DE69025949T2 - Verfahren zum wachstum von enzymkristallen - Google Patents
Verfahren zum wachstum von enzymkristallenInfo
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Description
- In der Literatur wird die Herstellung großer Einkristalle von Proteinen und Enzymen für Forschungszwecke, wie z. B. für die Röntgen-Kristallographie, umfangreich beschrieben. Das Prinzip der meisten dieser Verfahren besteht darin, das Enzym im Laufe von mehreren Tagen, Wochen oder sogar Monaten durch Verdampfen von Wassers aus der Probe sehr langsam einzuengen. Eine Übersicht über diese Verfahren findet sich im Journal of Crystal Growth, Bd. 90 (1980), S. 1-368, wo viele Verfahren und Vorgangsweisen beschrieben werden, die beim Kristallisieren biologischer Makromoleküle als zielführend angesehen werden. Keines dieser bekannten Verfahren eignet sich jedoch zur Produktion von großen, einheitlichen Enzymkristallen in präparativem oder industriellem Maßstab.
- Es gibt eine Unmenge an Veröffentlichungen und an Kenntnissen über die Kristallisation niedermolekularer organischer und anorganischer Verbindungen. Bei vielen niedermolekularen Verbindungen ist bekannt, wie große, einheitliche Kristalle durch Verdampfungs- oder Kühlchargenkristallisation gebildet werden. Es gibt zahlreiche Verfahren zur selektiven Entfernung kleiner Kristalle aus einem Kristallisator und des anschließenden Sammelns der gewünschten Klasse großer Kristalle. Üblicherweise umfassen die Vorgangsweisen das Beibehalten eines bestimmten Grades an Übersättigung, bis die gewünschte Kristallgröße erreicht ist. Trotz des umfangreichen theoretischen und praktischen Wissens über die Kristallisation im allgemeinen wurden jedoch die Kristallwachstumsverfahren, die Kristalle nach der Größe ordnen und die Herstellung großer Kristalle ermöglichen, auf die mehr als 1025 Beispiele für die Kristallisation biologischer Makromoleküle nicht angewandt [G.L. Gilliland: A biological macromolecule crystallization database: a basis for a crystallization strategy. Journal of Crystal Growth, Bd. 90 (1988), S.51-59].
- Ein Chargenkristallisationsverfahren in industriellem Maßstab für Glucose-Isomerase wird in US-A-4.699.882 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird das Enzym in einer geeigneten Konzentration von Ammoniumsulfat kristallisiert. Die hergestellten Kristalle sind von unterschiedlicher Größe, typischerweise 1 bis 100 µm, und die Größenverteilung bzw. die Durchschnittsgröße unterliegt keiner Steuerung. Das Verfahren eignet sich für die Produktion in großem Maßstab, jedoch nicht für die Bildung großer, d.h. 0,5 bis 1 mm großer, Kristalle bzw. für die Kristallisation von so großen Kristalle auf der Oberfläche fester, inerter Materialien.
- Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein industrielles Verfahren zur Herstellung großer Enzymkristalle bereitzustellen. Solche Kristalle bieten insoferne zahlreiche Vorteile, als sie direkt in Säulen verwendet werden können (falls sie im Substrat unlöslich sind), und sie vermeiden Verstopfungs- bzw. Fließwiderstandsprobleme, die bei kleinen Kristallen auftreten würden. Weiters können die als große Kristalle ausgebildeten Enzyme von anderen Materialien (Verunreinigungen), wie z.B. kleinen, teilchenförmigen Bruchstücken wie amorphem Niederschlag oder Zellwänden (die typischerweise eine Größe von 0,1-1 µm aufweisen), durch Sieben oder Sedimentieren und Zentrifugieren leichter getrennt werden, wodurch ihre Herstellung in größeren Ausbeuten ermöglicht wird.
- Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Ablagern von Enzymen als kristalline Schichten auf Oberflächen inerter Materialien bereitzustellen, wodurch das beschichtete Material dazu dienen kann, spezifische Reaktionen zu katalysieren. Die Verwendung von Fremdmaterialien als Kristallisationskern bietet ein neuartiges und überraschend vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme. Das hierin geoffenbarte Verfahren eignet sich auch sehr gut zum Züchten großer Enzymkristallmassen auf solchen festen Oberflächen. Durch das Züchten großer Kristalle auf der Oberfläche fester Materialien wird ein einfaches Verfahren zur Gewinnung, Immobilisierung und Verwendung von Enzymen in industriellen Verfahren bereitgestellt.
- Diese und andere Vorteile ergeben sich aus der Verwendung von Kristallen oder kristall beschichteten Festkörpern, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Gemäß der Erfindung werden relativ große Enzymkristalle entweder als reine einzelne Kristalle oder als kristalline Ablagerungen auffesten Materialien gebildet. Gemäß einer Ausführungsform wird eine gekühlte Kristallwachstumskammer (Kristallisator) mit einer gesättigten Lösung oder einer feinen Suspension eines kristallisierbaren Enzyms gefüllt. Die Lösung bzw. Suspension wird daraufhin abgekühlt, um die Kristallisation von Enzymkristallen zu initiieren. Ein Teil der Flüssigkeit in der Kammer wird kontinuierlich entfernt und trägt einen Teil der neugebildeten Kristalle als Suspension mit sich fort. Die Flüssigkeit wird durch eine Klassierungsvorrichtung entfernt, die relativ große Kristalle zurückhält und nur relativ kleine Kristalle passieren läßt. Die die relativ kleinen Kristalle befördernde Flüssigkeit wird neuerlich erhitzt, um die Enzymkristalle zu lösen, und das gelöste Enzym wird zur gekühlten Kristallwachstumskammer zurückgeführt, wo wiederum dessen Kristallisation bewirkt wird. Die Kristallisation tritt zumindest teilweise auf den zuvor gebildeten, relativ großen Kristallen auf, die durch die Wirkungsweise der Klassierungsvorrichtung die Kristallwachstumskammer nicht verlassen konnten. Auf diese Weise werden die relativ großen Enzymkristalle unter der fortlaufenden Wirkung von Kristallisation, Größenklassierung, Wiedererhitzung und Rückführung des Enzyms aus kleineren Kristallen wachsen gelassen.
- Die Entfernung des Enzyms aus kleineren Kristallen und dessen Rückführung im gelösten Zustand hält die flüssige Umgebung in der Kristallwachstumskammer in einem übersättigten Zustand. Die großen Kristalle werden geerntet bzw. gewonnen, wenn sie die für ihren eigentlichen Zweck geeignete Größe erreichen. In der vorliegenden Ausführungsform können große Enzymkristalle mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm hergestellt werden. Solche Enzyme können auf herkömmliche Weise, wie z.B. Sedimentation oder Zentrifugation, laufend gesammelt und in Verfahren in industriellem Maßstab vorteilhaft eingesetzt werden.
- In einer weiteren Ausführungsform werden fixierte, lose oder frei schwimmende, unlösliche, im wesentlichen inerte Materialien in die Kristallkammer eingebracht, wobei ein Teil des kristallisierenden Enzyms auf der Oberfläche des Materials abgelagert ist, das als Kristallisationskern dient. Wenn das feste Material in der Kammer fixiert ist, können die nicht abgelagerten, flüssigkeitshältigen Kristalle kontinuierlich aus dem Kristal lisator entfernt werden, ohne eine Klassierungsvorrichtung zu durchlaufen. Die Flüssigkeit wird erhitzt, um einen beträchtlichen Teil des Enzyms zu lösen, und zum Kristallisator zurückgeführt, in dem das Enzym direkt auf der Oberfläche des festen Materials kristallisiert wird, wodurch die Kristallschicht entsteht. Wenn das oder die zu beschichtende(n) Material/Materialien aus frei schwebenden Teilchen besteht/bestehen, ist möglicherweise eine Klassierungsvorrichtung, wie z.B. ein Sieb, notwendig, um die Teilchen im Kristallisator zu halten, während die anderen nicht-abgelagerten Kristalle entfernt, erneut gelöst und wie zuvor zur Kammer zurückgeführt werden. In beiden Ausführungsformen mit einem inerten Material kann die Oberfläche des Materials mit einer beliebig dicken Schicht versehen werden, soferne ein Zustand der Übersättigung im Kristallisator beibehalten wird. Sobald in der bevorzugten Ausführungsform das Enzym abgelagert ist, wird es durch Vernetzung mit einem Mittel wie z.B. Glutaraldehyd am festen Material fixiert.
- Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- In den Abbildungen (insbesondere Fig. 1 und 2) wird eine Kristallisationskammer 1 dargestellt, die ein einfaches zylindrisches Becherglas bzw. Behälter sein kann. Die Kammer enthält eine gesättigte Lösung oder eine feine Suspension eines kristallisierbaren Enzyms 2. Die Kristallisationskammer 1 (der Kristallisator) ist mit einem Rührer 11 ausgestattet und wird, vorzugsweise mit einem ein Wärmeübertragungsmedium 21 enthaltenden Kühlmantel 18, gekühlt, um eine gewählte Temperatur zu halten, bei der sich Kristalle 3 bilden. Beim Bilden der Kristalle wird mit Hilfe einer Pumpe 4 ein Flüssigkeitsstrom 5 kontinuierlich aus dem Kristallisator 1 durch eine Klassierungsvorrichtung 6 gepumpt. Diese Vorrichtung kann ein Sieb (Fig. 1) oder ein einfaches Rohr mit weiter Bohrung, eine Sedimentationsvorrichtung 12 (Fig. 2) oder ein Hydrozyklon oder jede andere Vorrichtung sein, die herkömmlicherweise zur Klassierung fester, in einer Flüssigkeit suspendierter Teilchen verwendet wird. Die Klassierungsvorrichtung 6 bewirkt, daß kleine Kristalle 7 hindurchgelangen können, während relativ große Kristalle zurückgehalten werden. Die abgetrennte Flüssigkeit mit den relativ kleinen Kristallen bewegt sich durch ein Rohr 19 zu einem Wärmetauscher 9, wo sie erhitzt wird, um einen beträchtlichen Teil der oder alle Kristalle 7 in der Flüssigkeit zu lösen. Wie aus der Figur ersichtlich, ist der Wärmetauscher 9 ein einfaches, temperaturgeregeltes Bad, in dem die Wärmeübertragung zwischen der Flüssigkeit 10 und dem enzymhältigen Strom 5 ausreicht, um das Enzym zu schmelzen. Die gelöstes Enzym enthaltende Flüssigkeit wird durch ein Rohr 20 zum Kristallisator 1 zurückgeführt, wo ihre Temperatur bei der Vermischung mit der Charge mittels eines Rührers 11 sofort sinkt. Neue Kristalle bilden sich, von denen einige auf den bereits bestehenden, durch die Klassierungsvorrichtung 6 zurückgehaltenen Kristallen 8 wachsen. Mittels dieser Vorgangsweise wird kontinuierlich ein hoher Übersättigungsgrad erzielt, bis das gesamte kristallisierbare Enzym auf der ausgewählten Gruppe relativ großer Kristalle abgelagert ist, die die Kammer 1 nicht verlassen durften.
- Das beschriebene Verfahren eignet sich für eine Vielzahl an kristallisierbaren Enzymen, wie z.B. Glucose-Isomerase, Meerrettich-Peroxidase, Gerste-β-Amylase, Lysozym aus Hühnereiweiß, α-Amylase aus Schweinepankreas, Hämoglobin und Aldolase aus Hasenskelettmuskeln.
- Gegebenenfalls können zu Beginn oder während des Kristallisationsverfahrens bestimmte Salze, wie z.B. Ammonium- oder Magnesiumsulfat, verwendet werden, um die Löslichkeit des Enzyms herabzusetzen und dessen Kristallisation zu bewirken. Ein gutes Beispiel für ein Enzym, für das sich diese Vorgangsweise eignet, ist Glucose- Isomerase. In Untersuchungen mit Glucose-Isomerase wurde ermittelt, daß die Kristalle bei einer Magnesiumsulfat-Konzentration von etwa 1,5% ein Löslichkeitsminimum aufweisen. Die Löslichkeit von Glucose-Isomerase nimmt zu, wenn die Magnesiumsulfat-Konzentration über das Minimum steigt. Unter Verwendung von Ammoniumsulfat nimmt hingegen die Löslichkeit von Glucose-Isomerase gemäß der bekannten allgemeinen Aussalzformel für Proteine logS = A + (B) (I), worin 5 die Löslichkeit ist, A und B Konstanten sind, die vom Enzym abhängen, und I die Ionenstärke des Mediums ist (direkt proportional zur Salzkonzentration), mit steigender Salzkonzentration ab.
- Bei allen Magnesium- und Ammoniumsulfat-Konzentrationen ist die Löslichkeit bei höheren Temperaturen höher. Somit dient das Heizverfahren dazu, die kleinen Kristalle im erfindungsgemäßen Verfahren zu lösen.
- Das zum Bewirken von Kristallisation verwendete Salz und die optimale Salzkonzentration variieren je nach Beschaffenheit des Enzyms. Weiters hängt die Auswahl des Salzes möglicherweise von der Kristallisationsnachbehandlung ab, der das Kristallprodukt unterzogen wird. Im Falle der Vernetzung von Kristallen mittels z.B. Glutaraldehyd wird manchmal Ammoniumsulfat bevorzugt, da die Ammoniumionen an der Vernetzung teilnehmen (siehe die laufende US-A-350.720, die hierin durch Verweis aufgenommen ist).
- Die lmpfkristalle, die als Kernbildungsstellen für das Wachstum von Kristallen gemäß der Erfindung dienen, können nach jedem auf dem Gebiet bekannten Enzymfällungsoder -kristallisationsverfahren hergestellt werden, z.B. nach den oben beschriebenen "Aussalz"-Verfahren. Es ist jedoch auch möglich, im vorhinein gebildete Impfkristalle am Beginn des vorliegenden Verfahrens einzusetzen. Solche Impfkristalle können in früheren Kristallisationen unter Anwendung des hierin geoffenbarten Verfahrens hergestellt worden sein. Alternativ dazu können Impfkristalle anfänglich durch allmähliche Zugabe solubilisierter Enzyme als unabhängiger Feed zu einer gekühlten, gesättigten Lösung gebildet werden, bis genügend Kristalle gebildet wurden, deren Größe ausreicht, um als Impfkristalle im erfindungsgemäßen Verfahren zu dienen. Dies kann ein eigener Vorgang außerhalb der erfindungsgemäßen Kristallisationskammer sein.
- Die Größe der erneut zu lösenden und rückzuführenden, relativ kleinen Teilchen ist eine Frage der Auswahl. Je kleiner die Anzahl der in der Wachstumskammer gehaltenen Kristalle ist, desto größer müssen natürlich die Kristalle beim Löslichkeitsgleichgewicht sein. Zum Züchten relativ großer Enzymkristalle sollte daher die Anzahl der anfänglichen (Impf)Kristalle, die in der Wachstumskammer gehalten und nicht wiedergelöst werden, relativ klein gehalten werden. Dadurch kann sich das übrige Enzymmaterial während des Rückführens auf relativ wenigen lmpfkristallen ablagern, was schließlich zu relativ wenigen größeren Kristallen führt. In der Praxis ist es sehr schwierig, die Anzahl der in der kristallisierten Enzymcharge vorhandenen Kristalle zu ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren sorgt jedoch für eine rasche Verringerung der Anzahl an Impfkristallen - ungeachtet ihrer Menge. Die endgültige Größe der Kristalle wird durch die Dimensionen der Vorrichtung, der Zirkulationsrate, die Gesamtmenge des Enzyms und die Siebfähigkeit des Klassierungsmittels bestimmt. Bei Verwendung eines Siebs ist natürlich die Maschengröße entscheidend. Bei Verwendung einer Sedimentationsvorrichtung 12 mit großer Bohrung (siehe Fig. 2) sind bei gegebener Flußrate die Dimensionen des Rohrs (Breite und Höhe) entscheidend. Die Flußrate wird so festgelegt, daß eine Mitnahme der relativ großen (und schwereren) Kristalle durch die Strömung 5 verhindert wird.
- Die Rate, bei der die suspendierten, relativ kleinen Teilchen entfernt, wiedergelöst und zur Wachstumskammer zurückgeführt werden, ist vom Wachstumsverfahren selbst mehr oder weniger unabhängig und wird üblicherweise durch Überlegungen betreffend den Stoffübergang und die Wärmeübertragung eingeschränkt. Innerhalb der Grenzen des Stoffübergangs und der Wärmeübertragung wachsen die größeren Kristalle umso schneller, je rascher die relativ kleinen Teilchen entfernt werden.
- Die Dimensionen der Geräte, die Rührgeschwindigkeit und die Zirkulationsrate beeinflussen letztendlich die Größe der gebildeten Kristalle. Die endgültige Durchschnittsgröße der Kristalle ist eine kontinuierliche Funktion der Rührgeschwindigkeit, wenn die Zirkulationsrate durch die Klassierungsvorrichtung konstant gehalten wird. Die Steigerung der Rate sorgt zumeist für eine Zunahme der endgültigen Größe der Kristalle.
- Die gewählten Bedingungen hängen von der Beschaffenheit des kristallisierten Enzyms oder Makromoleküls ab. Obwohl die im bevorzugten Verfahren weiter unten beschriebenen Bedingungen besonders für Glucose-Isomerase geeignet sind, ist das Prinzip des Verfahrens auf jedes kristallisierbare Protein anwendbar. Die Bedingungen für andere Enzyme müssen an Faktoren wie die jeweilige Löslichkeit und die Kristallisierbarkeitseigenschaften solcher Enzyme angepaßt werden, die im allgemeinen allesamt bekannt oder leicht ermittelbar sind. Ungeachtet des zu kristallisierenden Enzyms ist es entscheidend, daß die Löslichkeitseigenschaften des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen bei der Konstruktion eines Systems in Betracht gezogen werden, um das Enzym unter Bedingungen zu zirkulieren, bei denen seine Löslichkeit zunimmt. In bestimmten Fällen kann die Löse-Temperatur niedriger als die Kristallisationstemperatur sein, wenn die Löslichkeit des jeweiligen Proteins bei erhöhter Temperatur abnimmt. Die Art oder die Menge des Mittels, das zur Verringerung der Löslichkeit des Enzyms in der Kristallisationskammer eingesetzt wird, ist nicht entscheidend.
- Beim bevorzugten Verfahren zur Kristallisation von Glucose-Isomerase beträgt die Enzymkonzentration etwa 1 bis etwa 400 g Protein pro Liter, am bevorzugtesten etwa 50 bis etwa 200 g Protein pro Liter. Die Enzymkonzentration kann von 1 - 400 g Protein pro Liter reichen. Ammoniumsulfat wird in einer Menge von etwa 20 - 150 g pro 1.000 g des Gemisches zugegeben, wobei eine Konzentration von etwa 10% bevorzugt wird. Die Temperatur des Kristallisators wird bei etwa 6 - 25ºC, am bevorzugtesten bei etwa 8 - 20ºC gehalten. Die Löse-Temperatur reicht von etwa 20 - 60ºC, am bevorzugtesten von etwa 40 - 50ºC (oder beliebig oberhalb der Kristallisationstemperatur). Der Zirkulationsfluß, das Rühren und die Dimensionen können stark variieren. Im allgemeinen beträgt die Zirkulationsrate etwa das 1- bis 4fache des Volumens der Kristallisatorchargen pro Stunde.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 3 dargestellt. In dieser Ausführungsform enthält die Kammer 1 ein unlösliches, festes Material, wie z.B. Perlen 13, die Oberflächen 14 aufweisen, auf denen sich das kristallisierende Enzym 15 ablagern kann. Während des Verfahrens scheint die Oberfläche des unlöslichen, festen Materials Kernbildungsstellen zur Ablagerung des Enzyms zu bieten.
- Mit Fortdauer des Verfahrens bildet sich eine Schicht aus kristallisiertem Enzym auf der Oberfläche des festen Materials. Auf diese Weise können Enzymschichten jeder gewünscht Dicke gezüchtet werden. Wie aus der Figur ersichtlich, ist das feste Material eine Perle bzw. eine Kugel, es eignet sich allerdings jede beliebige Form. Beispielsweise kann das feste Material in Form von Platten, Gittern oder Geweben vorliegen. Es kann aus jedem geeigneten, unlöslichen Material bestehen, das unter den Verfahrensbedingungen unbeeinflußt (inert) ist. Geeignete Beispiele dafür sind Glas, Stahl, hochmolekulare Polymere (z.B. Polystyrol, Polyacryle, Teflon, Polyamide, Polyethylen, Polypropylen u.dgl.), lonenaustauschharze und Zellulosekunststoffe.
- Zur Gewinnung des beschichteten Enzyms ist anzuraten, daß das unlösliche, feste Material aus der Kammer entfembar ist. Zu diesem Zweck eignen sich insbesondere lose Perlen. Es ist aber auch möglich, daß das feste Material in der Kammer fixiert bzw. entfembar fixiert wird. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, eine Klassierungsvorrichtung vorzusehen, um die wachsende Kristallmasse von den kleineren Kristallen zu trennen, die sich anderswo in der Kammer bilden. Auch Perlen können je nach ihrem Gewicht und ihrer Größe ein Klassierungsmittel überflüssig machen.
- Sobald sich das Enzym auf der festen Oberfläche abgelagert hat, kann es nach jedem für das jeweilige Enzym geeigneten Verfahren fixiert werden. Beispielsweise kann es mit Glutaraldehyd vernetzt werden. Der so entstehende Verbundkörper kann, falls gewünscht, weiter beschichtet oder eingekapselt werden.
- Beim bevorzugtesten Verfahren finden die folgenden allgemeinen Parameter Anwendung:
- Eine Enzymlösung mit 2 bis etwa 100 g pro Liter Enzym wird in einer Kristallisationskammer auf einer Temperatur zwischen etwa 2 und etwa 7ºC gehalten. Ammoniumsulfat (5 - 15 Gew.-%) oder Magnesiumsulfat (etwa 1 - 5 Gew.-%) kann der Lösung zugegeben werden. Das zu beschichtende Material wird entweder als frei bewegliche Teilchen oder als fixierter Gegenstand in die Kristallisationskammer eingebracht.
- Die Kristallisationskammer wird konstant gerührt und die kleine Kristalle enthaltende Lösung kontinuierlich abgeführt und durch einen Wärmetauscher geleitet, der die Temperatur der Lösung von etwa 30ºC auf etwa 50ºC erhöht, wodurch sich die kleinen Enzymkristalle lösen. Die Lösung wird dann zur Kristallisationskammer zurückgeführt, wobei ihre Zugabe das Aufrecherhalten der Übersättigung der Kristallisationslösung bewirkt. Die bevorzugte Zirkulationsrate durch den Wärmetauscher beträgt etwa das 1- bis etwa das 6-fache Chargenvolumen pro Stunde. Am bevorzugtesten wird die kleine Kristalle enthaltende Flüssigkeit mittels des Durchtritts durch ein Sieb entfernt, dessen Maschengröße die größtmögliche ist, mit der die freien, zu beschichtenden Teilchen gerade noch zurückgehalten werden.
- Das Prinzip der Erfindung kann zur Herstellung von Kristallen einer Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen herangezogen werden. Da Glucose-Isomerase besonders für das hierin beschriebene Verfahren geeignet ist, wurde sie in den nachstehenden Beispielen als Modell verwendet. Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken sie jedoch nicht ein.
- Beispiele 1 - 3 erfolgten in Chargen von 0,5 - 10 l. Insgesamt wurden etwa 0,1 - 5 kg (Naßgewicht) Glucose-Isomerase-Kristalle mit großem Durchmesser (0,5 - 1,0 mm) hergestellt. Das Verfahren unterliegt keinen oberen oder unteren Maßstabsgrenzen. Es ist auf den Labormaßstab von einigen wenigen Millilitern ebenso anwendbar wie auf die Kubikmetergrößen in industriellen Verfahren.
- Ein Glucose-Isomerase-Konzentrat wurde wie folgt gemäß US-A-4.4 10.627 hergestellt:
- Streptomcyes rubiginosus wurden in einer 36 m³-Chargen-Fermentation fermentiert. Die Zellmasse in der Charge wurde lysiert, um die intrazelluläre Isomerase freizusetzen. Die Zellbruchstücke wurden abfiltriert, um die klare enzymhältige Lösung zu gewinnen. Die Lösung wurde ultrafiltriert und die verbleibende enzymhältige Lösung (typischerweise 1,6 m³) als isomerasehältiges Konzentrat in den Verfahren der Beispiele eingesetzt. Aliquote des Konzentrats wurden in verschiedenen Beispielen verwendet. Ein Teil des Konzentrats wurde wie nach dem Stand der Technik beschrieben kristallisiert (siehe US- A-4.604-199), und die Kristalle wurden in einigen Beispielen weiterverwendet, die kurz wie folgt zu beschreiben sind:
- Dem Konzentrat wurden 10 Gew.-% Ammoniumsulfat zugegeben. Glucose-Isomerase wurde als heterogene Kristallfamille kristallisiert. Das Produkt enthielt alle Kristallgrößen zwischen 1 und 50 µm. Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren als viskoses, festes Sediment gewonnen. Dieses Sediment wurde in einigen Beispielen als Ausgangsmaterial verwendet.
- 1,8 l Glucose-Isomerase-Konzentrat mit 36 g Isomerase-Protein (etwa 1,4 Millionen GIU Glucose-Isomerase-Aktivitätseinheiten) wurden in den Kristallisator (Durchmesser 150 cm, Höhe 170 cm) eingebracht. Das Rühren mit einem Flügelrad wurde gestartet und während des gesamten Verfahrens bei 100 U/min beibehalten. Ammoniumsulfat (0,2 kg) wurde zugegeben und gelöst. Der Kristallisator wurde mittels eines Wasserbads mit einer Temperatur von 10ºC außengekühlt. Die Pumpe wurde in Gang gesetzt und die Flußrate auf 4 l/h eingestellt. Das Kristallisationsgemisch wurde durch ein zylindrisches Sedimentierrohr mit einem Durchmesser von 4,5 cm und einer Höhe von 18 cm geführt. Das Gemisch gelangte dann durch einen in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 50ºC eingetauchten Wärmetauscher. Das Innenvolumen des Wärmetauscherrohrs betrug 39 ml und sein Durchmesser 4 mm. Die Kristalle wurden im Wärmetauscher gelöst und die Lösung zum Kristallisator rückgeführt.
- Zu Beginn wiesen die im Kristallisator auftretenden Kristalle durchwegs eine Größe von weniger als 50 µm auf. Durch das kontinuierliche Auflösen und Zirkulieren durch den Wärmetauscher wurde ein hoher Übersättigungsgrad beibehalten. Die Übersättigung erleichterte das kontinuierliche Wachstum aller im Kristallisator verbleibenden Kristalle. Verhältnismäßig mehr der kleinsten Kristalle wanderten jedoch durch das Sedimentierrohr und wurden gelöst. Je größer die Kristalle waren, desto weniger wahrscheinlich war es, daß sie durch den Lösekreislauf wanderten. Es war zu beobachten, daß die größten Kristalle eine Sedimentationsgeschwindigkeit aufweisen konnten, die über der linearen Fließgeschwindigkeit im Sedimentierrohr lag. Solche Kristalle konnten praktisch nie in den Lösewärmetauscher eintreten.
- Bei Fortführung dieses Vorgangs konnte folgendes beobachtet werden. Die durchschnittliche Größe der Kristalle nahm kontinuierlich zu. Während der ersten 3 - 4 Stunden wuchsen sie typischerweise um 50 µm pro Stunde. Die kleinen Kristalle (1 - 50 µm), die am Anfang zahlreich waren, schwanden bis zum Ende des Verfahrens bis zu einer sehr geringen, praktisch vernachlässigbaren Menge. Wie aus nachstehend angeführter Tabelle 1 ersichtlich, lagen nach 25 Stunden mehr als 95% der Clucose- Isomerase in Form von Kristallen mit einem Durchmesser von 700 - 1100 µm vor. Das Kristallwachstum kam praktisch zum Stillstand, wenn die Kristalle so groß waren, daß nur vernachlässigbare Mengen an Kristallen durch den Wärmetauscher gelangten. Es ist offenkundig, daß am Ende des Vorgangs die gesamte kristallisierte Isomerase in den großen Kristallen zu finden war.
- Nach 25 Stunden wurden das Pumpen und Rühren abgebrochen. Die Kristalle wurden im Kristallisator absetzen gelassen. Nach 30 Minuten wurde die Mutterlauge durch Dekantieren entfernt. Das Gewicht des festen, wasserhältigen Isomerasekristall- Sediments betrug 100 g. Mehr als 95% der ursprünglichen Isomerase befand sich im Kristallsediment. TABELLE 1 Kristallwachstum in Beispiel 1 Kristalldurchmesser Stunden
- Dieser Versuch erfolgte mit der gleichen Apparatur wie in Beispiel 1. 530 g Glucose-Isomerase-Kristallsediment wurde im Kristallisator mit 1. 350 g Leitungswasser vermischt. Das Gemisch wurde mittels Zirkulieren durch einen Wärmetauscher und Rühren, bis alle Isomerasekristalle gelöst waren, auf eine Temperatur von 27ºC erwärmt. Der Kristallisator wurde während dieses Vorgangs, der nach 40 Minuten abgeschlossen war, nicht gekühlt. 150 g Ammoniumsulfat wurden in der Lösung gelöst, um die Konzentration auf 10% zu bringen.
- Der Kristallisator wurde mit einem Wasserbad auf 18ºC gekühlt. Die Lösung wurde mit einer Flußrate von 7 Litern pro Stunde durch den in einem 50ºC warmen Wasserbad befindlichen Wärmetauscher gepumpt. Die Lösung im Kristallisator wies aufgrund der Heizwirkung der aus dem Heizelement kommenden Lösung eine Temperatur von 21ºC auf.
- Die Kristalisation begann sofort, als die Temperatur im Kristallisator auf 21ºC gesenkt wurde. Die Kristalle wuchsen am Anfang sehr rasch; die größeren Kristalle besaßen nach 1 Stunde einen Durchmesser von 300 µm. Die Wachstumsrate nahm rasch ab, sobald die Isomerase zu großen Kristallen umgewandelt worden war. Nach 20 Stunden wiesen die meisten Kristalle einen Durchmesser zwischen 500 und 900 µm auf. Die großen Kristalle wurden nach 30-minütigem Absetzen-Lassen wie in Beispiel 1 durch Dekantieren gewonnen. Das Gewicht des Kristallsediments betrug 400 g, was einer Ausbeute von 75% bezogen auf das Kristallgewicht entspricht. Ein Großteil der nichtrückgewonnenen Isomerase war aufgrund der in diesem Versuch herrschenden, relativ hohen Temperatur in der Mutterlauge löslich. (Die Isomerase in der Mutterlauge wurde durch Abkühlen und Umkristallisation rückgewonnen.)
- Das Prinzip der Apparatur war größtenteils das gleiche wie in Beispiel 1, doch die Dimensionen waren unterschiedlich. Der Kristallisator war ein 20 Liter- Polyethylenbehälter. Er wurde durch kalte Außenluft nut einer Temperatur von 2ºC gekühlt. Die Lösung im Kristallisator wurde vorsichtig mit einem Flügelrad gerührt, uni eine langsam rotierende Bewegung der Flüssigkeit zu bewirken. Die Lösung wurde von der Oberfläche in der Nähe der Rührerachse mit eineni einfachen Rohr mit einem Durchmesser von 4 nim abgenommen und durch die in einem 47ºC warmen Wasserbad befindliche Heizspirale gepumpt. Nach dem Erwärmen wurde die Lösung durch eine Kühlschlange in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 10ºC geführt. Die abgekühlte Lösung wurde zum Kristallisator zurückgeführt.
- In diesem Verfahren wurde ein 6,2 kg schwerer Anteil des Glucose-Isomerase- Kristal lsediments verwendet. 12,5 kg einer 10%-igen Ammoniumsulfat-Lösung wurden zugegeben und im Kristallisator gerührt, um eine homogene Suspension zu bilden. Die im gesamten Verfahren eingesetzte Rührgeschwindigkeit betrug 180 U/min, und das Flügelrad wurde auf eine Höhe von 1 cm oberhalb des Bodens eingestellt. Die Lösung wurde mit einer Rate von 5 l/h durch die Wärmetauscher gepumpt. Die Temperatur im Kristallisator betrug 12ºC.
- Die durch das in Beispiel 1 beschriebene, industrielle Gewinnungsverfahren gebildeten Kristalle wiesen Größen von 1 bis 100 µm auf. Praktisch keiner der Kristalle war am Beginn dieses Verfahrens gelöst. Als jedoch Lösung von der Oberfläche und aus der Mitte des Kristallisators abgenommen wurde, verschwanden die kleineren Kristalle allmählich. Der Kristallisatorbehälter selbst diente als Sedimentiervorrichtung. Es war zu beobachten, daß die kleineren Kristalle vorzugsweise dem Flüssigkeitsstrom durch den Lösekreislauffolgten. Die Trennwirkung verbesserte sich mit der Drehbewegung der Flüssigkeit.
- Dieses Verfahren wurde 120 Stunden weitergeführt. Am Ende war die gesamte Isomerase in einer sehr engen Größenverteilung kristallisiert: die Kristalle besaßen Durchmesser von 150 - 210 µm. Es wurden keine kleineren Kristalle festgestellt. Die Kristalle wurden absetzen gelassen und die Mutterlauge durch Dekantieren entfernt. Das Gewicht der gewonnenen Kristalle betrug 6,1 kg.
- 500 g Glucose-Isomerase-Kristalle (mit 36% Enzymprotein und 64% Wasser) wurden mit 2.000 ml einer 10%-igen Ammoniumsulfat-Lösung vernuscht. Das Gemisch wurde in den Kristallisator eingebracht. Die Suspension wurde mit einem Propellerrührer aus rostfreiem Stahl mit drei Blättern und einem Durchmesser von 11 cm gerührt. Die Temperatur im Kristallisator wurde durch ein auf einer Temperatur von 8ºC gehaltenes äußeres Kühlbad auf 16ºC gehalten. Die Suspension wurde durch den in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchten Wärmetauscher gepumpt. Der Vorgang wurde 24 Stunden lang fortgesetzt. Die kristallhältige Suspension wurde abgeleitet und für andere Versuche verwendet.
- Der Propellerrührer war mit einer transparenten Schicht aus kristalliner Isomerase überzogen. Das Gewicht der Schicht betrug etwa 3 g. Die Enzymschicht wurde durch Eintauchen in eine Lösung von Glutaraldehyd in 10%-igem Ammoniumsulfat bei 4ºC 4 Stunden lang vernetzt. Die vernetzte Enzymschicht war auf dem Propellerrührer gut fixiert. Die enzymatische Aktivität des enzymbeschichteten Propellerrührers zeigte sich, indem dieser zum Rühren in einer 400 ml-Probe 10%-iger Glucose herangezogen wurde. Nach einstündigem Rühren bei 40ºC betrug der Fructose-Gehalt der Probe etwa 4%.
- Es wurde die gleiche Apparatur wie in Beispiel 4 verwendet. 530 g Glucose-Isomerase- Kristalle (Naßgewicht, 60% Wasser) wurden in den Kristallisator eingebracht. 1.350 g Wasser wurden zugegeben, das Gemisch kontinuierlich gerührt und auf 30ºC erwärmt, bis alle Kristalle gelöst waren. 150 g Ammoniumsulfat wurden zugegeben und bis zum Lösen gerührt. Die Temperatur im Kristallisator wurde dann gesenkt und mit einem äußeren Kühlbad auf 23ºC gehalten. Die Enzymlösung wurde mit einer Flußrate von 8 l/h durch den in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchten Wärmetauscher gepumpt. Alle Kristalle, die durch den Wärmetauscher geführt wurden, lösten sich. Der Rührer wurde während des gesamten Verfahrens bei 100 U/min gehalten.
- Das Verfahren wurde 25 Stunden lang fortgesetzt und der Inhalt des Kristallisators danach abgeleitet. Der Kristallisator wurde zur Entfernung jeglicher Flüssigkeit trockengewischt und gewogen. Die Innenwände des Kristallisators waren mit einer glasartigen Schicht aus kristalliner Glucose-Isomerase überzogen. Durch Subtrahieren des Eigengewichts des Kristallisators wurde das Gewicht der Enzymschicht mit 39 g nasse Kristalle ermittelt.
- Die Enzymschicht wurde folgendermaßen durch Vernetzen fixiert. Der Kristallisator wurde mit 2 Litern eiskalten (1ºC) 10%-igen Ammoniumsulfats befüllt, das zuvor mit Glucose-Isomerase-Kristallen gesättigt worden war, um ein In-Lösung-Gehen der Isomerase-Schicht zu verhindern. 50 ml 50%-iger Glutaraldehyd wurden zugegeben und das Gemisch 3 Stunden lang gerührt, um das Vernetzen zu ermöglichen. Nach dem Vernetzen wurde der Kristallisator entleert und mit Wasser gewaschen, bis alle löslichen Stoffe entfernt waren. Die Isomerase war nun eine glasartige, gelblich-braune Schicht an den Wänden des Behälters aus rostfreiem Stahl.
- Die enzymatische Aktivität der Schicht zeigte sich durch Füllen des Kristallisators mit 2 Litern 30%-iger Glucose-Lösung mit einem pH-Wert von 7,5. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei 60ºC gerührt. Aus der Lösung wurden Proben gezogen und auf Fructose untersucht. Man konnte eine kontinuierliche Zunahme der Fructose-Menge beobachten. Nach 3 Stunden betrug die Fructose-Konzentration 13% und die Glucose- Konzentration 17%.
- 300 g Glucose-Isomerase-Kristalle (Naßgewicht wie oben) wurden durch Erwärmen auf 35ºC in 1.000 ml 12%-iger Ammoniumsulfat-Lösung gelöst. 50 g Glasperlen (Durchmesser 300 - 500 µm, d.h. durchschnittlich 400 µm) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde im Kristallisator mittels eines Flügelrads mit 120 U/min gerührt, um ein Absetzen der Perlen zu verhindern. Die Suspension wurde auf eine Temperatur von 20ºC gekühlt, um die Kristallisation einzuleiten. Die Lösung wurde mit einer Flußrate von 1 l/h durch das Sieb und das in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchte Heizelement zirkuliert. Alle freien Kristalle lösten sich im Heizelement auf. Das Verfahren wurde 18 Stunden lang fortgesetzt. Die Glasperlen wurden mit einer 100 µm dicken Schicht aus kristall iner Glucose-Isomerase überzogen.
- Dieses Beispiel zeigte, daß das Enzym auf einer Glasoberfläche kristallisieren kann. Es war jedoch zu beobachten, daß die Enzymschicht mechanisch nicht so stabil war wie in den anderen Beispielen. Durch langes Rühren löste sich die Enzymschicht von den Perlen ab.
- 550 g Glucose-Isomerase-Kristalle (Naßgewicht) wurden mit 2.000 ml einer 10%-igen Ammoniumsulfat-Lösung im Kristallisator vermischt. 100 g (130 ml Festbettvolumen) kugelförmiger Verbundperlen wurden zugegeben. Die Perlen hatten die folgende Struktur:
- - Durchmesser 500 - 800 µm
- - Kernkugel aus miteinander verschmolzenem Polystyrol und Wachs
- - Oberflächenschicht aus nativer Kurzfaser-Zellulose, mit gelöstem Polystryol am Kern festgeklebt
- - Faserlänge der Cellulose weniger als 50 µm.
- Das Gemisch wurde während des gesamten Verfahrens mit 100 U/min gerührt. Die Temperatur wurde am Beginn auf 16ºC eingestellt und am Ende des Verfahrens allmählich auf 11 ºC gesenkt. Die Lösung wurde mit einer anfänglichen Flußrate von 7 Litern und am Ende mit 3 Litern pro Stunde durch das Sieb (die Flußrate wurde schrittweise verringert) und den in ein 50ºC warmes Waserbad eingetauchten Wärmetauscher gepumpt. Die Gesamtdauer des Verfahrens betrug 47 Stunden. Am Ende war ein Großteil der Isomerase als fast perfekter, kugelförmiger Überzug auf den Perlen abgelagert. Die scharfen Kanten der auf den Verbund-Perlen abgelagerten Enzymkristalle wurden im Laufe des Verfahrens immer mehr abgetragen, was schließlich zu einer relativ glatten, kugelförmigen Oberfläche führte. Bei starker Vergrößerung (100fach oder stärker) in einem Licht- oder Rasterelektronenmikroskop war jedoch zu beobachten, daß die Kugeloberfläche zur Gänze mit typischen Kristallflächen aus Glucose-Isomerase bedeckt war. Die glasartige Lichtdurchlässigkeit der Enzymbeschichtung war ein weiterer Beweis für die kristalline Beschaffenheit der Schicht.
- Das Enzym wurde folgendermaßen durch Vernetzung auf den Kugeln fixiert:
- 1.100 ml der Mutten auge wurden verworfen, um die Suspension zu konzentrieren. Die Temperatur des Gemisches wurde während des gesamten Vernetzungsvorgangs auf 4ºC gehalten. 120 g Lysin-hydrochlorid wurden zugegeben und durch Rühren gelöst. 1 Mol Dikaliumhydrogenphosphat wurde zugegeben, um während des gesamten Verfahrens den pH-Wert zwischen 6 und 8 zu halten. 250 ml 50%-iger Glutaraldehyd wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 3,5 Stunden lang gerührt. Die Mutterlauge wurde verworfen und das Produkt auf einem Standardsieb mit 500 pm Maschenweite mit Wasser gewaschen, bis die gesamte, sichtbare, gefärbte Flüssigkeit und die kleinen Teilchen entfernt waren. Die kugelförmigen Produktteilchen wurden auf dem Sieb abtropfen gelassen, bis kein Wasser mehr entfernt wurde. Das Gewicht des Produkts betrug 550 g und das sedimentierte Schüttvolumen 400 ml. Das Produkt fiel in Form von äußerst einheitlichen, braunen Kügelchen an. Der Durchmesser von 95% der Teilchen lag zwischen 900 und 1100 µm. Es schien, daß die kleineren Verbundteilchen mit dickeren Schichten und die größeren Teilen mit dünneren Schichten von Isomerase überzogen waren. Demnach war die Größenverteilung des Produkts enger als jene der ursprünglichen Kernteilchen.
- Die enzymatische Aktivität des Produkts wurde durch Rühren einer 5 g-Probe des Produkts mit 100 ml 40%-iger Glucose bei 60ºC gezeigt. Der Fructose-Anteil des Gemisches nahm innerhalb von 2 Stunden auf 18% zu.
- 100 g Verbundträger wurden als zu beschichtende Kerne verwendet. Der Träger wies die folgende Zusammensetzung und Form auf:
- - 25% faserige Holzzellulose
- - 25% Titandioxid
- - 50% Polystyrol als Haftmittel
- - Teilchengröße 350 - 850 µm - die Form der Teilchen war unregelmäßig - dieses Material wird in US-A-4.355.177, Beispiel 1 beschrieben (das Granulat wurde jedoch nicht mit Diethylaminoethylchlorid-hydrochlorid derivatisiert).
- 200g Glucose-Isomerase-Kristalle (Naßgewicht) und 1.800 ml 10%-iges Ammoniumsulfat wurden im Kristallisator mit dem Träger vermischt. Das Gemisch wurde während der gesamten Verfahrensdauer mit 100 U/min gerührt. Die Flüssigkeit wurde mit einer Flußrate von 2 l/h durch das Sieb und den in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchten Wärmetauscher gepumpt. Die Temperatur im Kristallisator wurde auf 8ºC gehalten.
- Das Verfahren wurde nach 24 Stunden abgebrochen. Der Inhalt des Kristallisators wurde auf ein 300 µm-Sieb geleert und und abtropfen gelassen, um die Mutterlauge zu entfernen. Das Produkt auf dem Sieb wurde auf Glucose-Isomerase analysiert. Das Produkt enthielt 150 g kristalline, den Träger überziehende Isomerase, und die restliche Menge von 50 g Enzym befand sich in der Mutterlauge, die durch das Sieb abgetropft war. Bei Beobachtung unter einem Mikroskop erschien das Enzym als glasartige, lichtdurchlässige Schicht auf dem dunklen, undurchsichtigen Trägerteilchen.
- Das Enzym wurde durch Vernetzen mit Glutaraldehyd auf den Teilchen fixiert. Die enzymatische Aktivität wurde durch Vermischen mit Glucose und Beobachten der Umwandlung zu Fructose gezeigt.
- Glucose-Isomerase-Konzentrat wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. 28 g Magnesiumsulfat (berechnet als Trockensubstanz) wurden zugegeben und bei einer Temperatur von 25ºC in 1 l des Konzentrats gelöst. Das Gemisch wurde kontinierlich gerührt und auf eine Temperatur von 5ºC abgekühlt. Glucose-Isomerase kristallisierte rasch, wobei nach 3 Stunden 97% der ursprünglichen Aktivität in den Kristallen und 3% der Aktivität noch immer in der Mutterlauge zu finden war. Keine anderen Materialien wurden gefällt oder kristallisiert. Die kristalline Isomerase wurde wie in Beispiel 1 durch Zentrifugieren gewonnen. Dieses Kristallsediment wurde als Ausgangsmaterial in den Beispielen mit Magnesiumsulfat-Medium verwendet.
- Hier kam die Vorrichtung aus Fig. 2 zum Einsatz. 1 kg Glucose-Isomerase-Kristalle wurde in 5 l 2%-iger Magnesiumsulfat-Lösung suspendiert. Die kleinen Kristalle wurden durch eine in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchte Heizspirale zirkuliert. Die Zirkulationsrate betrug 15 l/h. Der Kristallisator wurde auf einer Temperatur von 16ºC gehalten. Das Verfahren wurde 20 Stunden lang fortgesetzt. Praktisch alle Kristalle befanden sich nach diesem Verfahren in der Größenklasse von 500 - 700 µm.
- In diesem Beispiel kam die Vorrichtung aus Fig. 1 zum Einsatz. Das Reaktionsgemisch im Kristallisator wies die folgende Zusammensetzung auf:
- 3,4 kg Glucose-Isomerase-Kristalle
- 3,9 kg Verbund-Träger (beschrieben in Beispiel 8)
- 15 l 2%-iges Magnesiumsulfat
- Der Kristallisator wurde auf einer Temperatur von 16ºC gehalten. Die freie Isomerase- Kristalle enthaltende Mutterlauge wurde durch eine in ein 50ºC warmes Wasserbad eingetauchte Heizspirale zirkuliert. Innerhalb von 24 Stunden waren 80% des Isomerase-Proteins als kristalline Schicht auf dem Träger abgelagert. Die Mutterlauge wurde durch Dekantieren entfernt. Das enzymbeschichtete Material wurde einem Vernetzungsverfahren unterzogen, um das Enzym auf dem Träger zu fixieren. Der Proteingehalt des vernetzten Endprodukts betrug 21%. Das Produkt erwies sich in den in Beispiel 7 beschriebenen Untersuchungen als enzymatisch aktiv.
- Beispiele 9 und 10 zeigen, daß das Verfahren in unterschiedlichen Medien funktioniert. Daraus folgt, daß alle chemischen und physikalischen Bedingungen, die die Löslichkeit von Enzymen verringern, an das erfindungsgemäße Verfahren angepaßt werden können.
- Für den Fachmann auf dem Gebiet sind viele Variationen der geoffenbarten Erfindung offenkundig. Die vorliegende Beschreibung soll jedoch den in den folgenden Patentansprüchen definierten Schutzumfang der Erfindung keinesfalls einschränken.
Claims (24)
1. Verfahren zur Herstellung kristalliner Glucose-Isomerase mit einer Kristallgröße von
etwa 0,5 bis 1 mm, umfassend das Halten einer Lösung von kristallisierbarer Glucose-
Isomerase (2) bei ausreichend kühler Temperatur, um Kristallbildung herbeizuführen,
das Halten der abgekühlten Lösung in einem übersättigten Zustand durch Abtrennen
eines Flüssigkeitsstroms (5) von der Lösung, der Glucose-Isomerase-Kristalle mit einer
Größe von weniger als 0,5 mm enthält, das Erwärmen der Flüssigkeit, um die Kristalle
im wesentlichen zu lösen, und das Rückführen der Flüssigkeit mit aufgelöster Glucose-
Isomerase in die Lösung zur weiteren Kristallisation.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung von kristallisierbarer Glucose-
Isomerase (2) bei einer Temperatur von etwa 2ºC bis etwa 25ºC gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kristallisationslösung (2) etwa 1 bis etwa 400 g
Protein pro Liter enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Erwärmungstemperatur etwa 25 bis etwa 60ºC
beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der übersättigten Glucose-Isomerase-Lösung ein
Mittel zur Verringerung der Enzymlöslichkeit zugegeben wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Mittel Salz ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Salz Magnesiumsulfat oder Ammoniumsulfat
ist.
8. Verfahren zum Züchten kristalliner Glucose-Isomerase mit einer Kristallgröße von
etwa 0,5 bis 1 mm, umfassend:
(1) das Beschicken einer Kristallwachstumskammer (1) mit einer gesättigten Lösung oder
feinen Suspension einer kristallisierbaren Glucose-Isomerase (2);
(2) Halten der Temperatur der Lösung oder Suspension in der Kristallwachstumskammer
(1) auf einem ausreichend niedrigen Wert, um Kristallbildung herbeizuführen;
(3) Abtrennen von Kristallen mit einer Größe von weniger als 0,5 mm aus der Lösung
durch kontinuierliches Leiten eines Teils der abgekühlten Flüssigkeit, die suspendierte
Kristalle enthält, aus der Kristallbildungskammer (1) durch ein Größenklassierungsmittel
(6,12), wodurch die Kristalle von weniger als 0,5 mm in einem Flüssigkeitsstrom (5) aus
der Kammer entfernt und die verbleibenden Kristalle in der Kammer (1) zurückgehalten
werden;
(4) Erwärmen des Stroms, der Glucose-Isomerase-Kristalle von weniger als 0,5 mm
enthält, um die darin suspendierten Kristallen im wesentlichen zu lösen;
(5) Rückführen des erwärmten Stroms mit gelöster Glucose-Isomerase zur
Kristallwachstumskammer (1), um die Flüssigkeit in der Kammer in einem übersättigten
Zustand zu halten;
(6) Fortsetzen der obigen Verfahrensschritte (2) bis (5), bis die Kristalle in der
Kristallwachstumskammer auf etwa 0,5 bis 1,0 mm angewachsen sind; und
(7) Gewinnen der so gezüchteten Glucose-Isomerase-Kristalle.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Temperatur in der Kristallisationskammer (1)
bei etwa 8ºC bis etwa 20ºC liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Kristallisationslösung (2) 50 bis etwa 200 g
Protein pro Liter enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Erwärmungstemperatur zwischen etwa 30ºC
und etwa 50ºC liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 8, worin der gesättigten Lösung oder feinen Suspension
ein Salz zugegeben wird, um die Löslichkeit der kristallisierbaren Glucose-Isomerase
herabzusetzen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Salz Magnesiumsulfat oder
Ammoniumsulfat ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Kristallisationslösung Ammoniumsulfat in
einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 15 Gew.-% zugegeben wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Kristallisationslösung Magnesiumsulfat in
einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 5 Gew.-% zugegeben wird.
16. Verfahren zum Züchten von Glucose-Isomerase-Kristallen auf einem festen Träger,
umfassend:
(1) Anordnen eines unlöslichen, inerten Materials (13) in einer
Kristallwachstumskammer (1), die eine gesättigte Lösung oder feine Suspension einer
kristal lisierbaren Glucose-Isomerase (2) enthält;
(2) Halten der Temperatur der Lösung in der Kristallwachstumskammer (1) auf einem
ausreichend niedrigen Wert, um die Bildung von Kristallen zu bewirken, von denen
sich ein Teil auf der Oberfläche des inerten Materials (13) ablagert und ein Teil als freie
Kristalle vorliegt;
(3) kontinuierliches Entfernen der freien Kristalle aus der Kristallwachstumskammer in
einem Flüssigkeitsstrom (5);
(4) Erwärmen des Stroms (5), um die darin suspendierten Kristalle im wesentlichen zu
lösen;
(5) Rückführen des Flüssigkeitsstroms mit darin gelösten Kristallen zur
Kristallwachstumskammer (1), um die Lösung in einem übersättigten Zustand zu halten;
(6) Fortsetzen der obigen Verfahrensschritte (2) bis (5), bis das feste Material
ausreichend überzogen ist; und
(7) Entfernen des festen Materials.
17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das inerte Material (13) aus Glas, rostfreiem
Stahl, Zellulose, Teflon, Ionenaustauschharz oder Kunststoff besteht.
18. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Kristallwachstumskammer (1) auf einer
Temperatur von etwa 2ºC bis etwa 7ºC gehalten wird.
19. Verfahren nach Anspruch 16, worin die gesättigte Lösung oder feine Suspension (2)
etwa 2 bis etwa 100 g Protein pro Liter enthält.
20. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Erwärmung auf zwischen etwa 30ºC bis
50ºC erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 16, worin der gesättigten Lösung oder feinen Suspension
ein Salz zugegeben wird, um die Löslichkeit der kristallisierbaren Glucose-Isomerase
herabzusetzen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, worin das Salz Ammonium- oder Magnesiumsulfat ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, worin der Lösung Magnesiumsulfat in einer
Konzentration von 1-5 Gew.-% zugegeben wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22, worin der Lösung Ammoniumsulfat in einer
Konzentration von 5-15 Gew.-% zugegeben wird.
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