CN108938618B - 延缓人间充质干细胞衰老的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了选自槲皮素,大黄根酸,毛地黄黄酮,芒柄花黄素,和厚朴酚,黄连素,山奈酚,矮茶素,脱氧肾上腺素,甘草查尔酮A的化合物及其衍生产品在制备用于促进干细胞增殖、延缓干细胞衰老、促进干细胞向成骨、软骨、脂肪细胞分化、提高干细胞的血管形成能力和/或加强小鼠运动耐力的方法中使用的药物中的用途。本发明还公开了在所述方法中,所述化合物可以与维生素C组合施用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地,涉及延缓人间充质干细胞衰老、促进干细胞增殖、促进干细胞向成骨、软骨细胞分化、促进间充质干细胞血管再生、加强小鼠运动耐力的系列化合物及其用途。
背景技术
人口老龄化是世界尤其是中国面临的日益严峻的社会问题,给社会和家庭带来沉重负担,影响社会持续性发展。因此,如何延缓衰老,实现“健康衰老”,是保证社会长治久安、经济持续性发展的必要条件。因此,衰老及衰老相关疾病已成为全球科研领域亟需解决和突破的热点及难点。延缓衰老药物筛选也成为重要方面。
成体干细胞广泛存在于机体内,具有自我更新和多向分化潜能,是进行组织修护、开展临床应用治疗特定组织器官疾病的重要资源。间充质干细胞(Mesenchymal stemcells,MSC)是成体干细胞家族的重要成员之一,源于发育早期的中胚层和外胚层,具有自我复制能力和多向分化的潜能。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、成骨、软骨等多种组织细胞。伴随着衰老的过程,间充质干细胞的耗竭会导致成骨能力变差,发生增龄性骨质疏松,此外,还将影响成肌能力,导致增龄性的肌肉萎缩等等。以上多种证据证实成体干细胞的衰竭,是组织器官丧失修复及再生能力的主要因素。在衰老细胞中,干细胞出现功能性衰老或耗竭,干细胞稳态失衡。
槲皮素来自植物多酚,是一种强的自由基清除剂,具有广泛的生物学作用,体外和一些动物模型中报道包括:抗致癌作用,抗炎和抗病毒活性以及衰减脂质过氧化。此外,槲皮素延缓衰老方面的研究也有报道。槲皮素可延长秀丽线虫的平均寿命15%。秀丽线虫转录因子DAF-16(哺乳动物FoxO家族成员的同源蛋白)已被鉴定为寿命、抗氧化应激抗性的关键调节器。槲皮素治疗导致线虫的DAF-16易位到细胞核中,这种状态经常与应激反应和长寿相关。槲皮素的保护和延寿作用不仅是由于其强大的抗氧化能力,还可能是通过激活长寿基因DAF-16而发挥功能的。在2010,槲皮素及其衍生物,即槲皮素辛酸酯,被鉴定为蛋白酶体激活剂,具有抗氧化特性,从而影响原代人成纤维细胞HFL-1的细胞寿命和存活率。此外,槲皮素在衰老成纤维细胞中具有恢复作用。最近,有报道称槲皮素为“senolyticdrug”,其最优使用浓度为10μM,可以选择性地诱导衰老内皮细胞凋亡,如成人内皮细胞,当与Dastinib联合使用时,它们减轻小鼠衰老相关表型。在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠模型中,通过用“Dastinib(5mg/kg)+槲皮素(10mg/kg)”处理来清除衰老细胞,降低了整体肝脂肪变性。然而,Hwang等人报道槲皮素在非衰老的人冠状动脉内皮细胞(HCAEs)中引起细胞死亡,其浓度(4–100μm)被报道有选择性地去除衰老细胞。因此,在原代成人内皮细胞中,槲皮素不是“senolytic drug”。
然而,槲皮素在人成年早衰症、儿童早衰症间充质干细胞中的作用尚未有报道。
发明内容
本发明的发明人发现槲皮素在50nM–2μM有明显的延缓人间充质干细胞衰老的作用,RNA-seq数据经生物过程富集GO-term分析发现,相对于溶剂DMSO处理组,槲皮素处理组上调基因主要富集在细胞周期、细胞增殖、细胞分裂、染色体分离四个方面,发明人的研究揭示了槲皮素延缓衰老的新机制。本发明主要利用人成年早衰症间充质干细胞(WRN-/-MSC)模型,进行天然产物库的筛选,通过对133个化合物的筛选,发现了以槲皮素为代表的10个小分子化合物,这些化合物具有促进细胞增殖,延缓细胞衰老的作用。
在此研究基础上,发明人对槲皮素延缓衰老的作用进行了深入的研究,主要是利用成年早衰症和儿童早衰症两种早衰症间充质干细胞细胞模型来研究槲皮素的功能,并在人原代牙间充质干细胞和人复制性衰老间充质干细胞中进行了进一步验证。本发明揭示了系列化合物及其衍生产品在人间充质干细胞中延缓衰老的功能,以及系列化合物及其衍生产品单独或组合与维生素C联合应用,联合应用具有明显的促进细胞增殖、延缓细胞衰老等功能。
延缓干细胞衰老的系列化合物及其衍生产品的应用。
所述干细胞,其特征在于:所述干细胞为间充质干细胞。
所述的干细胞,其特征在于:所述干细胞为人野生型间充质干细胞或人成年早衰症间充质干细胞或人儿童早衰症间充质干细胞。
所述的化合物及其衍生产品,其特征在于:所述化合物为:槲皮素,大黄根酸,毛地黄黄酮,芒柄花黄素,和厚朴酚,黄连素,山奈酚,矮茶素,脱氧肾上腺素,甘草查尔酮A。
所述的化合物,其特征在于:所述化合物延缓间充质干细胞衰老的浓度为槲皮素(10nM-2000nM,优选地100nM–300nM),大黄根酸(1nM-250nM,优选地50nM–100nM),毛地黄黄酮(50nM-500nM,优选地50nM–100nM),芒柄花黄素(10nM-500nM,优选地100nM–300nM),和厚朴酚(10nM-1000nM,优选地100nM–300nM),黄连素(10nM-200nM,优选地50nM–100nM),山奈酚(50nM-500nM,优选地100nM–300nM),矮茶素(10nM-200nM,优选地50nM–100nM),脱氧肾上腺素(100nM-1000nM,优选地50nM–300nM),甘草查尔酮A(10nM-200nM,优选地50nM–100nM)。
任一所述的化合物及其衍生产品,其特征在于:所述化合物及其衍生产品在促进细胞增殖、延缓细胞衰老、促进成骨、软骨形成、促进血管形成、加强小鼠运动耐力等方面的应用。
所述的应用,其特征在于:所述化合物及其衍生产品之应用包括但不限于治疗衰弱症、成年早衰症、儿童早衰症等衰老相关疾病,或者作为延缓衰老、促进健康衰老的保健品的应用。
所述的化合物及其衍生产品,其特征在于:所述衍生产品包括但不限于所述化合物的水合物、纳米颗粒包裹的化合物及其他形式修饰的化合物。
所述的化合物及其衍生产品,其特征在于:所述化合物及其衍生产品可以单一或组合与维生素C联合应用。
所述的化合物及其衍生产品与维生素C联合应用,其特征在于:所述维生素C的使用浓度为10μM–1000μM,优选地100μM-500μM。
所述的化合物及其衍生产品与维生素C联合应用,其特征在于:所述化合物与维生素C联合应用可促进细胞增殖、延缓细胞衰老、促进成骨、软骨形成、促进血管形成、加强小鼠运动耐力等方面的应用。
所述的化合物及其衍生产品与维生素C联合应用,其特征在于:所述化合物及其衍生产品之应用包括但不限于治疗衰弱症、成年早衰症、儿童早衰症等衰老相关疾病,或者作为延缓衰老、促进健康衰老的保健品的应用。
更具体地,本发明涉及以下各项:
1.选自槲皮素,大黄根酸,毛地黄黄酮,芒柄花黄素,和厚朴酚,黄连素,山奈酚,矮茶素,脱氧肾上腺素,甘草查尔酮A的化合物及其衍生产品在制备在用于促进干细胞增殖、延缓干细胞衰老、促进干细胞向成骨、软骨、脂肪细胞分化、提高干细胞的血管形成能力和/或加强小鼠运动耐力的方法中使用的药物中的用途。
2.根据1所述的用途,其中所述衍生产品包括所述化合物的水合物、纳米颗粒包裹的所述化合物及其他形式修饰的所述化合物。
3.根据1所述的用途,其中所述化合物是槲皮素。
4.根据1所述的用途,其中所述干细胞为间充质干细胞。
5.根据1所述的用途,其中所述干细胞为人野生型间充质干细胞或人成年早衰症间充质干细胞或人儿童早衰症间充质干细胞。
6.根据1所述的用途,其中在所述方法中,所述化合物的施用浓度为:槲皮素(10nM–2000nM,优选地100nM–300nM),大黄根酸(1nM–250nM,优选地50nM–100nM),毛地黄黄酮(50nM–500nM,优选地50nM–100nM),芒柄花黄素(10nM–500nM,优选地100nM–300nM),和厚朴酚(10nM–1000nM,优选地100nM–300nM),黄连素(10nM–200nM,优选地50nM–100nM),山奈酚(50nM–500nM,优选地100nM–300nM),矮茶素(10nM–200nM,优选地50nM–100nM),脱氧肾上腺素(100nM–1000nM,优选地50nM–300nM),甘草查尔酮A(10nM–200nM,优选地50nM–100nM)。
7.根据1所述的用途,其中在所述方法中,将所述化合物与维生素C组合施用。
8.根据7所述的用途,其中在所述方法中,维生素C的施用浓度为10μM–1000μM,优选地100μM–500μM。
附图说明
图1.本发明筛选的133个天然产物的MTS实验,结果显示10个小分子具有显著的促进成年早衰症间充质干细胞增殖的作用。
图2.本发明通过天然产物库筛选获得的促进细胞增殖的10个化合物及其结构式。
图3.本发明涉及的10个小分子化合物的有效浓度。
图4.本发明筛选的槲皮素的有效浓度筛选实验。A,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色;B,SA-β-gal阳性细胞统计;C,不同浓度槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞的细胞生长曲线。
图5.槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞向成骨、软骨、脂肪细胞分化实验。
图6.槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞具有延缓衰老的表型。A,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞的Ki67荧光染色;B衰老标志物p16、p21蛋白的western blot实验。
图7.体内实验证明槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞具有更好的细胞活力和血管形成能力。A,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞在小鼠体内的活力实验;B,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞在小鼠脂肪垫内血管形成能力实验。
图8.槲皮素处理的儿童早衰症细胞表型得到明显改善。A,实验用的儿童早衰症细胞的基因组测序,结果证明实验用细胞为LMNAG608G/+;B,mRNA水平,儿童早衰症特异的progerin蛋白表达量下降;C,蛋白质水平,儿童早衰症细胞特异的progerin蛋白表达量下降;D,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的细胞生长曲线;E,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色;F,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的单克隆形成实验;G,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的Ki67荧光染色;H,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的端粒长度检测;I,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的异常核的比例统计;J,槲皮素处理的儿童早衰症间充质干细胞的电镜观察,表型为处理后异染质增多,延缓衰老。
图9.A,槲皮素处理的人生理性衰老的牙间充质干细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色;B,槲皮素处理的人野生型复制性衰老的间充质干细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色。
图10.A,槲皮素100nM,维生素C(VC,280μM),槲皮素(100nM)+VC(280μM)处理的儿童早衰症间充质干细胞的细胞生长曲线;B,槲皮素100nM,维生素C(VC,280μM),槲皮素(100nM)+VC(280μM)处理的生理性衰老的人的牙间充质干细胞的细胞生长曲线。
本发明细胞实验对照均为溶剂二甲基亚砜(DMSO)。
图11.槲皮素在生理性衰老小鼠的运动能力检测。
对照组灌胃溶剂(含10%PEG的PBS),槲皮素组灌胃槲皮素(0.125mg/kg体重,每周灌胃一次,累积处理时间6个月)。
图12.槲皮素延缓衰老的作用机制研究
A,RNA-seq分析样品为溶剂(DMSO)和槲皮素分别处理的成年早衰症间充质干细胞,RNA-seq分析发现,相对于溶剂处理,槲皮素处理组有486个上调基因和294下调基因。B,进一步的生物过程富集GO-term分析发现这些上调基因主要富集在细胞周期、细胞增殖、细胞分裂、染色体分离四个方面。
注:*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001;n.s.,不显著。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明,均为37摄氏度,5%CO2。
下述实施例中的细胞培养基配方如下:
间充质干细胞(MSC)培养基配方:
α-MEM培养基(Gibco);
10%(体积百分含量)胎牛血清(Gemcell,Lot A77E01F);
1%(1g/100ml)青霉素/链霉素(Gibco);
10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(Joint Protein Central,bFGF);
下述实施例中的表达荧光素酶Luciferase的病毒载体记载在“Pan,H.,Guan,D.,Liu,X.,Li,J.,Wang,L.,Wu,J.,Zhou,J.,Zhang,W.,Ren,R.,Li,Y.,et al.(2016).SIRT6safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress bycoactivating NRF2.Cell research 26,190-205.”一文中,公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
实施例1、天然产物库的筛选
本实施例涉及在人成年早衰症间充质干细胞(WS MSCs)进行天然产物库(133个化合物,购买自selleck公司,货号L1400)的筛选。所用的方法为MTS方法,试剂购自Promega公司。后续实验用槲皮素为二水槲皮素,购自selleck公司。
具体方法如下:首先将第五代的WS MSCs铺种于96孔板中,3000个细胞/孔,培养过夜,第二天换为含有1μM各种化合物的MSC培养基,培养7天,隔天换液。采用阴性对照为溶剂二甲基亚砜(DMSO,1‰),阳性对照为Vitamin C(VC,280μM)。药物处理7天后,进行MTS检测,测定490nm的吸光值(OD值),进行细胞活力测定后分析。MTS结果(见图1)显示,133个化合物中有10个化合物具有促进WS MSC增殖的作用,其结构式如图2。
具体的MTS实验方法:
将MTS:MSC培养基按1:10体积比配置为混合液,将96孔板中的液体吸出,加入含有MTS的培养基,100μL/孔,37摄氏度,1-4小时,进行490nm吸光值检测。MTS购买于Promega公司。
实施例2、优选的10个小分子化合物的有效浓度检测
经过筛选获得槲皮素,大黄根酸,毛地黄黄酮,芒柄花黄素,和厚朴酚,黄连素,山奈酚,矮茶素,脱氧肾上腺素,甘草查尔酮A等10种小分子,并在WS MSCs细胞水平进行了有效浓度的研究。结果见图3。
检测方法细胞计数。将第五代(p5)的WS MSCs铺种于6孔板中,30000个细胞/孔,培养过夜,第二天换为分别含有100nM,250nM,500nM和1μM的各种化合物的培养基,培养约20天至第六代,隔天换液(含不同浓度的各种化合物的新鲜MSC培养基)。采用阴性对照为溶剂二甲基亚砜(DMSO)。药物处理至第六代,台盼蓝染色后进行细胞计数与分析。结果发现槲皮素促进增殖效果最为显著。
进一步的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色研究发现槲皮素在100nM–250nM最为有效,同样的细胞增值曲线也得出槲皮素100nM和250nM均显示延缓细胞衰老的特性(图4)。
细胞计数具体操作步骤如下:
1)利用细胞计数,统计连续传代(p5-p7)的DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSCs的细胞累积增殖倍数;
2)计算每代细胞增殖倍数=每代结束培养时细胞数/每代起始培养时细胞数;
3)细胞累积增殖倍数=log2(p5细胞增殖倍数)+log2(p6细胞增殖倍数)+log2(p7细胞增殖倍数)。
SA-β-gal染色:
细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-β-gal(senescence-associated-β-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。
分别以DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSCs细胞为供试细胞进行SA-β-gal染色:
1)6孔板中以合适密度种入细胞;
2)细胞密度达到60~80%时,PBS清洗两次细胞;
3)2%多聚甲醛+0.2%异戊醛固定,不超过5分钟;
4)PBS清洗2次;
5)加入染色液,37度避光过夜孵育。染色液配方如下:
柠檬酸/磷酸钠缓冲液 | 40mM |
K<sub>4</sub>[Fe(CN)<sub>6</sub>]·6H<sub>2</sub>O | 5mM |
K<sub>3</sub>[Fe(CN)<sub>6</sub>] | 5mM |
NaCl | 150mM |
MgCl<sub>2</sub> | 2mM |
X-gal | 1mg/ml |
6)PBS清洗2次;
7)Hoechst 33258(Invitrogen,货号:H3569)室温避光孵育5分钟;
8)PBS清洗一次;
9)显微镜下观察。
以X-Gal为底物,在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况,并进一步对两组细胞中的SA-β-gal染色阳性细胞比率进行定量统计分析。
实施例3、药物处理的WS MSCs具有更好的成骨、软骨分化能力和延缓衰老的表型。
使用槲皮素100nM和阴性对照DMSO(1‰)处理的第七代WS MSCs(自第五代开始药物处理),向成骨、软骨和脂肪细胞进行分化(图5)。结果发现槲皮素处理后的WS MSCs向成骨、软骨细胞分化能力增强。
成骨培养基:
软骨培养基:
脂肪培养基:
同时,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞具有延缓衰老的表型(图6)。A,槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞的Ki67免疫荧光染色,槲皮素处理后Ki67阳性细胞率增多;B,衰老标志物p16,p21蛋白的western blot蛋白定量实验。
免疫荧光实验:将培养于盖玻片上的供试细胞用4%的多聚甲醛室温固定30分钟,PBS漂洗(3次,5分钟/次)后,使用含有0.4%(体积百分含量)Triton X-100的PBS室温孵育30分钟,继而换用10%(体积百分含量)驴血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.货号:017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次,5分钟/次)后,然后加入对应二抗和染核试剂Hoechst 33258(工作浓度为2μg/ml,Invitrogen,货号:H3569),室温孵育1小时。PBS漂洗(3次,5分钟/次)后封片和观察。抗Ki67一抗(Vector,V P-RM04,1:1000稀释使用)。
Western blot检测:DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSC第七代细胞作为供试细胞,提取各细胞的总蛋白,利用western-blot检测细胞表达的蛋白质。所用一抗为:anti-p21(Cell Signaling Technology,2947),anti-p16(BD Bioscience,4828),二抗为HRP标记的羊抗兔抗体(Santa cruz公司,货号为sc-2004)。以β-actin为内参,一抗为鼠源抗β-actin抗体(Santa cruz公司,货号为sc-130301),二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体,Santa cruz公司(货号为sc-2005)。
实施例4、槲皮素处理的成年早衰症间充质干细胞体内活力更强,成血管能力更强(图7)。
本发明将槲皮素处理的细胞在小鼠体内进行了增殖和整合能力测定。
为了验证DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSC第七代细胞的体内生存能力,首先用表达荧光素酶Luciferase的病毒载体分别感染DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSC第七代细胞,感染3天后,将两种细胞分别消化为单细胞状态,随后分别注射入免疫缺陷型NOD-SCID小鼠(维通利华)左、右胫骨前肌,两种细胞的注射量均相同。注射0,5天后分别利用小动物活体成像系统(Xenogen IVIS spectrum,PE公司)检测小鼠左、右胫骨前肌中luciferase活性,来反映MSC的存活及体内整合能力。
具体操作方法如下:
1)选取生长状态良好、细胞密度为60~80%的细胞,感染表达荧光素酶Luciferase的病毒载体;
2)感染后72小时,用TrypLE(Gibco)消化为单细胞;
3)细胞计数,每1×106个细胞以100μl PBS重悬;
4)取100μl细胞悬液注射入小鼠胫骨前肌;
5)每日观察小鼠状态;
6)移植后0,5天后,取出小鼠,腹腔注射Luciferase底物(D-Luciferin Firefly,potassium salt,GOLDBIO公司),麻醉后用小动物活体成像系统进行分析。统计6组生物学重复的荧光强度。
结果显示,槲皮素处理的WS MSCs(右腿)在胫骨前肌中的luciferase活性较DMSO处理的MSC(左腿)在胫骨前肌中有显著提高(图7A),表明与DMSO处理的WS MSCs相比,槲皮素处理的WS MSCs在体内退行速度较慢,存活并整合的细胞数目更多。
脂肪垫实验:
1)收集DMSO和槲皮素100nM处理的WS MSC第七代细胞;
2)PBS洗一次;
3)细胞计数,每1.5×105个细胞以15μl混合液体(30%PBS,20%FBS,50%Matrigel)重悬;
4)取15μl细胞悬液注射入小鼠腹股沟脂肪垫(n=6);
5)注射后四周,对小鼠脂肪垫进行收集、OCT包埋;
6)切片
7)hCD31,SMA免疫荧光染色观察统计。
抗体为:抗SMA(ZSGB-Bio,ZM-0003),抗hCD31(BD Bioscience,555445),免疫荧光染色方法同实施例3。
结果显示,槲皮素处理的WS MSCs较DMSO处理的MSC具有明显的促进血管形成的能力(图7B)。
实施例5、槲皮素处理可以改善儿童早衰症间充质干细胞(HGPS MSCs)的细胞表型
首先对实验用HGPS MSCs进行基因组测序(美吉生物公司),结果发现所用细胞为HGPS细胞(LMNAG608G/+)(图8A);其次对HGPS特异的蛋白progerin在mRNA和蛋白水平分别进行qRT-PCR和免疫荧光实验,发现槲皮素100nM处理(自第六代处理至第十代)后progerin表达量下降(图8B-C);另外,细胞增殖曲线和单克隆形成实验证明槲皮素100nM处理可以促进细胞增殖(图8D,8F),SA-β-gal实验、Ki67免疫荧光实验和端粒长度检测说明槲皮素处理可以延缓HGPS MSCs衰老(图8E,G,H);同时,Lamin A/C免疫荧光实验和电镜实验证明槲皮素100nM处理可以减少HGPS MSCs异常细胞核数量(图8I),促使HGPS MSCs异染色质增加(图8J)。
Progerin qRT-PCR方法:
1)收集DMSO和槲皮素100nM处理的HGPS MSCs第十代细胞;
2)PBS洗一次;
3)TRIzol(Invitrogen)裂解细胞后,提取总RNA;
4)利用GoScript逆转录系统(Promega)将总RNA中的1-2μg RNA进行反转录为cDNA;
5)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)并进行分析。
使用CFX384Real-Time PCR系统(Bio-Rad),以18S做内参,数据采用ΔΔCq方法进行分析。
端粒长度检测qRT-PCR方法:
1)收集DMSO和槲皮素100nM处理的HGPS MSCs第十代细胞;
2)PBS洗一次;
3)提取总DNA;
4)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)并进行分析。
使用CFX384Real-Time PCR系统(Bio-Rad),以36B4做内参,数据采用ΔΔCq方法进行分析。
所用引物序列为:
单克隆形成实验方法:
1)收集DMSO和槲皮素100nM处理的HGPS MSC第十代细胞;
2)2000细胞/孔,铺种于12孔板,重复3次;
3)用含有DMSO或槲皮素100nM的培养基,连续培养2周;
4)PBS洗一次,进行多聚甲醛固定30分钟,PBS洗一次,结晶紫染色30分钟;
5)观察成像。
电镜方法:
1)收集DMSO和槲皮素100nM处理的5x106HGPS MSC第十代细胞;
2)1000rpm离心6分钟,去上清后,加入固定液;
3)电镜样品由中科院生物物理研究所电镜平台制备;
4)观察成像。
细胞增殖曲线、SA-β-gal实验、免疫荧光实验方法同实施例3。免疫荧光使用抗体:抗Progerin(Santa Cruz,sc-81611),抗Lamin A/C(SantaCruz,sc-7293),抗Ki67(Vector,VP-RM04)。
结果显示,与DMSO处理的HGPS MSCs相比,槲皮素100nM处理具有明显的促进细胞增殖、延缓细胞衰老、改善HGPS MSCs细胞表型的作用(图8)。
实施例6、槲皮素可以延缓人生理性衰老的牙间充质干细胞和人复制性衰老间充质干细胞衰老
SA-β-gal实验同实施例3.
结果(见图9)表明槲皮素处理可以延缓人原代牙间充质干细胞和人复制性衰老间充质干细胞衰老。
实施例7、槲皮素与VC联合应用可以更好促进儿童早衰症间充质干细胞和人生理性衰老的牙间充质干细胞增殖。
细胞增殖曲线实验方法同实施例3。
结果见图10A,10B,结果表明槲皮素100nM+VC(280μM)联合应用,具有更好促进儿童早衰症间充质干细胞和人生理性衰老的牙间充质干细胞增殖的作用。
实施例8、槲皮素在生理性衰老小鼠的运动能力检测
14月龄雄性C57BL/6小鼠在20±2℃环境下单独饲养。给予小鼠槲皮素(0.125毫克/千克体重)或仅用溶剂(10%PEG的PBS)每周口服灌胃(n=13)。每两个月测试一次体重和血糖。给药6个月后,进行转棒试验(ZH-YLS-4C,中国)测量运动耐力,动物被放置在滚动杆上,初始速度为5转/分钟,然后以加速水平(5转至40转/分)的模式进行测试。记录从转棒脱落的时间。结果(图11)显示,槲皮素灌胃组具有明显的运动耐力提升。
实施例9、槲皮素延缓衰老的作用机制研究
利用Illumina测序平台进行RNA-seq测序分析。成人早衰症间充质干细胞样品自第五代开始使用溶剂DMSO和槲皮素分别处理,在第七代进行细胞收集,提取mRNA,然后进行RNA测序分析。RNA-seq数据处理使用hisat2软件(V2.0.4)将测序读数修剪并映射到hg19人类基因组。每个基因的转录表达水平由HTSeq(V0.61)计算。差异表达基因(DEGs)使用DESeq2计算,P值(Benjamini-Hochberg)<0.05和绝对倍数变化>1.5为截断值。用皮尔森相关系数(R)对每个样品的重复性进行相关性评价。基因本体论(GO)和通路富集分析由Toppgene进行。结果(图12)显示槲皮素处理组有486个上调基因和294下调基因。生物过程富集GO-term分析发现这些上调基因主要富集在细胞周期、细胞增殖、细胞分裂、染色体分离四个方面。
Claims (3)
1.槲皮素与维生素C的组合在制备用于延缓儿童早衰症的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述槲皮素为水合物形式或纳米颗粒包裹的形式。
3.根据权利要求1所述的用途,其中槲皮素的施用浓度为100nM–300nM,维生素C的施用浓度为100μM–500μM。
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