CN102091318B - 蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及制备抗菌药品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及制备抗菌药品的方法,它以蟾蜍蛆虫为原料,采用溶剂萃取法离子交换树脂吸附法,超滤及微滤,凝胶色谱分离,超声驻波液相制备色谱等工艺,再冷冻干燥制备成蟾肽抗生素,并用此活性成分与适宜的赋形剂相结合,制成片剂、胶囊剂、栓剂、软膏剂及肠溶剂等剂型用于治疗多种疾病。本发明制备的药品抗菌范围广泛,药品成份明确、质量可控、性能稳定,具有工业生产价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的制备,特别是蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及制备抗菌药品的方法。
背景技术
蟾蜍是一种两栖类动物,皮肤长期裸露,为抵御外部微生物及各种病原菌的侵袭,它们的身体逐渐形成防御机制,其皮肤分泌产生了大量能有效杀灭微生物、抵御有害环境因子侵袭的物质,分泌物的主要成份是多肽,Zasloff从非洲爪蟾皮肤上发现了爪蟾抗菌肽Magainin,Gibson等人从蟾皮肤分离得到Bombinir like家族抗菌肽,从澳州当地的蛙类皮肤分泌物中陆续提取到Citropin家族,Caerin家族,Maculatin家族及Uperin家族的各种抗菌肽,赖仞等人从大蹼铃蟾的皮肤分泌物中提取了一种抗菌肽MSP VII,徐兴军等人从中华蟾蜍皮肤提取了抗菌肽,CN200410013742.4公开了采用中药培育蟾蜍蛆虫的方法,可以大批量工业化生产蟾蜍蛆虫。
原则上,前述提取的各种抗菌肽都有一定的抗菌活性,但是在药品生产中需要活性较高、来源丰富、性能稳定、成份明确、质量可控的原料。
发明内容
本发明的目的是提供蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及制备抗菌药品的方法,提取纯度蟾肽抗生素含量达到98.2%-98.9%,用此纯度蟾肽抗生素制备各种剂型的药品,产品成份明确、质量可控、性能稳定,对多种疾病疗效好并且原料来源广泛。
本发明的目的是通过如下方案实现的:以蟾蜍蛆虫为原料,采用水溶剂萃取法或稀碱溶液萃取法或稀醇溶液萃取法,结合离子交换树脂吸附法,超滤及微滤、凝胶色谱,超声驻波液相制备色谱等工艺中的一种或者多种工艺,再冷冻干燥制备成蟾肽抗生素,将蟾肽抗生素作为药用活性成分与适宜的赋形剂相结合、制成片剂、胶囊剂、栓剂、软膏剂、酊剂、糊剂、糊膜剂及肠溶剂等剂型用于治疗多种疾病。分离纯化的蟾肽抗生素用高效液相色谱(RP-HPLC)测定组分含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述:
实施例:
1、①将1000g干燥蟾蜍蛆虫加进到10L-100L纯净水及0.02%磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加热温度50℃-90℃,时间10min-60min;提取蟾肽抗生素;
②冷却至4℃-15℃,用分离机在800r/min-16000r/min连续分离除去固形物,收集上清液。
③将收集的上清液泵入HD-8强酸离子交换树脂柱中,静止30min-300min,饱和树脂先用0.5mol/LHCl-NH4Cl溶液洗涤,再用纯净水洗脱0.5h-2h,用0.01mol/L-0.5mol/LNH4OH洗脱。
④洗脱液泵入错流微滤器中,微滤膜孔径为0.1μm-0.8μm操作压力0.01Mpa-0.5Mpa连续微滤处理成微滤处理液。
⑤微滤处理液溶于由正丁醇-20mol/L-100mol/L三氟乙酸水溶液(1:1)组成的溶剂体系中,注入到超声驻波液相制备色谱中,声强0.1Kw-50kw、流速50ml/L-500ml/L、紫外检测器220nm检测,连续分离出蟾肽抗生素,收率达2.0%-2.8%。
⑥分离出的蟾肽抗生素用RP-HPLC测定,色谱柱:YMC-pack polymerc.8150mm×4.6mmLD.流动相:A.乙腈(20%)+水(80%)+三氟乙酸(0.05%),B.乙腈(45%)+水(55%)+三氟乙酸(0.05%,梯度条件:0-30min,0-100%B,流速:1.0ml/min-5.0ml/min,检测器:UV,220nm,柱温30℃-50℃,进样量:10μl-30μl,测定结果显示纯度为98.2%-98.9%。
2、①将1000g蟾蜍蛆虫用10L-100L的纯净水并加入0.02-0.10mo1/L磷酸—磷酸氢二钾缓冲液加热至35℃-90℃、保持30min-300min并且进行搅拌,提取出蟾肽抗生素的粗品;②加入提取液体积5倍-10倍的乙醇或甲醇,常温下静止沉淀1h-24h,然后用分离机在800r/min-16000r/min条件下将多糖类及蛋白质分离;③分离液泵入HD-8酸性阳离子交换树脂柱内,常温下放置1h-24h,然后用1mol/L-10mol/L氨水溶液洗脱收集蟾肽抗生素部分;④将收集的蟾肽抗生素部分溶解于由氯仿-乙醇-水(5:3:4)组成的溶剂体系中用超声驻波液相制备色谱以声强0.2kw-5.0kw,流速0.1ml/min-1000ml/min、紫外检测器波长220nm检测条件下分离纯化蟾肽抗生素;⑤将纯化的蟾肽抗生素用真空冷冻干燥机在-10℃— -50℃、真空度0.01Mpa-0.1Mpa条件下干燥1.0h-10h,含量达98.2%;⑥纯化的蟾肽抗生素粉碎过100目-200目筛收集粉末。
3、①将1000g蟾蜍蛆虫用5L-10L的纯净水并加入10%-20%乙醇,在超声波提取罐中以1kw-10kw声强超声波常温条件下提取10min-120min,提取出蟾肽抗生素粗品溶液;②提取液中加入5倍-10倍的乙醇,常温下,静止沉淀1h-24h,用分离机800r/min-16000r/min连续分离上述溶液成分离液;③用真空蒸发器在真空度0.01Mpa-0.5Mpa、温度10℃-50℃条件下浓缩分离液至原体积的10%-1.0%成浓缩液;④将浓缩液泵入HZ001酸性阳离子交换树脂柱中,用0.1mol/L-1.0mol/L NaOH溶液洗脱,收集蟾肽抗生素部分;⑤收集的蟾肽抗生素部分溶解到由氯仿-乙醇-水(5:4:3)组成的溶剂体系中,用超声驻波液相制备色谱以声强0.1kw-5.0kw、流速0.1ml/min-1000ml/min、紫外检测器波长220nm检测条件下连续分离纯化;⑥分离纯化的蟾肽抗生素在温度-10℃— -50℃、真空度0.01Mpa-0.1Mpa、真空冷冻干燥1h-10h成粉末状蟾肽抗生素,纯化后的蟾肽抗生素含量达98.9%。
4、①取1000g蟾蜍蛆虫与10L-100L0.01%-10%的乙醇稀溶液混合,加热50℃-180℃,时间10min-60min,然后冷却至10℃-20℃、加入0.1mol/L-5.0mol/L(NH4)2SO4溶液,放置30min-300min、用离心机以800r/min-16000r/min连续离心分离出分离液;②分离液注入到错流微滤器中,以孔径0.1μm-0.8μm、压力0.01Mpa-0.5Mpa、流速100ml/min-10L/min连续微滤处理成微滤处理液;③微滤处理液注入到平板错流超滤器中,以孔径2nm-10nm、压力0.5Mpa-1.0Mpa、流速5.0L/min-50L/min连续超滤处理成超滤处理液;④超滤处理液真空冷冻干燥处理,冷冻干燥温度-10℃— -50℃、真空度0.01Mpa-0.5Mpa、时间0.5h-5h冷冻干燥成粉状;⑤上述粉状物用溶于PH4.0、0.1mol/L-0.05mol/LHAC-NaAC缓冲液中、配制0.1g-100g/L溶液,注入到有Sephaeryls-100HR的色谱柱中,在PH3-pH14.压力0.1Mpa-0.5Mpa、流速10cm/h-条件下。用PH4.0,0.01mol/L HAC-NaAC缓冲液、以0.01L/min-0.5L/min流速洗脱、220nm检测并收集组分;⑥组分真空冷冻干燥温度-10℃- -50℃、真空度0.01Mpa-0.1Mpa、时间0.5h-3h,制备成蟾肽抗生素冻干粉,收率2.0%-2.8%。
5、蟾肽抗生素的体外抑菌与杀菌实验采用《全国临床检验操作规程》的方法,用1mg蟾肽抗生素冻干粉溶解于纯净水中稀释成10μg/ml的溶液备用,取对数生长期的五种菌类的常规培养液分别加到含有不同浓度蟾肽抗生素的肉汤培养基试管中,每毫升活菌数为1×505CFU,在培养箱中保持温度37℃,培养24h,观察各试管溶液的浊度。溶液澄清无菌生长的蟾肽抗生素浓度为最低抑菌浓度(MIC),分别吸取上述试管无菌生长的培养基50μl,接种于无菌琼脂培养基平板,37℃培养24h仍无菌类生长,其中的最低浓度则是蟾肽抗生素的最低杀菌浓度(MBC)。
蟾肽抗生素对不同菌类的MIC和MBC(μg/ml)
菌株 | MIC | MBC |
大肠埃希菌 | 3.23±0.15 | 5.26±0.22 |
金黄色葡萄球菌 | 4.17±0.13 | 6.31±0.42 |
绿脓杆菌 | 2.25±0.23 | 3.58±0.25 |
枯草芽孢杆菌 | 2.86±0.16 | 4.65±0.33 |
红色毛癣菌 | 2.75±0.20 | 4.22±0.17 |
6、蟾肽抗生素50g与微晶纤维素450g及硬脂酸镁50g混合,混合物用压片机打成直径5mm,重量150mg的片剂,该片剂中每片含蟾肽抗生素7.5mg,结合症状,每次1片至2片,每日服用2次至3次。
7、蟾肽抗生素40g与玉米淀粉1000g、乳糖100g混合均匀,以每600mg填充胶囊,本胶囊剂中,每个胶囊中含蟾肽抗生素7.5mg,结合症状,每次1个至2个,每日服用2-3次。
8、蟾肽抗生素50g与玉米淀粉450g及乳糖50g混合用重量300mg装入CAP肠溶胶囊,每个胶囊含蟾肽抗生素15mg,结合病状,每次1个-4个,每日服用2-3次。
9、将450g可可脂放入温度为4℃-12℃的容器中降温至10℃-12℃,粉碎过100目筛,加入500g羊毛脂及10g蟾肽抗生素混合均匀,加热至29℃-40℃熔化后,倒入栓剂鱼雷型模型中冷却成型,每颗栓剂重约15g,长约3cm-4cm制成栓剂,每个栓剂含蟾肽抗生素15mg,结合症状每天1个。
10、将1000g液体石蜡和1000g凡士林在干热100℃-200℃条件下杀菌1h-3h,冷却到室温后两者混合均匀并研磨30min-180min,再加入1.0g-50g蟾肽抗生素粉末混合均匀,即成蟾肽抗生素软膏剂。
11、取20g羊毛脂和30-35g凡士林加热熔化后,加入预先混合均匀的10g-15g淀粉及10g-15g氧化锌,搅拌均匀成为糊状后,冷却至室温时加入1g-5g蟾肽抗生素粉末混匀,即成蟾肽抗生素糊剂。
12、取蟾肽抗生素2g-10g溶于1000ml 0.1%-95%乙醇溶液中,并加入50ml-100ml甘油用高压均质机在0.3Mpa-60Mpa常温条件下均质处理,即制备成蟾肽抗生素酊剂。
13、取蟾肽抗生素10g溶于1000ml 30%-95%乙醇溶液中并加入1.0ml-100ml吐温-80和10ml-50ml蓖麻油及1.0ml-100ml丙二醇,搅拌均匀后再加入10g-200g羟丙基甲基纤维素溶解并混合均匀,即制备成蟾肽抗生素糊膜剂。
14、临床治疗与结果:
(1)纳入病例的患者符合《糖尿病足(肢端坏疽检查方法及诊断标准(草案))》的患者,治疗时间10d-90d。
(2)经诊断的糖尿病足患者病情按中医临床六级分级:
0 级:皮肤无开放性病灶。表现为肢端供血不足,颜色紫绀或苍白,肢端发凉、麻木、感觉迟钝或丧失,肢端刺痛或灼痛,常伴有足趾或足的畸形等;
一级:肢端皮肤有开放性病灶。水疱、血疱、鸡眼或胼胝,冻伤或烫伤及其他皮肤损伤所引起的浅表溃疡,但病灶尚未波及深部组织;
二级:感染病灶已侵犯深部肌肉组织。常有轻度蜂窝组织炎,多发性脓灶及窦道形成,或感染沿肌间隙扩大,造成足底、足背贯通性溃疡或坏疽,脓性分泌物较多,足或指趾皮肤干性坏疽,但肌腱韧带尚无破坏;
三级:肌腱韧带组织破坏。蜂窝组织炎融合形成大脓腔,脓性分泌物及坏死组织增多,足或少数足趾干性坏疽,但骨质破坏尚不明显;
四级:严重感染已造成骨质破坏。骨髓炎,骨关节破坏或已形成假关节,部分足趾或部分手足发生湿性或干性严重坏疽或坏死;
五级:足的大部或全部感染或缺血,导致严重的湿性或干性坏疽,肢端变黑,常波及踝关节及小腿。
(3)治疗方法:全部病例均采用严格控制血糖,同时疏通微循环,将坏死组织清除后用0.01%过氧化氢稀溶液杀菌,晾干后,常规用蟾肽抗生素酊剂涂复治疗,再用蟾肽抗生素糊剂或蟾肽抗生素软膏剂或蟾肽抗生素糊膜剂,治疗周期10天至90天。
(4)疗效标准参照《中医病证诊断疗效标准》拟定,痊愈:创面基本愈合,显效:创面面积缩小范围>50%,有效:创面面积缩小范围>30%;无效:创面面积颜色略有改善或无明显变化。治疗结果见表
15、治疗与结果:
(1)根据2000年中华医学会外科学组《痔诊治暂行标准》,内痔临床上常四期分类:
①期,无痛苦,主要以便血、分泌物多、痒为主;
②期,有便血痔随排便脱垂,但能自行还纳;
③期(又称为晚期),内痔脱垂于肛门口外;不能自行还纳,必须用手托回。
④期,内痔脱出肛门无法回纳到肛门的里面,这种是内痔中最严重的病症。
外痔分型
①血管肿型:内痔表面粗糙且柔软,色暗红或朱红色,触至易出血,此型以出血为主要症状;
②静脉曲张型:内痔表面较坚硬,带光泽,色暗红或青紫,痔体内为曲张的痔静脉和增生的组织的结缔组织;
③纤维化型:内痔表面坚硬,富有弹性,痔体表面略有白色纤维组织增生,已脱出,不易出血;
④血拴外痔主要发病特点为起病突然,疼痛剧烈,坠下不适感明显,偶有全身症状。局部检查可见肛旁隆起肿物,可触及皮下硬而滑的包块,触痛明显;
⑤炎性外痔:常由肛缘皮肤损伤和感染引起,多有肛门疼痛,在排便时疼痛加重、便血,肛门部有少量分泌物,局部检查肛旁隆起的肿物,红色,充血明显,有触痛,有时可伴有全身不适和发热;
⑥静脉曲张型外痔:肛门缘隆起成椭圆形,触之柔软,不痛,在大便用力时可见暗紫色肿块,排便后或休息后体积可缩小,是皮下静脉曲张引起,亦为晚期内痔发展而致。一般只感肿胀不适,排便加重发炎时才有疼痛症状;
⑦结缔组织型外痔或皮赘外痔:系肛门缘皮肤皱缔变大,结缔组织增生、形成许多大小不等、形状不一的皮赘。
(2)治疗方法:
用0.01%过氧化氢洗涤患部,晾干后,在外部涂敷蟾肽抗生素糊膜剂或蟾肽抗生酊剂或蟾肽抗生素糊剂或蟾肽抗生素软膏剂,治疗周期7天-30天,肛门内塞入蟾肽抗生素栓剂。
(3)疗效标准:
参照《中医病症诊断疗效标准》拟定,痊愈:肛门内外生有小肉突起部位恢复正常,没有分泌物;显效:内外生有小肉突起部位恢复正常,偶有分泌物;有效:内外生有小肉突起部位基本恢复正常,偶有便血或分泌物;无效:病症略有改善或无明显变化。
(4)治疗效果:
本发明的有益效果是其所用的蟾肽抗生素成分经提取纯化可以定性与定量加入到各种制剂中,质量稳定可控。治疗结果显示蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法在抗菌治疗过程中效果显著,适合工业化生产并推广使用。
Claims (1)
1.蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素的方法,其特征在于:
以蟾蜍蛆虫为原料,采用水溶剂萃取法或稀碱溶液萃取法或稀醇溶液萃取法,结合离子交换树脂吸附法,超滤及微滤、凝胶色谱,超声驻波液相制备色谱工艺中的一种或者多种工艺,再冷冻干燥制备成蟾肽抗生素,蟾肽抗生素提取要求如下:
用蟾蜍蛆虫为原料用10倍 -100倍纯净水及0.02%磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液加热50℃-60℃、时间30min-40min提取蟾肽抗生素或者用乙醇溶液1Kw-10Kw声强超声波常温条件下处理10min-120min或者用乙醇稀溶液加热50℃-80℃提取蟾肽抗生素粗品,提取分离液泵入HD-8或HZ001酸性阳离子交换树脂柱中,常温下放置5h-10h,然后用1mol/L-10mol/L氨水溶液洗脱并收集蟾肽抗生素部分或用0.1mol/L-1.0mol/LNaOH溶液洗脱并收集蟾肽抗生素部分,提取分离液用错流微滤器以孔径0.1μm-0.8μm,压力0.01Mpa-0.5Mpa,流速100ml/min-10L/min连续微滤处理并注入到平板错流超滤器中,以孔径2nm-10nm,压力0.5Mpa-1.0Mpa,流速5.0L/min-50L/min连续超滤处理后收集蟾肽抗生素部分,蟾肽抗生素部分溶解到由氯仿-乙醇-水按照5:4:3的体积比组成的溶剂体系中,用超声驻波液相制备色谱以声强0.1kw-5kw,流速0.1ml/min-1000ml/min,紫外检测器波长220nm检测条件下连续分离纯化,分离纯化的蟾肽抗生素在温度-10℃— -50℃,真空度0.01Mpa-0.1Mpa,真空冷冻干燥1h-10h成粉末状蟾肽抗生素。
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