CN107271490A - 牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜化合物含量变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜类化合物含量变化的方法，属于微生物发酵领域。本发明方法为牛樟芝液体发酵中，通过快速在线或者离线检测分析一种挥发性芳香物质α‑松油醇含量，进而能够快速预测判定三萜类化合物含量变化的分析方法，实现了发酵过程的自动化控制。根据在线实时参数的变化进行发酵过程的三萜类化合物预测分析增加了发酵过程的可控性和生产可预测性。这对于开发利用兼具多种生物活性的牛樟芝产品以及对其在工业生产上的应用具有十分重要的意义。

Description

牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜化合物含量变化的方法
技术领域
本发明涉及牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜化合物含量变化的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
牛樟芝(Antrodia camphorata)，属于担子菌纲、非褶菌目、多孔科、多年生担子菌，只生长在台湾地区的牛樟树，是一种稀有的食要用真菌，其菌丝体和子实体都具有很多生理活性，如保肝、抗氧化、抗炎症等。多糖、萜类和甾体类化合物为牛樟芝的主要活性化合物。三萜类化合物是其最主要活性物质之一，是以异戊二烯为组成单元，去掉羟基后首尾相连构成的天然化合物，药理研究表明牛樟芝三萜具有多种生物活性，如保肝、调节免疫、抗炎症、抗氧化、降血压等，对肿瘤和癌症有很好的治疗效果。自然界存在的牛樟芝生长在牛樟树上，生长及其缓慢、数量稀少、价格昂贵。
传统的食药用真菌常采用固体栽培方式进行培养，其生长环境条件接近自然状态，但固体栽培培养周期较长、代谢产物生物活性不稳定、易染菌；同传统的固体栽培相比，液体发酵周期短，易规模化特点则更凸显，许多采用人工固体栽培亦不易成功的真菌如牛樟芝、斑金钱菌等也成功实现液体发酵。但是，由于牛樟芝三萜类化合物主要存在于菌丝体内(即胞内)，在发酵过程对牛樟芝三萜类化合物的测定需要①取样，②固液分离、③有机溶剂对菌丝体进行室温浸提、煎煮或加热回流提取，④对提取样品进行分析测定等步骤，需要较长的时间，尤其是第三步就需要3个小时以上，具有明显的延时性。无论是在实验研究，还是工业化生产中，这种延时性对于以三萜类化合物为目的产物的牛樟芝液体发酵过程的实时监测与控制非常不利。因此建立一种在牛樟芝液体发酵过程中快速表征三萜类化合物含量变化趋势的方法紧迫且必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜类化合物含量变化趋势的方法，其原理是通过分析牛樟芝发酵液中的挥发性芳香物质，建立某种挥发性物质和三萜类化合物之间的定量关系，使其成为发酵过程三萜类化合物含量变化快速表征的参数。
本发明所述的牛樟芝液体发酵过程快速表征三萜类化合物含量变化的方法，是在发酵过程中通过快速测定挥发性芳香物质α-松油醇对三萜类化合物含量变化进行表征。
在本发明所述的α-松油醇，为牛樟芝液体发酵过程中产生的一种单萜类挥发性芳香物质，为无色粘稠液体，具有特有的丁香香气。在发酵过程中，其含量变化趋势与三萜类化合物含量变化趋势一致，能够很好的对发酵过程三萜类化合物含量变化进行表征。
本发明对α-松油醇的测定可以是通过发酵体系在线检测系统进行分析测定，也可以是离线检测。
本发明所述的在线检测装置为在发酵罐尾气分析部位安装过程质谱仪和电子鼻等在线检测仪器以及参数采集系统，对发酵过程α-松油醇进行在线检测分析。
在本发明的一种实施方式中，所述在线检测装置为发酵过程产生的尾气通过软管与电子鼻连接即可，组成一个循环回路。我们采用电子鼻监控发酵过程中尾气中的α-松油醇浓度，从而推测出发酵液中α-松油醇的量。
在本发明的一种实施方式中，所述电子鼻检测方法为：电子鼻测定时间100s；顶空温度25℃；内部流量300mL/min；进样流量300mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述离线检测装置为顶空固相微萃取-气相-质谱仪，定时取样牛樟芝发酵液，对发酵过程α-松油醇进行离线检测分析。
本发明的优点：
本发明提供所述方法检测牛樟芝三萜类化合物发酵过程含量变化，可以对发酵过程进行接近于实时的快速动态过程初步判定(即使是取样离线检测，每个样品的测定时间也不超过50分钟)，也可以以此为依据判断发酵是否异常，实现了发酵过程的自动化控制。根据在线实时参数的变化进行发酵过程的三萜类化合物预测分析增加了发酵过程的可控性和生产可预测性。这对于开发利用兼具多种生物活性的牛樟芝产品以及对其在工业生产上的应用具有十分重要的意义。
附图说明
图1实施例1发酵过程中α-松油醇与三萜类化合物的产量随时间变化的情况。
图2实施例2发酵过程中α-松油醇与三萜类化合物的产量随时间变化的情况。
图3实施例3发酵过程中α-松油醇与三萜类化合物的产量随时间变化的情况。
图4实施例4发酵过程中α-松油醇与三萜类化合物的产量随时间变化的情况。
图5实施例1发酵过程中其他挥发性物质与三萜类化合物的产量随时间变化的情况；(a)1，2-癸二醇，(b)芳樟醇，(c)1-辛烯-3-醇，(d)3-呋喃甲酸甲酯，(e)3-辛酮，(f)苯乙醇，(g)荜澄茄油烯醇，(h)正辛酸，(i)反式-橙花叔醇，(j)反式-2-辛烯-1-醇。
图6实施例2发酵过程中其他挥发性物质与三萜类化合物的产量随时间变化的情况；(a)1，2-癸二醇，(b)芳樟醇，(c)1-辛烯-3-醇，(d)3-呋喃甲酸甲酯，(e)3-辛酮，(f)苯乙醇，(g)荜澄茄油烯醇，(h)正辛酸，(i)反式-橙花叔醇，(j)反式-2-辛烯-1-醇。
具体实施方式
三萜类化合物的测定方法：
1)发酵液离心所得菌丝体用去离子水冲洗干净(洗去培养基成分)，冻干得干燥的菌丝体。干菌丝体经液氮研磨后准确称量500mg，加入15mL无水乙醇，用90℃热水浸提1h，重复提取三次。最后提取液7104×g离心力条件下离心10min，定容到25mL。稀释至适当浓度，取样1mL，按标准曲线测定方法测定，以试剂空白为对照，550nm处测定吸光值，依据标准曲线计算三萜类化合物的含量。
2)齐墩果酸标准曲线测定：精密称取齐墩果酸标准样品5.00mg，无水乙醇溶解定容成0.1g·L-1溶液。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL于25mL比色管中，沸水蒸干，然后加入新鲜配制的5％(质量体积比)香草醛-冰醋酸0.3mL，高氯酸1.00mL，60℃水浴20min，冷却后加入冰醋酸4mL，摇匀使其充分反应，以试剂空白为对照，550nm处测定其吸光值。
α-松油醇的离线检测方法(顶空固相微萃取-气相-质谱仪)：
1)对α-松油醇进行含量检测所添加的内标为色谱纯正丁醇。
2)对α-松油醇进行含量计算采用的是内标法，即将一定重量的正丁醇作为内标物加到一定量的牛樟芝液体发酵液混合物中，然后对含有正丁醇的样品进行色谱分析，分别测定正丁醇和待测组分的峰面积及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。
3)顶空固相微萃取条件为：萃取头在GC进样口老化至无杂峰，然后在55℃下萃取30min。被吸附的挥发性化合物在GC进样口250℃下解吸5min，冲入GC色谱柱。同时启动仪器采集数据。萃取头：DVB/CAR/PMDS。
4)气相色谱条件为：色谱柱：DB-WAX；载气：氦气，1.2mL·min-1；程序升温条件：40℃维持1min，4℃·min-1升温至120℃，10℃·min-1升温至240℃，维持6min。
5)质谱条件为：接口温度250℃；电离源温度：250℃；四级杆温度150℃；电离电势：70eV；离子化模式：EI+；质量扫描范围m/z 30～450amu。
实施例1
(1)培养条件1
牛樟芝菌种：ATCC200183
PDA斜面培养基(g·L-1)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20。
种子液体培养基(g·L-1)：麸皮10，玉米粉10，葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，VB1 0.1，KH2PO4 3。
发酵液体培养基(g·L-1)：麸皮10，玉米粉10，葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，VB1 0.1，KH2PO4 3，pH 5.5。
种子斜面：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，接种于PDA斜面培养基，28℃培养20d。
一级种子液体发酵：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，取1cm2的小方块接种到液体种子培养基。种子培养基(250mL)每瓶装液量80mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养10d。
二级摇瓶液体发酵：将生长好的一级种子液混合，均匀接种到500mL摇瓶，每瓶装液量150mL，接种量为10mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养15d。
(2)离线测定α-松油醇和三萜类化合物含量
在实施例1的培养条件下，α-松油醇和三萜类化合物发酵过程含量变化趋势如图1所示，两者的变化趋势依一致，用SPSS21.0软件α-松油醇和三萜类化合物进行相关性分析和一元线性回归分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.958。进一步对二者进行一元直线回归分析，得到二者之间定量回归方程为Y＝0.460X+8.976。
在本实施例中，牛樟芝发酵液取样后，取至少10mL发酵液在大于等于7104×g离心力的条件下离心10分钟，之后取上清液5mL置于顶空瓶中，按说明书中所述方法采用顶空固相微萃取-气相-质谱仪对α-松油醇进行测定。
实施例2
(1)培养条件2
牛樟芝菌种：ATCC200183
PDA斜面培养基(g·L-1)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20。
种子液体培养基(g·L-1)：麸皮10，玉米粉10，葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，VB1 0.1，KH2PO4 3。
发酵液体培养基(g·L-1)：麸皮10，玉米粉10，葡萄糖20，MgSO4·7H2O 2，VB1 0.1，KH2PO4 3，pH 4.5。
种子斜面：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，接种于PDA斜面培养基，28℃培养20d。
一级种子液体发酵：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，取1cm2的小方块接种到液体种子培养基。种子培养基(250mL)每瓶装液量80mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养10d。
二级摇瓶液体发酵：将生长好的一级种子液混合，均匀接种到500mL摇瓶，每瓶装液量150mL，接种量为10mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养15d。
(2)离线测定α-松油醇和三萜类化合物含量
在实施例2的培养条件下，α-松油醇和三萜类化合物发酵过程含量变化趋势如图2所示，两者的变化趋势依一致，对此培养条件下的α-松油醇和三萜类化合物进行相关性分析和一元线性回归分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.942。进一步对二者进行一元直线回归分析，得到二者之间定量回归方程为Y＝2.721X+12.057。
α-松油醇的测定同实施例1。
实施例3
(1)培养条件3
牛樟芝菌种：共鳞实业(深圳)有限公司保藏JMA01
PDA斜面培养基(g·L-1)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20。
种子液体培养基(g·L-1)：麸皮2.0，葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO4 1.5，VB1 0.1，KH2PO4 3。
发酵液体培养基(g·L-1)：麸皮2.0，葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO4 1.5，VB1 0.1，KH2PO4 3。
种子斜面：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，接种于PDA斜面培养基，28℃培养20d。
一级种子液体发酵：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，取1cm2的小方块接种到液体种子培养基。种子培养基(250mL)每瓶装液量80mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养10d。
二级摇瓶液体发酵：将生长好的一级种子液混合，均匀接种到500mL摇瓶，每瓶装液量150mL，接种量为10mL，接种后于28℃、110r·min-1条件下培养15d。
(2)离线测定α-松油醇和三萜类化合物含量
在实施例3的培养条件下，α-松油醇和三萜类化合物发酵过程含量变化趋势如图2所示，两者的变化趋势依一致，对此培养条件下的α-松油醇和三萜类化合物进行相关性分析和一元线性回归分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.961。进一步对二者进行一元直线回归分析，得到二者之间定量回归方程为Y＝2.360X+2.927。
α-松油醇的测定同实施例1。
实施例4
实施条件同实施例1，相比于图1，图4中α-松油醇在第8-9天之后不升反将，提示发酵出现异常。经取样镜检发现染菌，其所感染微生物为细菌。这说明本发明不仅能够表征正常发酵过程中三萜类化合物的含量变化，还能够在发酵异常时发出提示信号。
对照实施例1
在实施例1的培养条件下，将同等条件下所检测到的其他挥发性化合物和三萜类化合物进行含量上的相关性分析，其相关系数均较低，且都低于α-松油醇和三萜类化合物的相关系数，数据统计分析结果见表1。
其中，1,2-癸二醇在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，皮尔逊相关系数为0.630。芳樟醇在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，相关系数分别为0.301。1-辛烯-3-醇在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，皮尔逊相关系数为0.436。3-呋喃甲酸甲酯在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.899。3-辛酮在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.233。苯乙醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.869。荜澄茄油烯醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.875。正辛醛在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，皮尔逊相关系数为0.202。反式-橙花叔醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.512。反式-2-辛烯-1-醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.326。
表1实施例1发酵过程中其他挥发性物质与三萜类化合物相关性分析
对照实施例2
在实施例2的培养条件下，将同等条件下所检测到的其他挥发性化合物和三萜类化合物进行含量上的相关性分析，其皮尔逊相关系数均较低，且都低于α-松油醇和三萜类化合物的相关系数，数据统计分析结果见表2。
其中，1,2-癸二醇在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，皮尔逊相关系数为0.601。芳樟醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，相关系数分别为0.405。1-辛烯-3-醇在含量上和三萜类化合物呈现负相关性，皮尔逊相关系数为0.171。3-呋喃甲酸甲酯在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.585。3-辛酮在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.306。苯乙醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.809。荜澄茄油烯醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.501。正辛醛在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.530。反式-橙花叔醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.853。反式-2-辛烯-1-醇在含量上和三萜类化合物呈现正相关性，皮尔逊相关系数为0.120。
表2实施例2发酵过程中其他挥发性物质与三萜类化合物相关性分析
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，建立某种挥发性物质和三萜类化合物之间的定量关系，使所述某种挥发性物质成为发酵过程的表征参数，所述发酵过程包括三萜类化合物的发酵过程。
2.根据权利要求1所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，所述某种挥发性物质是α-松油醇。
3.根据权利要求2所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，α-松油醇在牛樟芝液体发酵产三萜类化合物的过程中，其含量变化趋势与三萜类化合物含量变化趋势一致。
4.根据权利要求1～3任一所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，α-松油醇的含量的测定方法是在线检测或离线检测。
5.根据权利要求4所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，所述在线检测是利用在发酵罐尾气分析部位安装过程质谱仪和电子鼻等在线检测仪器以及参数采集系统，对发酵过程α-松油醇进行在线检测分析。
6.根据权利要求5所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，所述在线检测是将发酵过程产生的尾气通过软管与电子鼻连接，组成一个循环回路，采用电子鼻监控发酵过程中尾气中的α-松油醇浓度，从而计算出发酵液中α-松油醇的量。
7.根据权利要求4所述的一种牛樟芝液体发酵过程的快速表征方法，其特征在于，所述离线检测是采用顶空固相微萃取-气相-质谱仪，定时取样牛樟芝发酵液，对发酵过程α-松油醇进行离线检测分析。
8.一种牛樟芝发酵生产三萜类化合物的设备，其特征在于，包括自动采集发酵过程中尾气中的α-松油醇浓度、计算出发酵液中α-松油醇的量并加以显示的模块。
9.根据权利要求8所述的一种牛樟芝发酵生产三萜类化合物的设备，其特征在于，还包括将α-松油醇的量换算为三萜类化合物的量的模块。
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