JP2515283B2 - 安定なグルコ―ス・イソメラ―ゼ濃縮物およびその製法 - Google Patents

安定なグルコ―ス・イソメラ―ゼ濃縮物およびその製法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、殺菌剤を加えなくても化学的、微生物学的
に安定であり、反応器カラム内の担体上に固定化するの
に非常に有用なグルコース・イソメラーゼ酵素の濃縮物
に関する。本発明はまた該濃縮物の製法に関する。
発明の背景 グルコースのフルクトースへの異性化のためのグルコ
ース・イソメラーゼの使用は、よく知られた工業的方法
であり、該酵素は、しばしば固定化形で使用される。使
用されている多くの商業的方法では、固定化酵素調製物
は別の工程で製造され、該工程においては、酵素は吸着
技術により担体上に固定化されるか、酵素と共に全微生
物細胞塊を固定してマトリツクスを形成させる。反応器
カラムを用意した固定化酵素で組立てる。酵素を使い果
したら、該カラムを空け、再び新しい固定化酵素調製物
で組立てる。
精製した酵素の方が未精製の粗調製物より担体上に吸
着され易いということが知られている（米国特許第4347
322号）。問題は、そのような、安定な、取扱い易く、
保存し易いカラム内の担体上に固定するために使用でき
る酵素調製物を製造することである。
沈澱または結晶化にもとずくグルコース・イソメラー
ゼ精製方法から得られた沈澱または結晶塊は少なくとも
60重量％の水を含有し、それは酵素構造の破壊なしには
除去することができない。そのような結晶塊は微生物学
的に安定でなく、取扱いや使用が困難である。別法とし
て、該結晶塊を溶解して溶液とすることがあり、その濃
度は貯蔵、安定性、輸送の見地からできるだけ高くする
のが望ましい。自明な方法は該酵素結晶を水または希薄
塩溶液中に溶解することであろう。しかし、実際にはグ
ルコース・イソメラーゼの比較的低い溶解性のために、
結晶を水に溶して十分な濃度のイソメラーゼ溶液を調製
することは不可能であることが判明している。イソメラ
ーゼの希薄水溶液は非常に不安定であり、微生物学的お
よび化学的劣化の結果、数日間でその活性を失う。
該酵素は有機溶媒に溶解しうることも示唆されている
（米国特許第4077842号）。しかし、食品製造工程にお
いて有機溶媒を使用することは望ましくなく、したがつ
て、この技術は食品製造に直接使用される酵素には適当
ではない。しかし、該酵素が食品に使用されないなら
ば、溶解に有用な物質の種類は拡張されうる。
グルコース・イソメラーゼは現在使用されている最も
重要な酵素の１つであるため、グルコース・イソメラー
ゼの調製、精製および使用に関する文献が多数存在す
る。しかし、発表されている精製方法は全て非常に複雑
で、一般に、かなり低収率である。
結晶化による酵素および蛋白質の精製は、それ自体公
知であり、例えば、便覧エンザイムズ〔デイクソン，エ
ムおよびウエブ，イー・シーエンザイムズ，第３版、ロ
ングマン・グループ・リミテツド，ブンガイ（Dixon,M.
and Webb,E..,Enzymes,3rd ed.,Longman Group Ltd.,Bu
ngay）1979,1116頁〕には、192枚の酵素結晶の写真が示
されている。さらに、硫酸アンモニウムは、いくつかの
場合、結晶化を促し、溶解性を減少させる薬剤として適
していることが知られている。加えて、硫酸アンモニウ
ム結晶化はしばしば、ある種の他の塩あるいはアセトン
またはアルコールのような有機溶媒により行なうことが
できる。この分野では、ある酵素または他のある蛋白質
がそれ自体は公知のある沈澱剤により結晶化されうるこ
とは決して自明でないということが一般に認められてい
る。生化学における精製方法が広大な発展を遂げても、
まだ、その結晶化がうまくいつていない多くの蛋白質お
よび酵素が知られている。すなわち、酵素結晶化の「科
学」（それは事実上むしろ芸術といつてよい。）は非常
に経験的であり、ある種の方法が１つの酵素の結晶化に
うまくいくことが示されても、同じ方法が他の酵素の結
晶化に一般的適用性を有するわけではない。
グルコース・イソメラーゼ精製方法またはそのような
方法の一部として分別硫酸塩（硫酸アンモニウムおよび
／またはマグネシウム）沈澱の使用がいくつかの刊行物
から知られている〔米国特許第4237231号、米国特許第4
077842号、アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Agr.Biol.Chem.），45（1981）619
〜627、同28（1965）1123〜1128、同34（1970）1795〜1
804、同29（1965）1129〜1134、バイオヒミカ・バイオ
フイズイカ・アクタ（Biochim・Biophys.Acta.），151
（1968）670〜680〕。
これらのイソメラーゼ精製方法に使用される硫酸塩濃
度は相対的に高い。例えば、米国特許第4237231号によ
る方法では、40％硫酸アンモニウムの飽和度で不必要な
蛋白質が該イソメラーゼ溶液から最初に沈澱し、次いで
イソメラーゼ自体がより高い飽和度（60％まで）で沈澱
する。
高い硫酸アンモニウム濃度が分別沈澱に使用される場
合、他の多数の蛋白質が常にイソメラーゼとともに沈澱
する。もしもイソメラーゼが他の方法で既にある程度精
製されていないならば、使用する硫酸アンモニウム濃度
が高くなればなるほど、さらに多数の蛋白質が沈澱して
くる。
分別沈澱にもとずく精製方法においては、得られる物
は通常無定形沈澱であり、工業用の遠心分離機またはセ
パレータにより良好な収率で母液から分離することは非
常に困難であり、または不可能でさえある。
該無定形沈澱は通常、混合析出物であり、特に、原料
物質が微生物細胞液であり、予め精製されていない場
合、イソメラーゼの他に、他の蛋白質も含む。そのよう
な無定形沈澱は母液から分離することが難しく、沈澱法
はイソメラーゼに関しては所望の精製効果を与えない。
硫酸アンモニウム、他の塩または有機溶媒によるグル
コース・イソメラーゼの結晶化は、いくつかの刊行物に
記載されている〔バイオヒミカ・バイオフイズイカ・ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta.）151（1968）670〜680、
アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Agr.Biol.chem.），34（1970）1795〜1804、同
45（1981）619〜627、同33（1969）1527〜1534〕。これ
らの刊行物に記載された結晶化方法の特徴的な点は低収
率であり、非常に長い結晶化時間であり、または化学薬
品の相対的に高い消耗である。これらの場合のいずれに
おいても基礎的研究目的用の少量の純粋なイソメラーゼ
を調製することを目的としている。例えば、イソメラー
ゼは最初ある種の方法（有機溶媒での抽出、DEAE−セフ
アデツクス−カラムクロマトグラフイー、硫酸アンモニ
ウム沈澱、透析）により精製され、その後、精製イソメ
ラーゼの純水溶液からの結晶化が硫酸アンモニウム、リ
ン酸塩緩衝剤またはアセトンを用いて行なわれている。
前記刊行物に記載された方法はどれも経済性が低いた
め、工業的規模で使用されていない。
発明の概要 本発明は濃厚水性ポリヒドロキシ化合物含有溶液に溶
解したグルコース・イソメラーゼを含有することで特徴
づけられる安定なグルコースイソメラーゼ濃縮物に関す
る。
本発明による濃縮物は化学的にも微生物学的にも安定
であり、特にグルコース・イソメラーゼを担体に固定化
する方法に有用であるということが判明した。好適なポ
リヒドロキシ含有化合物は、例えば、炭水化物およびポ
リオールのような水に容易に溶けるそのような全ての化
合物である。糖、グリセロール、ポリプロピレングリコ
ールまたはエチレングリコールもまた好適である。その
まま食品に使用されている糖ならびに食品添加物として
許容されている糖アルコールが特に好適である。異性化
の最終生成物はグルコース−フルクトース・シロツプで
あるので、これらの糖の混合物、すなわち、転化糖が該
目的に非常に好適である。
該濃縮物中の総乾燥固形分は本質的に微生物学的に安
定な程度でなければならない。すなわち、乾燥固形分は
約60〜70重量％であるべきである（すなわち、水分の作
用が十分低くなくてはならない）。
本発明によるグルコース・イソメラーゼ濃縮物は５〜
20重量％のグルコースイソメラーゼ、好ましくは、５〜
15重量％のグルコースイソメラーゼ、30〜60重量％の、
例えば、グルコース、マルトース、フルクトース、シユ
ークロース、ソルビトール、キシリトールまたはそれら
の混合物、例えば転化糖、グルコース・シロツプまたは
異性化グルコース・シロツプのような水溶性炭水化物、
15重量％以下の適当な塩、例えば、硫酸アンモニウムお
よび／またはマグネシウム、および／または緩衝剤（pH
5.0〜8.0）、例えば、ナトリウム−カリウム−リン酸緩
衝剤、炭酸塩緩衝剤または有機塩（例えばアミノ酸塩）
で調製された緩衝剤または緩衝剤の混合物を含有し、残
部が水である。
該濃縮物のpHは5.0〜8.0であり、酵素活性は500〜100
00GIU/g濃縮物である。好適には、pHは6.0〜8.0であ
り、酵素活性は2000〜5000GIU/g濃縮物である（GIU＝グ
ルコース・イソメラーゼ単位）。
発明の詳説 次に、本発明による好適な酵素濃縮物の数例を示す。
1.50重量％ グリセロール 10重量％ 水 15重量％ 酵素 5重量％ 硫酸アンモニウム 2.50重量％ 転化糖 30重量％ 水 15重量％ 酵素 1重量％ 緩衝剤（Na−Ｋ−リン酸塩） 4重量％ 硫酸アンモニウム 3.50重量％ ソルビトール 40重量％ 水 10重量％ 酵素 4.50重量％ シユークロース 30重量％ 水 15重量％ 酵素 5重量％ 緩衝剤（リン酸ナトリウム） しかしながら、総濃度が十分に高く、かつ、液状の溶
液が取扱い易いということを考慮しながら、必要に応じ
て濃縮物の組成を変えてもよい。
本発明によるグルコース・イソメラーゼ濃縮物は純粋
で、安定であり、取扱いおよび使用が容易である。酵素
活性は調節することができる。実用の観点からは、好適
な活性範囲は2000〜10000GIU/g調製物である。
用いる糖、糖アルコールおよび塩は好適には食品用
（例えば、フード・ケミカルズ・コード標準品）であ
る。酵素は結晶化その他の方法で十分に精製されるべき
である。
グルコース・イソメラーゼ吸着用の好適な担体はアニ
オン交換能を有する材料、例えば、ガラスビーズ、イオ
ン交換樹脂またはシリカ・ベース担体である。特に好適
にはDEAE−セルロースおよびDEAE−デキストランのよう
な蛋白質を吸着することで知られているジエチルアミノ
エチル（DEAE）誘導体である。文献に記載された多数の
担体がある。
DEAEセルロースを担体として使用する場合1000IGIU/g
固定化酵素（IGIU＝固定化グルコース・イソメラーゼ活
性）以上の高活性を得ることが容易である。
本発明は、また前記の安定なグルコース・イソメラー
ゼ濃縮物の製造方法に関する。該方法は、 ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化するため、好適
な塩を発酵から得た部分的に精製されたグルコース・イ
ソメラーゼ溶液へ加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
該溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、次いで、所
望ならば、１または数回再結晶し、 ｃ）炭水化物またはその濃厚水溶液を得られた結晶塊に
加え、溶解し、それによつて安定なグルコース・イソメ
ラーゼ濃縮物を得る。
ことを特徴とする。
本発明によれば、該イソメラーゼ酵素を塩溶液から結
晶化することにより非常に効率よく精製することができ
る。好適な塩は、該酵素を不活性化しない非毒性塩の全
てである。本発明による方法では硫酸アンモニウムおよ
び／またはマグネシウムが使用される。
塩によるグルコース・イソメラーゼの沈澱は、それ自
体は公知の方法で、例えば、アグリカルチユラル・アン
ド・バイロジカル・ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）,2
9（1965）pp.1129〜1134（イスムレおよびサトー（Isum
re and Sato））に記載されている。しかし、結晶形成
が起こるそのような方法は以前には記載されていない。
前記の方法では、無定形沈澱が形成される。
条件により、同じ化学薬品である硫酸ナトリウムまた
はマグネシウムを使用することにより無定形沈澱または
結晶沈澱のどちらかを得ることができる。多数の酵素が
同様な行動をとることが一般に知られている。
本発明による方法の特徴的な驚くべき特色は、沈澱す
る可能性がある他の全ての物質以前に、イソメラーゼが
結晶物質として沈澱するということである。該方法で
は、正確に選択した条件および他の物質が該溶液から沈
澱しない低濃度の硫酸アンモニウムが使用される。この
点で該方法は当該分野の文献に記載されていることとは
基本的に異る。以前には、グルコース・イソメラーゼは
産生微生物の細胞液または細胞液濃縮物から唯一の沈澱
成分として直接、単独で結晶化されたことはない。該方
法はまた、より以前に文献で述べられたことと基本的な
異なる非常に高い収率を与える。
酵素調製物の保存特性および安定性を、例えば、グリ
セロール、ポリアルコールおよび糖により増加できるこ
とが一般に知られている。そのような酵素調製物は通
常、前記物質を濃縮酵素溶液へ加えることにより調製さ
れる。
乾燥無水ポリアルコールまたは糖（好ましくは、グル
コース）を濃縮イソメラーゼ結晶懸濁液中に混合する
か、または約10000GIU/gの最高可能活性を有する固体結
晶塊中に混合すると、驚くべきことに、イソメラーゼ結
晶が溶解し、純粋な透明溶液を生じることが判明した。
そのような溶液は、その水分濃度が十分低く、そのイソ
メラーゼ活性が十分高いと、安定である。該溶液は結晶
化工程に由来する塩または後で加えられた塩を含有して
もよく、塩自体は微生物学的安定性を増加させる効果を
有する。しかし、該溶液について、可能な限り高いイソ
メラーゼ活性を達成するためにイソメラーゼ結晶を溶解
させる観点からは、ポリオールおよび糖が基本的に重要
である。
先行文献には、本発明による生成物と同じ程度の高い
酵素活性を有するイソメラーゼ溶液の例は全くなしい、
そのような溶液の調製方法も記載されていない。
グルコース・イソメラーゼ濃縮物の調製は好適には次
のように行なわれる。
ａ）溶菌によりストレプトマイセス・ルビギノサス（St
reptomyces rubiginosus）から細胞液を調製し（米国特
許第4410627号）、該、細胞液から限外過によりイソ
メラーゼ含有濃縮物を調製し、結晶化工程用の原料物質
とする。該濃縮物の好適なイソメラーゼ濃度は200〜800
GIU/gである。
ｂ）該イソメラーゼ溶液のpHは5.7〜8.0の範囲、好適に
はpH7.0に調整される。
ｃ）該溶液は16℃またはそれ以下に冷却される。
ｄ）硫酸アンモニウムおよび／またはマグネシウムが、
好ましくは、１当たり50〜170gで該溶液に加えられ
る。加えられる硫酸塩の量は最初のイソメラーゼ濃度お
よび最終の結晶化温度に依存する。加えられる硫酸塩の
最適量はイソメラーゼだけが結晶化し、他の蛋白質がま
だ沈澱を始めないような量である。
ｅ）たとえ、一度に全量を加えることにより許容しうる
結果が得られるとしても（そのような場合イソメラーゼ
結晶の大きさは、好ましくないくらい小さいままであ
る）、硫酸塩の添加は好適には、全量の添加に２〜４時
間を要するように徐々に行なう。
ｆ）該溶液は好適には数時間、好ましくは、関与する混
合物の凝固点近くまで冷却する。凝固点は試験した最低
硫酸塩濃度で約−２℃、最高硫酸塩濃度で−６℃であ
る。冷却は硫酸塩添加開始と同時か、硫酸塩添加完了し
てから開始することができる。徐々に冷却することによ
り、冷却が溶解度低下効果を有し、それによつても収率
が増加するという事実の他に、イソメラーゼ結晶の大き
さを有利に増加させるという冷却結晶化効果が得られ
る。
ｇ）イソメラーゼ結晶は、それらを容器の底へ沈降させ
るか、過するか、または大規模の時は、最適には、連
続セパレータにより遠心分離することにより溶液から分
離される。
ｈ）分離した結晶塊は、乾燥炭水化物またはその濃厚水
溶液を加えることにより溶解され、それにより該イソメ
ラーゼ結晶が溶解して安定なグルコース・イソメラーゼ
濃縮物が製造される。
所望により、結晶化を繰り返えしてもよく、その場
合、該結晶塊は分離（工程ｇ）後、比較的高温（20〜30
℃）で多量の水に溶解しなければならない。この点で、
好適な水量は溶液のイソメラーゼ活性が500〜2000GIU/m
lとなる量、換言すると、使用する水量の重量が典型的
には結晶塊の重量の４〜10倍となる量である。
本明細書において、GIUはグルコース・イソメラーゼ
単位の省号であ、室温および60℃で測定した、pH6.84〜
6.85（0.2Mマレイン酸ナトリウム）で最初に１当たり
２モルのグルコース、１当たり0.02モルの硫酸マグネ
シウムおよび0.001モルのCoCl2を含有する溶液中で１分
当たり１マイクロモルのグルコースをフルクトースへ変
換する酵素の量である。グルコースイソメラーゼ測定は
エヌ・イー・ロイドら、シリアル・ケミストリー（N.E.
LLoyd,et al.,Cereal Chem.）49,No.5pp.544−553（197
2）に開示された方法により行なつた。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１ 約40m3のストレプトマイセス・ルビギノサスの槽を米
国特許第4410627号の記載に従つて発酵する。細胞塊を
公知の方法（同参考文献）で溶解する。細胞残渣および
他の固体物質を通常の珪藻土ドラム過器により去
し、それにより32トンのイソメラーゼ含有液を得る。
この液をPCI（パターソン−キヤンデイインコーポレ
ーテツド（Patterson−Candy,Inc.））限外過器で
液し、それにより3000kgのイソメラーゼ含有濃縮物を得
る。その活性は960,000,000GIUである。限外過膜を通
過した通過液を除去する。
120kgの硫酸マグネシウムおよび300kgの硫酸アンモニ
ウム（MgSO4・7H2Oおよび（NH4）2SO4、食品用）を該濃
縮物に加える。結晶化を促進するため混合物を10℃に冷
却する。生成した結晶をデカンテーシヨンで分離し、41
1kgの硫酸アンモニウムを加えて結晶化を繰り返す。結
晶を再度デカンテーシヨンで分離する。402kgの水を加
えて結晶塊を溶解し、1Mのアンモニア溶液により該溶液
のpHを6.5に調整する。該溶液プレート過器で過
し、16kgの硫酸マグネシウムおよび40kgの硫酸アンモニ
ウムを使用して結晶化を再度繰り返す。
29kgの酵素、3.7kgの塩（MgSO4,（NH4）2SO4）および
残部が水からなる収量90kgの結晶塊を得る。該結晶塊へ
45kgのグルコースおよび45kgのフルクトースならびに70
重量％の乾燥固形分を有する20kgの転化糖を加える。こ
のようにして200kgの酵素調製物が得られる。その組成
は次のとおりである。
29.2重量％ 水 52.0重量％ 糖 14.5重量％ グルコース・イソメラーゼ 4.3重量％ 塩（硫酸マグネシウム−硫酸アンモニウ
ム） 該酵素濃縮物のグルコースイソメラーゼ活性は4500GI
U/gである。
実施例２ 実施例１に記載した方法で限外過した発酵物を調製
する限外過発酵物4000kgに、結晶硫酸アンモニウム24
4kgおよび水900kgに塩600kgを溶解した硫酸アンモニウ
ム溶液を加える。該溶液を13℃に冷却し、この温度で20
時間保つ。生成した結晶塊をウエストフアリア・エヌ・
エー７（Westfalia NA7）セパレータにより分離する。
結晶を水に溶解し、該溶液を過する。液量は2000
である。結晶硫酸アンモニウム122kgおよび水460に硫
酸アンモニウム300kgを溶解した硫酸アンモニウム溶液
を用いて結晶化をくり返す。得られた結晶塊を再度セパ
レータで分離する。結晶塊（525kg）へ同量の結晶フル
クトースを加える。これにより該塊が溶解し、フルクト
ースの一部がグルコースに異性化する。この方法で安定
な酵素濃縮物が得られる。その組成は次のとおりであ
る。
糖（グルコースおよびフルクトース） 50.0重量％ 酵素 11.2重量％ 硫酸アンモニウム 3.5重量％ 水 35.3重量％ 該濃縮物のグルコースイソメラーゼ活性は3000GIU/g
である。
実施例３ 実施例１に記載した方法で限外過発酵物を調製す
る。2,400,000,000GIU活性を有する4000の限外過し
た発酵物をグルコース・イソメラーゼの結晶化に用い
る。５％NaOH溶液により該溶液のpHをpH7.0に調整し、
溶液の温度を12℃に調整する。グルコース・イソメラー
ゼの結晶化のために、750の水に溶解した500kgの硫酸
アモニウムを該溶液へ等供給速度で２時間を要して加え
る。次いで該溶液を−２℃に冷却し、24時間撹拌する。
グルコース・イソメラーゼ結晶をウエストフアリア・エ
ヌ・エー−７セパレータにより分離する。23.6重量％の
乾燥固形分および2,300,000000GIUの活性を有する結晶
塊390kgを得る。30kgの塩化ナトリウムおよび180kgのグ
ルコースを該結晶塊へ加え、得られた酵素濃縮物のpHを
５％NaOH溶液で7.0に調整する。これらの条件下でグル
コースが一部異性化される。この方法で、600kgの安定
な酵素濃縮物が得られる。その組成は次のとおりであ
る。
49.7重量％ 水 30.0重量％ 糖（グルコース／フルクトース） 12.8重量％ 酵素 2.5重量％ 硫酸アンモニウム 5.0重量％ 塩化ナトリウム 該酵素濃縮物のグルコース−イソメラーゼ活性は3400
GIU/gである。
実施例４ 実施例１に記載した方法で限外過した発酵物を調製
する。2,400,000,000GIU活性を有する4000の限外過
した発酵物をグルコース・イソメラーゼの結晶化に用い
る。５％NaOH溶液により該溶液のpHをpH7.0に調整し、
溶液の温度を12℃に調整する。グルコース・イソメラー
ゼの結晶化のために、750の水に溶解した500kgの硫酸
アンモニウムを該溶液へ等供給速度で２時間で加える。
次いで該溶液を−２℃に冷却し、24時間撹拌する。グル
コース・イソメラーゼ結晶をデカンテーシヨンで分離す
る。40.0重量％の乾燥固形分および2,300,000,000GIUの
活性を有する結晶塊230kgを得る。115kgのグルコースお
よび115kgのフルクトースならびに70％の乾燥固形分を
有する50kgの転化糖を該結晶塊へ加える。この方法で、
510kgの酵素調製品物が得られる。その組成は次のとお
りである。
30.0重量％ 水 52.0重量％ 糖（グルコース、フルクトース） 15.1重量％ 酵素 2.9重量％ 硫酸アンモニウム 該酵素濃縮物のグルコース−イソメラーゼ活性は4500
GIU/gである。
実施例５ 実施例１に記載した方法で限外過した発酵物を調製
する。600GIU/mlの活性を有し25℃の温度の0.95のイ
ソメラーゼ濃縮物へ50gの硫酸アンモニウムを加える。
この段階では溶液中に沈澱は生成しない。該溶液を16時
間で０℃に冷却し、連続的に穏やかに撹拌しながら、そ
の温度に保持する。
イソメラーゼが２日で結晶し始める。結晶化を継続
し、５日後に97.5重量％のイソメラーゼが結晶形にな
り、2.5重量％のイソメラーゼがまだ母液中に溶解して
いる。結晶を実験室用遠心分離機で溶液から分離する。
それによつて56gの湿潤結晶塊を回収する。
この実施例によれば、文献で知られている典型的な量
と比べて非常に低濃度の硫酸アンモニウムでイソメラー
ゼを結晶させることができる。同時にこれは純粋な冷却
結晶化の実施例である。この実施例にかんがみ、もし硫
酸アンモニウムによる結晶化を迅速に行ない、次いで、
沈澱を直ちに、例えば15分で遠心分離機により分離した
ならば、米国特許第4237231号の方法のごとく、硫酸ア
ンモニウム濃度が低いと、イソメラーゼは完全に溶液中
に残存し、もし、沈澱しても結晶化は観察されず、その
利点が利用されないことが容易に理解できる。この実施
例に従つて調製された結晶塊は、その他の実施例と全く
同様に溶解できる。
本発明方法により調製された濃縮物は10カ月間は微生
物学的および化学的不活性化に対して安定であることが
証明されている。

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】濃厚水性ポリヒドロキシ化合物含有溶液中
    に溶解した結晶性グルコース・イソメラーゼからなり、
    約５〜約８のpHで、約５〜約20重量％のグルコース・イ
    ソメラーゼおよび約30〜約60重量％の水性ポリヒドロキ
    シ化合物を含有することを特徴とする安定なグルコース
    ・イソメラーゼ濃縮物。
  2. 【請求項２】グルコース・イソメラーゼ含量が約５〜約
    15％であって、pHが約６〜約８である特許請求の範囲第
    （１）項記載の濃縮物。
  3. 【請求項３】該ポリヒドロキシ化合物がグルコース、マ
    ルトース、フルクトース、サッカロース、ソルビトー
    ル、キシリトールおよび転化糖、グルコース・シロップ
    または異性化グルコース・シロップのようなそれらの混
    合物からなる群から選択される特許請求の範囲第（１）
    項記載の濃縮物。
  4. 【請求項４】50重量％のグルコースおよびフルクトー
    ス、15重量％のグルコース・イソメラーゼ、５重量％の
    硫酸アンモニウムまたはマグネシウム、および30重量％
    の水を含有する特許請求の範囲第（１）項記載の濃縮
    物。
  5. 【請求項５】ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化す
    るために、発酵から得た部分精製グルコース・イソメラ
    ーゼ溶液に適当な塩を加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
    該溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、次いで、所
    望により、１または数回再結晶し、 ｃ）ポリヒドロキシ化合物またはそれらの濃厚水性溶液
    を得られた結晶塊へ加えて溶解し、それによって安定な
    グルコース・イソメラーゼ濃縮物を得る ことを特徴とする、濃厚水性ポリヒドロキシ化合物含有
    溶液中に溶解した結晶性グルコース・イソメラーゼから
    なり、約５〜約８のpHで、約５〜約20重量％のグルコー
    ス・イソメラーゼおよび約30〜約60重量％の水性ポリヒ
    ドロキシ化合物を含有することを特徴とする安定なグル
    コース・イソメラーゼ濃縮物の製造方法。
  6. 【請求項６】グルコース・イソメラーゼを限外濾過で部
    分的に精製する特許請求の範囲第（５）項記載の方法。
  7. 【請求項７】ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化す
    るために、結晶硫酸アンモニウム、次いで、硫酸アンモ
    ニウム水溶液を発酵から得た限外濾過したグルコース・
    イソメラーゼに加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するた
    め、得られた溶液を冷却し、生成した結晶塊を分離し、
    該結晶を水に溶解して再結晶し、生成した溶液を濾過
    し、結晶硫酸アンモニウムおよび硫酸アンモニウム水溶
    液を加え、次いで生成した結晶塊を分離し、 ｃ）結晶フルクトースを得られた結晶塊へ加えて溶解
    し、それによりグルコース・イソメラーゼの安定な濃縮
    物を得る特許請求の範囲第（６）項記載の方法。
  8. 【請求項８】ａ）グルコース・イソメラーゼを結晶化す
    るために硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムを、
    発酵から得た限外濾過したグルコース・イソメラーゼ溶
    液へ加え、 ｂ）グルコース・イソメラーゼの結晶化を促進するため
    該溶液を冷却し、生成した結晶をデカンテーションで分
    離し、水、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムを
    加えることにより該結晶を再結晶し、デカンテーション
    で結晶を分離し、希アンモニアを加えることによりpHを
    6.5に調整し、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウ
    ムを加えることにより再度結晶化し、それにより結晶塊
    を得、 ｃ）該結晶塊へ水ならびにグルコースおよびフルクトー
    スを加えて溶解し、それによりグルコース・イソメラー
    ゼの安定な濃縮物を得る 特許請求の範囲第（６）項記載の方法。
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