KR101735433B1 - 담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법 - Google Patents

담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로 포도당, 콘스팁리커 및 폐효모추출액을 필수성분으로 하는 액체배지에서 배양된 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양물을 5 내지 10% 첨가하여 배양하였을 때, 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초의 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 메틸-D-글루코사이드의 수득량이 증가함을 확인함으로써, 본 발명의 펠리누스 린테우스 배양물이 첨가된 배지 조성물은 담자균 균사체의 양 및 다당체 수득량 향상을 위한 배양 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법{Culture method for increasing the amount of basidiomycete mycelium and polysaccharide}
본 발명은 담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법에 관한 것이다.
버섯은 분류학상 고등균류의 담자균류(일부는 자낭균)에 속한 것으로, 세계적으로 15,000여종이 알려져 있고, 이 중 약 2,000여종이 식용으로 개발 가능하다. 버섯은 균사체 및 그의 영양대사로 얻어지는 대사산물이 축적된 자실체로 구성된다. 균사체는 자실체의 약 4배 이상의 영양소, 약 50 내지 60배 정도의 약용성분을 더 함유하고 있으며, 최근 자실체 및 균사체의 추출물이나 균사체 배양물이 체질개선이나 각종 병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀져 건강식품이나 의약품으로서의 용도가 크게 증가하고 있는 실정이다.
특히, 버섯이 생산하는 특정 구조의 다당체는 오래전부터 면역기능을 활성화하여 면역증강효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 버섯 다당체는 일반적으로 β-1,3 글루칸(β-1,3 glucan)의 골격에 β-1,6의 가지 구조를 갖는 단일물질임에도 불구하고 생체기능에 다양한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 일본의 경우 기능성 식품으로 표고버섯 균사체 추출물이 이미 일반화되어 있으며, 또한 1992년 아가리쿠스버섯(흰들버섯) 자실체로부터 추출한 고분자 다당체가 암세포 증식 억제뿐만 아니라 류머티스 관절염이나 만성기관지염, 위염처럼 면역기능 약화가 원인인 모든 질병에 효능이 있다고 알려지면서 최근 기능성 식품으로 상품화되었다. 의약품의 경우 면역증강효과에 의한 암 치료(보조)제로 사용되고 있으며 구름(운지)버섯 배양 균사체에서 추출한 단백다당체 PSK가 항암성 면역증강제 크레스틴(Krestin)산제로, 치마버섯 균사체 배양의 배양여액에서 추출한 세포외 다당체 시조필란(Shizophyllan)이 항암성 면역증강제 시조필란(Sizofilan)주사제로 그리고 표고버섯 자실체에서 추출한 단백다당체 렌티난(Lentinan)이 항암성 면역증강제 렌티난(Lentinan)주사제로 판매되고 있다. 이처럼, 최근 다양한 버섯 균사체 추출물의 항종양작용, 면역조절 효과 및 임상실험에 의한 안정성이 입증되었으며, 따라서 각종의 산업적 응용연구가 활발히 진행되고 있다.
잎새버섯(Grifola frondosa)은 담자균문(Basidiomycota), 주름버섯강(Agaricomycetes), 구멍장이목(Polyporales), 왕잎새버섯과(Meripilaceae), 잎새버섯속(Grifola)에 속하며, 식용 버섯으로 취급되고, 면역증강기능 및 항암 효과가 우수한 것으로 알려져있다. 최근들어, 잎새버섯의 항 당뇨효과 및 혈압 강하효과 등이 새로이 보고되고 있으며, 이를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
동충하초는 겨울에는 곤충의 몸에 있다가 여름에는 풀처럼 나타난다는 데서 유래된 명칭으로, 동충하초균이 곤충의 몸에 침입하여 죽게 한 다음 그 기주의 양분을 이용하여 자실체를 형성하는 동충하초과에 속하는데, 번데기 동충하초, 풍뎅이 동충하초, 노린재 동충하초, 벌 동충하초, 거품벌레 동충하초, 눈꽃 동충하초 등의 그 종류가 매우 다양한 형태로 세계적으로 널리 분포되어 있다. 동충하초는 항암 및 면역계 활성을 증가시키는 활성을 갖고 있다고 알려져있으며, 이를 이용한 식용 및 약용으로의 이용이 많은 관심을 받고 있다.
이에 본 발명자들은 버섯의 균사체를 이용한 항암 및 면역계 활성 효과를 갖는 다당체의 개발에 필요성을 느끼고, 이를 위해 균사체 배양 조건을 개선시켜, 다당체 회수율을 증가시키는 새로운 배양방법을 개발하기 위해 노력하던 중, 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양액, 포도당, 효모추출액 및 펩톤을 유효성분으로 함유하는 담자균 배양 배지에서 배양할 때, 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 메틸-D-글루코사이드의 수득량이 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키기 위한 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양액, 포도당, 효모추출액 및 펩톤을 유효성분으로 함유하는 담자균 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 펠리누스 린테우스 배양액을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 펠리누스 린테우스 배양액, 포도당, 효모추출액 및 펩톤을 유효성분으로 포함하는 액체 배지에 담자균을 접종한 후, 배양하는 단계를 포함하는 담자균 균사체 및 이로부터 분리된 다당체 함량을 증가시키는 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 포도당, 콘스팁리커 및 폐효모추출액을 필수성분으로 하는 액체배지에서 배양된 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양물을 5 내지 10% 첨가하여 배양하였을 때, 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초의 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 메틸-D-글루코사이드의 수득량이 증가함을 확인함으로써, 본 발명의 펠리누스 린테우스 배양물이 첨가된 배지 조성물은 담자균 균사체의 양 및 다당체 수득량 향상을 위한 배양 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양액, 포도당, 효모추출액 및 펩톤을 유효성분으로 함유하는 담자균 배양용 배지 조성물을 제공한다.
상기 펠리누스 린테우스 균주는 (주)한국신약이 자연산 상황버섯으로부터 분리한 균주로 1997년 11월 17일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 0399BP로 기탁되어 있는 균주이다.
또한, 상기 배지 조성물은 전체 배지 조성물 100 중량부에 대하여, 펠리누스 린테우스 배양액 4 내지 12 중량부, 포도당 2 내지 10 중량부, 효모추출액 0.2 내지 2 중량부 및 펩톤 0.1 내지 1.0 중량부인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 배지 조성물은 전체 배지 조성물 100 중량부에 대하여, 펠리누스 린테우스가 5 내지 20 중량부 포함되는 것이 바람직하고, 펠리누스 린테우스가 5 내지 15 중량부 포함되는 것이 더욱 바람직하며, 펠리누스 린테우스가 4 내지 12 중량부로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 펠리누스 린테우스를 5 중량부 미만으로 포함하면 담자균 균사체 및 다당체 회수 효율이 떨어질 수 있고, 20 중량부를 초과하여 포함하면 생산 단가를 높이게 되어 좋지 않다.
또한, 상기 펠리누스 린테우스 배양액을 얻기 위하여, 펠리누스 린테우스 균주를 한천배지를 이용하여 계대 배양하는데, 이때 YMG 배지, PSA(potato sucrose agar)배지, PDA(potato dextrose agar)배지, MEA(malt extract agar)배지, QEA(quercus extract agar)배지, PEA(poplar extract agar)배지, RBEA(rice bran extract agar)배지, WBEA(wheat bran extract agar)배지, MCM(mushroom complete medium)배지, CDA(Czapedox agar)배지, SCA(Spawn complex agar)배지, OMA(oatmeal agar)배지 등이 이용될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 YMG 배지를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 펠리누스 린테우스 배양액은 포도당 2 내지 10%, 콘스팁리커 0.2 내지 5%, 폐효모추출액 0.1 내지 1.0%를 필수성분으로 하는 액체배지에서 3일 동안 배양하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 배지 조성물은 탄소원으로 포도당뿐만 아니라 대두유, 자당, 맥아추출물 및 물엿 등을 사용할 수 있고, 질소원으로 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 유레아 등의 유ㆍ무기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 바람직하게는 0.1 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이를 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온ㆍ고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 배지 조성물은 보조 탄소원을 추가적으로 포함하여 제조될 수 있다. 보조 탄소원은 담자균의 생육에 있어 필수적인 성분은 아니나 담자균의 생육 및/또는 담자균의 다당체 생성 과정을 촉진시키기 위하여 첨가되는 성분으로 예컨대 젖산, 구연산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 에탄올, 포름산, 말산, 피부르산 등이 사용될 수 있으며, 나아가 이들 성분 중 하나 이상을 본래 포함하고 있거나 이들 성분 중 하나 이상의 성분이 인위적으로 첨가된 감즙(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006), 감식초(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006), 사과즙(Lee OS, et al., J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 31(4), 572-577, 2002), 포도즙(Son CJ, et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12(5), 722-728, 2002), 맥주 폐액(Park JK, et al., Kor Chem Eng Res., 44(1), 52-57, 2006), 코코넛 부산물(Jonas R, et al., Polym Degrad Stab., 59, 101-106, 1998), 파인애플 과즙(일본 특허출원 제1999-299034호 참조), 감귤 착즙박 등을 들 수 있다.
또한, 상기 배지 조성물은 무기염류와 미량원소를 추가로 포함하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 무기염류로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있으며, 미량원로소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 아황산 펄프 폐액 등을 들 수 있다. 이들 무기염류와 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.
또한, 상기 담자균은 잎새버섯, 동충하초, 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 목이버섯, 영지버섯 및 눈꽃송이 버섯으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 배지 조성물은 담자균 균사체 및 이로부터 분리된 다당체의 양을 증가시키며, 상기 다당체는 α-메틸-D(+)-글루코사이드(α-Methyl-D(+)-glucoside)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 포도당, 콘스팁리커 및 폐효모추출액을 필수성분으로 하는 액체배지에서 배양된 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양물을 5 내지 10% 첨가하여 배양하였을 때, 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초의 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 메틸-D-글루코사이드의 수득량이 증가함을 확인함으로써(표 2 내지 표 4 참조), 본 발명의 펠리누스 린테우스 배양물이 첨가된 배지 조성물이 담자균 균사체의 양 및 다당체 수득량 향상을 위한 배양 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은,
1) 펠리누스 린테우스 배양액을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 펠리누스 린테우스 배양액, 포도당, 효모추출액 및 펩톤을 유효성분으로 포함하는 액체 배지에 담자균을 접종한 후, 배양하는 단계를 포함하는 담자균 균사체 및 이로부터 분리된 다당체 함량을 증가시키는 배양 방법을 제공한다.
상기 펠리누스 린테우스 배양액은 YMG 고체 배지에 계대 배양하여 일주일 동안 배양한 후, 액체 YMG 배지에 무균 접종하여 하루 동안 배양하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 펠리누스 린테우스 배양액은 YMG 배지에 무균 접종한 후, 포도당 2 내지 10%, 콘스팁리커 0.2 내지 5%, 폐효모추출액 0.1 내지 1.0%를 필수성분으로 하는 액체배지에서 3일 동안 배양하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 배양은 배양기 내에서 온도 28 내지 30℃, 회전수 200 내지 300 RPM, 공기량 1.0 내지 3.0 ℓ/분으로 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 다당체의 분리는 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초를 배양한 후, 배양여액과 균사체를 분리하고, 배양 여액을 농축한 후, 알코올을 이용하여 다당체를 추출하고, 상기 다당체를 물에 용해시켜 불용물을 제거하여 순수한 다당체를 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 포도당, 콘스팁리커 및 폐효모추출액을 필수성분으로 하는 액체배지에서 배양된 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양물을 5 내지 10% 첨가하여 배양하였을 때, 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초의 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 메틸-D-글루코사이드의 수득량이 증가함을 확인함으로써(표 2 내지 표 4 참조), 본 발명의 펠리누스 린테우스 배양물이 첨가된 배지 조성물이 담자균 균사체의 양 및 다당체 수득량 향상을 위한 배양 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 펠리누스 린테우스 배양액의 제조
담자균의 균사체 및 다당체 양을 증가시키는 배지 조성물로써 사용하기 위하여 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양액을 제조하였다.
구체적으로, 펠리누스 린테우스 균주는 자연산 상황버섯에서 분리된 균주이며, 수탁번호 KCTC 0399BP로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다. 상기 펠리누스 린테우스를 YMG 고체 배지에 계대하여 29 ± 1℃ 인큐베이터에서 일주일 동안 배양하였다. 상기 배양된 펠리누스 린테우스 고체 배지에 코르크 블러를 사용하여 블럭을 만든 후, 블럭 10 내지 20개를 200 ㎖ YMG 액체배지가 담긴 1 ℓ 플라스크에 무균 접종하여 29 ± 1℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 하루 동안 배양하였다. 그리고나서, 포도당 2 내지 10%, 콘스팁리커 0.2 내지 5%, 폐효모추출액 0.1 내지 1.0%를 필수성분으로 하는 액체배지 3 ℓ를 초기 pH 5.0으로 맞춘 후, 멸균하고, 하루 동안 배양한 상기 펠리누스 린테우스를 접종하여 29 ± 1℃, 250 RPM, 공기량 2.0 ℓ/분으로 3일 동안 배양함으로써 펠리누스 린테우스 배양액을 제조하였다.
< 실험예 1> 펠리누스 린테우스 배양물을 이용한 균사체 및 다당체의 수득이 향상된 담자균의 배양 방법
<1-1> 펠리누스 린테우스의 배양
상기 <실시예 1>에서 제조한 펠리누스 린테우스 배양액을 이용하여 펠리누스 린테우스를 배양하여 균사체의 양 및 다당체 회수율을 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>의 배양물을 포도당 2 내지 10%, 콘스팁리커 0.2 내지 5%, 폐효모추출액 0.1 내지 1.0%를 필수성분으로 하는 액체배지에 5% 또는 10% 첨가하고 pH 5.0으로 맞춘 후 이를 3 ℓ로 만들어 배양기에 멸균하였다. 그런 다음, 하루 동안 배양한 펠리누스 린테우스를 접종하여 29 ± 1℃, 250 RPM, 공기량 2.0 ℓ/분으로 3일 동안 배양하였다. 상기 배양된 펠리누스 린테우스 균사의 양 및 균사체를 열수 추출하여 얻은 다당체의 회수율, 다당체의 성분 중 α-메틸-D(+)-글루코사이드(α-Methyl-D(+)-glucoside)의 양을 비교 분석하였다.
균사체 양 측정 방법은 균사건조중량(Mycelium Dry Weight) 방법을 이용하여 측정하였다. 배양 후 회수한 배양물을 균일하게 섞어 일정량을 필터 페이퍼(Filter paper)를 이용하여 여과(filtering)한 후 분리된 균사체를 3회에 걸쳐 물로 세척하여 여과하였다. 마지막으로 여과된 균사체를 60℃에서 12시간 건조시켜 균사의 무게에 변화가 없을 때의 무게를 측정무게로 하여 1 ℓ당 균사건조중량으로 나타내었다.
다당체 회수 방법은 균사체의 열수추출을 통해 얻어진 열수추출물을 농축하고, 에탄올 침전을 이용하여 얻었다. 물로 세척하여 여과된 균사체에 5 내지 10배수의 물을 첨가하여 섞어준 후 열수 추출이 가능한 플라스크에 담아 냉각관이 연결된 항온 수조에서 90 내지 100℃ 온도에서 3 내지 6시간 동안 열수추출 하였다. 추출이 끝나면 상온에서 식힌 열수추출물을 필터 페이퍼를 이용하여 2번 여과하였다. 여과된 균사체 열수추출물을 8 내지 10배 농축하고 농축된 농축물의 2 내지 4배 에탄올을 교반시키며, 천천히 부어 침전을 시켜 4℃에서 12시간 방치하였다. 그런 다음, 원심분리기를 이용하여 5000 내지 10000 rpm에서 10 내지 20분 원심분리하여 침전물을 분리하고, 분리된 침전물을 회수하여 물에 녹인 후 동결건조하여 다당체를 회수하였다.
α-메틸-D(+)-글루코사이드 수득량 분석 방법은 검액 및 표준액을 조제하여 G-C법에 따라 시험하였다. 구체적으로 검액 조제를 위해, 회수된 다당체 20 ㎎을 20 ㎖ 플라스크에 넣고, 메탄올성 0.75 N 염산 시액 2 ㎖을 넣은 후, 80±5℃의 항온 수조에서 24시간 반응 시켰다. 상기 반응액을 실온에서 냉각 후, 여과하여 그 여액을 60℃에서 감압농축 시킨 후, 상기 잔사에 메탄올 2 ㎖을 넣고 완전히 용해시키고, 다시 60℃에서 감압농축하였다. 상기 잔사에 무수피리딘 1 ㎖을 넣어 녹이고, TMCS 0.1 ㎖ 및 HMDS 0.2 ㎖를 넣고 3분 간격으로 진탕한 후, n-Hexane 1 ㎖을 가하여 검액을 조제하였다. 표준액 조제를 위해, 시판하는 α-메틸-D(+)-글루코사이드 시약 20 ㎎을 정확히 칭량한 후, 무수피리딘 1 ㎖을 넣어 녹이고, TMCS 0.1 ㎖ 및 HMDS 0.2 ㎖를 넣고 3분 간격으로 진탕한 후, n-Hexane 1 ㎖을 가하여 표준액을 조제하였다. 상기의 검액 및 표준액을 가지고 하기 표 1의 조건에서 G-C법에 따라 시험하여 얻어지는 피이크 중 RT 7.5 내지 8.5사이의 피크의 면적을 하기 수학식으로 계산하였다.
아이템 작동 조건
분석기기 Shimadzu GC-9A
Column 3% SE-30 Chromosorb-W(AW-DMCS) 60/80mesh 2m Glass Column
Detector 수소불꽃 이온화검출기(감도 102)
Temp. Column temp. 180℃→220℃
Initial time 0min
Program rate 2.5℃/min
Final time 30min
Injection temp. 250℃
Carrier gas N2 30ml/min
Chart speed 5mm/min
Inj. Vol. 5㎕
Figure 112015071574059-pat00001
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 펠리누스 린테우스 배양물을 첨가한 배지 조건에서 균사체의 양 및 다당체 회수율(%)이 증가하고, α-메틸-D(+)-글루코사이드 수득량이 증가함을 확인하였다(표 2).
배지 조건 초기 pH 최종 pH 건조균체량
(M.D.W, g/ℓ)		 다당체 회수율(%) α-Methyl-D(+)-glucoside (㎎/g)
대조군 5.0 5.36 9.5 8.3 40.9
펠리누스 린테우스 배양물 5% 첨가 5.0 4.71 13.1 10.2 53.1
펠리누스 린테우스 배양물 10% 첨가 5.0 4.69 14.0 11.7 55.2
펠리누스 린테우스 배양물 15% 첨가 5.0 4.67 14.1 11.7 55.3
펠리누스 린테우스 배양물 20% 첨가 5.0 4.68 14.0 11.5 54.7
<1-2> 잎새버섯의 배양
담자균의 일종인 잎새버섯에서 상기 <실시예 1>에서 제조한 펠리누스 린테우스 배양액을 이용하여 배양하였을 때 균사체 및 다당체 양이 증가하는지 확인하였다.
구체적으로, 잎새버섯을 YMG 고체 배지에 계대하여 29 ± 1℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였다. 배양된 잎새버섯을 고체 배지에 코르크 블러를 사용하여 블럭을 만든 후, 블럭 10 내지 20개를 200 ㎖ YMG 액체배지가 담긴 1 ℓ 플라스크에 무균 접종하여 29 ± 1℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 3일 동안 배양한 뒤, 이를 포도당 2 내지 10%, 효모추출액 0.2 내지 2%, 펩톤 0.1 내지 1.0%을 필수 성분으로 하는 액체배지 3 ℓ에 상기 <실시예 1>의 펠리누스 린테우스 배양물을 첨가한 후, 초기 pH 5.0으로 맞춰 멸균한 배지에 접종하여 29 ± 1℃, 250 RPM, 공기량 2.0 ℓ/분으로 3일 동안 배양하였다. 상기 배양된 잎새버섯의 균사체 량 및 균사체를 열수 추출하여 얻은 다당체의 회수율, 다당체의 성분 중 α-메틸-D(+)-글루코사이드의 양을 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 비교 분석하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 펠리누스 린테우스 배양물을 첨가한 배지 조건에서 균사체 양 및 다당체 회수율이 증가함을 확인하였다(표 3).
배지 조건 초기 pH 최종 pH 건조균체량
(M.D.W, g/ℓ)		 다당체 회수율(%) α-Methyl-D(+)-glucoside (㎎/g)
대조군 5.0 4.11 10.7 5.3 42.7
펠리누스 린테우스 배양물 5% 첨가 5.0 4.40 14.9 8.3 46.2
펠리누스 린테우스 배양물 10% 첨가 5.0 4.58 15.5 8.7 46.9
펠리누스 린테우스 배양물 15% 첨가 5.0 4.57 15.4 8.6 46.8
펠리누스 린테우스 배양물 20% 첨가 5.0 4.58 15.4 8.1 46.9
<1-3> 동충하초의 배양
잎새버섯 이외의 다른 담자균인 동충하초에 상기 <실시예 1>에서 제조한 펠리누스 린테우스 배양액을 이용하여 배양하였을 때 균사체 및 다당체 양이 증가하는지 확인하였다.
구체적으로, 동충하초를 YMG 고체 배지에 계대하여 29 ± 1℃ 인큐베이터에서 15일 동안 배양하였다. 배양된 동충하초를 고체 배지에 코르크 블러를 사용하여 블럭을 만든 후, 블럭 10 내지 20개를 200 ㎖ YMG 액체배지가 담긴 1 ℓ 플라스크에 무균 접종하여 29 ± 1℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 3일 동안 배양한 뒤, 이를 포도당 2 내지 10%, 효모추출액 0.2 내지 2%, 펩톤 0.1 내지 1.0%을 필수 성분으로 하는 액체배지 3 ℓ에 상기 <실시예 1>의 펠리누스 린테우스 배양물을 첨가한 후, 초기 pH 5.0으로 맞춰 멸균한 배지에 접종하여 29 ± 1℃, 250 RPM, 공기량 2.0 ℓ/분으로 3일 동안 배양하였다. 상기 배양된 동충하초의 균사체 량 및 균사체를 열수 추출하여 얻은 다당체의 회수율, 다당체의 성분 중 α-메틸-D(+)-글루코사이드의 양을 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 비교 분석하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 펠리누스 린테우스 배양물을 첨가한 배지 조건에서 균사체 양이 증가하고, 다당체 회수율 및 α-메틸-D(+)-글루코사이드 수득량이 증가함을 확인하였다(표 4).
배지 조건 초기 pH 최종 pH 건조균체량
(M.D.W, g/ℓ)		 다당체 회수율(%) α-Methyl-D(+)-glucoside (㎎/g)
대조군 5.0 5.15 9.1 8.9 35.7
펠리누스 린테우스 배양물 5% 첨가 5.0 5.18 12.7 12.4 56.1
펠리누스 린테우스 배양물 10% 첨가 5.0 5.21 13.5 12.7 57.4
펠리누스 린테우스 배양물 15% 첨가 5.0 5.20 13.4 12.6 56.9
펠리누스 린테우스 배양물 20% 첨가 5.0 5.19 13.2 12.3 56.1
또한, 표 2 내지 표 4에 나타난 바와 같이, 펠리누스 린테우스, 잎새버섯 및 동충하초 배양에서 펠리누스 린테우스 배양물을 10% 이상 첨가하였을 경우, 균사체 양, 다당체 회수율 및 α-메틸-D(+)-글루코사이드 수득량이 더 이상 증가하지 않았으며 오히려 효율이 더 떨어지는 것을 확인함으로써, 펠리누스 린테우스 배양물을 5 내지 10% 첨가하는 것이 최적의 효율을 나타냄을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC0399BP 19971117

Claims (10)

1) 수탁번호 KCTC 0399BP로 기탁된 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 배양액을 제조하는 단계;
2) 전체 액체 배지 100 중량부에 대하여 상기 단계 1)의 펠리누스 린테우스 배양액 4 내지 12 중량부, 포도당 2 내지 10 중량부, 효모추출액 0.2 내지 2 중량부 및 펩톤 0.1 내지 1 중량부를 포함하는 액체 배지를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 액체 배지에 동충하초를 접종하여 배양하는 단계;
를 포함하는, α-메틸-D(+)-글루코사이드(α-Methyl-D(+)-glucoside)의 함량을 증가시키는 동충하초의 배양 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 2 내지 4일 동안, 27 내지 31℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
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