DE2310041C2 - Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium - Google Patents

Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium

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Description

Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium.
Die Erfindung betrifft das mit dem Anspruch 1 definierte Verfahren. Die Ansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Bei einem Verfahren zur Herstellung von Protein durch Züchten von Bakterien auf oder in einem wäßrigen Medium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, ist das erste Produkt eine wäßrige Suspension, die Bakterienzellen enthält
Man kann verschiedene Feststoff-Flüssigkeitstrennverfahren verwenden, um die Bakterienzellen von der Suspension abzutrennen. In einigen Fällen kann man beispielsweise die Suspension durch Zugabe eines Ausflokkungsmittels ausflocken oder koagulieren und dann können sich die koagulierten Zellen von der Flüssigkeit in Absetztankvorrichtungen trennen. Nach dem sich die Zellen abgesetzt haben, können sie durch Zentrifugieren weiter konzentriert und dann getrocknet werden, wobei man als Endprodukt getrocknete Bakterienzellen erhält
In vielen Fällen ist die Absetzgeschwindigkeit der ausgeflockten Zellen, die bei dem oben beschriebenen Trennverfahren möglich ist, extrem niedrig. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Flocken, die man erhält, oft klein und lose sind, d. h. die Menge an flüssigem Medium, die innerhalb der Flocken zurückgehalten wird, ist hoch und der Unterschied zwischen den Dichten der Flocken und dem Medium ist gering. Die Festigkeit der Flocken ist ebenfalls nicht ausreichend, um eine Trennung durch ein anderes Trennverfahren, wie durch Filtration oder Flotation, durchzuführen und ihr Verhalten während der anschließenden Zentrifugation bringt verglichen mit der ursprünglichen Suspension nur eine geringfügige Verbesserung mit sich: In der Praxis ist daher in vielen Fällen der einzige Vorteil, der mit einem solchen Trennverfahren erreicht wird, daß ein Teil des Mediums durch Absetzen entfernt wird. Im Hinblick auf die niedrigen Absetzgeschwindigkeiten, die erreicht werden können, ist es schwierig, diese Stufe bei dem Trennverfahren, wenn man in großem Maßstab arbeitet, auf wirtschaftliche Weise durchzuführen.
Die Anmelderin hat sich die Aufgabe gestellt diese Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen. Zur Lösung dieser Aufgabe ist nun erfindungsgemäß ein Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium durch Ausflocken der Zellen und Abtrennung der ausgeflockten Zellen aus dem Medium vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zellen ausgeflockt werden, indem man das Medium auf eine Temperatur innerhalb des Bereichs von 50 bis 2000C erhitzt und anschließend den pH-Wert des Mediums durch Behandlung mit einer Säure auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 2 bis 5 herabsetzt. Der Ausdruck »Ausflockung« wird auch im Sinne von »Koagulation« veraendet. Man nimmt an, daß dabei strukturelle Änderungen in den Wänden der Bakterienzellen auftreten, was bewirkt; daß die Zellen durch das erfindungsgemäße Verfahren ausgedockt werden können. Das Verfahren ist besonders geeignet, um Bakterienzellen der Stämme der Genera Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter und Bacillus, beispielsweise Stämme der Specien Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas diminuta, Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus und insbesondere Pseudomonas methylotropha (ein Spezies, deren Eigenschaften in der französischen Patentschrift 71 44 042 beschrieben sind) abzutrennen. Kulturen einer An zahl von Stämmen dieser letzten Species wurden in The National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, Aberdeen, Scotland, UK hinterlegt. Die Zahlenbezeichnungen, die diese Kulturen erhielten, sind die folgenden:
NCIBl 0508 -10515 und 10592 -10596.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, um Zellen dieser Stämme aus wäßrigen Medien abzutrennen. Obgleich das erfindungsgemäße Verfahren allgemein für die Trennung von Bakterienzellen aus Suspensionen
in flüssigen Medien verwendet werden kann und obgleich es bei ansatzweiser Arbeitsweise oder kontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden kann, ist es besonders für die kontinuierliche Trennung von Bakterienzellen als eine Stufe in einem einzelliges Protein herstellenden Verfahren, wie es in den britischen Patentanmeldungen Nr. 58 466/70 und 38 938/71 beschrieben ist, geeignet
Nach der Arbeitsweise des Anspruchs 3 wird der pH-Wert auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 bis 9, beispielsweise auf 8,5, erhöht. Die Zeit, während der das Medium bei einem alkalischen pH-Wert vor der weiteren Behandlung gehalten wird, kann innerhalb eines großen Bereichs variieren. Sie beträgt bevorzugt jedoch bis zu 30 Minuten, besonders 0,5 bis 10 Minuten. Die Zeit kann sehr kurz sein, z. B. wird sie bei dem oben beschriebenen Medium die Zeit sein, die erforderlich ist, um das Medium von der Alkalizugabestufe zu der Säurezugabestufe zu transportieren. ι ο
Für die pH-Werte im Bereich von 8 bis 9 ist das bevorzugte Alkali Ammoniak in wäßriger Lösung, beispielsweise eine 1 :6/NH4OH : H2O/Lösung. Für pH-Werte im Bereich von 9 bis 11 ist Natriumhydroxyd bevorzugt Andere alkalische Verbindungen, die verwendet werden können, sind beispielsweise Kalium- und Calciumhydroxyde.
Während der Erwärmungsstufe wird die Temperatur des Mediums bevorzugt auf 70 bis 900C erhöht. Bei einem kontinuierlichen Verfahren sind 80 bis 85° C besonders geeignet Die Zeit während der das Medium bei der höheren Temperatur vor der Säurebehandlung gehalten wird, kann innerhalb eines weiten Bereichs variieren. Bevorzugt beträgt sie bis zu 30 Minuten, insbesondere 0,5 bis 5 Minuten. Die Zeit kann sehr kurz sein. Das Medium kann schnell auf die erforderliche Temperatur erwärmt werden, indem man es durch einen Wärmeaustauscher leilsi end dann kann es bei dieser Temperatur während einer sehr kurzen Zeitperiode, beispielsweise weniger als 0,5 Minuten, gehalten werden. Bei dem oben beschriebenen kontinuierlichen Verfahren kann man eine Reihe von anderen Wegen für das Medium, nachdem es den Wärmeaustauscher verläßt, vorsehen. Man kann es direkt in die Säurebehandlungsstufe führen oder man kann es auf Umwegen dahin führen, was bewirkt daß das Medium während ausgewählter Zeiten von beispielsweise 1,2 oder 3 Minuten bei einer höheren Temperatur gehalten wird. Wird das Medium auf diese Weise während seinem Weg zwischen der Wärmebehandlung und der Säurebehandlungsstufe verzögert, so wird die Temperatur in gewissem Ausmaß, .nachdem es den Wärmeaustauscher verläßt, fallen, beispielsweise von 80° auf 73° C.
Nach der Wärmebehandlung kann das Medium vor der Säurebehandlung gekühlt werden. Dies ist bevorzugt wenn die ausgedockten Zellen gegebenenfalls durch Absitzen abgetrennt werden, aber nicht wenn ein Flotationsverfahren verwendet wird. Wird eine Kühistufe verwendet, so wird das Medium bevorzugt auf Umgebungstemperati'-, d.h. auf Zimmertemperatur, abgekühlt Jedoch sind Temperaturen innerhalb des weiten Bereichs von 20 bis 500C, insbesondere von 20 bis 300C, geeignet
Während der Säurebehandlungsstufe wird der pH-Wert bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 23 bis 4,5 vermindert, um zu bewirken, oaß sich die Bakterienzellen von dem Medium in großen Flocken abtrennen. Ein besonders geeigneter pH-Wert liege im Bereich von 3 bis 3,5, wenn die ausgeflockten Zellen schließlich durch Absetzen abgetrennt werden und im Bereich von 3.5 bis 4J5. wenn die Zellen schließlich durch Flotation abgetrennt werden. Als Säure kann man geeigneterweise Schwefel-, Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure verwenden oder ein Säuregas wie Kohlendioxyd oder Schwefeldioxyd. Wenn das Verfahren eine Stufe bei einem Biomassen-Produktionsverfahren bildet, verwendet man als Säure bevorzugt eine Mischung aus Phosphor-Schwefelsäure in geeigneten Teilen um zu ermöglichen, daß das Medium nach der Abtrennung der ausgeflockten Zellen in die Fermentationsstufe des Verfahrens rezirkuliert werden kann. Nach der Behandlung mit Säure wird das Medium bevorzugt gerührt, während sich die Flocken bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bildung von großen starken Flocken und man kann eine gute Absetzgeschwindigkeit erreichen. Die gebildeten Flocken können in ihrer Größe innerhalb eines großen Bereichs variieren, abhängig von der Rührgeschwindigkeit und von dem Bakterienstamm, beispielsweise können die Durchmesser im Bereich von 0,1 mm bis 0,1 cm liegen.
Auf die Säurebehandlungsstufe können folgende Stufen folgen: Absetzen oder Flotation, Zentrifugieren, Filtration oder Verdampfen und Trocknen, wobei man getrocknete Zellen als Endprodukt des Fermentationsverfahrens erhält. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Verminderung der Größe der Absetztankvorrichtungen und außerdem kann die Anzahl der Zentrifugen, die zum Trennen der Bakterienzellen, die bei dem Fermentationsverfahren gebildet werden, verwendet werden, vermindert werden.
Während der üblichen Herstellung von Bakterienzellen Hurch Fermentationsverfahren geht ein Teil des Proteingehalts der gebildeten Zellen in Lösung in dem flüssigen Medium. Werden die Zellen von dem Medium durch übliche Ausflockungsverfahren getrennt, so verbleibt das gelöste Protein in der überstehenden Flüssigkeit in dem Absetztank und geht verloren. Verwendet man das erfindungsgemäße Verfahren, so wird ein Teil des Proteins in dem Medium durch die Säurebehandlungsstufe in unlöslichem Zustand überführt und kann wiedergewonnen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel!
6 I einer Suspension, die 8 g/l Trockengewicht an Pseudomonas methylotropha Stamm NClB 10593 enthält, wird aus einer kontinuierlichen Kultur mit beschränktem Kohlenstoff in stetigem Zustand entnommen. Die Suspension wurde in sechs getrennte 1 1 Proben (A bis F) geteilt und der pH-Wert von fünf der Proben (A und C bis F) wurden durch Zugabe von wäßrigen Ammoniak auf 8,5 erhöht. Die Proben B bis F wurde auf ausgewählte Temperaturen erwärmt und dabei für ausgewählte Zeiten gehalten. Anschließend wurden sie auf 22°C gekühlt. Der pH-Wert aller Proben wurde durch Zugabe von Schwefelsäure auf 3,5 vermindert wodurch ein Ausflocken der Zellen auftrat. Nach der Säurebehandlung wurden die Proben in 1 1 graduierte Zylinder auf solche Weise
überführt, daß ein vollständiges Vermischen erreicht wurde. Die Anfangsabsetzgeschwindigkeit der Grenzschicht zwischen dem ausgeflockten Material und der überstehenden Flüssigkeit wurde bestimmt und die Konzentration des Materials, das sich am Boden des Zylinders nach 16 Stunden angesammelt hatte, wurdi gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt
In Versuchen in kleinem Maßstab ist die Reproduzierbarkeit der Absetzgeschwindigkeiten, bedingt durch die Unterschiede in den spezifischen Gewichten der Kulturmedien und der Bildung von Gasblasen, die die Absetzgeschwindigkeit der Flocken vermindert, verschlechtert Daher gibt die Absetzgeschwindigkeit in einigen Fällen ein ungenügendes Anzeichen für das Ausmaß der Ausflockung. In den Beispielen 1 und 2 wurde daher eine ίο qualitative Beschreibung der Ausflockung verwendet die auf der visuellen Bewertung der Größe und der Stärke der gebildeten Flocken basiert In den Tabellen 1 und 2 ist das Ausmaß der Ausflockung durch die folgenden Symbole dargestellt:
0 keine Ausflockung
15 + eine geringe Ausflockung
+ + starke Bildung von hauptsächlich kleinen leichten Flocken mit zufriedenstellenden Absetzeigenschaften
■{- + + eine ausgeprägte Bildung von großen starken Flocken mit sehr guten Absetzeigenschaften.
N.B. Bei der Probe A wurde auf die Stufe (B) verzichtet während bei der Probe B auf die Stufe (A) verzichtet wurde. Die Proben C bis F wurden beiden Stufen (A) und (B) unterworfen.
Probe Temperaturnach Zeit bei üer Anfangsabsetz- Endkonzentration Ausflockungs-
_- dem Erwärmen ("C) Temperatur in geschwindigkeit nach 16 h grad
Minuten (cm/h) (g/l)
A 35 — — 2 4
B 70 5 93 48
30 C 70 2 372 84
D 70 5 392 55
E 85 2 450 52
F 85 5 354 65
Beispiel 2
In getrennten Versuchen wurden Suspensionsproben, die ungefähr 2,5 g/l Trockengewicht an Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas diminuta, Bacillus cereus und Acaligenes faecalis enthielten, aus ansatzweisen Kulturen entnommen. In jedem Fall wurden vier 5 ml Proben (A bis D) genommen und folgendermaßen behandch:
A keine Behandlung
B Der pH-Wert wurde unter Verwendung von HCL auf 3,5 eingestellt.
C Der pH-Wert wurde unter Verwendung von NaOH-Lösung auf 10 eingestellt und unter Verwendung von HCl nach 15 Minuten auf 3,5 eingestellt.
D Der pH-Wert wurde unter Verwendung von NaOH-Lösung auf 8,5 eingestellt Die Probe wurde auf 800C während einer M'nute erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt und dann wurde
der pH-Wert unter Verwendung von HCl auf 3,5 eingestellt
Die Absetzgeschwindigkeiten zu Beginn und der Ausflockungsgrad, bestimmt wie in Beispiel 1, sind in der so folgenden Tabelle 2 aufgeführt
Tabelle 2
Bakterium Beispiel Setzgesc!i<vind.°£k;it Ausflockungs- pH des Mediums nach
zu Beginn (cm/h) grad der ersten
Probeenti.&hme
Pseudomonas fluorescens AO 0
B 60 +
60 C einige Flotation + + 7,4
D 110 + + +
Pseudomonas diminuta A 0 0
BO +
es CO+ 7,9
D einige Flotation + 4-
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Bakterium
Beispiel Setzgeschwindigkeit Ausflockungs-
zu Beginn (cm/h) grad
pH des Mediums nach
der ersten
Probeentnahme
Bacillus cereus
Alcaligenes faecalis
A B C D
A B C D
Beispiel 3
0
0
Eine Anzahl von Suspensionen, die einen Pseudomonas methylotropha Stamm enthielten, wurden unter Verwendung verschiedener Bedingungen in einer kontinuierlichen Ausflockungsvorrichtung ausgeflockt. In der Vorrichtung wurde Medium aus einem Beschickungstank in einen Rührtank durch ein System gepumpt, das enthielt:
(a) Eine Alkalieinführungsstelle-,
(b) einen Wärmeaustauscher, bei dem die Röhre, die das Medium transportierte, durch ein ölbad geleitet wurde;
(c) ein System, das verschiedene Strömungswege enthielt, die erD.iglichten, daß das Medium bei erhöhter Temperatur während verschiedener Zeiten gehalten wurde, beispielsweise während einer sehr kurzen Zeit (Intervallzeit 0), 1 Minute, 2 Minuten und 3 Minuten;
(d) einen Kühler;
(e) eine Säureeinleitungsstelle.
Einrichtungen waren vorgesehen, um den pH-Wert nach der Alkali- und Säurezugabe zu messen und um die Temperatur des Mediums beim Verlassen des Wärmeaustauschers und nach der Säurezugabe zu bestimmen. Die Alkalizugabe erfolgt, indem man eine 1 :6/NH4OH : H2O/Lösung in das System einleitet Die Säurezugabe erfolgt; indem man eine 1 :1 Mischung aus 0J5 η HjSCXi und 0J5 η H2PO4 Lösung in das System leitete.
Das Ausmaß der Ausflockung und die Klarheit der überstehenden Flüssigkeit, die durch das Verfahren erreichbar waren, wurden visuell gewertet.
Abhängig von dem pH-Wert und der Wärmebehandlung nahmen die Flocken verschiedene Formen an. Die folgenden Arten wurden identifiziert: (i) sehr klein, (ii) Fasern, wie feine Asbestfasern, (iii) größere Fasern, (iv) etwas granular, (ν) granular, (vi) Gelkügelchen.
Unter bestimmten Bedingungen wurden die Rocken in stärker gelartigem Zustand gebildet, wobei sie jedoch ihre Form beibehielten. Fand in dem Rührtank eine schlechte Vermischung statt, so bildeten sich Gelkügelchen und Flocken. Ein stärkeres Rühren gab eine volle Ausflockung, während übermäßiges Rühren ein Abbrechen der Flocken bewirkte.
Ideale Flocken sind groß und besitzen eine schnelle Absetzgeschwindigkeit (Geschwindigkeiten über 3000 cm/h wurden erhalten).
Die idealsten Flocken sind die oben erwähnten Flocken (iii), (iv) und (v). Feine Flocken besitzen die Neigung, daß sie in der überstehenden Flüssigkeit hängen bleiben und relativ langsame Absetzgeschwindigkeiten ergeben, während Gelkü^dchen aus nicht ausgeflockter Kultur bestehen und somit nicht ideal sind. Beispiele der bei den verschiedenen Bedingungen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt
Tabelle 3
Trockengewicht pH nach der der Bakterien Alkalizugabe
im Medium (g/l)
Temperatur nach dem Erwärmen
CQ
Verweilzeit der erhöhten Temperatur(Min.) Kühlwasser
pH-Wert nach der
Säurezugabe
Temperatur
im Rührtank
Bemerkungen
keine Zugabe
abgestellt
3,5
25
10,4 8,4 81.5 3
4,75 keine Zugabe 50 0
4,75 keine Zugabe 60 0
6,5 8,7 85 3
6,5 8,7 85 0
6,0 8,5 80 3
6,0 8,5 75 0
an 3,3 41
an 3,5 nicht bestimmt
an 3,5 nicht bestimmt
an 3,4 32
an 3,4 32
an 3,5 32
an 3,0 32,5
keine Ausflockung, eine gewisse Koagulation von Teilchen, die überstehende Flüssigkeit ist trübe große Flocken, gutes Absetzen feine Flocken, gutes Absetzen granuläre Flocken, klar überstehende Lösung Flocken und Gelkügelchen, die sich schnell absetzen Flocken und Gelkügelchen, die sich schnell absetzen große Gelflocken, eine klare überstehende Lösung große Flocken, schnelles Absetzen
Beispiel 4
Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei man 4 χ 200 ml Proben einer Suspension verwendete, die ungefähr 1 g/l Trockengewicht an Pseudomonas aeroginosa enthielt und aus einer ansatzreifen Kultur stammt. Der pH-Wert zur Zeit der Probenentnahme betrug 7,1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4 Absetzgeschwindigkeit
zu Beginn (cm/h)		 Ausflockungs
grad
Proben 0
0
0
etwas Flotation		 0
0
+
+ +
A
B
C
D
10
Beispiel 5
Vier 200 ml Proben einer Suspension, die ungefähr 5 g/l Trockengewicht an Arthrobacter Nov. enthielt, wurden aus einer ansatzreifen KLuitur entnommen. Der pH-Wert zur Zeit der Probenentnahme betrug 6,9. Die vier Proben wurden folgendermaßen behandelt:
A keine Behandlung
B Einstellung des pH-Werts auf 3,5 unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure
C Einstellung des pH-Werts auf 10 unter Verwendung von Natriumhydroxydlösung, Erwärmen während 5 Minuten auf 85°C und Einstellen des pH-Werts auf 3,5 mit Chlorwasserstoffsäure.
25
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5
30
Probe ursprüngliche Absetz- Ausflockungs
geschwindigkeit (cm/h) grad
A B C
40 45 50 55 60

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium durch Ausflocken der Zellen und Abtrennung der ausgeflockten Zellen aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ausgeflockt werden, indem man das Medium auf eine Temperatur innerhalb des Bereichs von 50 bis 2000C erhitzt und anschließend den pH-Wert des Mediums durch Behandlung mit einer Säure auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 2 bis 5 herabsetzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich den pH-Wert des Mediums durch Behandlung mit einem Alkali auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 bis 11 erhöht, bevor man
ίο das Medium erhitzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert durch die Behandlung mit dem Alkali auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 bis 9 erhöht.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Medium auf eine Temperatur innerhalb des Bereiches von 70° bis 90° C erhitzt
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Medium nach dem Erhitzen auf eine Temperatur innerhalb des Bereiches von 20 bis 30° C abkühlt bevor man es mit Säure behandelt
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man den :-H-Wert durch die Behandlung mit der Säure auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 2J5 bis 4,5 herabsetzt
DE2310041A 1972-03-03 1973-02-28 Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wäßrigen Medium Expired DE2310041C2 (de)

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GB998172A GB1381306A (en) 1972-03-03 1972-03-03 Separating bacterial cells from a liquid medium

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