CN111150065A - 沙棘水溶性提取物在抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用，所述沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的质量百分含量为20‑45％。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)通过抑制Tau蛋白磷酸化从而防治阿尔兹海默症，而非目前常用的胆碱抑制剂，无副作用；(2)通过各物质的协同作用防治阿尔兹海默症，针对阿尔兹海默症病因病机，各味药材各具其效，互相协调，遵循扶正祛邪，标本兼治的防治原则，诸药合用，共奏温肾健脾，补气固表、活血通络的功效，对阿尔兹海默症具有优异的防治效果，治愈率高。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，更具体的说是涉及一种沙棘水溶性提取物在抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s diseases，AD)，又称老年痴呆，是一种多发于中老年群体的神经退行性疾病，其发病机制与胆碱能损伤、自由基损伤、Aβ毒性和神经炎症等相关，是老年人中发病率和死亡率都很高的一种临床疾病。有数据显示，老年人中阿尔兹海默症的患病率约4.9％，患者一般存活年限平均仅为5.5年，已在全球引起死亡的原因中位居第六。随着人们生活压力的逐渐增大及生活方式的改变，过度用脑、作息不规律等不良生活习惯及神经系统疾病如失眠、抑郁等也可导致阿尔兹海默症。
目前，胆碱抑制剂是临床上通过抑制胆碱酯酶防治阿尔兹海默症最常用药物。胆碱抑制剂可明显抑制阿尔兹海默症患者脑内胆碱酯酶的释放，但无法防治阿尔兹海默症发病。在阿尔兹海默症发病早期使用胆碱抑制剂，可一定程度延缓痴呆进程、改善认知能力，但长期服用胆碱抑制剂会产生恶心呕吐、肌肉麻痹、抽搐、昏迷等症状，无法保证患者生活质量，对改善患者生存率无意义。目前临床并不主张常规使用胆碱抑制剂防治阿尔兹海默症还是病变早、晚期的防治。
因此，如何提供一种无副作用、疗效好、可长期使用的防治阿尔兹海默症的制剂是本领域技术人员亟须解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种沙棘水溶性提取物在抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用。
沙棘中含有维生素类化合物、三萜、黄酮类化合物、蛋白质、氨基酸、有机酸、其他微量元素等。中医典籍中记载：沙棘用于食少脾虚，积食腹痛，经闭瘀血，心痛胸痹，跌打瘀肿。沙棘具有保护心脑血管、增强机体免疫力、保护肝脏等作用，同时沙棘中含有良好的延缓衰老、抗炎、抗氧化、降血脂、抗放射等生物活性。
优选的，所述沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的质量百分含量为20-45％。
优选的，所述抑制Tau蛋白磷酸化制剂还包括如下质量百分含量的组分：木香水溶性提取物15-30％、白葡萄干水溶性提取物8-20％、甘草水溶性提取物5-20％和栀子水溶性提取物8-25％。
木香内含挥发油、生物碱、树脂、菊糖及甾醇等成分，其性温，味辛、苦，归脾、胃、大肠、胆、三焦经，具有行气止痛、健脾消食的功能，用于胸腹胀痛、呕吐、腹泻、痢疾、里急后重、食积不消等症。
白葡萄干性平、味甘、微酸。其含糖量高达70％。白葡萄干含热能高，同时富含矿物质、维生素等多种营养成分。
甘草中已分离出化合物200余种，黄酮类化合物和三萜类占总量的多数，少量部分包括生物碱、多糖和一些微量元素。
栀子中的特征化合物有40种，包括环烯醚萜类、二萜类、三萜类、黄酮类、三萜皂苷类及色素等，具有利胆保肝、抗炎、抗肿瘤以及改善血液循环、抗血栓，防治脑出血等作用。
进一步的，所述抑制Tau蛋白磷酸化制剂可用作防治阿尔兹海默症制剂。
Tau蛋白的过渡磷酸化表达，因其丧失维持微管稳定的作用，影响脑组织神经系统功能，促进β-淀粉样蛋白沉积，诱发阿尔兹海默症。因此，抑制Tau蛋白磷酸化即可防治阿尔兹海默症。
甘草和栀子均为抑制炎症因子，减少Aβ沉积，从而防治阿尔兹海默症。
优选的，所述沙棘水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取个大饱满的沙棘果实置于15-20℃下阴干，得预处理沙棘；
(2)制备沙棘超声提取液：对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为25-45min、超声功率350-650W、超声温度30-60℃，得沙棘超声提取液；
(3)制备沙棘酶解液：调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1-3:1，酶解温度30-40℃，搅拌速度为50-120r/min，酶解时间为25-60min，得到沙棘酶解液；
(4)制备沙棘水溶性提取物：继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.0-2.0，加入的热水水温为40-50℃，继续加热至55-65℃，边加热边搅拌，反应时间为30-45min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
采用超声-酶-热水联合提取法，提高了水溶性物质的提取率，通过温和的反应条件，避免了高温、高压操作对营养物质的破坏。
优选的，所述木香水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于15-25℃下阴干，得预处理木香；
(2)制备木香超声提取液：对预处理木香进行超声提取，超声时间为40-60min、超声功率380-720W、超声温度34-65℃，制得木香超声提取液；
(3)制备木香酶解液：调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为1.2-3.4:1，酶解温度35-45℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间为20-45min，得木香酶解液；
(4)制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.2-2.3，加入的热水水温为35-55℃，继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为38-46min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
采用超声-酶-热水联合提取法，提高了水溶性物质的提取率，通过温和的反应条件，避免了高温、高压操作对营养物质的破坏。
优选的，所述白葡萄干水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取粒大、味柔糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理白葡萄干；
(2)制备白葡萄干超声提取液：对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为50-80min、超声功率410-700W、超声温度30-60℃，得到白葡萄干超声提取液；
(3)制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.3-3.3:1，酶解温度40-48℃，搅拌速度为66-115r/min，酶解时间为25-40min，得到白葡萄干酶解液；
(4)制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.5-2.2，加入的热水水温为39-53℃，继续加热至60-75℃，边加热边搅拌，反应时间为40-46min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物。
采用超声-酶-热水联合提取法，提高了水溶性物质的提取率，通过温和的反应条件，避免了高温、高压操作对营养物质的破坏。
优选的，所述甘草水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于15-25℃下阴干，得到预处理甘草；
(2)制备甘草超声提取液：对预处理甘草进行超声提取，超声时间为50-65min、超声功率430-600W、超声温度37-59℃，得甘草超声提取液；
(3)制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.1-3.5:1，酶解温度35-41℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间35-50min，得到甘草酶解液；
(4)制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:1.5-2.8，加入的热水水温为35-55℃，继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为38-46min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
采用超声-酶-热水联合提取法，提高了水溶性物质的提取率，通过温和的反应条件，避免了高温、高压操作对营养物质的破坏。
优选的，所述栀子水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于15-25℃下阴干，得到预处理栀子；
(2)制备栀子超声提取液：将预处理栀子进行超声提取，超声时间25-45min、超声功率450-600W、超声温度42-71℃，得栀子超声提取液；
(3)制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.4-3.7:1，酶解温度30-42℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间为20-45min，得到栀子酶解液；
(4)制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:1.4-2.7，加入的热水水温为35-55℃：继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为40-50min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
采用超声-酶-热水联合提取法，提高了水溶性物质的提取率，通过温和的反应条件，避免了高温、高压操作对营养物质的破坏。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
(1)通过抑制Tau蛋白磷酸化从而防治阿尔兹海默症，而非目前常用的胆碱抑制剂，无副作用；
(2)通过各物质的协同作用防治阿尔兹海默症，针对阿尔兹海默症病因病机，各味药材各具其效，互相协调，遵循扶正祛邪，标本兼治的防治原则，诸药合用，共奏温肾健脾，补气固表、活血通络的功效，对阿尔兹海默症具有优异的防治效果，治愈率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例8中westernblot检测tau蛋白磷酸化改变图
图2附图为本发明实施例8中westernblot检测tau蛋白磷酸化统计图，其中，图中纵坐标为tau指标与内参β-actin比值；*代表与空白组比P<0.05，**代表与空白组比P<0.01，***代表与空白组比P<0.001；#代表与模型组比，P<0.05。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)各水溶性提取物的制备：
沙棘水溶性提取物：
①选取个大饱满的沙棘果实置于15℃下阴干，得预处理沙棘；
②对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为43min、超声功率600W、超声温度55℃，得沙棘超声提取液；
③调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1:1，酶解温度32℃，搅拌速度为120r/min，酶解时间为30min，得到沙棘酶解液；
④继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1，加入的热水水温为41℃，继续加热至59℃，边加热边搅拌，反应时间为30min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
木香水溶性提取物：
①选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于15℃下阴干，得预处理木香；
②对预处理木香进行超声提取，超声时间为57min、超声功率700W、超声温度60℃，制得木香超声提取液；
③调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为1.21，酶解温度45℃，搅拌速度为100r/min，酶解时间为40min，得木香酶解液；
④制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.2，加入的热水水温为50℃，继续加热至65℃，边加热边搅拌，反应时间为41min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
白葡萄干水溶性提取物：
①选取粒大、味柔糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理白葡萄干；
②对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为70min、超声功率670W、超声温度58℃，得到白葡萄干超声提取液；
③制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.4:1，酶解温度48℃，搅拌速度为110r/min，酶解时间为35min，得到白葡萄干酶解液；
④制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.5，加入的热水水温为50℃，继续加热至71℃，边加热边搅拌，反应时间为42min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物
甘草水溶性提取物：
①选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于15℃下阴干，得预处理甘草；
②对预处理甘草进行超声提取，超声时间为60min、超声功率580W、超声温度55℃，得甘草超声提取液；
③制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.3:1，酶解温度40℃，搅拌速度为105r/min，酶解时间46min，得到甘草酶解液；
④制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:2.1，加入的热水水温为50℃，继续加热至72℃，边加热边搅拌，反应时间为42min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
栀子水溶性提取物：
①选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于15℃下阴干，得到预处理栀子；
②将预处理栀子进行超声提取，超声时间40min、超声功率580W、超声温度70℃，得栀子超声提取液；
③制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.7:1，酶解温度40℃，搅拌速度为102r/min，酶解时间为42min，得到栀子酶解液；
④制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:1.8，加入的热水水温为51℃：继续加热至73℃，边加热边搅拌，反应时间为45min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
(2)称取沙棘水溶性提取物60g、木香水溶性提取物50g、白葡萄干水溶性提取物40g、甘草水溶性提取物30g和栀子水溶性提取物20g，混合均匀后经制粒机制粒即制得抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂。
实施例2
(1)各水溶性提取物的制备：
沙棘水溶性提取物：
①选取个大饱满的沙棘果实置于20℃下阴干，得预处理沙棘；
②对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为30min、超声功率400W、超声温度35℃，得沙棘超声提取液；
③调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.2:1，酶解温度32℃，搅拌速度为65r/min，酶解时间为30min，得到沙棘酶解液；
④继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.3，加入的热水水温为42℃，继续加热至58℃，边加热边搅拌，反应时间为33min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
木香水溶性提取物：
①选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于25℃下阴干；
②对预处理木香进行超声提取，超声时间为45min、超声功率400W、超声温度38℃，制得木香超声提取液；
③调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为1.4:1，酶解温度35℃，搅拌速度为65r/min，酶解时间为25min，得木香酶解液；
④制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.9，加入的热水水温为40℃，继续加热至55℃，边加热边搅拌，反应时间为40min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
白葡萄干水溶性提取物：
①选取粒大、味糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理葡萄干；
②对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为55min、超声功率450W、超声温度35℃，得到白葡萄干超声提取液；
③制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2.0:1，酶解温度42℃，搅拌速度为70r/min，酶解时间为28min，得到白葡萄干酶解液；
④制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.7，加入的热水水温为40℃，继续加热至63℃，边加热边搅拌，反应时间为43min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物甘草水溶性提取物：
①选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于25℃下阴干，得预处理甘草；
②对预处理甘草进行超声提取，超声时间为53min、超声功率450W、超声温度39℃，得甘草超声提取液；
③制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.5:1，酶解温度38℃，搅拌速度为63r/min，酶解时间35min，得到甘草酶解液；
④制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:2.0，加入的热水水温为38℃，继续加热至59℃，边加热边搅拌，反应时间为40min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
栀子水溶性提取物：
①选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于25℃下阴干，得到预处理栀子；
②将预处理栀子进行超声提取，超声时间30min、超声功率480W、超声温度45℃，得栀子超声提取液；
③制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.9:1，酶解温度33℃，搅拌速度为62r/min，酶解时间为23min，得到栀子酶解液；
④制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:2.1，加入的热水水温为38℃：继续加热至58℃，边加热边搅拌，反应时间为43min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
(2)称取沙棘水溶性提取物65g、木香水溶性提取物54.17g、白葡萄干水溶性提取物43.33g、甘草水溶性提取物32.5g和栀子水溶性提取物21.67g，混合均匀后经制粒机制粒即制得抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂。
实施例3
(1)各水溶性提取物的制备：
沙棘水溶性提取物：
①选取个大饱满的沙棘果实置于20℃下阴干，得预处理沙棘；
②对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为35min、超声功率420W、超声温度38℃，得沙棘超声提取液；
③调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2:1，酶解温度35℃，搅拌速度为70r/min，酶解时间为33min，得到沙棘酶解液；
④继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.7，加入的热水水温为45℃，继续加热至60℃，边加热边搅拌，反应时间为35min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
木香水溶性提取物：
①选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于25℃下阴干；
②对预处理木香进行超声提取，超声时间为50min、超声功率450W、超声温度40℃，制得木香超声提取液；
③调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为3:1，酶解温度38℃，搅拌速度为70r/min，酶解时间为28min，得木香酶解液；
④制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:2.3，加入的热水水温为42℃，继续加热至58℃，边加热边搅拌，反应时间为43min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
白葡萄干水溶性提取物：
①选取粒大、味糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理葡萄干；
②对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为58min、超声功率490W、超声温度37℃，得到白葡萄干超声提取液；
③制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3.3:1，酶解温度45℃，搅拌速度为75r/min，酶解时间为30min，得到白葡萄干酶解液；
④制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:2.2，加入的热水水温为42℃，继续加热至65℃，边加热边搅拌，反应时间为45min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物
甘草水溶性提取物：
①选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于25℃下阴干，得预处理甘草；
②对预处理甘草进行超声提取，超声时间为55min、超声功率480W、超声温度40℃，得甘草超声提取液；
③制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3.5:1，酶解温度40℃，搅拌速度为63r/min，酶解时间38min，得到甘草酶解液；
④制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:2.8，加入的热水水温为40℃，继续加热至60℃，边加热边搅拌，反应时间为40min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
栀子水溶性提取物：
①选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于25℃下阴干，得到预处理栀子；
②将预处理栀子进行超声提取，超声时间35min、超声功率500W、超声温度48℃，得栀子超声提取液；
③制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3.7:1，酶解温度35℃，搅拌速度为65r/min，酶解时间为25min，得到栀子酶解液；
④制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:2.5，加入的热水水温为40℃：继续加热至60℃，边加热边搅拌，反应时间为45min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
(2)称取沙棘水溶性提取物70g、木香水溶性提取物58.33g、白葡萄干水溶性提取物46.67g、甘草水溶性提取物15g和栀子水溶性提取物35g，混合均匀后经制粒机制粒即制得抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂。
实施例4
(1)各水溶性提取物的制备：
沙棘水溶性提取物：
①选取个大饱满的沙棘果实置于20℃下阴干，得预处理沙棘；
②对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为45min、超声功率650W、超声温度60℃，得沙棘超声提取液；
③调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3:1，酶解温度35℃，搅拌速度为70r/min，酶解时间为33min，得到沙棘酶解液；
④继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.8，加入的热水水温为45℃，继续加热至60℃，边加热边搅拌，反应时间为35min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
木香水溶性提取物：
①选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于25℃下阴干；
②对预处理木香进行超声提取，超声时间为60min、超声功率720W、超声温度65℃，制得木香超声提取液；
③调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为3.1:1，酶解温度45℃，搅拌速度为110r/min，酶解时间为45min，得木香酶解液；
④制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.8，加入的热水水温为55℃，继续加热至75℃，边加热边搅拌，反应时间为46min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
白葡萄干水溶性提取物：
①选取粒大、味糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理葡萄干；
②对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为80min、超声功率700W、超声温度60℃，得到白葡萄干超声提取液；
③制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3:1，酶解温度48℃，搅拌速度为115r/min，酶解时间为40min，得到白葡萄干酶解液；
④制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.5，加入的热水水温为53℃，继续加热至75℃，边加热边搅拌，反应时间为46min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物
甘草水溶性提取物：
①选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于25℃下阴干，得预处理甘草；
②对预处理甘草进行超声提取，超声时间为65min、超声功率600W、超声温度59℃，得甘草超声提取液；
③制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.3:1，酶解温度41℃，搅拌速度为110r/min，酶解时间50min，得到甘草酶解液；
④制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:2.1，加入的热水水温为55℃，继续加热至75℃，边加热边搅拌，反应时间为46min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
栀子水溶性提取物：
①选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于25℃下阴干，得到预处理栀子；
②将预处理栀子进行超声提取，超声时间45min、超声功率600W、超声温度71℃，得栀子超声提取液；
③制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为3.5:1，酶解温度42℃，搅拌速度为110r/min，酶解时间为45min，得到栀子酶解液；
④制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:2.2，加入的热水水温为55℃：继续加热至75℃，边加热边搅拌，反应时间为50min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
(2)称取沙棘水溶性提取物52g、木香水溶性提取物43.33g、白葡萄干水溶性提取物34.67g、甘草水溶性提取物26g和栀子水溶性提取物17.33g，混合均匀后经制粒机制粒即制得抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂。
实施例5
(1)各水溶性提取物的制备：
沙棘水溶性提取物：
①选取个大饱满的沙棘果实置于20℃下阴干，得预处理沙棘；
②对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为25min、超声功率350W、超声温度30℃，得沙棘超声提取液；
③调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2.2:1，酶解温度30℃，搅拌速度为50r/min，酶解时间为25min，得到沙棘酶解液；
④继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.5，加入的热水水温为40℃，继续加热至55℃，边加热边搅拌，反应时间为30min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
木香水溶性提取物：
①选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于25℃下阴干；
②对预处理木香进行超声提取，超声时间为40min、超声功率380W、超声温度34℃，制得木香超声提取液；
③调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为1.7:1，酶解温度35℃，搅拌速度为60r/min，酶解时间为20min，得木香酶解液；
④制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.9，加入的热水水温为35℃，继续加热至55℃，边加热边搅拌，反应时间为38min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
白葡萄干水溶性提取物：
①选取粒大、味糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理葡萄干；
②对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为50min、超声功率410W、超声温度30℃，得到白葡萄干超声提取液；
③制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2.7:1，酶解温度40℃，搅拌速度为66r/min，酶解时间为25min，得到白葡萄干酶解液；
④制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.6，加入的热水水温为39℃，继续加热至60℃，边加热边搅拌，反应时间为40，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物
甘草水溶性提取物：
①选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于25℃下阴干，得预处理甘草；
②对预处理甘草进行超声提取，超声时间为50min、超声功率430W、超声温度37℃，得甘草超声提取液；
③制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2.3:1，酶解温度35℃，搅拌速度为60r/min，酶解时间35min，得到甘草酶解液；
④制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:1.9，加入的热水水温为35℃，继续加热至55℃，边加热边搅拌，反应时间为38min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
栀子水溶性提取物：
①选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于25℃下阴干，得到预处理栀子；
②将预处理栀子进行超声提取，超声时间25min、超声功率450W、超声温度42℃，得栀子超声提取液；
③制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为2.7:1，酶解温度30℃，搅拌速度为60r/min，酶解时间为20min，得到栀子酶解液；
④制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:1.6，加入的热水水温为35℃：继续加热至55℃，边加热边搅拌，反应时间为40min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
(2)称取沙棘水溶性提取物45g、木香水溶性提取物37.5g、白葡萄干水溶性提取物30g、甘草水溶性提取物22.5g和栀子水溶性提取物15g，混合均匀后经制粒机制粒即制得抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂。
实施例6
对实施例1-5制备得到的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂进行理化指标、微生物指标测定。
测试方法如下：
(1)沙棘果汁含量的测定：采用紫外可见光光度法测定沙棘果汁中钾、总磷、脯氨酸含量含量(采用联邦德国的RSK值测定果汁含量，即测定果汁中钾、总磷、脯氨酸含量)。
(2)水分含量的测定：采用常压加热干燥法测定水分含量。
(3)脂肪含量的测定：采用酸水解法测定脂肪含量。
(4)蛋白质含量的测定：采用双缩脲定氮法测定蛋白质含量。
(5)菌落总数的测定：采用菌落计数方法测定菌落总数。
(6)大肠杆菌的测定：采用大肠杆菌平板计数法测定大肠杆菌数量。
测试结果见表1所示。
表1理化指标和微生物指标
通过表1结果可知，本发明提供的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂的理化指标、微生物指标符合要求。
实施例7与市售产品营养成分对比
将实施例1制备的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂与市售产品(国寿堂速溶沙棘果茶、集信堂生榨沙棘、权健双仁沙棘口服液、贡天下野山坡沙棘饮料)进行营养成分的对比。
测定方法如下：
(1)能量的测定：氧弹量热法测定能量值。
(2)蛋白质的测定：同实施例6。
(3)脂肪的测定：同实施例6。
(4)碳水化合物的测定：采用高锰酸钾滴定法测定碳水化合物含量。
(5)膳食纤维的测定：采用酶-重量法测定膳食纤维的含量。
(6)叶黄素的测定：采用紫外可见光光度法测定叶黄素的含量。
测定结果如表2所示。
表2营养成分对比表
通过表2结果可知，与市售沙棘产品相比较，本发明制备的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂的膳食纤维以及叶黄素含量较高，脂肪含量较低，能量适中，叶黄素可抑制体内红细胞衰老，从而抑制阿尔兹海默症。
实施例8小鼠实验
选取健康雄性小鼠60只，随机分为6组每组10只分别为：空白组、模型组、阳性组、将实施例1中制备的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂高、中、低剂量组。适应性喂养7d，适应性喂养后，进食前除开空白组小鼠外各腹腔注射D-半乳糖120g-1·d-1(生理盐水配置)和灌胃AlCl320 mg·g-1·d-1(双蒸馏水配置)造模，空白组注射等量生理盐水和灌胃等量双蒸馏水，连续60d，造模同时给药，阳性组灌胃给予奥拉西坦260mg·kg-1·d-1，模型组和空白组给予等量双蒸水，按抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂剂量给药，高剂量组1.132g·kg-1·d-1,中计量组0.503g·kg-1·d-1,低剂量组0.312g·kg-1·d-1，每天一次。给药60d后，脱颈处死，取小鼠大脑，加入9倍预冷的生理盐水匀浆，4℃下12000r/min离心20min，取上清液，严格按ELISA试剂盒说明测定各组小鼠大脑中乙酰胆碱酶(Ach)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转氨酶(ChAT)含量,所有试剂盒采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测，同时使用美国sigma公司小鼠tau蛋白检测试剂盒测定tau蛋白含量，测定结果见表3、图1、图2。
表3对小鼠血清Ach、AchE、ChAT水平的影响
注：与模型组比较，*表示具有显著性差异(P<0.05),**表示具有极显著差异(P<0.01)；与阳性组比较，#表示具有显著性差异(P<0.05),##表示具有极显著差异(P<0.01)
由表3可知，与空白组比较，模型组小鼠脑中AchE和ChAT含量极显著降低，Ach含量极显著升高(P<0.01)；高剂量组Ach含量相较于空白组极显著升高，AchE含量极显著降低(P<0.01)，ChAT含量显著降低(P<0.05)；中剂量组小鼠脑内AchE含量与空白组相比显著降低，ChAT含量显著性降低(P<0.05)；与空白组比较，低剂量组AchE和ChAT含量有所升高、Ach含量有所降低，无显著性差异，对胆碱能系统具有很好的调节作用，高剂量组活性较好。
由图1、图2可知，高剂量组tau变化最高，抑制效果最强，低剂量组低于阳性组，中计量组与阳性组持平，但实施例1产品均较空白组都对tau蛋白有抑制效果。
由此可得知，本发明提供的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂对AD小鼠具有很好的防治效果，具有很好的应用前景。
实施例9食用信息反馈
100名食用者中性别如下：男性50人，女性50人。
100名食用者中年龄分布如下：50-65岁20人，60-70岁55人，70岁以上25人。
食用者健康情况：身体状况正常者80人，具有阿尔兹海默症者20人。
效果判定依据为：
通过日常生活能力评定量表(ADL)、简易智力状态检查量表(MMSE)、阿尔茨海默病行为病理评定量表(BEHAVE-AD)分别评价患者日常生活能力、智力状态、痴呆病理行为等情况。
ADL量表内容主要包括洗澡、如厕、进食、大小便控制、平地行走、修饰、穿衣等项目，共100分，分数越高，说明日常生活能力越强，MMSE量表共30分，分数越高，说明患者智力状态越佳。BEHAVE-AD共30分，分数越高，说明患者病理行为越严重。
显效：未患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用实施例1颗粒剂制备溶液两次，每次10mL，连续30d，ADL分数有上升，MMSE分数有上升，VEHAVE-AD分数有下降。
患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用两次，连续30d，ADL分数上升15分以上，MMSE分数上升5分以上，VEHAVE-AD分数下降5分以上。
有效：未患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用两次，连续30d，ADL分数上升5分以内，MMSE分数上升3分以内，VEHAVE-AD分数下降3分以内。
患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用两次，连续30d，ADL分数有上升，MMSE分数有上升，VEHAVE-AD分数有下降。
无效：未患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用两次，连续30d，ADL分数不上升，MMSE分数不上升，VEHAVE-AD分数不下降。
患有AD者，服用抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，每天饮用两次，连续30d，ADL分数不上升，MMSE分数不上升，VEHAVE-AD分数不下降。
反馈结果：
1)显效者85人，有效者为15人，无效者为0人。
2)饮用效果与性别无关。
3)患有AD者与健康者的食用效果无较大差异。
由此可见，本发明提供的抑制Tau蛋白磷酸化制剂或防治阿尔兹海默症的制剂，对于未患有AD的正常人群，能够起到防治老年痴呆、健脑的作用，对于患有的人群，能够缓解老年痴呆现象，整体来讲发挥了防治阿尔兹海默症的有效效果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述沙棘水溶性提取物在制备抑制Tau蛋白磷酸化制剂中的质量百分含量为20-45％。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制Tau蛋白磷酸化制剂还包括如下质量百分含量的组分：木香水溶性提取物15-30％、白葡萄干水溶性提取物8-20％、甘草水溶性提取物5-20％和栀子水溶性提取物8-25％。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述沙棘水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取个大饱满的沙棘果实置于15-20℃下阴干，得预处理沙棘；
(2)制备沙棘超声提取液：对预处理沙棘进行超声提取，超声时间为25-45min、超声功率350-650W、超声温度30-60℃，得沙棘超声提取液；
(3)制备沙棘酶解液：调节沙棘超声提取液的pH为3.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1-3:1，酶解温度30-40℃，搅拌速度为50-120r/min，酶解时间为25-60min，得到沙棘酶解液；
(4)制备沙棘水溶性提取物：继续向沙棘酶解液中加入热水，沙棘酶解液和热水的体积比为1:1.0-2.0，加入的热水水温为40-50℃，继续加热至55-65℃，边加热边搅拌，反应时间为30-45min，冷却干燥得沙棘水溶性提取物。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木香水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取条匀、质地坚实、香气浓郁的木香于15-25℃下阴干，得预处理木香；
(2)制备木香超声提取液：对预处理木香进行超声提取，超声时间为40-60min、超声功率380-720W、超声温度34-65℃，制得木香超声提取液；
(3)制备木香酶解液：调节木香超声提取液的pH为3.5，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶的质量配比为1.2-3.4:1，酶解温度35-45℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间为20-45min，得木香酶解液；
(4)制备木香水溶性提取物：向木香酶解液中加入热水继续反应，木香酶解液和热水的体积比为1:1.2-2.3，加入的热水水温为35-55℃，继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为38-46min，冷却干燥得木香水溶性提取物。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白葡萄干水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取粒大、味柔糯的白葡萄干洗净，烘干得预处理白葡萄干；
(2)制备白葡萄干超声提取液：对预处理白葡萄干进行超声提取，超声时间为50-80min、超声功率410-700W、超声温度30-60℃，得到白葡萄干超声提取液；
(3)制备白葡萄干酶解液：调节白葡萄干超声提取液的pH为4.0，之后加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.3-3.3:1，酶解温度40-48℃，搅拌速度为66-115r/min，酶解时间为25-40min，得到白葡萄干酶解液；
(4)制备白葡萄干水溶性提取物：向白葡萄干酶解液中加入热水继续反应，白葡萄干酶解液和热水的体积比为1:1.5-2.2，加入的热水水温为39-53℃，继续加热至60-75℃，边加热边搅拌，反应时间为40-46min，冷却干燥得到白葡萄干水溶性提取物。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述甘草水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取灰棕、质地坚实而重、气香的甘草于15-25℃下阴干，得到预处理甘草；
(2)制备甘草超声提取液：对预处理甘草进行超声提取，超声时间为50-65min、超声功率430-600W、超声温度37-59℃，得甘草超声提取液；
(3)制备甘草酶解液：调节甘草超声提取液的pH为4.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.1-3.5:1，酶解温度35-41℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间35-50min，得到甘草酶解液；
(4)制备甘草水溶性提取物：向甘草酶解液中加入热水继续反应，甘草酶解液和热水的体积比为1:1.5-2.8，加入的热水水温为35-55℃，继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为38-46min；冷却干燥得到甘草水溶性提取物。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述栀子水溶性提取物的制备方法如下：
(1)预处理：选取皮薄而脆、内黄外淡的栀子于15-25℃下阴干，得到预处理栀子；
(2)制备栀子超声提取液：将预处理栀子进行超声提取，超声时间25-45min、超声功率450-600W、超声温度42-71℃，得栀子超声提取液；
(3)制备栀子酶解液：调节栀子超声提取液的pH为3.2，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解反应，果胶酶和纤维素酶质量配比为1.4-3.7:1，酶解温度30-42℃，搅拌速度为60-110r/min，酶解时间为20-45min，得到栀子酶解液；
(4)制备栀子水溶性提取液：向栀子酶解液中加入热水继续反应，栀子酶解液和热水的体积比为1:1.4-2.7，加入的热水水温为35-55℃：继续加热至55-75℃，边加热边搅拌，反应时间为40-50min；冷却干燥得到栀子水溶性提取物。
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|---|---|---|---|---|
| CN113481269A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-10-08 | 青海康普生物科技股份有限公司 | 一种沙棘蛋白多肽的制备方法 |
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- 2020-01-14 CN CN202010036799.5A patent/CN111150065A/zh not_active Withdrawn
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