CN105378056B - 灵芝菌丝体的工业级培养方法 - Google Patents

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Abstract

本文揭示一种用以培养灵芝菌丝体的工业级方法。依据所揭示内容，每隔30天可自约300公升的液态培养物中收成高达约15公斤的干燥灵芝菌丝体，且所收成的干燥灵芝菌丝体中富含高量的三萜化合物，其至少包含灵芝酸S(ganoderic acid S,GAS)、灵芝酸T(ganoderic acid T,GAT)、灵芝酸Me(ganoderic acid Me,GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R,GAR)、及赤灵酸S(ganodermic acid S,GMAS)。

Description

灵芝菌丝体的工业级培养方法
技术领域
本揭示内容是有关于一种工业级的灵芝培养方法，特别是用以培养灵芝菌丝体，而非灵芝子实体的工业级培养方法。
背景技术
长久以来，在东南亚地区，食用性真菌都被当作营养补充品或健康食品来使用，其中又以灵芝(Ganoderma lucidum)为大宗，且因其具有医疗效果也被当作药材使用超过千年之久。自灵芝中分离出来的活性成分大致包括灵芝三萜类(triterpenoids)、多糖体(polysaccharides)、核苷(nucleic acids)、多肽类(polypeptides)、和植物固醇类(phytosterols)等等。在这些活性成分中，又以灵芝三萜类最重要，因其具有药学活性，包括抑制胆固醇合成、抗癌、抗高血压等等。灵芝三萜类包含各式灵芝酸(ganoderic acids,GAs)、赤灵酸(ganodermic acids,GMAs)、灵芝醇(ganoderic alcohol)、灵芝酮(ganodericketone)、灵芝醛(ganoderic aldehyde)等化合物。在灵芝酸的相关研究中发现，灵芝酸具有可杀死癌细胞的细胞毒性和抑制其扩增的效果。举例来说，已知灵芝酸D(ganodericacid D,GAD)可防止人类子宫颈癌细胞(即，Hela细胞)增生(Yue et al.,Mol CellProteomics(2008)7:949-961)；灵芝酸A和H(ganoderic acids A and H；简称GAA及GAH)可抑制乳癌细胞生长或防止其侵犯其它组织(Jiang et al.,Int J Mol Med(2008)21:577-584)；灵芝酸X(ganoderic acid X,GAX)可抑制拓朴酶活性并能诱使肝癌细胞进入细胞凋亡程序(Li et al.,Life Sci.(2005)77,252-265)；灵芝酸M除了可有效地抑制癌细胞生长外，还可抑制肺癌细胞的迁移(Wang et al.,Int Immunopharmacol(2007)7:864-870)，GMAS则已知可诱发血小板聚集(Wang et al.,Biochim.Biophys.Acta.(1989)986,151-160)、抑制血小板功能(Wang et al.,Biochem.J.(1991)277(Pt 1),189-197)和抑制由血栓素A2(Su et al.,Biochem.Pharmacol.(1999)58,587-595；Su et al.,Biochim.Biophys.Acta.(1999b)1437,223-234)或前列腺素E1(Su et al.,Thromb.Res.(1999c)99,135-145)在血小板中所诱发的细胞反应。
过去，灵芝仅能在自然环境中生长或仅出现在偏远高山的老树上。但是，随着灵芝培育技术不断被改进，现在已可在人工环境下培育出灵芝，但多半使用固态基质；例如，日本公开专利第57014816号揭示一种透过将赤芝孢子种植在木材中而来培育赤芝的方法，但此方法的缺点是产率太低，因播种孢子本身就需要花费许多人力，且培育期太长，需等到120至150天才能采收，此外，所长成的灵芝及其所含活性化合物(三萜类化合物)的种类与含量都与天然灵芝相去甚远。
基于此，相关领域亟需一种改良的灵芝培育方法，其可在极短的时间内产生可供制造药物用的灵芝活性化合物。
发明内容
因此，本揭示内容目的是提供一种用以培育灵芝，特别是用以培育灵芝菌丝体，而非子实体，的工业级培育方法。依据本揭示内容，每隔30天可自约300公升的液态培养物中收成高达约15公斤的干燥灵芝菌丝体，且所收成的干燥灵芝菌丝体中富含高量的三萜化合物，其至少包含灵芝酸S(ganoderic acid S,GAS)、灵芝酸T(ganoderic acid T,GAT)、灵芝酸Me(ganoderic acid Me,GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R,GAR)、及赤灵酸S(ganodermic acid S,GMAS)。依据一较佳实施方式，由所述方法培育而成的灵芝菌丝体，每公克干燥菌丝体含有约28-33毫克的三萜化合物。
所揭示工业级培育灵芝菌丝体的方法包含以下步骤：
(a)将灵芝菌丝体接种在不超过1公升的液态培养基中并培育约5-15天；
(b)将步骤(a)所收成的液态培育物接种在至少30公升的液态培养基中并培育约2-5天；
(c)将步骤(b)所收成的液态培育物接种在至少300公升的液态培养基中并培育约2-5天；以及
(d)将步骤(c)所收成的液态培育物移转到复数个培养盘中，使每一培养盘中每毫升液态培养基分别具有约1.5-2.5平方公分的表面积，并且在介于约200-2,000照度下培育约10-20天。
依据一较佳实施方式，所揭示方法的每一步骤均是在介于约20-35℃的温度、约50-100％的相对湿度、以及约5-200LPM(公升/分钟)的通气量下实施。
依据一较佳实施方式，所述步骤(a)、(b)及(c)均是在黑暗中且振荡或搅拌速度介于约50-200rpm下实施：且所述步骤(d)的照度为720lux。
适合用于本发明的液态培养基至少包含葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母抽出物和盐类。非必要的，此液态培养基还可更包含黄豆粉。
依据一较佳实施方式，本发明方法更包含以下步骤：
(e)从步骤(d)的液态培育物中收获灵芝菌丝体；和
(f)将步骤(e)所收获的灵芝菌丝体干燥直到其水分含量低于5％为止，其中每公克该干燥的灵芝菌丝体中含有约28-33毫克的三萜化合物。
依据本发明培育方法所获得的干燥的灵芝菌丝体中的三萜化合物至少包含灵芝酸S(ganoderic acid S,GAS)、灵芝酸T(ganoderic acid T,GAT)、灵芝酸Me(ganodericacid Me,GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R,GAR)、及赤灵酸S(ganodermic acid S,GMAS)。
依据一较佳实施方式，步骤(d)中的培养盘数目为288；且依据本发明方法每隔30天可收获至少约15公斤的干燥灵芝菌丝体。
透过以下的详细说明、图示与附随的权利要求书，将可更了解本揭示内容的这些及其它特征。需知以上的概述及以下的详细说明仅为例示，用来阐述本揭示内容，而非用以限制本揭示内容的范畴。
附图说明
为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1是依据本发明一实施方式所显示的培养系统100的示意图；及
图2是依据本发明另一实施方式所显示的培养盘121a和培养架120的示意图。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作该多个具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将该多个数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
本发明内容是关于一种工业级培养灵芝菌丝体的方法，依据所揭示方法，每隔30天可收获至少约15公斤的干燥灵芝菌丝体，其中每公克干燥灵芝菌丝体含高达约28-33毫克的三萜化合物，其至少包含灵芝酸S(ganoderic acid S,GAS)、灵芝酸T(ganoderic acidT,GAT)、灵芝酸Me(ganoderic acid Me,GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R,GAR)和赤灵酸S(ganodermic acid S,GMAS)。此外，依据本揭示内容，若需要将产量放大时，仅需将所揭示批次制备方法成比例放大(即，2倍、3倍或更多)，即可获得成比例量的干燥灵芝菌丝体。
依据所揭示培育灵芝菌丝体的方法，其至少包含四个阶段。在第一阶段，先将灵芝菌丝体接种在内含不超过1公升第一液态培养基的培养瓶内，并于适当培养条件下培育约5-15天。较佳是，将灵芝菌丝体接种不超过0.8公升，更佳是不超过0.5公升的第一液态培养基内。所揭示的第一液态培养基至少包含：1.5％葡萄糖、1.5％蔗糖、0.5％蛋白胨、0.2％酵母抽出物、和0.06％KH2PO4。接种后，于持续振荡的情况下，将整个液态培养基培养在符合以下条件的环境下：振荡速度介于约50-120rpm，例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120rpm；温度介于约20-35℃，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃；培育约5-15天，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。较佳是，振荡速度是介于约65-105rpm，例如约65、70、75、80、85、90、95、100或105rpm；温度介于约22-33℃，例如约22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33℃；培育约8-12天，例如约8、9、10、11或12天；更佳是，振荡速度是介于约75-90rpm，例如约75、80、85或90、rpm；温度介于约25-30℃，例如约25、26、27、28、29或30℃；培育约9-11天，例如约9、10或11天。在一较佳实施方式中，是在振荡速度约85rpm、温度约28℃下培育约10天。
在第二阶段，先将第一阶段所收获的液态培育物接种在内含至少30公升第一液态培养基的酦酵槽内，并于适当培养条件下培育约2-5天。类似的，接种后，于持续搅拌的情况下，将整个液态培养基培养在符合以下条件的环境下：搅拌速度介于约80-200rpm，例如约80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200rpm；通气量介于约5-15LPM，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15LPM；和温度介于约20-35℃，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃；培育约1-5天，例如约1、2、3、4或5天。较佳是，搅拌速度是介于约110-170rpm，例如约110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165或170rpm；通气量介于约7-12LPM，例如约7、8、9、10、11或12LPM；温度介于约22-33℃，例如约22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33℃；培育约2-4天，例如约2、3或4天；更佳是，搅拌速度是介于约120-160rpm，例如约120、125、130、135、140、145、150、155或160rpm；通气量介于约9-10LPM，例如约9或10LPM；；温度介于约25-30℃，例如约25、26、27、28、29或30℃；培育约3天。在一较佳实施方式中，是在搅拌速度约150rpm、通气量约10LPM、温度约28℃下培育约3天。
在第三阶段，先将第二阶段所收获的液态培育物接种在内含至少300公升第二液态培养基的酦酵桶内，并于适当培养条件下培育约2-6天。第二液态培养基至少包含：3％葡萄糖、6.5％蔗糖、1.0％蛋白胨、3％黄豆粉、0.6％酵母抽出物、0.06％KH2PO4和0.05％MgSO4。类似的，接种后，于持续搅拌的情况下，将整个液态培养基培养在符合以下条件的环境下：搅拌速度介于约50-150rpm，例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150rpm；通气量介于约50-150LPM，例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150LPM；和温度介于约20-35℃，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃；培育约2-6天，例如约2、3、4、5或6天。较佳是，搅拌速度是介于约70-130rpm，例如约70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130rpm；通气量介于约80-130LPM，例如约80、90、100、110、120或130LPM；温度介于约22-33℃，例如约22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33℃；培育约3-5天，例如约3、4或5天；更佳是，搅拌速度是介于约85-115rpm，例如约85、90、95、100、105、110或115rpm；通气量介于约90-110LPM，例如约90、100或110LPM；温度介于约25-30℃，例如约25、26、27、28、29或30℃；培育约4天。在一较佳实施方式中，是在搅拌速度约110rpm、通气量约100LPM、温度约28℃下培育约4天。
在第四阶段，将第三阶段所收获的液态培育物转移到多个培养盘中，使得每个培养盘中每毫升液态培养基具有约1.5-2.5平方公分的表面积，之后在约200-2,000照度下培养约10-20天。简言之，是在每一培养盘中倒入约0.5-1公升的第三阶段所收获的液态培育物，每一培养盘的面积介于约1,000-2,500平方公分间，较佳是介于约1,500-2,000平方公分间，更佳是约1,800平方公分。在本阶段中，使用高达约288个培养盘来盛装第三阶段所收获的液态培育物，以进行后续的培育。接着，将该多个盛装有第三阶段所收获的液态培育物的培养盘堆栈起来，放在培养盘架上，推入具有温度、湿度、通气以及光照控制的环境中，继续培育。详言之，是将培育温度控制在约20-35℃间，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃；相对湿度控制在约50-100％间，例如约50、60、70、80、90或100％；通气量介于约5-20LPM间，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20LPM；光照强度约100至1,000照度间，例如约100、130、200、260、300、390、400、460、520、650、780、910或1000照度；培育约10-20天，例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。较佳是将培育物维持在温度约22-33℃间，例如约22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33℃；相对湿度控制在约70-100％间，例如约70、80、90或100％；通气量介于约8-18LPM间，例如约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18LPM；光照强度约200至780照度间，例如约200、260、300、390、400、460、520、650或780照度；培育约12-18天，例如约12、13、14、15、16、17或18天。更佳是将培育物维持在温度约25-30℃间，例如约25、26、27、28、29或30℃；相对湿度控制在约80-100％间，例如约80、90或100％；通气量介于约10-16LPM间，例如约10、11、12、13、14、15或16LPM；光照强度约300至520照度间，例如约300、390、400、460或520照度；培育约14-16天，例如约14、15或16天。在一较佳实施方式中，是在通气量约15LPM、相对湿度100％、光照强度约460照度且温度约28℃下培育约14天。
典型的情况是在如图1所示的培育系统100中进行第四阶段的培育。此培育系统100包括一外壳110以及至少4个培养架；但图1中仅示出两个培养架(120,130)。每一培养架(120)分别包含两栏(120a,120b)，每一栏可分别置入至少一个培养盘(121a)。培养盘可由金属或塑料材料制成，且可以具有任意的形状或大小。在如图2所示的实施方式中，该培养盘(121a)是由不锈钢金属制成，为长方形形状，宽度约40公分、长度约60公分且高度约5公分。每一培养架的每一栏最多可置入36个培养盘，因此每一培养架上可堆栈高达72个培养盘；故，所揭示培育系统100最多可放入288个培养盘。
接着，将依据以上所揭示方法而培育并收获的灵芝菌丝体在不高于70℃的温度下风干，最好是在不高于60℃的温度下风干，直到其水分含量低于约10％以下，较佳是低于约5％以下，更佳是低于约3％以下。
一般来说，依据上述培育方法，可从每一批次培育物或300公升的第三阶段液态培育物中收成约10-20公斤的干燥灵芝菌丝体，较佳是可收成约13-17公斤的干燥灵芝菌丝体。
并且，依据本发明揭示培育方法而收成的干燥灵芝菌丝体中，每公克干燥灵芝菌丝体中含有高达约28-33毫克的三萜化合物；较佳是，每公克干燥灵芝菌丝体中含有高达约30毫克的三萜化合物。该多个三萜化合物至少包含GAS、GAT、GAMe、GAR、及GMAS。
此外，当需要获得更高量的三萜化合物时，此领域具有通常知识的相关技艺人士可轻易地借由成倍复制此所揭示的培育方法与系统，而将所揭示制备方法放大，以获得成倍(如2倍、3倍或更高倍数)的干燥灵芝菌丝体。
以下实施例是用来阐明本揭示内容特定方式，并帮助已知技艺者了解并实施本揭示内容。但本揭示内容范畴并不限于该多个实施例中。
实施例
实施例1以工业级规模培育灵芝菌丝体
1.1生产第一阶段液态培育物
将约1平方公分的灵芝菌丝体接种在400毫升的第一液态培养基中，此第一液态培养基包含1.5％葡萄糖、1.5％蔗糖、0.5％蛋白胨、0.2％酵母抽出物、和0.06％KH2PO4。接着，以约85rpm的速度持续搅拌培育物，并在约28℃的温度下培育约10天，所得培育物称“第一阶段液态培育物”。
1.2生产第二阶段液态培育物
将约30公升的第一液态培养基倒入体积约50公升的酦酵槽内，接着，将约2.8公升的实施例1.1的第一阶段液态培育物接种在酦酵槽内的第一液态培养基中。以约150rpm的速度持续搅拌培育物，并在通气量约10LPM、温度约28℃下培育约3天，所得培育物称“第二阶段液态培育物”。
1.3生产第三阶段液态培育物
将约300公升的第二液态培养基倒入体积约500公升的酦酵槽内，接着，将约50公升的实施例1.2的第二阶段液态培育物接种在酦酵槽内的第二液态培养基中。此第二液态培养基至少包含：3％葡萄糖、6.5％蔗糖、1.0％蛋白胨、3％黄豆粉、0.6％酵母抽出物、0.06％KH2PO4和0.05％MgSO4。接着，以约100rpm的速度持续搅拌培育物，并在通气量约100LPM、温度约28℃下培育约4天，所得培育物称“第三阶段液态培育物”。
1.4放大培育第三阶段液态培育物
在无菌情况下，于288个培养盘(40公分x60公分x5公分)中分别倒入约1公升的第三阶段液态培育物，接着，将培养盘放入如图1所示的培养系统中，于100％相对湿度、通气量约15LPM、温度约28℃、光照约460照度下培育约14天。收集所产生的灵芝菌丝体，并以约60℃的温度风干直到其含水量低于约5％为止。
实施例2各培育条件对实施例1的干燥灵芝菌丝体内三萜化合物量的影响
在本实施例中，透过改变实施例1.4的培育条件以及产物中所含三萜化合物的量，来找出最适宜放大实施例1.3的第三阶段液态培育物的培育条件。所测试并加以变化的培育条件包括：光照强度从0至720照度，通气量从0至30LPM，相对湿度从50％至100％，温度从约23℃至33℃。之后，收集各条件下所培育出来的灵芝菌丝体，于60℃的温度下风干直到水分含量低于5％，并测定其所含的三萜化合物(其至少包含GAS、GAT、GAMe、GAR、及GMAS)的总量。结果示于表1-5。
表1 光照强度对实施例1的灵芝菌丝体中三萜化合物量的影响
表2 通气量对实施例1的灵芝菌丝体中三萜化合物量的影响
表3 相对湿度对实施例1的灵芝菌丝体中三萜化合物量的影响
表4 培育温度对实施例1的灵芝菌丝体中三萜化合物量的影响
表5 每一培养架上装载的培养盘数对实施例1的灵芝菌丝体中三萜化合物量的影响
综合以上表1-5的结果，可发现如果将最后放大阶段的灵芝培育物培育在有光照的环境下，可提高灵芝菌丝体内三萜化合物的含量高达3倍，比较表1中无光照以及光照260照度的结果，每克菌丝干重内三萜化合物的含量从9.11毫克提高至26.66毫克。至于其它培育条件对三萜化合物含量的影响，则发现通气量至少需达15LPM、相对湿度至少需达80％、且温度至少需为28℃。
至于系统中培养细胞的盘数，实验也发现当培养盘数少的时候，灵芝菌丝体内三萜化合物的含量反而呈现微幅下降。推测此是因为培育系统中因培育物减少造成相对湿度下降(即，无法维持80％)所致。
当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且熟习此技艺者可对齐进行各种修饰。上文提出的说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并作为实作本发明的例示。虽然本发明内容已以实施方式揭示如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何熟习此技艺者，在不脱离本揭示内容的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明内容的保护范围当视后附的权利要求书所界定者为准。

Claims (9)

1.一种工业级培养灵芝菌丝体的方法，包含：
(a)将灵芝菌丝体接种在不超过1公升的一液态培养基中并培育5-10天；
(b)将步骤(a)的液态培育物接种在至少30公升的该液态培养基中并培育2-5天；
(c)将步骤(b)的液态培育物接种在至少300公升的该液态培养基中并培育2-5天；及
(d)将步骤(c)的液态培育物分装到多个培养盘中，并在介于200至2,000照度下培育10-20天，其中在每个培养盘中，每毫升培养基具有1.5-2.5平方公分的表面积；
其中，步骤(a)、(b)及(c)均是在黑暗中进行，且步骤(a)至(d)任一步骤都是在温度20-30℃间、相对湿度50-100％间、通气量5-200LPM间实施。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在每个培养盘中，每毫升培养基具有1.8平方公分的表面积。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该液态培养基包含葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母抽出物、及盐类。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该液态培养基更包含黄豆粉。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(d)的照度为460照度。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该多个培养盘的数目为288。
7.如权利要求2所述的方法，更包含：
(e)自步骤(d)的培育物中收获菌丝体；以及
(f)干燥步骤(e)所收获的菌丝体直到其含水量低于5％为止，其中该干燥的灵芝菌丝体中，每公克灵芝菌丝体干重中三萜化合物总量高达28-33毫克。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该三萜化合物至少包含灵芝酸S、灵芝酸T、灵芝酸Me、灵芝酸R、及赤灵酸S。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法可产生至少15公斤的干燥灵芝菌丝体。
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