CN114469980A - 化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用。化合物或其衍生物选自尿苷、2′‑脱氧尿苷、脯氨酸、1‑硬脂酰‑GPC(18∶0)、异亮氨酸、鞘磷脂、鞘氨醇、7‑甲基鸟嘌呤和棕榈酰鞘磷脂中一种或多种化合物或其衍生物。本发明的应用对衰老过程尤其是人间充质干细胞衰老以及间充质干细胞衰老所诱发的退行性疾病等具有潜在的治疗作用。

Description

化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用。
背景技术
世界人口老龄化正逐步加剧，我国人口老龄化已达到较为严重的程度。日益加剧的人口老龄化无疑给社会医疗体系、经济和家庭造成沉重的负担。面对人口平均寿命的不断延长、人类社会逐步老龄化的严峻形势，衰老与抗衰老研究已然成为当今科学的重大论题和研究热点。
一般认为衰老是生命活动的基本现象和必然规律。衰老主要是指随年龄的增长，机体、器官、组织、细胞、生物大分子等多个层次的逐步发生退行性的变化，进而导致机体功能受损和疾病易感性的增加。与此同时，机体各元件的老化是衰老及衰老相关疾病的重要诱因，衰老相关疾病主要包括心血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、自身免疫疾病和神经退行性疾病等。虽然，衰老这一生命过程是不可避免的，但是延缓衰老、防治衰老相关疾病、进而改善老年人的生活质量是可能的。从衰老的分子机制和延缓衰老新型化合物等不同的层次研究衰老及衰老相关疾病不仅有利于解析衰老现象的生物学机制，也为人类主动延缓衰老、防治衰老相关疾病、实现健康老龄化提供理论基础和科学依据，并提供潜在的临床应用靶标。
在衰老机制研究方面，研究者发现干细胞的耗竭是衰老及衰老相关疾病的重要诱因，干细胞的耗竭是组织器官丧失修复及再生能力的主要因素。干细胞可以分为全能干细胞、多能干细胞和成体干细胞。其中成体干细胞，广泛存在于机体内，具有自我更新和多向分化潜能。因其具有再生能力，成体干细胞被认为是进行组织修护、开展临床应用治疗特定组织器官疾病的重要资源。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是成体干细胞家族的重要成员之一，源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制能力和多向分化的潜能。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、成骨、软骨等多种组织细胞。在衰老的过程中，间充质干细胞出现功能性衰老或耗竭，干细胞稳态失衡会导致成骨能力变差，发生增龄性骨质疏松等。
在药物延缓衰老研究方面，研究者们已经发现了一些能够延缓衰老的化合物，比如维生素C。维生素C又称为L-抗坏血酸，是一种抗氧化剂，因此，其具有维持细胞内的氧化还原平衡、降低细胞内活性氧的重要功能。
发明内容
本发明的目的之一在于提供尿苷等化合物或其衍生物的应用。
本发明提供了选自尿苷(uridine)、2′-脱氧尿苷(2′-deoxyuridine)、脯氨酸(proline)、1-硬脂酰-GPC(18：0)(1-stearoyl-GPC(18：0))、异亮氨酸(isoleucine)、鞘磷脂(d18：1/24：1，d18：2/24：0)(sphingomyelin(d18：1/24：1，d18：2/24：0))、鞘氨醇(sphingosine)、7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine)、棕榈酰鞘磷脂(d18：1/16：0)(palmitoyl sphingomyelin(d18：1/16：0))中一种或多种化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用。
可选地，根据上述的应用，所述抗衰老为如下任一种：
A1)延缓细胞、组织和/或器官衰老；
A2)预防和/或治疗细胞、组织和/或器官衰老所致疾病；
A3)促进细胞增殖；
A4)提高身体机能。
可选地，根据上述的应用，所述细胞、组织和/或器官衰老所致疾病具体可为退行性疾病，例如选自成年早衰症、儿童早衰症、增龄性骨质疏松和衰弱症中的一种或多种。
可选地，根据上述的应用，所述制剂为药物、保健品、食品或化妆品。
所述药物可为口服给药制剂、注射给药制剂或外用给药制剂。
所述化合物衍生物包括但不限于所述化合物的水合物、纳米颗粒包裹的所述化合物或其他形式修饰的所述化合物。
上述的应用中，所述化合物或其衍生物的施用浓度可为：尿苷(1μM-200μM)、2′-脱氧尿苷(10nM-1μM)、脯氨酸(150μM-1000μM)、1-硬脂酰-GPC(18：0)(1μM-25μM)、异亮氨酸(1μL-1000μM)、鞘磷脂(d18：1/24：1，d18：2/24：0)、鞘氨醇(50nM-50μM)、7-甲基鸟嘌呤(1nM-80nM)、棕榈酰鞘磷脂(1μM-120μM)。
上述的应用中，所述化合物或其衍生产品可以单一或组合联合应用。
本发明还提供了一种延缓细胞衰老或促进细胞增殖的方法，包括采用含有尿苷的培养基培养细胞，实现延缓细胞衰老或促进细胞增殖，所述细胞为离体的细胞。
可选地，根据上述的方法，所述尿苷在培养基的浓度为1-200μM，例如10-200μM、100-200μM。
上述细胞可为干细胞。具体可为间充质干细胞，例如选自人成年早衰症间充质干细胞、人儿童早衰症间充质干细胞和人原代间充质干细胞中的一种或多种。
上述促进细胞增殖可体现为如下任一种：
(1)提高Ki67阳性细胞比例；
(2)提高细胞单克隆能力；
(3)提高S期细胞比例。
上述延缓细胞衰老可体现为如下任一种：
(1)降低细胞中DNA损伤，例如降低γH2AX蛋白含量和/或53BP1蛋白含量；
(2)促进细胞中异染色质增加，例如提高H3K9me3修饰水平；
(3)提高细胞软骨分化能力。
本发明还提供了一种提高动物身体机能的方法，包括给动物施用尿苷，实现所述动物身体机能的提高。
可选地根据上述方法，可包括给动物口服施用浓度为20mg/mL的尿苷。
上述提高身体机能可体现为如下任一种：
(1)增加抓力；
(2)提高跑步等运动能力。
上述动物具体可为老年动物，例如老年小鼠。
本发明提供制备具有增殖性能提高和/或具有延缓衰老性能的细胞的方法，包括采用尿苷处理原细胞(例如，以含有尿苷的培养基培养所述原细胞)，得到目的细胞，所述目的细胞与原细胞相比，增殖性能提高和/或衰老延缓；所述原细胞为离体的间充质干细胞。
可选地，所述目的细胞的Ki67表达量高于所述原细胞，所述目的细胞的γH2AX蛋白含量低于所述原细胞，所述目的细胞的53BP1蛋白含量低于所述原细胞，和/或所述目的细胞的H3K9me3修饰水平高于所述原细胞。
本发明实施例主要利用人成年早衰症间充质干细胞(WRN-/-MSC)模型，进行候选化合物的筛选，通过对9个化合物的筛选，发现了尿苷具有促进细胞增殖，延缓细胞衰老的作用。在此基础上，本发明实施例利用成年早衰症和儿童早衰症两种早衰症间充质干细胞模型来研究尿苷的功能，并在人原代间充质干细胞中进行了进一步验证，表明尿苷在1μM-200μM有明显的延缓人间充质干细胞衰老、促进人间充质干细胞增殖的作用。RNA-seq数据经GO-term富集分析表明，相对于对照组，尿苷处理组上调基因主要富集在细胞周期、细胞增殖、细胞分裂等方面，揭示了尿苷在延缓衰老方面的新机制。
本发明实施例揭示了尿苷在人间充质干细胞中具有延缓衰老、促进细胞增殖的功能，具备临床转化价值与意义，对衰老过程尤其是人间充质干细胞衰老以及间充质干细胞衰老所诱发的退行性疾病等具有潜在的治疗作用。
附图说明
图1为实施例1的实验结果图，其中，A为人成年早衰症中候选代谢物处理的细胞增殖能力检测；B为年轻和年老人血浆中尿苷的水平的检测分析。
图2为实施例2的实验结果图，其中，A为实验用的人成年早衰症间充质干细胞的western blot检测，证明该细胞为WRN蛋白缺失的成年早衰症间充质干细胞；B为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞Ki67免疫荧光染色及统计；C为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验；D为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的细胞周期分析及统计；E为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞γH2AX和53BP1免疫荧光染色及统计；F为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞H3K9me3免疫荧光染色及统计；G为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的软骨分化能力分析及统计。
图3为实施例3的实验结果图，其中，A为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验；B为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色及统计；C为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的细胞周期分析及统计；D为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色及统计；E为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色及统计。
图4为实施例4的实验结果图，其中，A为尿苷处理的人原代间充质干细胞的单克隆形成能力检验；B为尿苷处理的人原代间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色及统计；C为尿苷处理的人原代间充质干细胞的细胞周期分析及统计；D为尿苷处理的人原代间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色及统计；E为尿苷处理的人原代间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色及统计。
图5为实施例5的实验结果图，其中，A为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞中的上下调通路；B为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞中嘧啶代谢以及线粒体功能维持基因的上调。
图6为实施例6的实验结果图，其中，A为老年小鼠抓力检测统计，B为老年小鼠跑台检测统计。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
人成年早衰症间充质干细胞(WS MSCs)和野生型人间充质干细胞(WT MSCs)在文献“Zhang W，Li J，Suzuki K，Qu J，WangP，Zhou J，Liu X，RenR，Xu X，OcampoA，Yuan T，Yang J，Li Y，Shi L，Guan D，Pan H，Duan S，Ding Z，Li M，Yi F，Bai R，Wang Y，Chen C，Yang F，Li X，Wang Z，Aizawa E，Goebl A，Soligalla RD，Reddy P，Esteban CR，Tang F，Liu GH，Belmonte JC.A Wemer Syndrome Stem Cell Model UnveilsHeterochromatinAlterations as a Driver of Human Aging.Science.2015；348(6239)：1160-1163.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所获得人类胚胎多能干细胞来源的人成年早衰症间充质干细胞。
人儿童早衰症间充质干细胞(HGPS MSCs)在文献“Wu Z，Zhang W，Song M，Wang W，Wei G，Li W，Lei J，Huang Y，Sang Y，Chan P，Chen C，Qu J，Suzuki K，Belmonte JC，LiuGH.Differential Stem Cell Aging Kinetics in Hutchinson-Gilford ProgeriaSyndrome and Wemer Syndrome.Protein Cell.2018.9(4)：333-350.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所获得人类胚胎多能干细胞来源的儿童早衰症间充质干细胞(HGPS MSCs)。
人原代间充质干细胞(h PMSC)在文献“Liang C，Liu Z，Song M，Li W，Wu Z，WangZ，Wang Q，Wang S，Yan K，Sun L，Hishida T，Cai Y，Izpisua Belmonte JC，Guillen P，Chan P，Zhou Q，Zhang W，Qu J，Liu GH.Stabilization of Heterochromatin byCLOCKPromotes Stem Cell Rejuvenation and Cartilage Regeneration.CellResearch.2021.31(2)：187-205.”中公开过，公众可从中国科学院生物物理研究所获得人原代间充质干细胞(hPMSC)。
下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37摄氏度，5％CO2。
下述实施例中的细胞培养基配方如下：
间充质干细胞(MSC)培养基配方：
α-MEM培养基(Invitrogen公司产品，货号：12571071)；
10％(体积百分含量)胎牛血清(Gibco公司产品，Cat#10099-141)；
0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen公司产品，货号：11140-050)；
1mM GlutaMAX二肽(Invitrogen公司产品，货号：35050-061)；
1％(体积百分含量)(1g/100ml)青霉素/链霉素(Invitrogen公司产品，货号：15070-063)；
10ng/ml人FGF2(Joint Protein Central公司产品)。
下述实施例中的小鼠如下：
所有动物实验均按照中国科学院动物管理和使用委员会批准的方案进行。野生型C57BL/6J小鼠在23-24℃的无病原体环境中，在12小时光照、12小时暗照的条件下，自由获得正常的食物和水。笼子垫料每周更换一次。
实施例1、代谢物的筛选
一、化合物筛选
本实施例涉及在人成年早衰症间充质干细胞(WS MSCs)进行化合物(化合物购买自sigma、selleck、MedChemExpress、源叶生物公司，详细见表1)的筛选。所用的检测仪器为IncuCyte S3活细胞成像系统(Essen BioScience，MI USA)。后续实验用尿苷，购自sigma公司。
具体方法如下：首先将第六代的WS MSCs铺种于96孔板中，3,000个细胞/孔，培养过夜，第二天换为含有不同浓度的各种化合物(浓度见表2)的MSC新鲜培养基，培养6天，隔天换含有不同浓度的各种化合物的MSC新鲜培养基。所有化合物筛选浓度信息列在表2中。采用阴性对照为该化合物所用溶剂(详细见表1)，阳性对照为Vitamin C(VC，280μM，购自sigma公司)。培养6天后，利用IncuCyte S3活细胞成像系统(Essen BioScience，MI USA)，进行细胞增殖能力测定。细胞增殖能力通过phase object confluence(percent)进行评价，并将6个重复处理孔的数值取平均值后进行比较。细胞增殖能力结果(筛选流程见图1中的A)显示，候选化合物中尿苷(Uridine)具有最好的促进成年早衰症间充质干细胞增殖的作用。
尿苷结构式如式1所示：
Figure BDA0003414732550000061
表1化合物信息表
Figure BDA0003414732550000062
Figure BDA0003414732550000071
表2化合物浓度
Figure BDA0003414732550000072
Figure BDA0003414732550000081
二、年轻人和年老人的血浆中尿苷的水平的检测分析
样本来自北京医院、昆明医科大学附属第一医院，提供者知情。
收集年轻(19-25岁，n＝28)和老年人(75-92岁，n＝21)人血浆样本，用于尿苷浓度检测。
对于样品预处理程序，将200μL内标物(1μg/mL氟尿嘧啶(Alta，货号#1ST10360)的乙腈(Sigma，货号#34851)和0.1％甲酸(Fisher Scientific，货号#A117-50)等)加入50μL血浆中，涡旋混合10s，4℃15,000rpm离心10min获得上清液。用160μL水稀释40μL上清液，然后将10μL稀释后的上清液注入SCIEXTriple QuadTM 4500LC-MS/MS系统进行分析。
对于校准品制备，将尿苷(Sigma，Cat#U3003)溶解在50％甲醇/H2O中以获得储备溶液(1mg/mL)。储备液进一步用50％甲醇/H2O稀释作为校准曲线，在-80℃下储备。校准品稀释至以下浓度：0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μg/mL。使用流动相在反相柱(Kinetex 2.6μm F5，100×3.0mm，Phenomenex，Torrance，CA，USA)上分离化合物。将色谱柱加热至40℃，使用Sciex DX Pump以0.6mL/min的流速洗脱流动相。涡轮离子喷雾接口在5500V和450℃下以负离子模式运行。尿苷和氟尿嘧啶(IS)分别在m/z 242.6和128.9处主要产生去质子化的分子。在Q2中与氮碰撞后，在Q3中对产物进行扫描，尿苷的m/z为109.0，IS的m/z为41.9。Ahalyst软件(1.6.3版，Applied Biosystems)用于数据收集，MultiQuantTM MD软件(3.0.2版，Applied Biosystems)用于定量。每个样品技术重复6次，取平均值进行统计分析。
结果如图1中的B所示，年轻个体中尿苷浓度是年老个体中尿苷浓度的1.45倍，表明年轻人和年老人血浆中的尿苷浓度具有显著性差异，年轻人血浆中的尿苷浓度高于年老人血浆中的尿苷浓度。
实施例2、尿苷处理改善人成年早衰症间充质干细胞(WS MSCs)的细胞表型。
首先对实验使用的野生型人间充质干细胞和人成年早衰症间充质干细胞进行鉴定，收集第五代的野生型人间充质干细胞和人成年早衰症间充质干细胞，提取总蛋白，用western blot方法检测WRN蛋白含量。结果显示用于化合物筛选和药效验证的人成年早衰症间充质干细胞为WRN蛋白缺失的成年早衰症间充质干细胞(图2中的A)。
使用尿苷200μM和阴性对照溶剂H2O自第五代开始处理人成年早衰症间充质干细胞，隔天换分别含有尿苷或对照溶剂的新鲜培养基，连续处理两代至第六代，检测尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞衰老相关的表型，具体如下：
使用尿苷200μM处理两代(第五代至第六代)后，进行Ki67染色以及单克隆形成实验，结果证明尿苷200uM处理可以促进细胞增殖，具体表征为尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞具有更高的Ki67阳性细胞比例以及克隆形成能力(图2中的B-C，图2中的B左侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞Ki67免疫荧光染色图，右侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞Ki67免疫荧光染色统计；图2中的C左侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验图，右侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验统计)。
细胞周期实验证明，尿苷200μM处理可以增加成年早衰症间充质干细胞的S期细胞比例(图2中的D)。
γH2 AX和53BP1免疫荧光染色实验证明，尿苷200μM处理可以降低成年早衰症间充质干细胞中DNA损伤水平，具体表征为尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞具有相对较低的γH2AX和53BP1阳性细胞比例(图2中的E，左侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞γH2AX和53BP1免疫荧光染色图，右侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞γH2AX和53BP1免疫荧光统计)。
H3K9me3免疫荧光染色实验证明，尿苷200μM处理可以促进成年早衰症间充质干细胞中异染色质增加，具体表征为尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞具有相对较强的H3K9me3信号强度(图2中的F，左侧图尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞H3K9me3免疫荧光染色图，右侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞H3K9me3免疫荧光染色统计)。
甲苯胺蓝染色实验证明，尿苷200μM处理可以增加成年早衰症间充质干细胞的软骨分化能力，具体表征为尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞分化为软骨的甲苯胺蓝染色实验表现出具有相对较高的甲苯胺蓝着色强度，代表尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞分化的软骨具有相对较高的软骨细胞密度(图2中的G，左侧图为甲苯胺蓝染色图，右侧图为尿苷处理的人成年早衰症间充质干细胞的软骨分化能力分析统计)。
上述检测方法具体如下。
蛋白质免疫印迹western blot实验：
首先提取野生型人间充质干细胞和人成年早衰症间充质干细胞的总蛋白，利用Westernblotting检测细胞表达的蛋白质。所用一抗为WRN抗体(anti-WRN，兔源，Abcam公司产品，货号：ab200)。二抗为HRP标记的羊抗兔抗体(Santa cruz公司产品，货号：sc-2005)。以ACTIN为内参，一抗为鼠源抗ACTIN抗体(Santa cruz公司产品，货号：sc-69879)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体(Santa cruz公司产品，货号：sc-2005)。
结果表明，成年早衰症间充质干细胞中WRN表达缺失。
免疫荧光实验：
分别以H2O(对照)和尿苷200μM自第五代开始处理，连续处理两代至第六代的成年早衰症间充质干细胞为供试细胞，将培养于盖玻片上的供试细胞用4％的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，使用含有0.4％(体积百分含量)Triton X-100的PBS室温孵育30分钟，继而换用10％(体积百分含量)驴血清(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然后加入对应二抗和染核试剂Hoechst 33258(工作浓度为2μg/ml，Invitrogen，货号：H3569)，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后封片和观察。采用GraphPad 9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用Student’s t test检验，P＜0.05表示对照组与尿苷处理组相比较，具有显著性差异。免疫荧光使用抗体：抗Ki67(Vector，VP-RM04)，抗H3K9me3(abcam，ab8898)，抗γH2AX(Millipore，05-636)和抗53BP1(Bethyl，A300-273A)。
结果表明，使用尿苷200μM处理两代(第五代至第六代)后，成年早衰症间充质干细胞具有更高的Ki67阳性细胞比例(图4中的B)。尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞具有相对较低的γH2AX和53BP1阳性细胞比例(图2中的E)。尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞具有相对较强的H3K9me3信号强度(图2中的F)。
单克隆形成实验：
分别以H2O(对照)和尿苷200μM自第五代开始处理，连续处理两代至第六代的成年早衰症间充质干细胞为供试细胞，将3000个细胞种于12孔板的1个孔中，每个样品3个重复。其中生长最快的样品长至80％密度时进行染色，将细胞使用4％多聚甲醛固定，用双蒸水稀释结晶紫溶液至1×，室温覆盖染色30min，使用清水反复冲洗干净。使用扫描仪进行全孔扫描，并使用ImageJ软件将图片转为灰度图片并计算累积密度值。采用GraphPad9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用Student’s t test检验，P＜0.05表示对照组与尿苷处理组相比较，具有显著性差异。
结果表明，使用尿苷200μM处理两代(第五代至第六代)后，成年早衰症间充质干细胞具有更高的克隆形成能力(图2中的C)。
细胞周期检测：
分别以H2O(对照)和尿苷200μM自第五代开始处理，连续处理两代至第六代的成年早衰症间充质干细胞为供试细胞，使其达到80％密度时，使用Tryple酶(Gibco)消化为单细胞，冷PBS洗一遍后，使用70％乙醇-80℃固定过夜。第二天使用冷PBS洗一遍后进行染色，染色液包含0.1％Triton X-100，0.02mg/mL碘化丙啶(P3566，Molecular Probes)and 0.2mg/mL RNA酶A(B100675-0500，Sangon biotech)，37℃孵育30min，之后使用流式细胞仪进行检测(BD FACS Calibur)。采用GraphPad 9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用Student’s t test检验，P＜0.05表示对照组与尿苷处理组相比较，具有显著性差异。
结果显示，与H2O处理的成年早衰症间充质干细胞相比，尿苷200μM处理具有明显增加成年早衰症间充质干细胞的S期细胞比例(图2中的D)。
软骨分化能力检测：
1)将H2O(对照)和200μM尿苷自第五代成年早衰症间充质干细胞开始处理，连续处理两代至第六代的成年早衰症间充质干细胞，以1×105个/孔的接种量分别接种在低吸附96孔板中，每孔加入100μL软骨培养基。
2)将培养板放置在离心机中，450g室温离心5min，离心后可观察到细胞成团。
3)每2-3天更换软骨培养基，培养约30天。
4)显微镜下拍照记录软骨球的大小。
5)观察完球径大小，用4％多聚甲醛固定，30％蔗糖溶液脱水后，用OCT包埋。
6)用冷冻切片机连续切片，厚度为0.12μm。
7)挑选完整的最大横截面切片，放置于多聚赖氨酸处理的载玻片上。
8)用PBS洗两遍去除包埋剂，用甲苯胺蓝染液染色30min。用PBS洗去多余染色液，倒置显微镜下观察染色效果。
采用GraphPad 9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用Student’s t test检验，P＜0.05表示对照组与尿苷处理组相比较，具有显著性差异。
结果显示，与H2O处理的成年早衰症间充质干细胞相比，尿苷200μM处理的成年早衰症间充质干细胞分化的软骨具有相对较高的软骨细胞密度具有明显增加(图2中的G)。
软骨培养基配方(％为体积百分含量)及来源：95.5％高糖DMEM(HyClone，SH30243.01)，1％Glutamax(Gibco，35050079)，1％MEMNEAA(Gibco，11140076)，1％Peniciin-Streptomycin(Gibco，15140-163)，100nM Dexamethasone(Selleck，S1322)，1％ITS，50μg/mL Ascorbic acid(Sigma，A4403)，40μg/mL Proline(Sigma，P5607)，10ng/mLTGFβ1(购自R&D公司)。
实施例3、尿苷处理可以改善儿童早衰症间充质干细胞(HGPS MSCs)的细胞表型
使用尿苷100μM和阴性对照溶剂H2O连续处理儿童早衰症间充质干细胞(HGPSMSCs)两代(自第十代至第十一代，隔天换分别含有尿苷或对照溶剂的新鲜培养基)后，检测尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞(HGPS MSCs)衰老相关的表型，具体如下：进行Ki67染色以及单克隆形成实验，结果证明尿苷100μM处理可以促进细胞增殖，具体表征为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞具有更高的Ki67阳性细胞比例以及克隆形成能力(图3中的A-B，A左侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验，A右侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的单克隆形成能力检验统计；B左侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色图，B右侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色统计)。
细胞周期实验证明，尿苷100μM处理可以增加儿童早衰症间充质干细胞的S期细胞比例(图3中的C)。
γH2AX和53BP1免疫荧光染色实验证明，尿苷100μM处理可以降低儿童早衰症间充质干细胞中DNA损伤水平，具体表征为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞具有相对较低的γH2AX和53BP1阳性细胞比例(图3中的D，左侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色图，右侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色统计)。
H3K9me3免疫荧光染色实验证明，尿苷100μM处理可以促进儿童早衰症间充质干细胞中异染色质增加，具体表征为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞具有相对较强的H3K9me3信号强度(图3中的E，左侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色，右侧图为尿苷处理的儿童早衰症间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色统计)。
单克隆形成实验、细胞周期检测、Ki67，H3K9me3，γH2AX和53BP1免疫荧光实验方法与实施例2所述相同。免疫荧光使用抗体：抗Ki67(Vector，VP-RM04)，抗H3K9me3(abcam，ab8898)，抗γH2AX(Millipore，05-636)和抗53BP1(Bethyl，A300-273A)。
结果显示，与H2O处理的儿童早衰症间充质干细胞相比，尿苷100μM处理具有明显的促进细胞增殖、改善儿童早衰症间充质干细胞细胞表型的作用。
实施例4、尿苷可以延缓人原代间充质干细胞衰老
使用尿苷100μM和阴性对照H2O连续处理人原代间充质干细胞两代(自第13代开始药物处理，连续处理两代至第13+1代，隔天换分别含有尿苷或对照溶剂的新鲜培养基)后，检测尿苷处理的人原代间充质干细胞衰老相关表型(图4)，具体如下：使用尿苷100μM处理两代(第13代至第13+1代)后，进行Ki67染色以及单克隆形成实验，结果证明尿苷100μM处理可以促进细胞增殖，具体表征为尿苷处理的人原代间充质干细胞具有更高的Ki67阳性细胞比例以及克隆形成能力(图4中的A-B，A左侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的单克隆形成能力检验，A右侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的单克隆形成能力检验统计；B左侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色图，B右侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色统计)。
细胞周期实验证明，尿苷100μM处理可以增加人原代间充质干细胞的S期细胞比例(图4中的C)。
γH2AX和53BP1免疫荧光染色实验证明，尿苷100μM处理可以降低人原代间充质干细胞中DNA损伤水平，具体表征为尿苷处理的人原代间充质干细胞具有相对较低的γH2AX和53BP1阳性细胞比例(图4中的D，左侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色图，右侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的γH2AX和53BP1免疫荧光染色统计)。
H3K9me3免疫荧光染色实验证明，尿苷200μM处理可以促进人原代间充质干细胞中异染色质增加，具体表征为尿苷处理的人原代间充质干细胞具有相对较强的H3K9me3信号强度(图4中的E，左侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色，右侧图为尿苷处理的人原代间充质干细胞的H3K9me3免疫荧光染色统计)。
单克隆形成实验、细胞周期实验、Ki67，H3K9me3，γH2AX和53BP1免疫荧光实验方法与实施例2相同。免疫荧光使用抗体：抗Ki67(Vector，VP-RM04)，抗H3K9me3(abcam，ab8898)，抗γH2AX(Millipore，05-636)和抗53BP1(Bethyl，A300-273A)。
结果显示，与H2O处理的人原代间充质干细胞相比，尿苷100μM处理具有明显的促进细胞增殖、改善人原代间充质干细胞表型的作用。
实施例5、尿苷延缓成年早衰症细胞衰老的作用机制研究
利用Illumina测序平台进行RNA-seq测序分析。成年早衰症间充质干细胞样品自第五代开始使用对照溶剂H2O和100μM尿苷分别处理，连续处理2代，隔天换分别含有尿苷或对照溶剂的新鲜培养基，在第六代进行细胞收集，提取mRNA，然后进行RNA测序分析。RNA-seq数据处理使用hisat2软件(V2.0.4)将测序读数修剪并映射到hg19人类基因组。每个基因的转录表达水平由HTSeq(V0.61)计算。差异表达基因(DEGs)使用DESeq2计算，P值(Benjamini-Hochberg)＜0.05以及log2(倍数变化)＞0.25为截断值。基因本体论(GO)和通路富集分析由Metascape进行。
结果如图5所示。A为与H2O处理的成年早衰症间充质干细胞相比，尿苷处理的成年早衰症间充质干细胞中的上调基因和下调基因富集的桐庐分析，图中基因本体论(GO)和通路富集分析分析显示上调基因主要富集在细胞周期、DNA修复等通路。下调基因主要富集在内质网压力应答，免疫应答以及氧应答等通路。B显示尿苷处理组能够显著性地提高嘧啶代谢以及线粒体功能相关的基因。
实施例6、尿苷提高老年小鼠身体机能
对于长期口服给药实验，每天用尿苷或溶媒治疗老年C57BL/6J雄性小鼠(21-22个月大)。用尿苷治疗时，剂量为20mg/kg，溶解到3毫升的饮用水中(尿苷治疗组，n＝26)。对于经溶媒处理的小鼠，自由饮水(对照组，n＝26)。
第8周，对老年小鼠进行抓力检测。通过小型动物抓力检测器(Panlab网格强度仪)进行抓力分析，以检测尿苷处理后的肌肉力量变化。抓网倾斜角度30度，以恒定的速率平行拉网匀速拉动，直到小鼠自动放开抓网。重复该过程10次，每次间隔1分钟。去掉最大和最小抓力，计算其平均值为每只小鼠的抓力。
第9周，对于老年小鼠跑台检测，以初始速度5m/min训练5分钟，然后以1m/min2的速度加速，运动25min连续训练2天。在第3-5天，对小鼠进行测试和数据收集，小鼠在跑步机起点位置停留时间超过8秒，则会受到电击刺激，记录并统计30分钟内的电刺激频率。
如图6所示，图6中的A为老年小鼠抓力检测结果，结果表明尿苷组的小鼠抓力显著高于对照组，提示尿苷有提高小鼠抓力的作用；图6中的B为跑台检测结果，结果表明尿苷组的单位时间小鼠电击次数显著低于对照组，提示尿苷可提高小鼠全身的运动能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.选自尿苷、2′-脱氧尿苷、脯氨酸、1-硬脂酰-GPC(18:0)、异亮氨酸、鞘磷脂、鞘氨醇、7-甲基鸟嘌呤和棕榈酰鞘磷脂中一种或多种化合物或其衍生物在制备抗衰老制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗衰老为如下任一种：
A1)延缓细胞、组织和/或器官衰老；
A2)预防和/或治疗细胞、组织和/或器官衰老所致疾病；
A3)促进细胞增殖；
A4)提高身体机能。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细胞、组织和/或器官衰老所致疾病选自成年早衰症、儿童早衰症、增龄性骨质疏松和衰弱症中的一种或多种。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述制剂为药物、保健品、食品或化妆品。
5.一种延缓细胞衰老或促进细胞增殖的方法，其特征在于：包括采用含有尿苷的培养基培养细胞，实现延缓细胞衰老或促进细胞增殖，所述细胞为离体的细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述尿苷在培养基的浓度为1-200μM。
7.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述细胞为间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述间充质干细胞选自人成年早衰症间充质干细胞、人儿童早衰症间充质干细胞和人原代充质干细胞中的一种或多种。
9.一种提高动物身体机能的方法，其特征在于：包括给动物施用尿苷，实现所述动物身体机能的提高。
10.制备具有增殖性能提高和/或具有延缓衰老性能的细胞的方法，其特征在于：包括采用尿苷处理原细胞，得到目的细胞，所述目的细胞与原细胞相比，增殖性能提高和/或衰老延缓；所述原细胞为离体的间充质干细胞。
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