CN105277595A - 电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用。本发明确定了一个新的多拉菌素发酵过程前体的补加优化工艺，即通过电子嗅在线检测和反馈控制前体物质环己烷甲酸的补加量，将发酵液内的环己烷甲酸维持在最佳浓度，既满足菌体合成多拉菌素所需要的前体量，又不会由对菌体的代谢活性产生不利的影响。该方法弥补了过程取样进行液相或气相色谱测定耗时时间长，难于实现在线检测和及时控制的不足，对多拉菌素工业发酵生产具有重要的指导作用。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，特别涉及电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用。
背景技术
多拉菌素，商品名为“通灭”（Dectomax），是20世纪90年代由美国辉瑞公司研制开发的新一代大环内酯类广谱抗寄生虫药，它由突变的阿维菌素链霉菌株在含有环己甲酸（CHC）的环境下生物合成。多拉菌素属于阿维菌素类药物，但具有比阿维菌素更佳的药代动力学特性和功效，其抗寄生虫范围广泛、体内血药浓度高、消除慢（多拉菌素半衰期5.7天，阿维菌素半衰期4.2天），药效维持时间长、无过敏反应等。多拉菌素已由美国食品药品管理局（FDA）批准作为治疗牛、羊、猪等家畜胃肠道线虫、彪肺虫、眼部寄生虫、蛴螬、吸虱、疥癣螨等寄生虫感染的兽用驱虫药。家蝇与哺乳动物相比，其对阿维菌素类杀虫剂的敏感程度增加600～700倍，且具有很高的选择性，在正常使用剂量下，安全性较好。
在多拉菌素批培养发酵工艺中，环己甲酸是多拉菌素合成过程中的重要前体物质，该物质被直接用于多拉菌素分子结构合成。关于环己甲酸对多拉菌素发酵的影响的报道显示，该前体对细胞生长有显著的抑制作用，但环己烷甲酸添加量的不足又会限制产物的快速合成。在发酵过程中环己烷甲酸残留量的检测主要是通过气相色谱或液相色谱进行测定，这种测定方法耗时较长，在实际生产过程中难于实现大批量样本的快速检测，因此现在的多拉菌素发酵过程中环己烷甲酸往往采用定时检测和分批补加的方式进行。为了能够实现环己烷甲酸残留量的在线监测和反馈控制，并优化最佳的环己烷甲酸控制技术，本发明首次提出并找到了利用电子嗅特异传感膜进行多拉菌素发酵液中环己烷甲酸残留浓度的在线实时检测与优化控制方法。
发明内容
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用。
技术方案：本发明提供了电子嗅觉器在环己甲酸含量检测中的应用。
本发明还提供了电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用。
所述应用：包括以下步骤：
（1）标准曲线绘制：在发酵罐中通入不同浓度的环己甲酸，以电子嗅觉器的响应值作为横坐标，以环己烷甲酸的浓度作为纵坐标，得出电子嗅觉器检测的响应值与发酵液内环己烷甲酸浓度的拟合方程，即为标准曲线；
（2）将多拉菌素发酵罐的发酵尾气通入电子嗅觉器中，检测发酵尾气中环己甲酸在电子嗅觉器内的响应值，即得多拉菌素发酵罐的环己甲酸的浓度。
作为优选，所述电子嗅觉器采用气敏传感膜TGS2440。
作为另一种优选，多拉菌素发酵条件为：温度19-45℃；搅拌转速50-800转/min；通气比为4.5vvm以下，优选4.0vvm以下。
本发明还提供了电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测及环己甲酸含量控制中的应用。
有益效果：本发明确定了一个新的多拉菌素发酵过程前体的补加优化工艺，即通过电子嗅在线检测和反馈控制前体物质环己烷甲酸的补加量，将发酵液内的环己烷甲酸维持在最佳浓度，既满足菌体合成多拉菌素所需要的前体量，又不会由对菌体的代谢活性产生不利的影响。该方法弥补了过程取样进行液相或气相色谱测定耗时时间长，难于实现在线检测和及时控制的不足，对多拉菌素工业发酵生产具有重要的指导作用。
附图说明
图1为电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用示意图。
图2为环己烷甲酸的电子嗅觉器特定雷达指纹图谱；
图3为不同浓度下的特定通道响应变化曲线；
图4为不同通气比的情况下电子嗅觉器的响应值；
图5为电子嗅觉器检测环己烷甲酸浓度的拟合曲线；
图6为气相色谱检测环己烷甲酸浓度的曲线；
图7为在线反馈控制环己烷甲酸补加速率与传统批次补加工艺对多拉菌素发酵合成的影响。
具体实施方式
本发明实施例中多拉菌素发酵条件：
（1）菌种和培养基
生产菌株：多拉链霉菌JT-01，保存于江苏威凌生化有限公司
斜面种子、平板培养基：
淀粉0.6%，酵母抽提物0.4%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.05%，硝酸钠0.1%，琼脂粉1.5%；pH7。
摇瓶种子培养基：
淀粉2%，黄豆饼粉1%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.1%，碳酸钙0.2%；pH7。
发酵培养基：
淀粉15%，黄豆饼粉1.2%，酵母提取物0.7%，磷酸氢二钾0.5%，氯化钠0.06%，10%浓度的环己甲酸钠3%；pH7。
（2）仪器和试剂
仪器：发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司15L和50L发酵罐；舜宇恒平尾气质谱仪及分析软件；722型紫外一可见分光光度计；旋转式摇床。
（3）培养方法
多拉菌素发酵采用三级发酵，其中包括二级种子发酵。
将保藏的菌种孢子用接种针或无菌竹签均匀涂在斜面/平板培养基上，在28℃和40%相对湿度条件下培养5-7天。
在500ml摇瓶中加入100ml种子培养基，灭菌后接入3-4ml孢子悬浮液，在28℃，240rpm下培养24-48小时。
在500ml锥形瓶中加入100ml发酵培养基，接入8ml种子液，在28℃，240rpm下培养13天。
（4）测定方法：
还原糖测定：DNS方法。
生物量测定：离线测定采用湿体积法，将10mL发酵液置于离心管，3000rpm离心15min，将离心上清倒入量筒，根据上清的体积计算出发酵液的体积。效价测定：采用国家药典方法。
pH、DO在线测定：采用MettlerToledo耐高温电极进行在线测定。
温度：铂温度电极在线测定。
进气和尾气中氧和二氧化碳的测定：采用舜宇恒平尾气质谱仪对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析。
氧消耗速率OUR和二氧化碳生成速率CER测定：OUR和CER的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。
电子嗅气敏传感器：电子嗅含有16个气敏传感器，这些传感器的敏感膜材料是半导体氧化物SnO2，当待测气体与陶瓷膜接触时，涂在陶瓷膜表面的SnO2敏感膜的电阻随着待测气体的种类和浓度的不同而变化。当空气掠过敏感膜表面时，空气中的氧气与敏感膜中游离的负电子通过电子亲和力结合，形成一个势垒，这个势垒会导致气敏传感器的电阻变大，一般会达到几万到几十万欧姆。当待测气体经过敏感膜表面时，还原性气体的自由电子与O2结合，使势垒减小，导致气敏传感器的电阻变小。根据欧姆定律
其中U为电压值，I为电流值，R为电阻值。在电压保持不变的情况下，与传感器串联的电阻两端的电压会随电阻变化而发生改变。
实施例1考察系列气敏传感膜相应情况
在发酵罐中配制不同环己烷甲酸浓度的无菌培养基溶液，并进行通气和搅拌状态下进行发酵过程的定性和定量检测。
考察8个TGS-8系列气敏传感膜（TGS800、812、813、821、822、826、830、842）、7个TGS-2000系列气敏传感膜（TGS2100、2180、2181、2281、2440、2601、2610）和1个TGS4161传感膜共16个传感膜进行响应的检测识别。
各传感器元件的实验测定结果见表1。
环己烷甲酸的电子嗅觉器特定雷达指纹图谱见图2，不同浓度下的特定通道响应变化曲线见图3，根据环己烷甲酸的电子嗅觉器特定雷达指纹图谱的变化以及不同浓度环己烷甲酸浓度下的响应曲线变化我们选择了气敏传感膜TGS2440，该传感膜的响应强度在环己烷甲酸溶液浓度（50到4500ppm）范围内表现出较好的一致性关系。
表116个传感膜响应检测识别结果
实施例2考察不同操作控制条件对测定稳定性的影响
在500ppm浓度的环己烷甲酸溶液发酵罐中进行发酵过程控制条件模拟实验。
在50升发酵罐中，添加30升的水溶液，pH调节在7.0±0.2的中性条件；该发酵罐采用三层平叶桨搅拌系统，通气管有底部进入。正常的发酵过程工艺条件：转速450rpm、温度27℃、罐压0.03MP、通气比1.2vvm，将尾气接到电子嗅采样口进行数据采集。
考察了不同通气比、温度、发酵转速、不同罐压对TGS2440传感膜测定结果响应值的影响，测试结果表明：
（1）温度在测试的19℃到45℃变动的情况下，检测的电子嗅觉器响应值几乎没有变化；
（2）发酵罐的搅拌转速在50到800转/min的情况下，响应值保持一致；
（3）同样罐压在正常发酵控制范围内变动时，响应值保持恒定；
（4）随着通气比的变化，当通气不高于4.5vvm的情况下对检测结果几乎没有影响，说明在该通气比以下，液相中的环己烷甲酸向气泡中的扩散速度与气泡的溢出速度达到了平衡（见图4）；而当通气比高于4.5vvm时，电子嗅觉器检测的响应值开始下降，说明液体中环己烷甲酸向气泡中的扩散速度已开始慢于气泡的溢出速率；而正常发酵过程中通气比往往在4.0vvm一下，以防止过高的通气比带来的动力消耗成本。
因此在正常的控制条件下，该电子嗅觉器传感膜能够实现对环己烷甲酸残留浓度的在线检测。
实施例3标准曲线绘制
将发酵罐内环己烷甲酸浓度分别控制在50ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm、3000ppm、4500ppm通过三次检测获得响应值的平均值，以电子嗅的响应值作为横坐标，以环己烷甲酸的浓度作为纵坐标，得出电子嗅检测的响应值与发酵液内环己烷甲酸浓度的拟合方程
其中，y为环己烷甲酸浓度，x为电子嗅响应值。拟合方程的R2为0.995，说明拟合方程是可信的。
通过将拟合方程计算的环己烷甲酸浓度（见图5）与离线气相色谱（见图6）的结果相对比，两种检测方式得到的实验结果非常接近，说明通过拟合方程计算的结果是正确的，即利用电子嗅在线检测发酵液内的环己烷甲酸含量是可行的。
实施例4
将多拉菌素发酵罐的发酵尾气通入电子嗅觉器中，检测发酵尾气中环己甲酸在电子嗅觉器内的响应值，即得多拉菌素发酵罐的环己甲酸的浓度。具体见图1，利用电子嗅进行发酵液中环己烷甲酸残留浓度的检测与补料流加控制示意图如下，发酵罐的尾气经除水处理后直接进入电子嗅进行检测，电子嗅为四通道检测装置，可同时对4台发酵罐进行在线检测，监测得到的信号转换成数值信号后，用于补料调节泵补加速度的反馈控制。
通过电子嗅在线检测和反馈控制环己烷甲酸含量进行多拉菌素发酵工艺优化：
在50升发酵罐中，通过采用电子嗅传感仪进行发酵过程环己烷甲酸浓度的在线检测，并反馈控制补料泵的补加速率控制环己烷甲酸的浓度分别为200ppm、500ppm、800ppm和1500ppm考察不同浓度对多拉菌素发酵合成的影响，见图7，通过在发酵过程中补加不同浓度的环己烷甲酸实验得到了环己烷甲酸的最优补加浓度为500±40ppm，多拉菌素的效价最高达到1886μg/mL，比间歇式的补加模式相比效价提高了85.2%以上，当环己烷甲酸的浓度高于800ppm时明显降低多拉菌素合成速率，当高于1500ppm的情况下明显限制菌体的生长，这说明补加过多的前体物质会对菌体代谢过程产生一定的抑制作用。
Claims (6)
1.电子嗅觉器在环己甲酸含量检测中的应用。
2.电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
标准曲线绘制：在发酵罐中通入不同浓度的环己甲酸，以电子嗅觉器的响应值作为横坐标，以环己烷甲酸的浓度作为纵坐标，得出电子嗅觉器检测的响应值与发酵液内环己烷甲酸浓度的拟合方程，即为标准曲线；
将多拉菌素发酵罐的发酵尾气通入电子嗅觉器中，检测发酵尾气中环己甲酸在电子嗅觉器内的响应值，即得多拉菌素发酵罐的环己甲酸的浓度。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述电子嗅觉器采用气敏传感膜TGS2440。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：多拉菌素发酵条件为：温度19-45℃；搅拌转速50-800转/min；通气比为4.5vvm以下，优选4.0vvm以下。
6.电子嗅觉器在多拉菌素发酵过程环己甲酸浓度在线检测及环己甲酸含量控制中的应用。
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