CN116328740A - 一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物大分子纯化工艺，及固相萃取剂。该工艺包括：步骤S1,固相萃取剂的制备；S2，生物大分子料液调配，S3，目标分子吸附及捕获，S4，目标分子缓冲液洗涤，S5，目标分子洗脱与分步洗脱，S6，固相萃取剂的再生。本发明能够通过逆流，回流，并流，分流等工艺达到固相萃取剂发挥最佳性能，从生物大分子母液中提取纯度更高的多种产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物大分子分离技术领域，并阐述了固相萃取剂的制备，具体为一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂。
背景技术
当今有很多的大分子分离纯化技术，其中最重要的便是色谱分离技术。色谱分离采用硅胶，氧化铝等无机类，葡聚糖，琼脂糖等多糖类，聚苯烯，聚丙烯酸等聚合物类，无一不是通过孔径来实现比表面积的增大，来追求更大的结合载量，但是对于超大生物大分子来说，比如AAV，mRNA，pDNA来说，需要更大的孔径通过，现在的整体柱、纤维素膜、或者超大孔径的微球类产品均可实现上述大分子的分离提纯，但是只能够提纯指定分子，而且效率极低，回收率也很低全流程回收率约为30％。
发明内容
针对上述问题，本发明制备1微米左右的微球作为固相萃取剂，该1微米左右的微球具有6m2/ml的外表面积，与现使用的整体柱比表面积相当，兼具有流动性，能够快速的吸附目标分子，通过不同材质制备的固体萃取剂微球，具有亲水性，或疏水性，可以通过修饰其他的功能基团来实现各种各样的分离提纯需求。本发明采用离心机为萃取设备，能够很好的避免传统层析萃取因为微球粒径较小的原因，陡然增加的背压，还可以使吸附后的固体萃取剂和吸附剩余液体进行很好的分离，通过调节温度和缓冲液，可以满足活性较高的生物大分子进行分离提纯。本发明提供如下技术方案：
一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其步骤如下，固相相萃取剂制作，生物大分子料液调配，目标分子吸附及捕获，目标分子缓冲液洗涤，目标分子洗脱与分步洗脱，固相萃取剂的再生。
进一步的所属固相萃取剂为有机聚合物微球和多糖微球或包覆有机聚合物微球，本微球具有亲水性，不与生物大分子产生排斥作用，具有一定的强度，可以为实心球也可以为空心球。
更进一步的选择有机聚合物微球，所属的有机聚合物包括但不限于以下聚合物：丙烯酸聚合物，苯乙烯聚合物，聚乳酸，聚乙烯醇，甲基丙烯酸聚合物，尼伦类聚合物，甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合物，环氧类聚合物等塑料及橡胶类聚合物。
所述聚合物形状为球形，有比较大的表面积，能够有比较大的配基密度，可以对生物大分子进行吸附，本发明主要应用于离子交换吸附类和亲和吸附类。
具体的离心萃取工艺如下：
生物大分子料液配置：料液配置应该选择与其对应的层析工艺料液相同，即有着相同的缓冲溶液，盐浓度等其他保持生物大分子活性的必备物质基础。生物大分子的浓度可以根据固体萃取剂的量来选择。一般选择为层析吸附法的120％～150％。
目标分子的吸附于捕获：首相把固体萃取剂加入到萃取离心机中，不断的喷入缓冲溶液，以达到保证生物大分子活性的条件，对应层析工艺为缓冲步骤。上面步骤完成之后经过低速离心将缓冲液分离出来，加入配置好的料液量加入萃取离心机中，进行吸附和捕获目标分子，待捕获完成后进行低速离心或者切向流过滤，达到固液分离的效果。此步骤对应层析工艺中的上样。
目标分子洗涤：往萃取离心机中加入洗涤液，所述洗涤液与对应的层析工艺相同，将洗涤液加入萃取离心机中充分洗涤排除洗涤余液，可以采用一次洗涤，也可以多次洗涤，也可以采用不同浓度的洗涤液进行洗涤，以达到提纯或捕获的目的。
目标分子洗脱与分步洗脱：往萃取离心机中加入洗脱液，洗脱液与对应的层析工艺相同，将洗脱液和吸附生物大分子充分混合，收集洗脱余液，即为我们目标分子，可以采用梯度洗脱，等度洗脱或者阶梯洗脱。
固相萃取剂再生，也可为固相萃取剂再平衡，与所对应的层析工艺的再生液相同，能够重复使用6-8次。
以上步骤为简单的一种用于生物大分子的离心萃取工艺及固相萃取剂的方式，此方式为构成离心萃取工艺的主要单元，即单级萃取。
单级萃取只包括一个混合过程和一个分离过程，我们的固体萃取剂与料液接触即为混合过程，低速离心分离即为分离过程。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.制备1微米左右的微球作为固相萃取剂，该1微米左右的微球具有6m2/ml的外表面积，与现使用的整体柱比表面积相当，兼具有流动性，能够快速的吸附目标分子，通过不同材质制备的固体萃取剂微球，具有亲水性，或疏水性，可以通过修饰其他的功能基团来实现各种各样的分离提纯需求。本发明采用离心机为萃取设备，能够很好的避免传统层析萃取因为微球粒径较小的原因，陡然增加的背压，还可以使吸附后的固体萃取剂和吸附剩余液体进行很好的分离，通过调节温度和缓冲液，可以满足活性较高的生物大分子进行分离提纯。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明单级萃取装置示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供一种技术方案：一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其步骤如下，固相相萃取剂制作，生物大分子料液调配，目标分子吸附及捕获，目标分子缓冲液洗涤，目标分子洗脱与分步洗脱，固相萃取剂的再生。
本实施例中，所述固相萃取剂为有机聚合物微球和多糖微球或包覆有机聚合物微球，本微球具有亲水性，不与生物大分子产生排斥作用，具有一定的强度，可以为实心球也可以为空心球。
本实施例中，所述有机聚合物微球，所述的有机聚合物包括但不限于以下聚合物：丙烯酸聚合物，苯乙烯聚合物，聚乳酸，聚乙烯醇，甲基丙烯酸聚合物，尼伦类聚合物，甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合物，环氧类聚合物等塑料及橡胶类聚合物。
本实施例中，所述聚合物形状为球形，有比较大的表面积，能够有比较大的配基密度，可以对生物大分子进行吸附。
一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺，具体的离心萃取工艺如下：
S1、生物大分子料液配置：料液配置应该选择与其对应的层析工艺料液相同，即有着相同的缓冲溶液，盐浓度等其他保持生物大分子活性的必备物质基础。生物大分子的浓度可以根据固体萃取剂的量来选择。一般选择为层析吸附法的120％～150％。
S2、目标分子的吸附于捕获：首相把固体萃取剂加入到萃取离心机中，不断的喷入缓冲溶液，以达到保证生物大分子活性的条件，对应层析工艺为缓冲步骤。上面步骤完成之后经过低速离心将缓冲液分离出来，加入配置好的料液量加入萃取离心机中，进行吸附和捕获目标分子，待捕获完成后进行低速离心或者切向流过滤，达到固液分离的效果。此步骤对应层析工艺中的上样。
S3、目标分子洗涤：往萃取离心机中加入洗涤液，所述洗涤液与对应的层析工艺相同，将洗涤液加入萃取离心机中充分洗涤排除洗涤余液，可以采用一次洗涤，也可以多次洗涤，也可以采用不同浓度的洗涤液进行洗涤，以达到提纯或捕获的目的。
S4、目标分子洗脱与分步洗脱：往萃取离心机中加入洗脱液，洗脱液与对应的层析工艺相同，将洗脱液和吸附生物大分子充分混合，收集洗脱余液，即为我们目标分子，可以采用梯度洗脱，等度洗脱或者阶梯洗脱。
S5、固相萃取剂再生，也可为固相萃取剂再平衡，与所对应的层析工艺的再生液相同，能够重复使用6-8次。
以上步骤为简单的一种用于生物大分子的离心萃取工艺及固相萃取剂的方式，此方式为构成离心萃取工艺的主要单元，即单级萃取。
本案例包含特定粒径的苯乙烯微球制备技术，用于固体萃取剂采用1L反应釜进行制作，包括以下步骤：
S1、将苯乙烯：二乙烯基苯：对乙酰氧基苯乙烯＝8：1：1进行溶解，搅拌至没有气泡，溶解为透明或灰透明均一溶液，取上述溶液40g,作为分散相，添加1％的引发剂；
S2、将含1.5％PVA0388，0.5％氯化钠，其余组分为纯水，搅拌溶解，配置成均一透亮溶液，取上述溶液200g,作为连续相；
S3、将分散相以流线形加入连续相中，22℃搅拌转速2400转，分散时间2小时；
S4、升高温度至79℃，聚合2-3个小时，调高温度至84℃聚合，24个小时；
S5、经过酒精洗涤多次后，分离出1微米左右的小球。
【实施例二】
本案例包含特定粒径的苯乙烯微球进行水解，用于固体萃取剂采用1L反应釜进行制作，包括以下步骤：
S1、将实施例一制作小球50g放置在反应仪器中，加入300mL，0.5M的氢氧化钠溶液搅拌均匀，升高温度至85℃，水解12个小时；
S2、洗涤过滤，65℃烘干，变为亲水性小球。
【实施例三】
本案例包含特定粒径的DEAE苯乙烯微球制作，用于固体萃取剂采用1L反应釜进行制作，包括以下步骤：
S1、将上述实施例二小球50g放置在反应仪器中，加入300mlDMSO，12g氢氧化钠，31.8g碳酸钠，17.55g氯化钠，71.2gDEAE·HCl，混合均匀，分散时间为2个小时。
S2、将上述混合物加热至70-75℃，反应7个小时。
S3、反应结束后自然降至室温，用酒精反复清洗7遍，水清洗三遍。
S4、测得交换容量为429μmol/g
【实施例四】
本案例包含特定粒径的DEAE苯乙烯微球应用于DNA的捕获，包括以下步骤：
S1、采用微型离心萃取机20型号进行试验(即转鼓直径为20mm)，准备大肠杆菌裂解液，切向流0.45μm进行过滤。
S2、将平恒缓冲液：50mM Tris，10mM EDTA，PH7.2与5mlDEAE微球进行混合，一起用泵打入离心机中，再用平衡缓冲液100ml，按照5ml/min，泵入平恒。
S3、停止加入缓冲液，加入样液，样液组成：HCP(宿主细胞蛋白)55％，RNA21％，质粒DNA3％,LPS(脂多糖)3％，其他物质(培养基，内毒素)15％，质粒DNA浓度为0.064mg/ml，使样液与平衡后的微球充分吸附，总上样量为30ml，速度为2ml/min。
S4、上样完成后，泵入平衡缓冲液进行洗涤，平衡缓冲液100ml，按照5ml/min，泵入平恒。
S5、平衡缓冲液洗去浮液后，泵入洗涤缓冲液：50mM Tris，10mM EDTA，0.6M NaCl，PH7.2，洗涤缓冲液100ml，按照5ml/min，泵入平恒。
S6、洗涤完成后，泵入洗脱缓冲液：50mM Tris，10mM EDTA，1M NaCl，PH7.2，收集洗脱液，洗脱液为5ml，按照1ml/min速度洗脱。
S7、回收洗脱液质粒浓度为0.307mg/ml，HCP蛋白质去除率99％和RNA去除率99％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其步骤如下，固相相萃取剂制作，生物大分子料液调配，目标分子吸附及捕获，目标分子缓冲液洗涤，目标分子洗脱与分步洗脱，固相萃取剂的再生。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其特征在于：所述固相萃取剂为有机聚合物微球和多糖微球或包覆有机聚合物微球，本微球具有亲水性，不与生物大分子产生排斥作用，具有一定的强度，可以为实心球也可以为空心球。
3.根据权利要求2所述的一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其特征在于：所述有机聚合物微球，所述的有机聚合物包括但不限于以下聚合物：丙烯酸聚合物，苯乙烯聚合物，聚乳酸，聚乙烯醇，甲基丙烯酸聚合物，尼伦类聚合物，甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合物，环氧类聚合物等塑料及橡胶类聚合物。
4.根据权利要求1所述的一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺及固相萃取剂，其特征在于：所述聚合物形状为球形，有比较大的表面积，能够有比较大的配基密度，可以对生物大分子进行吸附。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种用于生物大分子纯化的离心萃取工艺，具体的离心萃取工艺如下：
S1、生物大分子料液配置：料液配置应该选择与其对应的层析工艺料液相同，即有着相同的缓冲溶液，盐浓度等其他保持生物大分子活性的必备物质基础。生物大分子的浓度可以根据固体萃取剂的量来选择。一般选择为层析吸附法的120％～150％。
S2、目标分子的吸附于捕获：首相把固体萃取剂加入到萃取离心机中，不断的喷入缓冲溶液，以达到保证生物大分子活性的条件，对应层析工艺为缓冲步骤。上面步骤完成之后经过低速离心将缓冲液分离出来，加入配置好的料液量加入萃取离心机中，进行吸附和捕获目标分子，待捕获完成后进行低速离心或者切向流过滤，达到固液分离的效果。此步骤对应层析工艺中的上样。
S3、目标分子洗涤：往萃取离心机中加入洗涤液，所述洗涤液与对应的层析工艺相同，将洗涤液加入萃取离心机中充分洗涤排除洗涤余液，可以采用一次洗涤，也可以多次洗涤，也可以采用不同浓度的洗涤液进行洗涤，以达到提纯或捕获的目的。
S4、目标分子洗脱与分步洗脱：往萃取离心机中加入洗脱液，洗脱液与对应的层析工艺相同，将洗脱液和吸附生物大分子充分混合，收集洗脱余液，即为我们目标分子，可以采用梯度洗脱，等度洗脱或者阶梯洗脱。
S5、固相萃取剂再生，也可为固相萃取剂再平衡，与所对应的层析工艺的再生液相同，能够重复使用6-8次。
以上步骤为简单的一种用于生物大分子的离心萃取工艺及固相萃取剂的方式，此方式为构成离心萃取工艺的主要单元，即单级萃取。
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| CN107427742A (zh) * | 2014-12-17 | 2017-12-01 | 水技术公司 | 用于固相萃取的装置及其使用方法 |
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2023
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Patent Citations (5)
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