CN106883010A - 樟芝生长促进剂及用其快速发酵生产樟芝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种樟芝生长促进剂及用其快速发酵生产樟芝的方法，包括斜面培养、液态种子制备、液态发酵及固态发酵，在各发酵过程中可添加香草醛等芳香族化合物中的一种或几种的组合，从而极大地缩短发酵生产樟芝菌丝体及子实体的培养周期，提高生物活性物质樟芝三萜的含量。与目前研究报道的技术相比，本发明技术工艺简单、高效，使用了微量的生长促进剂，可以达到快速生产樟芝菌丝体及子实体的目的，发酵周期较传统方法缩短50％以上，樟芝三萜的含量提高了60％以上，降低了生产成本，具有良好的工业运用前景。

Description

樟芝生长促进剂及用其快速发酵生产樟芝的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在发酵过程中添加一种生长促进剂或几种生长促进剂组合，利用液态发酵，培养基固态发酵及太空包固态发酵等手段，从而快速生产樟芝菌丝体及子实体的方法。
背景技术
牛樟芝(Antrodia camphorata)是具有高度的宿主专一性的薄孔菌属珍稀药用真菌，仅生长于台湾特有常绿阔叶乔木牛樟树腐朽树干内壁。历史上台湾人民作为解酒保肝，治疗腹泻的传统中药，现代研究表明樟芝含有多种有效成分，如三萜、多糖、甾体和苯环衍生物等，同时具有多种药理活性，如抗肿瘤、增加免疫能力、抗病毒、抗高血压、抗炎症、降胆固醇、保护肝脏等。近年来，随着樟芝保健及药用价值的逐步开发，人们的消费需求日益增长，但由于野生牛樟芝生长十分缓慢，资源稀少，使得野生牛樟芝价格十分昂贵，市价高达每台斤新台币十多万元至数十万元。
目前樟芝逐渐成为保健和治疗疾病的新星，使得研究者和开发商十分注重人工培养技术的研究。樟芝的人工培养方法主要有三种：椴木栽培法、固体栽培法和液体发酵法，椴木栽培法获得产物成分与野生樟芝相似，但其培养周期2～3年，依赖于牛樟树椴木资源，不利于牛樟树资源保护，不宜运用于工业化大规模生产。液体发酵法培养周期仅7～14天，生产成本低，相关技术运用成熟，但活性成分及药理活性与野生樟芝差异较大。樟芝固态栽培与野生牛樟芝生长环境类似，培养所得产物形态及有效成分与野生牛樟芝较为相似，主要的固态培养方法为太空包和三角瓶固态发酵，但其培养周期较长，容易污染杂菌，生产成本较高。
专利CN101803534B提供了一种樟芝的大规模固体培养方法，通过太空包接种培养可大规模运用于商业化种植，所得樟芝子实体形似圆锥，重量约为0.2～1.0kg，但培养周期较长，为5～8月。
本专利通过在液体发酵、固态发酵和太空包固态发酵添加不同种类和浓度的生长促进剂，促进樟芝菌丝体及子实体的快速生产，同时，在发酵过程中使用本专利提供的生长促进剂可提高樟芝主要活性成分樟芝三萜的含量。综上所述，本专利提供了一种樟芝快速高效发酵工艺，节省时间成本，满足日益增长的樟芝产品需求，具有极大地工业运用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵促进剂，可以在不改变其它发酵条件以及发酵培养基组成的情况下，刺激樟芝孢子迅速萌发，生成大量樟芝菌丝体，提高樟芝主要活性成分三萜含量并降低生产成本。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种樟芝快速发酵的生长促进剂，该生长促进剂包含香草酸、肉桂酸、丁香酸、香草醛、阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸、苯酚、苯甲醇、苯乙醇中的一种或几种，可促进液体发酵生产菌丝体、固态发酵生产樟芝子实体，使用浓度范围为0.1～10mM，过滤除菌后在发酵培养工序中加入，可一次或者多次添加。所述的生长促进剂可在现有文献公开的所有樟芝发酵工艺中使用，均能缩短发酵周期，提高有效成分樟芝三萜的含量。
一种采用生长促进剂的樟芝快速发酵方法，其特征为，该方法包括斜面培养、种子制备、液态发酵和固态发酵培养工序，如下所述：
A.斜面培养：樟芝菌丝体转接至PDA斜面培养基，24～30℃培养10～30d；
B.种子制备：樟芝斜面菌种接入种子培养基，在24～30℃培养10～20d得到种子液；种子培养基按质量体积比为：葡萄糖15～25g/L，酵母粉0.5～2g/L，硫酸镁0.5～2g/L，磷酸二氢钾1～4g/L，pH 4.5；
C.液态发酵：将步骤B发酵得到的樟芝发酵液接种至含生长促进剂的液体发酵培养基继续发酵，控制培养温度为24～30℃、培养7～13d；
D.固态发酵：将步骤B发酵得到的樟芝发酵液接种至含生长促进剂的固体培养基或新鲜的太空包继续发酵，控制培养温度为24～30℃、培养4～9月；太空包按质量比的组成为：香樟树木屑40～70份，麸皮5～25份，豆饼粉5～25份，硫酸镁0.15～3份，磷酸二氢钾0.15～3份，喷洒含0.1～10mM发酵促进剂的水溶液，调整水份至35～65％，混合所有物料制备太空包。
可根据产品需求，选择A-B-C或A-B-D步骤进行发酵生产。
发酵结束，取樟芝菌丝体或子实体烘干并粉碎。称取粉碎后的樟芝子实体菌粉0.05g，加入500μL甲醇，50Hz超声2h提取樟芝三萜，提取液利用齐墩果酸-香草醛-冰醋酸比色法测定樟芝三萜含量。
本发明的积极作用在于：在发酵培养基中添加了经过试验筛选得出的发酵促进剂，刺激樟芝孢子萌发及菌丝生长，将樟芝的太空包固态发酵培养时间缩短到4～5月，降低了污染杂菌的概率，樟芝活性成分三萜提高了67.24％，且发酵促进剂用量极少且价格低廉，并不会明显增加生产成本。发酵结束后，可以利用菌体收集的水洗等工艺将发酵促进剂去除，发酵促进剂的残留浓度低于0.5mg/kg菌体，远低于《食品中污染物限量国家标准》规定限量一般为3～5mg/kg的要求，符合卫生部、国家食品药品监督管理局的相关标准。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。例如，本发明所述的基于该发酵促进剂的快速发酵工艺可应用于所有的樟芝菌种。又如，该发酵促进剂可用于樟芝斜面培养及种子制备发酵培养过程中生产樟芝菌丝体均属于本发明的范畴。
具体实施方式以下通过实例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
1.樟芝菌丝体转接至PDA斜面培养基，24～30℃培养10～20d；
2.樟芝斜面菌种接入种子培养基，在24～30℃培养10～20d得到含无性孢子种子液；
种子培养基(g/L)：葡萄糖15～25，酵母粉0.5～2，硫酸镁0.5～2，磷酸二氢钾1～4，pH 4.5；
3.樟芝固态发酵培养基以重量百分比计算的组成为香樟树木屑30％～60％，麸皮5％～20％，豆饼粉5％～20％，硫酸镁0.15％～3％，磷酸二氢钾0.15％～3％，喷洒含30μM发酵促进剂香草醛的水溶液，调整水份至35-65％，混合所有物料制备太空包，每包1.0～5.0kg。将太空包置于100～180℃灭菌2～5h，冷却至室温备用。
4.将事先准备好的樟芝菌种接种于太空包，然后将太空包放置温室，在24～30℃下培养1～2个月后去除太空包，加香草醛水溶液润湿以促进其表面子实体生长，培养5个月之后采收风干的樟芝子实体。
5.称取粉碎后的樟芝子实体菌粉0.05g，加入500μL甲醇，50Hz超声2h提取樟芝三萜，提取液利用齐墩果酸-香草醛-冰醋酸比色法测定樟芝三萜含量，得到樟芝三萜含量分别为44.43mg/g。
实施例2
1.樟芝菌丝体转接至PDA斜面培养基，24～30℃培养10～20d；
2.樟芝斜面菌种接入种子培养基，在24～30℃培养10～20d得到含无性孢子种子液；
种子培养基(g/L)：葡萄糖15～25，酵母粉0.5～2，硫酸镁0.5～2，磷酸二氢钾1～4，pH 4.5；
3.樟芝液态发酵培养，将樟芝种子液按体积比5％接种于樟芝液态发酵培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，pH 4.5)，在樟芝液态发酵培养基中添加阿魏酸30μM，26℃，150rpm培养10d，收集樟芝菌丝体，烘干，粉碎。
4.称取烘干粉碎后的樟芝菌丝体及子实体菌粉0.05g，加入500μL甲醇，50Hz超声2h提取樟芝三萜，提取液利用齐墩果酸-香草醛-冰醋酸比色法测定樟芝三萜含量，得到樟芝菌丝体三萜含量为23.45mg/g。
实施例3
采用不添加发酵促进剂的方法培养樟芝子实体，具体步骤如下：
1.樟芝菌丝体转接至PDA斜面培养基，24～30℃培养10～20d；
2.樟芝斜面菌种接入种子培养基，在24～30℃培养10～20d得到含无性孢子种子液；
种子培养基(g/L)：葡萄糖15～25，酵母粉0.5～2，硫酸镁0.5～2，磷酸二氢钾1～4，pH 4.5；
3.樟芝固态发酵培养基以重量百分比计算的组成为香樟树木屑30％～60％，麸皮5％～20％，豆饼粉5％～20％，硫酸镁0.15％～3％，磷酸二氢钾0.15％～3％，调整水份至35-65％，混合所有物料制备太空包，每包1.0～5.0kg。将太空包置于100～180℃灭菌2～5h，冷却至室温备用。
4.将樟芝种子液接种于太空包，然后将太空包放置温室，在24-30℃下培养2个月后去除太空包，加湿以促进其表面子实体生长，8～9个月之后采收风干的樟芝子实体。
此外，在太空包制作的过程中，喷洒含30μM发酵促进剂香草醛/阿魏酸/香草酸/苯乙醇/香草醛及苯乙醇混合物/香草酸及苯乙醇混合物/香草醛及阿魏酸混合物的水溶液，其它操作同上。太空包放置温室，在24～30℃下培养1～2个月后去除太空包，再次喷洒发酵促进剂润湿以促进其表面子实体生长，培养4～6个月之后采收风干的樟芝子实体，检测其中三萜的含量。
表1发酵促进剂对樟芝培养周期及三萜含量的影响

Claims (6)

1.一种樟芝快速发酵的生长促进剂，其特征为，该生长促进剂包含香草酸、肉桂酸、丁香酸、香草醛、阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸、苯酚、苯甲醇、苯乙醇中的一种或几种，可促进液体发酵生产菌丝体、固态发酵生产樟芝子实体。
2.权利要求1所述的生长促进剂的使用方法，其特征为，该生长促进剂使用浓度范围为0.1～10mM，过滤除菌后在发酵培养工序中加入。
3.如权利要求2所述的方法，其特征为，所述的生长促进剂经过滤除菌后在发酵培养过程中可一次或者多次添加。
4.如权利要求2所述的方法，其特征为，所述的生长促进剂可在现有文献公开的所有樟芝发酵工艺中使用，均能缩短发酵周期，提高有效成分樟芝三萜的含量。
5.一种采用生长促进剂的樟芝快速发酵方法，其特征为，该方法包括斜面培养、种子制备、液态发酵和固态发酵培养工序，如下所述：
A.斜面培养：樟芝菌丝体转接至PDA斜面培养基，24～30℃培养10～30d；
B.种子制备：樟芝斜面菌种接入种子培养基，在24～30℃培养10～20d得到种子液；种子培养基按质量体积比为：葡萄糖15～25g/L，酵母粉0.5～2g/L，硫酸镁0.5～2g/L，磷酸二氢钾1～4g/L，pH 4.5；
C.液态发酵：将步骤B发酵得到的樟芝发酵液接种至含生长促进剂的液体发酵培养基继续发酵，控制培养温度为24～30℃、培养7～13d；
D.固态发酵：将步骤B发酵得到的樟芝发酵液接种至含生长促进剂的固体培养基或新鲜的太空包继续发酵，控制培养温度为24～30℃、培养4～9月；
可根据产品需求，选择A-B-C或A-B-D步骤进行发酵生产。
6.如权利要求5所述的樟芝快速发酵方法，其特征为，步骤D中太空包按质量比的组成为：香樟树木屑40～70份，麸皮5～25份，豆饼粉5～25份，硫酸镁0.15～3份，磷酸二氢钾0.15～3份，喷洒含0.1～10mM发酵促进剂的水溶液，调整水份至35～65％，混合所有物料制备太空包。
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