KR20010049921A

KR20010049921A - 발아활성화된 적색 가노데마 루시덤 포자 및 그것을생산하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20010049921A
Application number: KR1020000043727A
Authority: KR
Inventors: 지안 리우; 치경 정
Original assignee: 지안 리우; 치경 정
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2001-06-15
Also published as: EP1092765A3; US6316002B1; US20010031265A1; JP2001169774A; US6468542B2; EP1092765A2

Abstract

본 발명은 면역장애, 암, 에이즈, 간염, 당뇨병 및 심장혈관 질환을 갖는 환자에게 약효가 있고, 자유라디칼 산화 및 간-독성 효과을 예방하거나 억제할 수 있는 생물활성 물질들을 생산하는 적색 가노데마 루시덤(Ganoderma lucidum) 포자의 발아활성 방법을 설명한다. 본 방법은 세 단계로 세분할 수 있다. 첫번째 단계에서는, 발아를 유도하기 위해 용액에 포자를 침지시키고, 생물활성 물질의 합성을 유도하기 위해 배양박스에 발아처리된 포자들을 넣으며, 포자들의 세포벽을 연화시키는 것을 포함하는 발아활성화 방법이 도입된다. 두번째 단계에서는, 포자외피(epispore)에 세포벽 분해효소 및/또는 기계적인 힘을 가하여 포자벽-분해(sporoderm-broken) 가노데마 포자들을 채취한다. 마지막 단계에서는, 포자벽-분해 포자들을 저온에서 건조하고 추출하여 생물활성 물질들을 포자벽-분해 포자들로부터 추출한다.

Description

발아활성화된 적색 가노데마 루시덤 포자 및 그것을 생산하기 위한 방법{Germination activated red Ganoderma Lucidum spores and method for producing the same}

관련발명

본 발명은 1999년 10월 12일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 60/158,377호에 의한 우선권을 주장하고, 본 명세서에서 참고자료로 통합되어져 있다.

본 발명의 분야

본 발명은 발아활성화된 적색 가노데마 루시덤 Leyss ex Fr. Karst. 포자로부터 추출된 생물활성 물질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 생물활성 물질을 배양 및 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 면역장애, 암, 에이즈, 간염, 당뇨병 및 심장혈관 질환을 갖는 환자 또는 포유동물을 치료하기 위하여, 발아활성화된 가노데마 포자에 의해 생산된 생물활성 물질의 사용 및 사용방법에 관한 것이다. 또한, 생물활성 물질은 자유라디칼 산화 및 간-독성 효과을 예방하거나 또는 저해하는데 사용할 수 있다.

발명의 배경기술

가노데마(가노데마 루시덤 Leyss ex Fr. Karst)은 다공성균류(polyporous fungus)이다. 상기 가노데마 루시덤은 바시디마이세츠(Basidiomycetes) 강, 폴리포라세애(polypolaceae) 과, 가노데마 속에 속한다. 고대로부터, 가노데마는 인간의 생명을 연장시키는 능력때문에, 기적의 균류라는 칭송을 받아왔다. 가노데마의 약효는 병을 치료하기 위해 인체의 신경-엔도크린-면역 시스템을 자극하거나 변형시킬 수 있는 천연 또는 생물활성 물질을 가노데마가 생산하기 때문이라고 믿어진다. 또한, 가노데마는 항종양 및 면역 강화 특성(Kim et al., Int.J.Mol.Med.(1999), 4(3):273-277), 심장혈관 효과(Lee et al., Chem.Pharm.Bull.(1990),38:1359-1364) 뿐만 아니라, 자유라디칼 제거(scarvenging) 및 항-간독성 활성(Lin et al., J.Ethnopharmacol.,(1995),47(1):33-41)이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 가노데마로부터 추출된 두 물질들이 특히 가노데마의 약효에 관련하여 보고되어 있다. 그것들은 트리터펜 및 폴리사카라이드이지만, 이들 물질들의 약효에 대한 주장을 지지할 수 있는 임상학적 증거는 제공되고 있지는 않다(Mekkawy et al., Phytochemistry,(1998),49(6):1651-1657;Wasser et al.,Crit.Rev.Immunol., (1999),19(1):65-96).

가노데마는 중국의 약 중에서 매우 희귀하고, 가치있는 약초이다. 가노데마는 중국에서 "링찌(ling zhi)"로서 5,000년 이상에 걸쳐 알려져왔다. 예를 들면, G..루시덤(G..lucidum)(적색), G..애플라나툼(G..applanatum)(갈색), G..쭈개(G.. tsugae)(적색), G..시넨스(G..sinence)(흑색), 및 G..오레곤넨스(G..oregonense)(어두운 갈색)의 다양한 가노데마들이 있다. 그러나, 가노데마의 야생형은 단지 경사가 가파른 산 중의 고목에서만 천연적으로 매우 드물게 성장하기 때문에, 다량 및 고품질의 가노데마의 일정한 공급이 요구되는 연구가 거의 수행되지 못해왔다.

최근에 들어, 인공 배양 기술의 발전이 이루어지면서, 가노데마 루시덤 (Fr.) Karst의 인공 배양 방법이 개발되었다(예를 들면, 미국특허 제 4,472,907호를 참조). 새롭게 개발된 배양방법은 연구자들이 연구에 필요한 충분한 량의 가노데마를 생산하는 것을 가능하게 한다.

비록 가노데마 포자는 가노데마의 모든 생물활성 물질들을 함유하기 때문에 가노데마의 정수(精髓)로써 믿어지지만, 가노데마 연구들의 대부분은 실험물질로써 가노데마의 과실체(fruit body) 또는 균사체(mycelium)를 사용하여 수행한다. 가노데마의 포자는 거의 연구되지 않았다.

가노데마 포자들은 매우 딱딱하고, 탄력을 갖는 이중-층 포자외피(epispore)를 갖는 작고 먼지-같은(mist-like) 5∼8㎛의 포자들이기 때문에, 분해하기 어렵다. 일반적으로 가노데마 포자들은 성숙한 가노데마의 갓(pileus)에서 비산(飛散)된다. 성숙기 때, 가노데마 포자들은 갓으로부터 분출된다. 그러한 분출된 가노데마 포자들은 일반적으로 "포자분말"라고 부른다. 야생에서, "포자분말"은 다음과 같은 이유들 때문에 채취하기 어렵다: (1) 포자의 발아율이 매우 낮은 점(즉, 약 3-15%); (2) 분출주기가 비교적 짧은 점(즉, 생활환(life cycle)마다 약 10일); 및, (3) 바람 및 비와 같은 몇몇 환경적인 요인이 포자의 수집을 방해시킨다는 점.

더구나, 수집된 포자의 물질들은 포자외피의 탄력성 때문에 추출하기 어렵다.

최근 몇 년 동안에, 가노데마 루시덤 포자의 세포벽을 분해시키는 방법들에 대해 개시한 보고들이 있었다. 예를 들면, JP 52041208에 세포막의 효과적인 기계적 분해에 의한, "쉬이테이크(shiitake)" 포자들에서 효과적인 성분 추출을 개시하였다. JP 2240026A에는 가노데마 포자들을 분해할 수 있는 용매의 사용을 개시하였다. CN 1134306에는 물 침지, 공기-건조 및 전자파 가열처리를 결합시켜, 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자화분(sporopellen)을 생산하는 방법을 개시한다. CN 1165032에는 라이소자임, 스네일 효소(snail enzyme), 셀룰라제 및 헤미셀룰라제와 같은 표피-용해 효소를 가지고 가노데마 루시덤 포자분말의 표피를 분해한 후, 동결한 다음, 효소를 녹인 용액(enzymolyzed solution) 및 초음파로 용해하는 방법을 개시한다.

포자 분해 기술이 향상되면서, 가노데마 포자에 대해 더 많은 연구가 시작되었다. 그러나, 포자 분해 기술들의 향상은 포자의 낮은 발아율의 결점을 극복하지 못한다. 실제로, 낮은 발아율 때문에, 가노데마 포자에 대한 대부분의 연구들은 다양한 발아단계 내에서 휴지기(休止基) 상태의 포자로부터 생물활성 물질들의 추출물을 사용하여 수행되었다.

생활환 중 다른 단계에 있는 포자들은 다른 종류 및/또는 생물활성 물질의 다른 비율을 생산하기 때문에, 각 일단(一團)의 포자 혼합물마다 다른 활성의 함유물들을 함유한다. 그러한 연구에 의한 결과들은 적당한 기준들(controls)을 제공할 수 없기 때문에 명백히 의미가 없다.

하기에 나타낸 본 발명에서, 발아활성 방법을 소개할 것이다. 본 방법은 휴지기 상태의 가노데마 포자들을 성공적으로 활성화시킬 수 있고, 가노데마 포자들의 발아율을 95%이상으로 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 포자에서 생물활성 물질의 고회수(高回收)를 가능하게 할 뿐만 아니라, 생물활성 물질의 기능적 활성을 성공적으로 보존할 수 있는 독특한 포자 분해방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 면역장애, 암, 에이즈, 간염, 당뇨병 및 심장혈관 질환을 갖는 환자 또는 포유동물을 치료하는데 있어서, 발아활성화된 가노데마 포자들에서 추출된 생물활성 물질의 중요성을 입증하는 임상학적 연구들을 제공한다. 또한, 생물활성 물질들은 자유라디칼 산화 및 간-독성 효과를 예방 또는 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 적색 가노데마 루시덤 포자들의 발아율을 현저하게 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다. 적색 가노데마 루시덤의 휴지기 포자가 발아에 의해 활성화될 때, 그것들은 그 종류에 있어서 특별히 한정되지는 않지만, 활성화 유전자들 및 프로모터들, 활성화 효소들, 스테롤들, 사이토킨들, 인터페론들, 락톤 A, 가노데마산 A, 트리터펜들, 폴리사카라이드들, 비타민들, 수퍼옥사이드 디스무타제들(SOD), 비타민 E, 글리코프로테인들, 성장인자들 등을 함유하는 생활성 물질들을 생산한다. 이들 생물활성 물질들은 전체적으로 우수한 약효를 나타낸다.

본 발명의 방법은 발아를 유도하기위해 용액에 가노데마 포자들을 침지시키는 것을 요구한다. 이러한 목적으로 사용되는 용액은 맑은 또는 증류시킨 물, 식염수 및 어떤 영양용액을 포함한다. 영양용액의 예는 코코넛 쥬스, 1∼5%의 맥아추출액, 0.5∼25%의 가노데마 조포낭(sporocarp) 또는 캐필리티아(capillitia)의 추출물, 비오틴을 함유한 0.1∼5%의 배양액, 1염기성(monobasic) 포타슘 포스페이트 및 마그네슘 설페이트를 함유한 0.1∼3%의 배양액을 포함한다. 가노데마 포자 중량의 0.1∼5배의 첨가량으로, 상기 나열된 영양 용액들 중 하나 이상을 사용할 수 있다. 포자들을 30분∼8시간 동안 20∼43℃의 온도에서, 바람직하게는 2∼4시간 동안 25∼35℃ 사이의 온도에서 용액에 침지시킨다.

발아 유도된 가노데마 포자들은 생물활성 물질들의 합성을 활성화시키기 위해 일정한 온도 및 일정한 습도로 조절이 되고, 통풍이 잘되는 배양박스에 넣는다. 상대습도는 65∼98%, 바람직하게는 85∼97%이고, 및 온도는 18∼48℃, 바람직하게는 25∼35℃이다.

또한, 본 발명은 포자벽-분해 가노데마 포자들을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 포자들의 세포벽을 용해시킬 수 있는 효소, 또는 기계적인 힘 또는 둘 다를 가지고, 발아활성화된 가노데마 포자들에 처리하는 것을 요구한다. 분해효소들의 예들로는 키티나제 또는 셀룰라제를 포함한다. 기계적인 힘의 형태들은 미분화 (micronization), 롤 프레싱(roll pressing), 분쇄, 초음파 및 초고압력 미세증기(microstream)처리를 포함한다. 효소분해와 함께 하나 이상의 기계적인 힘의 결합이 바람직하다.

또한, 본 발명은 발아활성화된 가노데마 포자들로부터 생물활성 물질들을 추출하는 방법을 더 제공한다. 본 방법은 포자벽-분해 가노데마 포자들을 저온에서 건조한 다음, 건조된 포자벽-분해 가노데마 포자들을 용매로 추출을 하는 것이 요구한다. 건조 방법은 동결-건조(freeze-drying) 또는 진공-건조(vacuum-drying)일 수 있다. 생물활성 물질들은 물에 의해 또는 알콜, 에테르, 아세톤 등의 유기용매에 의해, 또는 둘다에 의해 추출될 수 있다. 또한, 그것들은 박막 응축(thin film condensation)에 의해서 추출될 수 있다.

포자벽-분해 가노데마 포자 또는 추출된 생물활성 물질들은 환자들 또는 포유동물들에 경구투여될 수 있도록, 종래의 어떠한 약물전달시스템으로 제형화될 수 있다.

게다가, 본 발명은 면역 장애, 암, 에이즈, 간염, 당뇨병, 심장혈관 질환, 및 박테리아성 또는 바이러스성 간염을 갖는 환자들을 치료하기 위한 생물활성 물질들을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 자유라디칼 산화를 예방하고, 간-독성 효과을 억제하기 위해 생물활성 물질을 사용하는 방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 면역학적 장애(다중 경화, 근육 경직 및 근육 디스트로피를 포함한 신경시스템 및 신경근육 조직의 기능장애), 암, 간염, 당뇨병, 심장혈관 질환, 및 박테리아성 또는 바이러스성 간염 치료제로써 생물활성 물질들의 사용을 제공한다. 생물활성 물질들은 항산화제 및 항-간독성제로써 사용될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명

가노데마 루시덤의 작은 포자는 매우 딱딱하고, 탄력적인 이중층 포자외피를 갖는다. 야생에서, 가노데마 루시덤의 포자 발아는 비교적 느리며, 그들의 발아율은 극도로 낮다. 실제로, 적당한 조건하에서 포자의 발아관(germ tube)이 발아를 시작하는 데 24∼48시간 걸리고, 캐필리티아는 72시간 후에 가지를 형성하며, 발아율은 단지 3∼15%이다.

본 발명의 방법을 사용하여, 적색 가노데마 루시덤의 성숙한 포자들은 처리과정을 수행하여 선택된다. 포자 처리과정에는 3개의 뚜렷한 단계들이 있다. 이 과정의 목적은 발아활성화된 포자들에 의해 생산된 많은 양의 생물활성 물질들을 효과적으로 보존하는 것이다. 첫번째 단계는 일정 시간의 기간동안 용액 내에 포자들을 침지하는 것에 의해 달성될 수 있는 발아를 유도하고, 발아 유도된 포자를 통풍이 잘되는 배양박스에서 배양하는 것을 포함한다. 두번째 단계는, 효소 처리 및/또는 기계적 힘에 의해 성취될 수 있는 포자벽-분해(즉, 포자외피의 세포벽을 부수는 것에 의해) 포자의 생산을 포함한다. 마지막 단계는 동결-건조 또는 진공 건조한 다음, 용매추출 또는 박막 응축에 의해 달성될 수 있는 포자벽-분해 포자로부터 생물활성 물질의 추출을 포함한다.

이하, 생물활성 물질들의 생산을 이끌기 위한 본 발명의 단계를 일반적으로 설명한다.

I. 발아유도를 위한 침지: 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자들을, 발아유도하기 위한 침지 과정을 수행하기 위하여 신중하게 선택했다. 포자들을, 적색 가노데마 루시덤 포자들을 빠르게 발아시킬 수 있는 맑은 또는 증류시킨 물, 생물학적 식염수, 또는 다른 영양용액에서 유지시켰다. 영양용액의 예로는 코코넛 쥬스 또는 1∼5%의 맥아추출용액, 0.5∼25%의 가노데마 루시덤 조포낭 또는 가노데마 루시덤 캐필리티아, 비오틴을 함유한 0.1∼5%의 배양액, 포타슘 포스페이트(1 염기성) 및 마그네슘 설페이트를 함유한 0.1∼3%의 배양액을 포함한다. 용액의 선택은 요구되는 침지시간, 처리할 포자의 양 및 물질 이용성과 같은 다른 인자들에 따라 적의 선택된다. 상기 발아용액 중 하나 이상이 적색 가노데마 루시덤 포자 무게의 0.1∼5배의 첨가량으로 사용될 수 있었다. 침지시간은 물의 온도에 따라 결정되고, 일반적으로 침지는 20∼43℃의 수온에서 30분∼8시간동안 수행했다. 바람직한 침지시간은 2∼4시간이었고, 수온은 25∼35℃이었다.

Ⅱ. 활성 배양 : 적색 가노데마 루시덤의 포자들을 침지 용액으로부터 꺼내고, 과도한 용액은 적하하여(drip) 제거하였다. 그런 다음, 포자들을, 일정 온도 및 습도를 가지고, 통풍이 잘되는 배양박스에 넣어서 포자활성 배양을 수행하였다. 배양의 상대습도는 일반적으로 65∼98%로 맞추었고, 배양온도는 18∼48℃로, 및 배양시간은 30분∼24시간을 유지하였다. 본 발명에 의해 제공된 방법을 사용하여서, 적색 가노데마 루시덤의 포자활성이 95%이상의 비율에 도달했다. 활성 동안, 적색 가노데마 루시덤 포자의 세포벽들은 분명하게 연화되어, 포자의 세포벽을 침투하는 것이 쉬워졌다.

Ⅲ. 포자외피의 처리 : 발아활성 과정 후, 포자들을 효소분해 처리하였다. 이 과정은 저온 및 효소 활성이 유지되는 조건에서, 산업계에서 통상적으로 사용하는 키티나제, 셀룰라제 또는 다른 효소들을 사용하여 수행하였다. 이 과정은 포자외피가 탄력성을 잃고, 흐물흐물해질(brittle) 때 완료한다. 선택적으로, 물리학적 처리로, 예를 들면, 미분화, 롤 프레싱, 분쇄, 초음파 및 초고압력 미세증기 처리 및 산업계에서 통상적으로 사용되는 다른 기계적 방법으로 수행하여 세포벽을 침투시켰고, 침투율은 99% 이상이다.

Ⅳ. 건조 또는 추출 : 건조는 산업계에서 통상적으로 사용되는 동결-건조 또는 진공 건조 등을 포함하는 표준방법을 사용하여, 저온에서 수행하였다. 얻어진 생성물은 4% 이하의 수분함량을 가졌다. 건조 후, 물 또는 알콜에 의해, 또는 박막 응축에 의해 생물활성 물질이 추출되었다. 추출된 생물활성 물질들은 최종 생성물에서 오염물질이 없도록 하기 위해서 투석을 하여 더 정제하였다.

Ⅴ. 생물활성 물질들의 약제학적 제형들 : 그런 다음, 생물활성 물질들은 정제된 분말, 추출물 페이스트(extract paste), 주사용액, 또는 경구 복용제로 만들어질 수 있다. 또한, 본 발명은 잘 알려진 부형제(賦形劑) 및 당업계에서 알려진 제조방법을 사용하여, 생물활성 물질의 약제학적 제제들의 제조를 포함한다. 게다가, 생물활성 물질들은 그 종류가 특별히 한정되지는 않지만, 정제(錠劑, tablet), 캡슐, 용액, 좌약(坐藥), 비강 분무, 또는 주사 장치들을 포함하는 편리한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여방법의 선택은 환자의 병상에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에서 설명된 방법에 의해 생산된, 본 발명의 생물활성 물질은 활성화 유전자들, 생물적으로 가능한 프로모터 유도자들, 다세포 활성자의 유도자, 인터페론 유도자들, 락톤 A, 가노데마 폴리사카라이드, 가노데마 포자 지방산들, 가노데마 포자 긴사슬 알킬 탄화수소들, 가노데마 트리터펜들, 스테롤들, 수퍼옥시드 디스무타제, 비타민 E, 활성화 글리코프로테인, 특정 성장인자들, 가노데마산 A, 수퍼옥시드 디스무타제들(SOD), 다중 활성 효소들, 및 성장인자들 등을 포함한다. 이들 생물활성 물질들은 전체적으로 후반에서 설명할 치료 용도들에 기여한다.

본 발명을 실시예로서 더 설명할 것이다. 실시예들은 세가지 다른 부류로 나누어 진다: (1) 생물활성 물질들의 다양한 생산방법을 설명한 "제조예들"; 동물 모델들을 사용하여 다양한 실험 테스트를 설명한 "실험예들"; 및 (3) 다양한 질병들을 갖는 환자들에게 생물활성 물질의 처리 및 그러한 처리 결과를 설명한 "임상예들". 특히, "임상예들"은 생물활성 물질들이 다양한 질병에 대한 치료효과를 갖는다는 것을 증명하기 때문에 흥미롭다. 예를 들면, B형 간염, 암, 및 HIV 또는 에이즈를 포함한 심각한 질병을 갖는 환자들에게 본 포자들로부터 추출된 생물활성 물질들을 처리한 후에 엄청난 개선을 보여주었다. 또한, 신경 시스템 및 신경근육조직의 기능장애(예를 들면, 다중 경화, 경직 및 근육 디스트로피)와 같은 면역장애에 관련된 병을 갖는 사람들은 생물활성 물질들 먹은 후에 개선효과를 보였다. 게다가, 생물활성 물질들은 결핵 및 독감을 포함한 박테리아성 또는 바이러스성 감염의 치료에 적용하였다. 또한, 그것들은 당뇨병 또는 갑상선 결핍과 같은 호르몬 결핍 환자의 치료에 양성 효과가 있는 것으로 나타났다. 가노데마 포자들로부터 추출된 생물활성 물질들을 사용하는 다른 이점은 환자들에게 많은 투여량을 처방해도, 그것들은 무독성이라는 것이다.

제조예들

제조예 1

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하고, 1%의 맥아추출액 100㎏을 포자에 부가한 후, 발아를 유도하기 위한 침지처리를 6시간동안 수행하였다. 수온은 20℃로 맞추었다.

2. 침지처리 후, 포자들을 꺼내고, 과도한 용액은 적하해서 제거하였다. 그런 다음, 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스로 넣고, 포자활성 배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 70%였고, 배양온도는 20℃이며, 활성은 12시간동안 지속하였다. 시험 후, 적색 가노데마 루시덤 포자의 발아율은 96%에 이르렀고, 포자외피는 활성화동안 분명하게 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 미분화(micronization)는 침투방법으로 사용되었다. 미분화 후, 적색 가노데마 루시덤의 포자외피의 침투율이 99%에 이르렀다.

4. 표준 진공건조 장치를 사용하여 건조처리를 수행하였고, 얻어진 생성물은 3% 미만의 수분함량을 가졌다.

5. 얻어진 생물활성 물질들을 표준 화학분석들을 통해 측정하였다.

제조예 2

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하고, 45㎏의 코코넛 쥬스 및 100㎏의 증류수를 포자에 부가한 후, 발아를 유도하기 위한 침지처리를 30분 동안 수행하였다. 수온은 35℃로 맞추었다.

2. 발아 유도를 위한 침지처리 후, 과도한 용액은 적하해서 제거하였고, 포자들을 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 80%였고, 배양온도는 36℃이며, 활성은 5시간동안 지속하였다. 전자현미경 검사 후, 적색 가노데마 루시덤 포자들은 발아관의 기본적 형성이 발생하면서 활성상태로 있었고, 포자외피는 활성 기간동안 분명하게 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 0.1㎏의 키티나제 및 0.1㎏의 셀룰라제를 이용하여, 효소분해 온도 40∼55℃에서, 3시간 동안 포자의 효소분해를 수행하였다. 2시간 후에, 포자의 딱딱하고 탄력성 있는 이중-층 세포벽은 더 이상 탄력성을 가지지 않았고, 흐물흐물해 졌다. 또 다른 방법으로, 미분화기를 사용하여 세포벽이 침투되도록 더 처리하여, 적색 가노데마 루시덤 포자의 침투율이 99%에 이르렀다.

4. 표준 동결-건조 장치 장치를 사용하여 건조처리를 수행하였고, 얻어진 생성물은 2.8% 미만의 수분함량을 가졌다.

제조예 3

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하고, 영양용액으로서 5%의 가노데마 루시덤 조포낭 추출물 150㎏을 포자에 첨가하고, 용액온도 30℃에서 4시간 동안 침지처리를 수행하였다.

2. 침지처리하여 발아를 유도한 후, 과도한 용액은 적하해서 제거하였고, 포자들을 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 65%였고, 온도는 38℃이며, 활성은 5시간동안 지속하였다. 전자현미경 검사를 하였을 때, 포자들은 활성상태로 있었고, 발아관의 형성은 전혀 발생하지 않았으며, 포자외피는 활성기간 동안에 분명하게 연화된다는 것이 확인되었다.

3. 초고압 미세증기 장치를 사용하여 세포벽 침투를 수행하였을 때, 적색 가노데마 루시덤 포자의 침투율은 99%이상이었다.

4. 표준 동결-건조 장치 장치를 사용하여 건조처리를 수행하였고, 얻어진 생성물은 3.2% 미만의 수분함량을 가졌다.

제조예 4

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하고, 2%의 비오틴을 함유한 배양액 200㎏을 포자에 부가하였다. 발아유도를 위한 침지처리는 40℃의 용액온도에서 3시간 동안 지속하였다.

2. 침지 후, 포자를 꺼내고, 과도한 수분은 적하해서 제거하였다. 그런 다음, 포자들을 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 90%였고, 온도는 33℃이며, 활성은 4시간동안 지속하였다. 포자의 활성율은 95%에 이르렀고, 포자외피는 활성기간 동안 분명하게 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 0.08㎏의 키티나제 및 0.2㎏의 셀룰라제를 갖고 포자들의 효소분해를 40∼55℃에서 3시간동안 수행하였다. 과정 끝에서, 포자들의 딱딱하고, 탄력성있는 이중-층 세포벽은 더 이상 탄력성이 없었고, 흐물흐물해 졌다. 그런다음, 압판기(press roller)를 사용하여, 롤 프레싱을 수행하였다. 포자들의 침투율은 99% 이상이었다.

4. 건조처리를 표준 저온 송풍 건조기로 12시간동안 수행하였고, 얻어진 생성물은 4%미만의 수분함량을 가졌다.

제조예 5

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하고, 0.1% 포타슘 포스페이트(1염기성) 및 마그네슘 설페이트의 배양액 100㎏을 포자에 부가한 후, 용액의 온도 21℃에서 8시간동안 발아유도를 위한 침지처리를 수행하였다.

2. 침지 후, 과도한 수분은 적하해서 제거한 다음, 포자들을 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 85%였고, 온도는 42℃이며, 활성은 3시간동안 지속하였다. 전자 현미경 검사를 하였을 때, 적색 가노데마 루시덤 포자는 활성상태에 있었고, 씨눈이 형성되었으며, 포자외피는 활성기간 동안 분명하게 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 물로 추출을 수행하였고, 알콜로 이차 추출을 하였다. 추출용액을 합한 다음, 박막 기술을 사용하여 농축시켰다.

4. 과정을 더 수행하여 정제분말, 추출물 페이스트, 주사기 용액 또는 경구 복용제를 만들었다.

5. 얻어진 생성물의 생물활성 물질들은 표준 화학분석을 사용하여 측정하였다.

제조예 6

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하였다. 5%의 캐필리티아를 함유한 가노데마 루시덤의 추출용액 50㎏ 및 1%의 맥아추출물 50㎏을 포자에 부가한 후, 25℃의 용액온도에서 7시간 동안 침지시켜, 발아를 유도하였다.

2. 침지시켜 발아유도를 한 후, 과도한 수분은 적하해서 제거하였고, 포자들을 일정 온도 및 습도를 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 85%였고, 온도는 25℃이며, 활성은 12시간동안 지속하였다. 전자 현미경 검사를 하였을 때, 적색 가노데마 루시덤 포자는 활성상태에 있었고, 발아관은 이미 형성되었으며, 포자외피는 활성기간 동안 분명히 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 초고압 미세증기 장치를 갖고 세포벽 침투를 수행하였을 때, 적색 가노데마 루시덤 포자의 침투율은 99% 이상이었다.

4. 표준 동결-건조 방법을 사용하여 건조처리를 수행하였고, 얻어진 생성물은 2.8% 미만의 수분함량을 가졌다.

제조예 7

1. 적색 가노데마 루시덤의 성숙하고 온전한 포자 100㎏을 신중하게 선택하였고, 32℃의 증류수 300㎏을 포자에 부가한 후, 침지처리를 8시간 동안 수행하였다..

2. 침지시켜 발아를 유도한 후, 과도한 수분은 적하해서 제거하였고, 포자들을 일정 온도 및 습도을 갖는 통풍이 잘되는 배양박스에 넣고, 활성배양을 수행하였다. 배양박스의 상대습도는 95%였고, 온도는 35℃이며, 활성은 24시간동안 지속하였다. 전자 현미경 검사를 하였을 때, 적색 가노데마 루시덤 포자는 활성상태에 있었지만, 어떠한 발아관도 형성되지 않았으며, 포자외피는 활성기간 동안 분명히 연화된다는 것을 확인하였다.

3. 미분화 후, 적색 가노데마 루시덤 포자의 침투율은 99%에 이르렀다.

4. 표준 진공 건조 방법을 사용하여 건조처리를 수행하였고, 얻어진 생성물은 3.5% 미만의 수분함량을 가졌다.

실험예

다음 실험에서 사용된 생물활성 물질들은 발아활성, 효소공학에 의한 포자벽 분해 및 동결 건조 공정에 의해 가노데마 포자들로부터 추출되었다. 생물활성 물질들은 그 종류가 특별히 한정되지는 않지만, 가노데마 폴리사카라이드들, 가노데마 포자 지방산들, 가노데마 포자 긴사슬 알킬 탄화수소들, 가노데마 트리터펜들, 수퍼옥시드 디스뮤타제, 비타민 E, 활성화 글리코프로테인들, 몇몇 성장인자들 등을 포함한다. 완전히 세포벽-분해된 가노데마 포자들은 표준 가노데마 포자들보다 훨씬 더 효율적인 생리학적 활성을 보여준다.

실험예 1 : 종양 조직 내의 말론디알데하이드(MDA)의 함량 조사에 의한 포자벽-분해 가노데마 포자들의 자유라디칼 제거 효과

Ⅰ. 물질 및 방법

1.1. 물질

실험에 사용된 NIH 마우스들은 광동 주, 보건부의 시험동물 센터(the Test Center of the Department of Health, Guangdong Province)에서 공급받았다. 마우스는 20∼22g의 무게였으며, 그것들 중 절반은 수컷, 절반은 암컷이었다. 마우스 세망육종(細網肉腫, reticulosarcoma)(L-II)은 본 기관에서 제공하였다. 가노데마 루시덤 포자분말을 사용한 0.2g/㎖ 경구 용액이 제조되었다. 아드리아마이신(ADM, Adriamycin)이 쉔젠에 있는 완르 제약주식회사(Wan Le Pharmaceutical Co., Ltd. in Shenzhen)에 의해 제조되었다.

1.2 장치

MPF-4 현광분광계는 히타치(Hitachi)에 의해 만들어졌다.

1.3 원리

산성 조건에서, 2-티오바비투릭 산-말로닐 티오우레아(TBA, 2-thiobarbituric acid-malonyl thiourea) 및 말론디알데하이드(MDA, Malondialdehyde) 사이의 축합은 형광(515nm 파장에서 빛을 흡수하고, 553nm에서 형광을 방출함)을 방출하는 적색 화합물을 생산했다. MDA의 양은 MPF-4 형광분광계를 사용하여 형광 광도를 측정하여 결정하였다.

1.4 방법

무균상태에서, 7일동안 잘 생육된 복수증(腹水症) 마우스 L-II 세포들을 복강(abdominal cavity)으로부터 추출하고, 생물학적 식염수 용액을 갖고 1:1의 비율로 희석한 다음, 마우스의 오른쪽 겨드랑이로 종양세포 현탁액을 피하접종하였다. 각 마우스에 0.2㎖를 접종하였다. 그런 다음, 접종된 마우스는 각 군마다 마우스 12마리씩 5개 군으로 임의로 나누어졌다. 음성 대조군으로 : 20㎖/㎏/d(day)의 생물학적 식염수 용액을 주사했다; 양성 대조군으로 : 아드리아마이신(ADM) 1mg/㎏/d를 투여하였다; 가노데마 루시덤 포자 저투여군으로 : 2g/㎏/d; 가노데마 루시덤 중간투여군으로 : 4g/㎏/d; 가노데마 루시덤 고투여군으로 : 8g/㎏/d. 종양세포 접종 후 24시간 째에 시작하여, 10일 연속으로 섭식튜브(gavage)를 통해 각 군의 시험동물에게 약물 투여를 시각하였다(ADM 군에 대해서는 약을 복강주사하였다). 각 군의 시험동물들의 활동성, 피부 및 털의 광택 및 변 상태를 관찰하였다. 마지막으로 약물을 투여한 날에, 마우스들을 죽였다. 그런 다음, 그것들의 무게를 재고, 종양을 꺼냈으며, 종양의 억제율을 계산하였다. 약 1g의 종양조직을 MDA 측정에 사용하였다. 조직의 과도한 혈액은 차가운 0.9% NaCl로 세척하였다. 남겨진 혈액은 천 또는 종이에 조직을 흡수시켜 제거하였다. 그런 다음, 조직을 조각으로 짜르고, 글래스 균질화기(homogenizer)에 위치시켰다; 0.9% NaCl을 첨가한 다음, 분쇄를 수행하여 10%(w/v) 균질화된 조직 용액을 생산하였다. 종양 조직 내의 MDA 양은 TDA 현광분광계로 측정하였다.

2. 결과

2.1 가노데마 루시덤 포자들의 종양 억제 효과(표 1 참조)

가노데마 루시덤 포자의 마우스 L-II 종양 억제율은, 저투여, 중간투여, 고투여군 각각에 대하여 66.8%, 70.9% 및 76.2%이었다. 종양 억제는 투여량-의존 방법에 따라 효과가 있었다.

2.2 마우스 종양 조직들 내의 MDA에 대한 포자들의 효과

마우스 종양 조직 내의 MDA 양은 가노데마 루시덤 포자의 투여량 증가와 함께 점차적으로 감소하였다(표 2 참조). 가노데마 루시덤 포자들의 각 투여군에서 MDA 양은 대조군과 유의적(有意的)으로 차이가 있었다(p〈0.001).

3. 토의

자유라디칼들은 세포대사과정에서 일정하게 생산되어, 생물체에 해로운 효과을 갖을 수 있는 고활성 물질들이다. 그것들은 산화반응을 유도할 수 있고, 단백질의 가교화시켜 단백질에 악영향을 미칠 수 있으며, 효소의 활성을 감소시키고, 핵산의 비정상적 대사를 원인이 되며, 생물학적 막(membrane) 내 폴리불포화 지질의 초과산화(superoxidation)를 일으킬 수 있다. 자유라디칼 공격으로 인해서, 생물체 내 다양한 기관들뿐만 아니라, 세포의 구조들 및 기능들에 악영향을 미쳐서, 노화 및 다중 병상들(pathologies)을 초래한다.

MDA는 지질 과산화(peroxidation) 이차 환원 산물, 즉 지질 과산화의 대사물이다. 그것은 두개의 효과기를 갖는 화합물이고, 단백질, 핵산, 세팔린(cephalins) 등과 같은 아미노기를 함유한 화합물과 반응하여, 단백질의 변성, 효소활성의 손실 및 DNA손상과 함께 가교에 의한 기능손실 원인이 된다. 또한, 동물 시험를 통해 MDA가 동물 내에서 종양을 유도할 수 있는 강한 발암물질(carcinogen)임을 보여주었다. 종양 조직 내 MDA 측정은 종양에 의해 유도되는 지질 과산화의 양을 직접적으로 반영할 수 있다.

가노데마 루시덤 포자의 활성화 성분은 가노데마 루시덤 폴리사카라이드, 가노데마 루시덤 산들, SOD, 비타민 E 등과 같은 항산화제를 포함하고, 항산화제는 지질 과산화를 방지하기 위한 가노데마 루시덤 포자들의 능력의 기초가 될 수 있다. 따라서, 가노데마 루시덤 포자들은 자유라디칼 제거, 생물체들의 보호 및 암의 치료 뿐만 아니라, 예방에 있어서 양성적 역할을 하는 것으로 볼 수 있다.

표 1∼2에 따르면, ADM 군 마우스의 세망육종 조직에서 가장 높은 MDA 양을 나타냈다. ADM의 항암 메커니즘 중에 하나는 금속이온과의 결합능력이다. 그러나, 이것은 또한 자유라디칼 생성의 유도를 이끈다. 게다가, 비록 ADM이 암 형성을 저해해도, 그것은 심장근육 마이토콘드라아 및 막을 동시에 공격하여, 심각한 심장 장애를 일으킨다. ADM 군은 암세포의 성장과정 동안 지질 과산화 양이 증가하는 것을 나타내는 양성 대조군 다음에 위치했다. 가노데마 루시덤 포자의 고투여, 중간투여, 저투여군의 MDA 양은 모두, 두개의 양성 및 음성 대조군의 것보다 유의적으로 낮았다. 2g/㎏/d∼8g/㎏/d의 투여범위 내에서, MDA의 량은 가노데마 포자의 투여량 증가와 함께 유의적으로 감소하였고, 가노데마 루시덤 포자들은 지질 과산화의 억제에 큰 작용을 하고, 이와 동시에 효과은 2g/㎏/d∼8g/㎏/d의 투여범위 내에서 투여량의 증가와 함께 증가하는 것으로 나타났다. 비록 자유라디칼들은 암세포에 해가 되지만, 암세포를 파괴하는 동안 생물에도 또한 해가 된다. 본 시험 결과를 토대로, 가노데마 루시덤 및 가노데마 루시덤 포자들은 동물 종양에 대한 명백한 억제 효과를 갖는다는 것을 보여주었다. 또한, MDA 양 저해에 대한 가노데마 루시덤 포자의 효과은 투여량-의존이라는 것은, 비록 가노데마 루시덤 포자가 종양세포 내의 자유라디칼을 감소시키지만, 종양을 억제하는 능력에는 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

상기의 시험에서, 약은 암세포들을 마우스에 접종한 후 곧바로 투여하였다. 또한, 암세포 성장과정 동안, 가노데마 루시덤 포자들을 마우스들에 연속적으로 투여하였다. 가노데마 루시덤 포자들은 종양세포의 성장동안 종양세포에 의해 자유라디칼의 형성을 연속적으로 억제하여, 자유라디칼에 의해서 다시 일어날 수 있는 지질 과산화에 의한 DNA 손상을 억제하였다. 동시에, 가노데마 루시덤 포자들은 종양 세포에 의한 주변세포의 파괴를 또한 억제하고, 종양세포들의 성장을 억제하였다. 그 결과, 가노데마 루시덤 포자들에 의해 유도된 자유라디칼의 감소는 종양억제에 있어서 가노데마 루시덤 포자들의 메커니즘 중에 하나가 될 수 있다.

실시예 2 : 순수한 가노데마 루시덤 포자의 면역조절 효과

캡슐

I. 시험 조건 :

1. 시료들 : 추천되는 하루 투여량은 0.06/㎏체중(Bodyweight : BW)이다(즉, 60㎏의 어른 기준으로 하루에 3번 투여, 각 투여때 마다 4개 갭슐, 각각의 캡슐은 0.3g의 무게이다). 다양한 시험에 요구되는 농도는 가노데마 루시덤 포자를 증류수로 희석하여 모두 제조된다.

2. 투여량 : 차가운 증류수 대조군, 저투여, 중간투여 및 고투여군들이 있었다. 저투여, 중간투여, 고투여군의 투여량은 다음과 같았다.

저투여군 : 추천되는 대략적인 하루 투여량, 0.06g/㎏ BW

중간투여군 : 추천되는 대략적인 하루 투여량의 10배, 0.60g/㎏ BW

고투여군 : 추천되는 대략적인 하루 투여량의 30배, 1.80g/㎏ BW

3. 동물 : 6∼8주된 20∼22g 무게의 NIH 흰마우스들을 조사자격 승인 번호 제 97A022를 받은 광동 의약 시험동물 농장(Guangdong Medical Animal Farm)으로부터 제공받았다. 펠렛(pellets)은 광동 의약 동물농장에서 제공받았다.

4. 동물 수용 실험실 : 동물들은 무균이고, 실내온도 25±2℃, 습도 70∼75%에서 수용되어졌다.

5. 투여 경로 : 각 동물은 시험물질을 매일 0.2㎖/10g의 투여량으로 섭식튜브를 통해 투여하였다.

II. 실험방법 :

1. 동물들의 지연 알레르기 반응 검사(발바닥의 두께 증가 측정)

실험실 조건 하에서 일주일 동안 격리시킨 후, 40마리의 마우스들을 임의의 4개의 군으로 나누었다. 시험물질을 4주 동안 매일 마우스들에게 투여하고, 시험 끝나기 4일 전에, 면역 동물들에게 2%(v/v) 양 적혈구(sheep erythrocytes) 0.2㎖을 복강주사하여, 동물들을 감작시켰다(sensitize). 4일 후에, 왼쪽 뒤 발바닥의 두께를 측정하였고, 그런 다음 20%(v/v)의 양 적혈구(마우스마다 20㎕)를 같은 부위에 피하주사하였다. 주사후 24시간 째에, 왼쪽 뒤 발바닥의 두께를 3번 측정하여 평균값을 얻었다.

2. 마우스 혈청 용혈소의 역가 측정(혈액 응고 측정에 의해)

40마리의 마우스들을 각 군에 10마리씩 임의의 4개 군으로 나누었다. 시험물질을 4주동안 매일 투여하였다. 시료량은 체중에 따라 매주 조정하였다. 시험 끝나기 4일전에, 면역 동물들은 2%(v/v)의 양 적혈구 0.2㎖를 각각 복강주사하였고, 5일 후에, 안구를 꺼내어, 혈액시료를 얻었다. 혈청은 나중 사용을 위해 저장하였다. 흉선 및 지라의 무게를 측정하고, 이들의 체중에 대한 비율을 계산하였다.

응고 반응 : 미량원소 반응 플레이트 내에서, 혈청을 생물학적 식염수 용액을 갖고 적당한 비율로 희석한 각 50㎕에, 0.5%의 양 적혈구 50㎕을 첨가하고, 습윤 용기(moist container) 내에 넣은 다음, 뚜껑을 덮고 37℃ 배양기에 3시간 동안 두었다. 응고정도를 관찰하였다.

3. 마우스 탄소제거 검사

40마리의 마우스들을 각 군에 10마리씩 4개군으로 나누었다. 시험물질을 4주동안 매일 투여하였다. 시료량은 체중에 따라 매주 조정하였다. 마지막 투여후 28일 째에, 1:4로 희석한 인디아 잉크(India ink)를 0.1㎖/10g체중의 마우스 꼬리 정맥에 정맥주사하였다. 타이머(timer)를 사용하여, 2분, 10분째에 혈액 20㎕을 캔서스(canthus)내 정맥으로부터 뽑아내고, Na₂CO₃용액 2㎖를 첨가한 다음, 대조군으로 Na₂CO₃용액을 사용한 721 분광측광기를 이용하여 600nm 파장에서 OD값을 측정하였다. 그런 다음, 마우스를 죽이고, 간 및 지라의 무게를 측정하여, 식작용지수 (phagocytic index)를 계산하였다.

4. 데이타 처리 : SAS를 사용하여 분산 분석을 수행하였다.

III. 검사 결과

1. 마우스 체중에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽; cell wall completely penetrated)의 작용을 표 3에 나타내었다. 각 시험군 마우스의 초기, 중간, 최후 체중은 동일 기간의 대조군과 비교하였다. 표 3의 결과는 시험군과 대조군 사이에 통계학적 유의적 차이성을 보여주지는 않았고, 이는 완전히 침투되는 세포벽을 갖는 순수 가노데마 루시덤 포자 캡슐은 마우스 체중에 대해 유의적인 효과를 갖지 않는다는 것을 제안한다.

2. 마우스의 지라 및 흉선 무게에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 효과를 표 4에 나타내었다. 각 시험 군 마우스의 지라/체중 및 흉선/체중의 비율을 대조군과 비교하였다. 결과는 시험군 및 대조군 사이에 유의적 차이가 없음을 보여주고, 이는 마우스의 지라 및 흉성 무게에 대해 순수 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)이 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

3. 마우스의 지연 알레르기 반응에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 효과를 표 5에 나타내었다. 저투여, 중간투여, 고투여군 마우스들의 발바닥 두께를 대조군의 것과 비교하였고, 통계학적으로 처리하였다. 결과는 시험군과 대조군 사이에 유의적 차이가 있음을 보여준다.

4. 시험동물의 혈청 용혈소 중의 중 항체 역가에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 효과를 표 6에 나타내었다. 결과는 고투여군에서만 대조군과의 유의적 차이가 있었음을 보여주고, 이는 단지 고투여 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)만이 혈청 용혈소 중의 항체 역가에 효과함을 나타낸다.

5. 마우스의 탄소제거 식작용지수에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 효과를 표 7에 나타내었다. 단지 고투여군만이 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이성을 나타내었고, 이는 고투여군에서 발아활성화된 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)은 시험동물의 탄소 제거 식작용지수를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다.

IV. 결론:

발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)을 사용하는 것에 의해, 양 적혈구에 의해 유도된 마우스의 지연 알르레기 반응이 상당히 증가하였고(발바닥의 두께의 증가에 의해 측정되었을 때), 발바닥의 두께가 증가하였고, 이는 세포 면역기능의 증가효과를 나타낸다; 시험동물의 혈청 용혈소 중의 항체 역가은 상당히 증가하였고, 이는 호르몬 면역기능 증가효과를 나타낸다; 및 실험동물의 탄소 제거 식작용지수는 상당히 증가함을 보여주었고, 이는 대식세포에 의한 식효과(phagocytosis)의 증가효과를 나타낸다.

또한, 이런 결과는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)이 면역조절효과가 있음을 보여준다.

실험예 3: 독성 검사 및 마우스에서 가노데마의 박테리아 감염 예방 검사

I. 물질

1. 시험물질 : 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 포자시료는 갈색분말로 보였다. 100 메쉬체를 통과시킨 후, 시료 120g을 증류수 300㎖과 혼합하고, 교반기에서 7000rpm으로 15분동안 교반하였다. 그런다음, 그것들을 살균된 병에 넣고, 0.4g/㎖의 페이스티 용액(pasty liquid)를 얻었다. 이를 하루에 두번 위 섭식튜브 (gastric gavage)를 통해 투여하였다.

2. 동물:

18∼22g의 체중을 갖는 건강한 NIH 흰마우스를 광동 의약 시험동물 농장으로부터 얻었다.

II. 방법 및 결과

1. 급성 독성 LD₅₀검사:

체중 18∼22g을 갖는 40마리의 NIH 작은 흰마우스(절반은 수컷, 절반은 암컷)을 본 검사에 사용하였다. 마우스들을 임의의 4군으로 나누었다. 투여는 공복의 위에 위 섭식튜브를 이용하여 수행하였다. 일주일동안 관찰하였고, 그 결과는 표 8에 나타내었다.

결과 : 시험 마우스들의 활동성 및 음식 섭취량은 정상인 것으로 나타났다. 죽은 마우스는 없었다. 경구 LD₅₀은 21.5g/㎏ BW 이상이었다.

이 결과는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽) 시료가 비독성이라는 것을 나타낸다. 이 양은 추천되는 처리량 (0.08g/㎏ BW)의 268.75배이었다.

2. 골수 소핵 검사:

체중 20∼23g을 갖는 70마리의 NIH마우스들을 본 시험에 사용하였다. 마우스들은 7군으로 나누고, 식품 안정성을 위한 독성평가 방법(Toxicological Evaluation Procedure for Food Safety)에 따라 시험을 수행하였다. 투여는 하루에 두번 위 섭식튜브로 투여하였다. 두번째 투여 후, 6시간째에 마우스들을 죽였고, 두개의 대퇴부(femurs) 모두를 슬라이드 프레파라트로 옮겨서, 염색하고 현미경 검사를 하였다. 만개의 폴리크로마틱 적혈구(PCE, polychromatic erythrocytes)를 검사하였다. 소핵화된 적혈구(MN-PCE)의 수를 측정하였고, 결과를 표 9에 나타내었다.

결과 : 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 다양한 투여군의 소핵율은 바탕 대조군(blank control group)의 것과 유사하였고, 그것들의 어떤 것도 유의적인 차이성을 보여주지 못했다. 본 검사는 음성 결과를 나타내었다.

3. 정자 변형 검사

18∼22g의 무게를 갖는 25마리의 NIH 마우스들을 임의의 5개 군으로 나누고, 위 섭식튜브를 통해 5일동안 매일 투여하였다(복강주사된 사이클로포스파마이드 양성군). 35일 후, 동물들을 죽이고, 고환을 슬라이드 프레파라트로 당뇨병기고, 염색하였다. 각 군마다 전체 5000 정자를 오일 담금 렌즈(oil immersion lens)로 검사하였고, 정자 변형율을 계산하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.

결과 : 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)을 처리한 다양한 투여군의 정자변형은 바탕대조군의 것과 유사하다. 50.00g/㎏ BW 정도의 고투여를 해도, 생식 세포의 어떠한 유도 변형도 발견되지 않았다.

4. 에임즈 테스트(Ames test)

시험 박테리아(TA97, TA98, TA100 및 TA102)를 베이징 보건부, 식품검사청에 의해 공급받았다. 박테리아의 특성들 및 S9 활성이 평가되었고, 그것들은 자격을 충족하였다. 페트리 디쉬(Petri dish) 혼합 방법을 사용하여, 두개의 독립적인 시험을 수행하였다. 세 개의 디쉬들을 각 군마다 준비하였고, 결과는 표 11에 나타내었다.

결과 : 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)을 처리한 각각의 투여군에 S9 혼합물을 투여했든 안했든 간에, 시험 결과는 복귀돌연변이(reverse mutation)에 의한 콜로니의 수와 자연돌연변이 (natural mutation)에 의한 콜로니의 수가 두 배이상이 되지 않는다는 것을 보여준다. 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)이 직접적으로 또는 간접적으로 돌연변이의 원인이 된다는 것이 어디에도 나타나지 않았다.

IV. 검사결과 요약

1. LD₅₀:

표 8에서 나타낸 바와 같이, 발아활성화된 포자벽-활성 분해 가노데마 루시덤 포자를 처리한 동물에서 어떠한 악영향도 나타나지 않았다. 경구 LD₅₀은 21.5g/㎏ BW 이상이었다. 본 결과는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자가 무독성이라는 것을 나타낸다.

2. 소핵 검사

표 9에서 나타낸 바와 같이, 골수 소핵 검사를 수행하여, 0.62∼10g/㎏ BW 사이의 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽) 투여량 범위에서 세포 돌연변이에 영향을 미치지는지에 대해서 연구하였다. 결과는 가노데마 루시덤 군 및 바탕 대조군 사이에 어떠한 유의적 차이성을 보여주지 않았으며, 이는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자들이 생체 내에서 세포 돌연변이를 유도하지 않음을 나타낸다.

3. 정자 변형 검사

표 10에서 나타낸 바와 같이, 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자들이 2.5∼10g/㎏ BW로 투여된 동물들의 정자 변형율은 바탕대조군의 것과 같았고(통계학적으로 비유의적), 이는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자들이 생체 내에서 정자변형을 유도하지 않음을 나타낸다.

4. 에임즈 테스트

표 11에 나타낸 바와 같이, 0.5∼5000ug/디쉬으로 투여된 발아활성화된 가노데마 루시덤 포자들은 복귀돌연변이를 유의적으로 유도하지는 않았다(시험 결과는 복귀돌연변이에 의한 콜로니의 수와 자연돌연변이에 의한 콜로니의 수가 두 배이상이 되지 않는다는 것을 보여준다.). 또한, 본 결과는 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자들이 직접적 또는 간접적으로 돌연변이를 유도하지 않는 것을 보여준다.

실험예 4 : 래트(RAT)에서 가노데마의 독성 검사

I. 물질:

1. 시험 물질 : 시료는 갈색 분말처럼 보였다. 100 메쉬체를 통과시킨 후, 시료 120g을 증류수 300㎖과 혼합시키고, 7000rpm으로 15분동안 교반하였다. 그런다음, 그것들을 20분 동안 살균처리하고, 페이트스로 만들었다. 페이스트 1㎖당 시료 약 0.4g이 있었다.

2. 동물 : 건강한 SD 래트을 광동 의약 시험동물 농장에서 공급받았다.

II. 방법

80∼88g의 체중을 갖는 동종의 건강한 SD 래트 96마리를 군마다 24마리씩 임의의 4군으로 나누었다(절반은 암컷, 절반은 수컷). 각 군에서 몸무게의 평균 편차는 ±5g이하였다. 약투여 전 1주일 동안, 어떠한 비정상적 활동성, 식성 또는 특징적인 외양(外樣)이 있는지 살펴보았다.

1. 투여량 : 추천되는 성인의 투여량은 하루에 4번, 매번 4개의 캡슐(캡슐마다 0.3g)이였다. 이 투여량은 성인의 체중이 60㎏으로 가정하여 기초한 것이다. 이 투여량은 0.08g/㎏ BW의 투여량으로 환산될 수 있다. 동물 독성 검사를 위해, 세 시험군 및 하나의 대조군이 각 군마다 12마리의 래트(그중 절반은 암컷, 절반은 수컷이다.)을 포함하도록 조정하였다.

바탕 대조군 : 증류수

25X 군 : 2.0g/㎏/일

50X 군 : 4.0g/㎏/일

100X 군 : 8.0g/㎏/일

2. 검사 방법 :

(1) 래트은 체중에 따라 계산된 투여량으로 섭식튜브를 통해 매일 30일 동안 투여하였다. 고투여군은 하루에 두번 섭식투여하였고, 대조군은 같은 량의 증류수를 섭식투여하였다. 체중은 매주 측정하였고, 섭비된 음식량은 동물의 생리학적 지수를 기록하면서 측정하였다.

(2) 표준 혈액검사를 투여 마지막에 실시하였다. 혈액검사는 적혈구 계수(計數), 헤모글로빈, 백혈구 세포 및 다른 분화된 세포 계수, 및 혈소판의 숫자를 포함하였고, 모두 일본산 R-1000STSME 혈액세포 계수기를 사용하여 측정하였다. 혈액 생화학, 혈당, 알부민, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 크레아티닌, 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제(transaminase) 및 혈액 뇨 질소(blood urea nitrogen)에 대해 검사하였다. 측정은 프랑스산 ALIZE 자동화 생화학분석기를 사용하여 수행하였다.

(3) 각 동물에서, 간, 신장, 지라, 심장 및 고환을 추출하고, 무게를 재었다. 그런 다음, 이들 기관들을 포름알데히드 내에서 보존하였다. 병리학적 관찰을 위해 슬라이드를 준비하고, 염색하였다.

III. 결과 및 분석

1. 다른 투여군으로부터 래트는 잘 성장했고, 대조군과 비교하여 어떤 유의적 차이성은 없었다(p〉0.05)(표 12 및 표 13 참조). 각 투여군에서 음식 소비량 및 이용률은 대조군과 어떤 유의적 차이는 없었다(표 13 참조).

2. 마지막 혈액검사에서, 특정 지수의 어떤 것도 대조군과 비교하여 어떤 유의적 차이성은 없었다(표 14 참조).

3. 혈액화학 연구에서, 수컷 래트의 혈당량은 고투여군뿐만이 아니라, 저투여 및 중간투여군에서도 대조군과 비교하여 상당히 감소하였다(p〈0.05). 또한, 암컷 래트의 혈당량은 중간투여 및 고투여군(p〈0.05) 뿐만이 아니라, 저투여군(p〈0.01)에서도 상당히 줄어들었다. 그러나, 이들 값은 여전히 정상적인 범위 내에 있었다. 저투여 및 중간투여군 암컷 래트의 혈액 뇨 질소량은 대조군과 비교하여 유의적인 차이성이 있었다(p〈0.05). 저투여 및 고투여군 암컷 래트의 트리글리세라이드량은 대조군과 비교하여 유의적 차이성이 있었다(p〈0.05). 시험군의 다른 지수들에서는 대조군과 비교하여 유의적 차이성은 없었다(표 15 참조).

4. 각 시험군의 기관지수 값은 대조군과 비교하여 유의적 차이성은 없었다(표 16 참조). 병리학적 관찰을 통해, 어떠한 시험군에서도 병리학적 비정상 기관은 없었다.

IV. 검사결과 요약

본 검사에서, 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)의 추천되는 양(0.08g/㎏ BW)의 25, 50 및 100배가 성장하는 SD 래트 암컷 및 수컷 둘다에 투여되었다. 대조군은 증류수를 투여하였다. 검사기간은 30일동안 지속하였고, 최종 결과는 다음과 같다:

1. 대조군과 비교하여, 순수 가노데마 루시덤 포자를 투여받은 시험 래트의 체중 증가는 유의적 차이가 없었다.

2. 표준 혈액검사는 기본적으로 정상적인 결과를 보여주었다.

3. 혈액 화학 : 혈당에서 다소 약간의 감소가 있었고, 암컷의 트리글리세라이드에 약간의 증가가 있었으나, 일반적인 범위 내에 있었다.

4. 각 투여군으로부터 래트 기관의 병리학적 생체검사는 어떠한 비정상성을 보여주지 않았다.

결론 : 발아활성 포자벽-분해 가노데마 루시덤 포자 캡슐(완전히 침투되는 세포벽)을 가지고, 30일동안 사육한 검사는 모든 지수값에서 정상인 것으로 나타났고, 그것들은 안전하게 사용될 수 있었다.

실험예 5 : 발아 활성된 포자벽-분해 가노데마 포자의 항종양 활성

가노데마 포자들

I. 목적

본 연구의 목적은 마우스 혈종(hematoma), 마우스 육종(sarcoma) 180(S-180) 및 마우스 세망육종(L-II)와 같은 고형 종양이 접종된 동물에서, 발아활성화된 가노데마 포자의 생체내 항종양성을 조사하기 위한 것이다.

II. 방법:

22∼22g의 무게를 갖고, 동수의 암컷과 수컷의 실험 NIH 마우스를 중국, 광동성의 국립위생부의 실험동물 센터(Experimental Animal Center, Public Hygiene Office of Guangdong Province, China)로부터 얻었다. 마우스 육종 180 (S-180), 마우스 혈종 및 마우스 세망육종(L-II) 계열을 중국, 선 얏센 의과대학, 암연구소 (Cancer Institute, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, China)로부터 얻었다. 발아활성화된 가노데마 포자 현탁액(0.2g/㎖)이 광조우 녹색식품공학 주식회사(Guangzhou Green Food Engineering Co., Ltd.) 및 그린파워 건강식품 국제 주식회사(Green Power Health Products International Co., Ltd.(Hong Kong)에 의한 본 발명에 따라 제공되었다. 사이클로포스파마이드(CTX)는 샹하이, 제 12 의약 공장(12^thMedicine Factory, Shanghai)으로부터 구입하였다. 아드리아마이신은 센젠 왕 돈 제약회사(Shenzhen Wong Don Pharmaceutical Company)로부터 구입하였다.

마우스 육종 180(S-180), 마우스 혈종 및 마우스 세망육종(L-II) 세포들을 추출하고, 무균상태에서 생리학적 식염수로 희석하였다. 각 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 종양 세포 현탁액 0.2㎖(1x10⁷세포)를 접종하였다. 접종된 마우스는 임의의 5군으로 나누었다.(군마다 10∼12마리 마우스): (1) 양성대조군(동물들에 식염수 [20㎖/㎏/d]을 투여); (2) 양성 대조군(동물들에 사이클로포스파마이드 [20㎖/㎏/d]투여); (3) 가노데마 포자 저투여군(2g/㎏/d); (4) 중간투여군(4g/㎏/d); 및 (5) 고투여군(8g/㎏/d). 투여는 접종 후 24시간째에 시작하였고, 7일 동안하였다. 저투여, 중간투여군에서는, 매일 아침에 한번 섭식튜브를 통해 약을 투여하였다. 고투여군에 대해서는, 아침 한번 및 저녁에 또 한번 섭식튜브를 통해 투여하였다. 마우스의 움직임, 표피 광택 및 변을 관찰하였다. 그런 다음, 18일째에 경부탈구(cervical dislocation)에 의해서 마우스를 죽이고, 전자저울로 무게를 재었다. 겨드랑이 종양을 절개하고 무게를 재었다. 항종양 효과는 종양저해율로 평가하였다:

종양저해율 (IR%)=[1-(처리군의 평균 종양 무게/대조군의 평균 종양 무게)]x100%

t-검사을 통해 처리군과 대조군 사이의 차이성을 비교하였다.

III. 결과 :

A. 마우스 육종 180(S-180)에 대한 발아활성 가노데마 포자의 저해효과

실험결과를 표 17에 나타내었다. 2g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 42.3∼45.2%이었다(세번의 반복실험); 4g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 56.2∼57.3%이었다(세번의 반복실험); 8g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 79.3∼82.0%이었다(세번의 반복실험). t-검사는 가노데마 투여군의 평균 종양무게와 음성대조군의 평균 종양무게의 차이가 유의적임을 보여준다(p〈0.001). 게다가, 가노데마 포자를 투여한 후, 실험 마우스는 현저하게 체중이 증가하였다. 적당한 조건 내에서 탈모 및 설사와 같은 부작용을 나타내지 않았다.

B. 마우스 혈종에 대한 발아활성 가노데마 포자의 저해

표 18은 2g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 52.2∼74.5%이고(세번의 반복실험); 4g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 63.7∼77.7%이며(세번의 반복실험); 2g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 73.2∼86.1%임(세번의 반복실험)을 나타낸다. t-검사는 가노데마 포자 투여군의 평균 종양무게와 음성대조군의 평균 종양무게의 차이가 유의적임을 보여준다(p〈0.01∼0.001).

C. 마우스 세망육종(L-II)에 대한 발아활성화된 가노데마 포자의 저해

표 19에서 나타낸 바와 같이, 2g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 54.9∼66.8%이었다(세번의 반복실험); 4g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 66.9∼70.9%이며(세번의 반복실험); 8g/㎏/d의 가노데마 포자 군의 종양 저해율은 76.2∼79.6%임(세번의 반복실험)을 나타낸다. t-검사는 가노데마 포자 투여군의 평균 종양무게와 음성대조군의 평균 종양무게의 차이가 유의적임을 보여준다(p〈0.001).

IV. 결론

표 17∼19의 결과는 발아활성화된 가노데마 포자들이 마우스 혈종, 마우스 육종 180(S-180) 및 마우스 세망육종(L-II)와 같은 고형 종양이 이식된 동물에 대한 상당한 저해효과를 갖는 것을 나타낸다. 그것은 인간 종양에 대해서도 유사한 효과를 보일 것으로 예상된다. 발아활성화된 가노데마 포자가 몸의 항상성유지 반응(homeostasis response)을 촉진 및 활성화시키고, 신진대사 내의 호르몬 및 수용체들, 신경내분비 및 면역 시스템의 조절을 도와주며, 따라서, 몸의 병저항성을 조절, 강화, 증강시키다는 것을 암시한다.

실험예 6. 비포자벽-분해 및 포자벽-분해 가노데마 포자 사이의 항종양 효과의 비교연구

I. 목적:

다음 실험의 목적은 마우스에 이식된 혈종에 대한 비포자벽-분해 및 포자벽-분해 가노데마 포자의 항종양효과를 조사한 것이다.

II. 물질 및 방법:

22∼22g의 무게를 갖고, 동수의 암컷과 수컷의 실험 NIH 마우스를 중국, 광동성의 국립위생부의 실험동물 센터로부터 얻었다. 마우스 혈종 계열은 선 얏센 의과대학, 암연구소로부터 얻었다. 포자벽-분해 및 비포자벽-분해 가노데마 포자는 광조우 녹색식품공학 주식회사 및 그린파워 건강식품 국제 주식회사에서 제공되었다.

7일동안 복강에서 유지된 마우스 혈종 세포들을 추출하고, 무균상태에서 생리학적 식염수로 희석하였다. 무균상태에서, 0.2㎖의 종양세포 현탁액(1x10⁷세포)을 마우스의 오른쪽 겨드랑이로 피하접종하였다. 마우스들을 임의의 8개 군으로 나누었다: (1)음성 대조군; (2) 양성대조군; (3) 비-포자벽-분해 저투여군; (4) 비-포자벽-분해 중간투여군; (5) 비-포자벽-분해 고투여군; (6) 포자벽-분해 저투여군; (7) 포자벽-분해 중간투여군; (8) 포자벽-분해 고투여군. 각 군은 10마리 마우스들을 포함하였다. 접종 후 24시간째에, 가노데마 포자를 7일동안 위섭식튜브를 통해 투여하였다. 양성대조군 동물들은 사이클로포스파마이드(CTX)를 투여하였다. 각 군에서 사용된 양은 하기에서 나타내었다:

저투여 및 중간투여군에서는, 실험군 및 대조군 현탁액을 아침에 투여하였고, 고투여군에서는, 현탁액을 아침에 한번, 저녁에 한번 투여하였다. 이를 7일동안 계속하였다. 이 기간동안, 동물의 움직임, 변 및 표피를 관찰하였다. 그런 다음, 8째날에 마우스드을 경부탈구에 의해서 죽였다. 그들의 무게를 전자저울로 측정하였다. 종양을 꺼내고, 절개하여 무게를 재었다. 종양저해율을 평가했고, 계산은 상기와 같이 수행하였다.

같은 실험을 3번 반복하였다. t-검사로 군들간의 차이를 비교하였다.

III. 결과

A. 비-포자벽-분해 가노데마 포자의 종양 저해율: (표 20 참조)

저투여군 = 6.1%, 8.2% 및 6.0% (세번의 반복실험)

중간투여군 = 18.2%, 20.8% 및 22.6%(세번의 반복실험)

고투여군 = -4.8%, 3.1% 및 2.4%(세번의 반복실험)

종양 저해율은 중간투여군에서 가장 높았고, 고투여군에서 가장 낮았다. t-검사에 의한 통계학적 분석은 중간투여군에서만 유의적 차이 p〈0.05를 보여주었고, 고투여군 및 저투여군에서는 아니었다(p〉0.05).

B. 포자벽-분해 가노데마 포자들의 종양저해율: (표 20참조)

저투여군 = 27.1%, 30.2% 및 33.3%(세번의 반복실험)

중간투여군 = 38.2%, 39.6% 및 42.3%(세번의 반복 실험)

고투여군 = 43.3%, 45.3% 및 45.8%(세번의 반복실험)

t-검사에 의한 통계학적 분석은 실험군과 음성 대조군 사이의 종양무게에 대한 유의적 차이를 나타내었다. 또한, 전체 실험 기간동안, 독성 부작용이 전혀 관찰되지 않았다. 마우스들의 움직임, 변 및 표피는 정상이었고, 이 기간동안 어떠한 쥐도 죽지 않았다.

표 20에 나타낸 바와 같이, 비-포자벽-분해 가노데마 포자들은 종양저해율이 -4.8∼22.6%인 것으로 나타났고(투여량 2g/㎏/d∼8g/㎏/d), 포자벽-분해 가노데마 포자의 것(즉, 27.1%∼45.8% 저해율)보다 훨씬 낮았다. 표 20에서 나타낸 결과는 포자벽-분해 가노데마 포자들이 비-포자벽-분해 포자보다 종양에 대한 훨씬더 우수한 치료효과를 나타내는 것을 증명한다.

IV. 토의:

상기 연구들은 포자벽-분해 가노데마 포자들이 비-포자벽-분해 포자들 보다 훨씬더 우수한 항종양 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 항종양 효과의 차이에 대한 하나의 설명은 딱딱한 포자벽 층들을 사람이 쉽게 소화할 수 없다는 것이다(항종양율 -4.8%∼22%). 그러나, 포자벽이 분해되면, 함유된 활성물질들이 쉽게 쉽게 흡수될 수 있다(항종양율 27.1%∼45.8%). 또한, 생물활성 물질의 최대 생산을 유도하기 위해서, 발아활성과정을 동시에 수행함으로써, 발아활성화된 가노데마 포자들은 정상 포자벽-분해 가노데마 포자들보다 훨씬 더 많은 생물활성 물질들을 제공한다. 이러한 생물활성 물질들은 정상 포자벽-분해 가노데마 포자들보다 질병에 대한 훨씬더 우수한 치료효과를 나타낸다.

임상예

임상예 1: 만성 B형 간염(HBV) 환자에 대한 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 포자들의 효과들

1. 물질 : 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 포자들이 광조우 녹색식품공학 주식회사 및 그린파워 건강식품 국제 주식회사에 의한 본 발명의 방법에 따라 제조되었다.

II. 환자의 선정:

임상연구가 1998년 12월과 1999년 4월사이에 수행되었다. HBV 진단받은 환자 14명이 선정되었다. 선정은 감염질병 및 기생충부 1995년 국제회의 4차 표준규범 조정안(the standard criteria set forth in the 1995 National Meeting for the Department of Infectious Disease and Parasites)을 기초로 하였다. 7명의 환자들이 무증후성 보균자로 진단되었고, 다른 7명은 만성 간염으로 진단받았다. 그들 중에서, 2명은 보통의 병증(moderate severity)이었고, 2명의 경증이었다. 모든 환자들은 HBsAg(간염균 B 표면 항원), HBeAg(간염 Be 항원) 및 HBV DNA(간염균 B DNA 정량) 양성이 있다. 14명의 환자들에, 8명의 남자와 6명의 여자가 포함되었고, 모두 17∼71세 사이의 나이였다.

III. 복용:

각 환자들은 45일동안 연속으로 매일 3번씩, 복용때마다 3개의 가노데마 포자 정제(錠劑, tablet), 1정제당 200㎎을 복용하였다(1차 복용과정). 15일동안 복용을 멈추고, 다시 45일동안 연속적으로 재복용하였다(2차 복용과정).

IV. 관찰:

1. 혈액시료를 매달 채취하였다. HBsAG, HBeAg 및 HBe-항체를 엘리사(ELISA)법을 사용하여 시험였다. 시험용 키트는 정쉬안 생물공학회사(Chung-Shian Bioengineering Company)에서 제공받았다.

2. 혈청 HBV DNA 정량 시험 시약(Digene Hybrid Capture II Assay)을 정쉬안 의과대학에서 제공받았다.

3. 혈청 ALT 활성이 이탈리아산 생화학 반자동 분석장치를 사용하여 측정하였다.

V. 결과:

A. HBeAg 및 HBV DAN에 대한 발아활성화된 가노데마 포자의 효과

14명의 환자에 가노데마 포자들을 복용시킨 결과를 표 21에 나타내었다. 복용 초기에, 이들 14명의 환자들은 모두 HBeAg 및 HBV DNA 양성으로 검사되었다.

표 21에 나타낸 바와 같이, 1달 동안 포자벽-분해 가노데마 포자들의 복용 후, 2명의 환자들이 HBeAg 음성이 되었고, 1명의 환자가 HBeAb 양성이 되었다. 두달 후, 2명의 환자가 HBeAb양성이 되었고, 3명이 HBV DNA 음성이 되었다. 복용 3달 및 4달동안, 각달에서, 1명의 환자가 HBeAb 양성 및 1명이 HBV 음성이 되었다. 나머지 두명의 환자들이 처음과 같은 HBeAg 음성이었으나, 2달 후에, HBeAg 양성이 되었다. 또한, HBeAg 양성으로 나타난 5명의 환자들이 HBV DNA 음성이 되었다. 후에, 그는 HBeAg 음성 및 HBeAb 양성이 되었으나, 복용 전보다 ALT 함량이 높게 되었다.

B. ASC(무증후성 보균자) 및 CHB(만성간염 B)에 대한 발아활성화된 가노데마 포자들의 효과

ASC 및 CHB 환자에 대한 가노데마 포자들의 치료효과는 유사하고, 통계학적으로 무의미하다.

C. 발아활성 가노데마 포자들의 치료효과에 대한 복용과정

표 22에 나타낸 바와 같이, 가노데마 포자들의 두번의 복용과정 후에, 치료효과는 가노데마 포자의 한번의 복용과정보다 더 좋았다. 상기 나타낸 바와 같이, 1차 복용과정은 45일동안 지속한다. 15일동안 멈춘후, 복용을 45일동안 재시작한다(2차 복용과정).

D. 발아활성화된 가노데마 포자 복용 후의 부작용 관찰

모든 환자 14명이 전체 복용 프로그램을 완수했다. 어떠 사람도 열 또는 피부 염증(irratation)을 보이지 않았다. 모든 환자들은 정상적인 식성 및 수면주기를 유지하였다. 이러한 연구결과들은 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 포자들은 환자에 명백한 부작용 없이 임상적으로 안전하다는 것을 나타낸다.

임상예 2 : 임상관찰

다음은 포자벽-분해 가노데마 포자들을 복용시킨 환자들을 개개적으로 관찰한 것이다.

1. 환자 N : 남성, 36세

진단 : B형 간 간염 보유자; 어머니는 몇 년전에 간암으로 죽었다. 환자 N은 1999년 3월과 1999년 9월 사이에 포자벽-분해된 가노데마 포자들을 고투여하였다. 9월에, 환자 N의 지방간(fatty liver) 및 담낭종양(gall bladder polyps)이 사라졌다. 또한 그의 HBV DNA가 크게 감소했다.

날짜	관찰	변화
1999년 3월	지방간담낭 종양
1999년 7월	HBV DNA 3490pg/㎖
1999년 9월	HBV DNA 620pg/㎖정상간	정상 범위로 줄어듬

2, 환자 L : 남성, 62세

환자 L은 간문맥 정맥 부위에 위치한 종양을 갖는 혈종(종양크기: 5.1x6.6x7.7cm)으로 진단되었다. 그는 1999년 5월에 가노데마 포자의 고투여 복용을 시작하였다. 1997년 8월에 X-선 결과는 그의 종양의 크기가 3.5x3.4x3cm으로 줄어든 것이 확인되었다. 1999년 5월과 8월 사이에 가노데마 포자들은 환자 L에게 유일하게 투여한 약이었다.

날짜	관찰	변화
1999년 5월	간암으로 확인됨종양크기 5.1x6.6x7.7cm다른 부수체 종양들이 존재
1999년 8월	종양크기 3.5x3.4x3cm

3. 환자 C : 남성, 44세

환자 C는 B형 간염 및 초기 간경변 환자로 진단되었고, 1997년 이후로 병원에 입원하고 있다.

날짜	관찰	변화
1999년 3월	B형 간염 및 황달B형 간 간염 및 단지 간경화	복용 시작
현재	HBV DNA 5pg/㎖

4. 환자 L-1: 남성, 67세

환자 L-1은 인슐린 주사를 받은지 10년된 포도당 조절장애(poor glucose control)를 갖는 것으로 진단되었다. 1999년 3월에, 환자 L-1의 헤모글로빈 Alc(HbAlc)는 16.4% 이었다. 환자 L-1은 발아활성화된 포자벽-분해 가노데마 포자들을 1999년 3월에 고투여로 복용하기 시작했다. 1999년 8월에, 그의 HbAlc는 10%로 줄어들었고, 정상적인 포도당 조절 범위내에 있었다.

날짜	관찰	변화
1999년 3월	Hb Alc 16.4%
1999년 8월	Hb Alc 10%
주) 복용은 3월에 시작했다. 결과 : 정상적인 포도당 조절

본 발명을 예들 및 바람직한 실시예들로 설명하였지만, 본 발명이 개시된 실시예에만 국한되는 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명이 다양한 변형이 가능하다는 것은 당업자들에게 자명할 것이다. 따라서, 첨부된 청구의 범위는 그러한 모든 변형을 포함하기위해 가장 넓은 해석을 제시하였다.

본 발명은 면역장애, 암, 에이즈, 간염, 당뇨병 및 심장혈관 질환을 갖는 환자에 약효가 있고, 자유라디칼 산화 및 간-독성 효과을 예방하거나 억제할 수 있는 생물활성 물질들을 생산하는 적색 가노데마 루시덤(Ganoderma lucidum)의 포자를 활성화시키는 발아방법을 제공한다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법:

발아를 유도하기 위해서 물, 식염수 및 영양용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 용액에 포자를 침지시키는 단계; 및

상기 발아처리된 포자를 배양박스에 넣는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 포자들을 50℃이하에서 30분∼8시간동안 용액에 침지시키는 것을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 영양용액이 코코넛 쥬스, 맥아추출물, 가노데마 조포낭(sporocarp) 추출물, 가노데마 캐필리티아(capillitia) 추출물, 비오틴을 함유한 배양액, 및 포타슘 포스페이트 및 마그네슘 설페이트를 함유한 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나임을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 포자들을 2∼4시간 동안 용액에 침지시키는 것을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 포자들을 20∼43℃에서 용액에 침지시키는 것을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 용액이 상기 포자 무게의 0.1∼5배임을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 포자들을 65∼98%의 상대습도 및 18∼48℃의 온도를 갖는 배양박스 내에 넣는 것을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 1항에 따라 발아활성화된 가노데마 포자들을 세포벽 분해특성을 갖는 효소를 갖고 처리하는 단계를 포함하는 포자벽-분해 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 효소가 키티나제 또는 셀룰라제임을 특징으로 하는 포자벽-분해 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 1항에 따라 발아활성화된 가노데마 포자들을 기계적힘으로 처리하는 단계를 포함하는 포자벽-분해 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 기계적힘이 미분화(micronization), 롤 프레싱, 분쇄, 초음파, 초고압 미세증기처리(super high pressure microstream treatment)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나임을 특징으로 하는 포자벽-분해 가노데마 포자들을 생산하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 발아활성화된 가노데마 포자들로부터 생물활성 물질들을 추출하는 방법:

제 8항에 따라 포자벽-분해된 가노데마 포자들을 저온에서 건조하는 단계; 및

건조된 포자벽-분해 가노데마 포자들을 추출하는 단계.
제 12항에 있어서, 상기 건조는 동결-건조 또는 진공-건조임을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들로부터 생물활성 물질들을 추출하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 생물활성 물질들이 물, 알콜, 또는 박막 응축(thin film condensation)에 의해서 추출됨을 특징으로 하는 발아활성화된 가노데마 포자들로부터 생물활성 물질들을 추출하는 방법.
제 8항의 포자벽-분해 가노데마 포자들 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 10항의 포자벽-분해 가노데마 포자들 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 12항의 포자벽-분해 가노데마 포자들 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 면역장애 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역장애 치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 면역장애 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역장애 치료방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 면역장애 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역장애 치료방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간염 치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간염 치료방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간염 치료방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 에이즈 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 에이즈 치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 에이즈 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 에이즈 치료방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 에이즈 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 에이즈 치료방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 암 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 암 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암치료방법
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 암 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암치료방법
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 당뇨병 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 당뇨병 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 당뇨병 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 자유라디칼 산화 예방에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 자유라디칼 산화 예방방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 자유라디칼 산화 예방에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 자유라디칼 산화 예방방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 자유라디칼 산화 예방에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 자유라디칼 산화 예방방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간독성 저해에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 간독성 저해방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간독성 저해에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 간독성 저해방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 간독성 저해에 효과적인 양으로 사람에게 투여하는 것을 포함하는 간독성 저해방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 심장혈관 질환 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장혈관 질환 치료방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 심장혈관 질환 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장혈관 질환 치료방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 심장혈관 질환 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장혈관 질환 치료방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 박테리아 또는 바이러스 감염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 박테리아 또는 바이러스 감염치료 방법.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 박테리아 또는 바이러스 감염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 박테리아 또는 바이러스 감염치료 방법.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 박테리아 또는 바이러스 감염 치료에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는 박테리아 또는 바이러스 감염치료 방법.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 면역장애 치료제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 면역장애 치료제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 면역장애 치료제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항암제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항암제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항암제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-에이즈제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-에이즈제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-에이즈제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 당뇨병 치료제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 당뇨병 치료제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 당뇨병 치료제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간염 치료제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간염 치료제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간염 치료제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항산화제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항산화제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항산화제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간독성 저해제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간독성 저해제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 간독성 저해제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 심장질환 치료제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 심장질환 치료제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 심장질환 치료제.
제 8항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-박테리아제 또는 항-바이러스제.
제 10항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-박테리아제 또는 항-바이러스제.
제 12항에 따라 제조된 생물활성 물질들을 포함하는 항-박테리아제 또는 항-바이러스제.