溶性、不活性物質を注入する段階と、 （２）結晶生成が行われるよう前記結晶成長チャンバ内の前記溶液の温度を十分 低温に保つ段階で、結晶の一部は前記不活性物質の表面上に堆積し、また他の一 部は遊離結晶として存在する溶液温度維持段階と、（３）流体内の前記遊離結晶 を前記結晶成長チャンバから常時排出する段階と、 （４）前記流体内に懸濁されている前記結晶が略溶解するよう前記流体を加熱す る段階と、 （５）前記溶液が過飽和状態を維持するよう溶解結晶を有する前記流体を前記結 晶成長チャンバに帰還させる段階と、 （６）前記固形物質が十分に被膜されるまで前記第２段階から前記第５段階まで を継続する段階と、（７）前記固形物質を除去する段階とから構成されているこ とを特徴とする固形キャリヤ上で酵素結晶を成長させる方法。 ２０．前記不活性物質はガラス、ステンレススチール、セルロース、テフロン、 イオン交換レジンあるいはプラスチックから構成されることを特徴とする請求の 範囲第１９項記載の酵素結晶成長方法。 ２１．前記結晶成長チャンバの温度は約２℃から約７℃の範囲に維持されている ことを特徴とする請求の範囲第１９項記載の酵素結晶成長方法。 ２２．前記飽和溶液または前記微細懸濁液には１リットル当たり約２グラムから 約１００グラムの蛋白質が含有されていることを特徴とする請求の範囲第１９項 記載の酵素結晶成長方法。 ２３．前記加熱は約３０℃から約５０℃の範囲であることを特徴とする請求の範 囲第１９項記載の酵素結晶成長方法。 ２４．前記結晶性酵素の溶解度を低減させるため前記飽和溶液もしくは前記微細 懸濁液に塩を添加することを特徴とする請求の範囲第１９項記載の酵素結晶成長 方法。 ２５．前記塩は硫酸アンモニウムまたは硫酸マグネシウムであることを特徴とす る請求の範囲第２４項記載の酵素結晶成長方法。 ２６．前記溶液に１重量％から５重量％の濃度範囲で硫酸マグネシウムを添加す ることを特徴とする請求の範囲第２５項記載の酵素結晶成長方法。 ２７．前記溶液に５重量％から１５重量％の濃度範囲で硫酸アンモニウムを添加 することを特徴とする請求の範囲第２５項記載の酵素結晶成長方法。 ２８．前記結晶性酵素はグルコース異性化酵素であることを特徴とする請求の範 囲第２５項記載の酵素結晶成長方法。