CN104833708A - 红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物制备技术领域，公开了一种红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，包括如下步骤：根据电子嗅内各气敏传感器对红霉素发酵液内不同浓度的正丙醇的响应值筛选出合适的气敏传感器通道；在红霉素发酵液内混合加入不同量的油，并通过气敏传感器通道测出不同的响应值；每次改变搅拌速度、空气流量、温度和压力中的一个参数，通过气敏传感器通道测出不同的响应值；将气敏传感器通道对红霉素发酵液中的正丙醇浓度的响应值与正丙醇浓度建立拟合方程；通过拟合方程的曲线确定正丙醇在红霉素发酵液中的实时补给量。本发明的电子嗅检测灵敏度高，检测范围值广，电子嗅检测电路简单，其气敏传感器直接可以转化成电压信号，测量时间短。

Description

红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法

技术领域

本发明属于微生物制备技术领域，特别是一种红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法。

背景技术

在红霉素发酵过程中，正丙醇(n-propanol)对提高红霉素产量的影响已经被研究了很多年。虽然一些研究者已经研究了正丙醇在红霉素合成过程中的重要作用，但是没有对红霉素的补加量和发酵过程中发酵罐内正丙醇的含量做过深入的研究。正丙醇量补加量不足会导致生物反应器内前体物质含量不足，因此将导致最终的红霉素产量较低，而发酵过程中补加过多的正丙醇又可能会影响菌株的代谢活性，导致红霉素的产量降低，所以，在整个红霉素发酵过程中控制正丙醇的添加量是一个非常重要的课题，也是一个提高红霉素产量的关键点。

以前的研究只能通过气相色谱进行离线测定正丙醇含量，这种方法不仅过程繁琐，而且由于离线检测具有延迟性，不能快速的获得检测结果，并且根据正丙醇的残余量而优化补加工艺。而在红霉素工业生产中也只按照固定的比例进行添加，没有考虑实时的正丙醇消耗速率和发酵罐内的残余量，因此也就没有对正丙醇的量进行一个精确的控制，并通过发酵过程中正丙醇的量来优化添加策略。这既是不经济的，也不是最佳的补加策略。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，通过电子嗅的在线检测，使红霉素发酵液中正丙醇的含量一直处于最佳值。

本发明采取的技术方案是：

一种红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，其特征是，包括如下步骤：

(1)根据电子嗅内各气敏传感器对红霉素发酵液内不同浓度的正丙醇的响应值筛选出合适的气敏传感器通道；

(2)在所述红霉素发酵液内混合加入不同量的油，并通过第(1)步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

(3)根据第(2)步得到的响应值判断第(1)步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第(1)步；

(4)每次改变所述红霉素发酵液的搅拌速度、空气流量、温度和压力中的一个参数，通过第(1)步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

(5)根据第(4)步得到的响应值判断第(1)步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第(1)步；

(6)将最终确定的气敏传感器通道对所述红霉素发酵液中的正丙醇浓度的响应值与所述正丙醇浓度建立拟合方程；

(7)通过拟合方程的曲线确定正丙醇在所述红霉素发酵液中的实时补给量。

进一步，所述第(1)步中的正丙醇浓度为50至2000ppm。

进一步，所述第(2)步中加入的油量为所述正丙醇的0至2倍。

进一步，所述第(4)步中的温度为20至40℃；搅拌速度为100至500rpm；空气流量为0.5至2.5vvm；所述压力为0至1atm。

本发明的有益效果是：

(1)电子嗅检测灵敏度高，检测范围值广；

(2)电子嗅检测电路简单，其气敏传感器直接可以转化成电压信号；

(3)测量时间短。

附图说明

附图1是本发明的气敏传感器通道对于正丙醇的响应值曲线图；

附图2是本发明的气相色谱离线检测正丙醇浓度对比图；

附图3为不同浓度正丙醇对于红霉素摇瓶发酵的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法的具

体实施方式作详细说明。

电子嗅已经广泛应用在其他行业，例如食品质量、医疗检测等。但是在生物发酵行业还没有应用。它对于尾气质谱仪(gas mass spectrometer)是一个很好的补充工具，因为它具有高的灵敏度，可以检测到的浓度范围是1.0～10000ppm，个别的气敏传感器可以检测到100ppt的浓度。此外，电子嗅的电路简单，待测气体引起气敏传感器电阻的变化可以直接转化为电压信号，而不需要其他的处理和信号放大的环节；电子嗅从接触气体到稳定状态的时间小于10秒，恢复时间少于30秒，因此测量时间较短。综上所述，通过电子嗅对发酵液中正丙醇的含量进行在线检测，并且通过过程曲线优化补加策略，实现提高红霉素产量，并且可以将电子嗅在线监测正丙醇的工艺应用在工业生产中。

正丙醇通过补料泵补入发酵液中，在搅拌桨的作用下，正丙醇与发酵液搅拌均匀，由于正丙醇是容易挥发的液体，所以液体中的正丙醇会有一部分挥发到发酵罐上部的空气中，并且随着尾气排出，尾气被电子嗅的微型电磁阀吸入后，会形成一个检测气体的响应曲线图，由亨利定律可知，挥发性物质在气体中所占的比例与在溶液中的浓度有一个对应的关系，所以，通过检测尾气中正丙醇的含量就可以由公式得到发酵液中正丙醇的含量。由于将发酵内正丙醇含量设为固定值，所以电子嗅会根据检测到的结果来控制补料泵的补料速率和补料量，来维持发酵液内正丙醇的含量。同时，发酵尾气连接尾气质谱分析仪，来检测发酵尾气中的O2和CO2浓度，并且计算OUR、CER和RQ等参数。

电子嗅内含有16个气敏传感器，这些传感器的敏感膜材料是半导体氧化为SNO2，当待测气体接触陶瓷膜，涂在陶瓷膜上面的SNO2敏感膜电阻随着待测气体的种类和浓度的不同而不同。当只有空气掠过敏感膜表面时，空气中氧气与敏感膜中处于游离状态的负电子通过电子亲和力结合，形成一个势垒，这个势垒会导致气敏传感器的电阻变大，一般会达到几万到几十万欧姆，而当被检测的气体经过敏感膜的表面时，还原性气体的自由电子与O2结合，使势垒减小，导致气敏传感器的电阻变小。根据欧姆定律可知道，在电压保持不变的情况下，与传感器串联的电阻两端的电压会随之发生改变，直接输出电压信号。

参见附图1，在50L发酵罐中分别准备浓度为50ppm、100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm和2000ppm的正丙醇，模拟正常发酵情况，将无菌空气通入到发酵罐内的水中，发酵尾气经缓冲瓶后通入到电子嗅内。运行条件为搅拌220rpm，34℃。纵向比较，发现16个通道对相同浓度的正丙醇具有完全不同的响应值，这是由于16个通道是由16个不同的气敏传感器组成的，每一个传感器对与不同的物质具有不同的灵敏度和相应范围，所以会出现检测结果的差异。而单一通道的响应值随着正丙醇浓度的增加也相应增加，只是增加的幅度不同，例如15通道，它的响应值随着正丙醇浓度的变化而明显增高，而1号通道的响应值，随着正丙醇浓度的改变变化很小，这个图说明电子嗅的16个检测模块对正丙醇都有一定的响应值，但是不同的检测模块对正丙醇的响应差别很大。

因此，选择合适的通道对于准确的检测发酵液内正丙醇的含量是非常重要的。选择通道的依据主要有两点，首先，在有限的范围内(0-2000ppm)，所选通道对不同浓度的正丙醇要有相对较高的灵敏性和差异性，比如4通道、5通道、6通道、15通道等；其次，电子嗅的响应值要与离线气相色谱检测结果有一定的对应性和准确性。参见附图2，5通道检测结果与离线结果趋势类似，准确度较高，因此，将5通道作为在线监测正丙醇浓度的合适元件。

在红霉素发酵过程中，油既是发酵培养基中的重要碳源类物质，还起到消泡、改变发酵液的流场特性、作为氧气的载体、提高氧的亲和力等等作用，因此，在初始的培养基中就会含有较多的油，而且在补料过程中也需要作为碳源大量补加，所以，在整个红霉素发酵过程中，发酵液内的油含量较高，含油发酵液的流变特性和挥发特性都会发生改变，这有可能会对电子嗅的检测带来不利的影响。因此，研究了不同浓度的油对电子嗅检测的影响。通过五组对比实验，在等量的正丙醇(1000ppm)水溶液中分别混合加入0倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍质量(远大于红霉素发酵过程中的实际用量)的油，运行条件为搅拌220rpm，34℃。要实验结果中，不同实验组的电子嗅5号通道的响应值几乎没有差别，这充分说明发酵液中的油对电子嗅的检测不会产生明显的影响。

在抗生素发酵过程中，由于微生物的初级代谢和次级代谢会产生一部分有机酸、挥发性物质，甚至产生一些未知的物质，电子嗅对于这些物质的响应很可能会对正丙醇的检测结果产生影响，因此，比较了电子嗅对不同浓度正丙醇(浓度从0ppm到2000ppm)分别在水中和发酵液中的响应值。

电子嗅在线检测正丙醇的原理是补入发酵罐内的正丙醇在搅拌和通气的条件下，与发酵液充分混合，由于正丙醇是一种易挥发的液体，在液体中会有一部分挥发到发酵罐上部的空气中，随着发酵尾气排出，经过缓冲瓶后进入电子嗅。因此，考虑到亨利定律P＝k×c，(P为气体中溶质分压，C为液体中溶质的浓度，K为亨利常数)，发酵液的温度、搅拌速度、通气量和罐压都可能会对亨利常数产生一定的影响，所以这些条件可能会对电子嗅的检测结果产生相对对应的影响。实验设计如表1.1，每次改变其中一个参数，其它三个参数不变。

表1.1实验方案

实验结果告诉我们，随着空气流量和搅拌速率的增加，电子嗅的检测结果几乎没有变化，这说明空气流量和搅拌速率的改变对电子嗅的响应几乎没有影响，不同的温度对检测结果影响较大，温度从15℃上升到25℃，电子嗅的响应值随着温度的增加而增加，在30℃以前，响应值增加幅度明显，而当温度高于30℃，电子嗅响应值趋于稳定，而红霉素发酵过程中的温度精确控制在34℃，因此可以忽略温度对于检测结果的影响。随着压力的逐渐增加，电子嗅的响应值逐渐降低，温度和罐压对电子嗅的检测结果引起的变化是复合亨利定律的，因为影响温度和压力会影响亨利常数的大小，温度和压力会改变正丙醇的溶解度，随着温度升高，正丙醇溶解度降低，气体中的含量上升，导致检测浓度上升，随着压力的增大，正丙醇溶解度升高，气体中正丙醇含量降低，通过尾气进入电子嗅的浓度降低，结果导致检测结果下降，但是由于在红霉素发酵过程中的罐压稳定控制在0.05atm，所以压力对于电子嗅响应值的影响也可以忽略。

通过以上一系列的实验结果，可以得出初步的实验结论，电子嗅的16个不同的气敏传感器对于不同浓度的正丙醇具有不同的响应程度，通过与离线数据的对比分析，最终确定了5号通道用来检测正丙醇的浓度，同时发现油和发酵液对于电子嗅的检测结果没有明显的影响，而红霉素发酵过程中，在固定发酵温度和罐压的条件下，改变一些操作参数，例如空气流量和搅拌速率并不会对电子嗅的检测带来影响。基于以上实验结果，确认电子嗅可以实现在线监测控制正丙醇的浓度。

将发酵罐内正丙醇浓度分别控制在0ppm、500ppm、100ppm、1500ppm、2000ppm，通过三次检测获得响应值的平均值，以电子嗅的响应值作为横坐标，以正丙醇的浓度作为纵坐标，做出电子嗅检测的响应值与发酵液内正丙醇浓度的拟合方程：，其中y为正丙醇浓度，x为电子嗅响应值。拟合方程的R2为0.994，说明拟合度较好，并且通过拟合方程计算的正丙醇浓度与离线气相色谱的结果相对比，两种测定结果非常接近，说明拟合方程的计算结果是可信的，也就是利用电子嗅在线监测发酵液内的正丙醇含量是可行的。

作为一种重要的前体类物质，正丙醇已经应用在红霉素发酵过程中，而且正丙醇对于细胞生长和红霉素合成的影响也已经被研究了很多。为了获得合适的正丙醇添加量，设计了六种不同的正丙醇补加策略，如表1.2，第一组为对照组，2到6组的补加正丙醇的体积分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，为了近似的模拟发酵罐的补加过程，从发酵24h开始每隔12h补加一次正丙醇，直到发酵168h结束。

表1.2六种不同的正丙醇补加策略

参见附图3，左柱形图为六组实验的菌浓，与对照组相比，5组补加正丙醇的实验组菌浓数据与对照组相近，说明不同浓度的正丙醇对于红色糖多孢菌的生长没有明显的抑制作用，中间的柱形图代表六组实验的残糖数据，结果差异不大，这说明六组实验的菌体生长状况和碳源消耗量相近，而最终的红霉素发酵效价(右边柱形图)差异很大，综合这三方面的数据，说明了红霉素效价的差异是由于补入的正丙醇浓度的不同而引起的。不加正丙醇的对照组红霉素效价为4373ug/mL，补加1g/L正丙醇的实验组最终效价为7546ug/mL，比对照组提高了72.5％，但是随着补加正丙醇浓度的提高，红霉素效价逐渐降低，其中补加5g/L正丙醇的实验组发酵效价低于对照组，为3800ug/mL，说明过多的正丙醇补加对于红霉素的发酵也是有害的。由于从1g/L到5g/L的跨度较大，所以进行了缩小补加范围的发酵实验，正丙醇补加量分别是0g/L(对照组)、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L，实验结果同样是正丙醇的补加量为1g/L的实验组红霉素效价最高，因此，确定了红霉素摇瓶发酵补加正丙醇的最佳浓度为1g/L。

在摇瓶上获得最优补加浓度1g/L后，在50L发酵罐进行发酵验证。发酵尾气通过电子嗅的在线监测获得正丙醇浓度数据，结果反馈控制补料泵补加正丙醇速率，三组实验分别控制发酵液内正丙醇浓度为500ppm、1000ppm和1500ppm。补加起始时间为48h，根据发酵结果图，由于反馈控制补加过程是在电子嗅获得实时的发酵液内正丙醇的浓度后，信号传送给补料泵会有一定的延迟，所以在程序设定的控制情况下，实时监控曲线会有小的波动。在100h以前，三批发酵实验的菌浓相近，说明在这段时间正丙醇的补加对菌体的生长没有明显的抑制作用，这与摇瓶发酵的结果类似，但在100h以后，补加正丙醇量最少的A组菌浓稍高于两外两组，说明在发酵后期过多正丙醇对菌体有一定的抑制作用。在菌浓相近的情况下，说明单位菌体的耗氧量相近，具有类似的生物活性，在相同补料工艺下，残余的碳源和氮源曲线相近，说明营养物质的消耗、菌体的活性和菌浓都比较接近。48h前的菌体生长状况没有明显的差别，而在48h开始补加不同浓度的正丙醇后，效价增长出现明显差别，维持正丙醇浓度500ppm的A组效价增长缓慢，尤其是在100h后，最终168h放罐效价为6500ug/mL，这是由于前体正丙醇补加量不足引起的。而维持正丙醇浓度为1000ppm的B组维持效价快速增长的时间较长，最终效价达到8500ug/mL。而补加浓度为1500ppm的C组效价增长速率低于B组，最终效价为7969ug/mL，这可能是由于过量的正丙醇对红霉素生产过程产生某些抑制作用引起的。

综上所述，可以基本了解了正丙醇在菌体内的代谢方向，在正丙醇补加量不足的情况下，正丙醇主要通过合成丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A来合成红霉素，其中也会有一部分进入三羧酸循环中，这使得前体供应不足，最终导致红霉素产量较低。而当补加的正丙醇量充足时，一部分正丙醇会通过甲基丙二酰辅酶A合成琥珀酰辅酶A来进入三羧酸循环代谢途径，增加三羧酸循环的代谢通量，产生更多的能量和中间代谢物来维持菌体的代谢活性。另一部分会作为前体直接合成红霉素，足够的正丙醇补加量保证了这两条途径的代谢通量，因此最终的红霉素产量较高。

通过电子嗅检测正丙醇浓度的可行性研究，确定了电子嗅在线检测正丙醇浓度的实验方法，并且研究了油、发酵液、发酵过程操作变量(空气流量、搅拌速率、温度、罐压)对电子嗅检测的影响，最终选择了5号气敏传感器作为检测正丙醇的工具，建立了5通道检测的拟合方程，并且通过与离线气相色谱检测结果对比验证了电子嗅检测的准确性和稳定性。综合以上结果得出了电子嗅可以准确的在线监测发酵液内正丙醇的浓度。

通过在摇瓶内补加不同浓度的正丙醇实验得到了正丙醇的最优补加浓度为1g/L，此时红霉素的效价为7546ug/mL，比不加正丙醇的对照组效价提高了72.5％，同时发现了补加过多的正丙醇会导致红霉素效价低于对照组，这说明过多的前体物质补加量会对菌体有一定的抑制作用。

在摇瓶上获得最佳的正丙醇补加量1g/L后，在50L罐上研究了通过在线电子嗅检测和反馈控制工艺，将发酵液内正丙醇的量控制在不同的浓度(500ppm、1000ppm、1500ppm)，对红霉素发酵单位的影响。实验结果表明将发酵液内的正丙醇浓度维持在1000±38ppm的范围内可以得到最高的红霉素效价8500ug/ml，并且在这个条件下，正丙醇的浓度不会对红色糖多孢菌的生产产生不利影响。而将正丙醇浓度维持在500±40ppm的范围内红霉素效价为6500ug/ml，这是由于前体正丙醇的补加量不足引起的。将正丙醇浓度维持在1500ppm±30ppm的范围内，红霉素效价为7969U/mL，这是由于正丙醇的补加量过多，而对红霉素生产菌株红色糖多孢菌产生一定的抑制作用引起的。

通过实验，确定了一个新的红霉素发酵过程优化工艺，就是通过电子嗅在线监测和反馈控制前体物质正丙醇的补加量，将发酵液内的正丙醇维持在最优的浓度，既满足菌体合成红霉素所需要的补加量，又不会由于正丙醇在发酵液内过多而对菌体的活性产生抑制作用。并且通过发酵过程中有机酸的分析，研究了正丙醇在菌体内的代谢路径，在正丙醇补加量不足时，不能提供足够的前体物质来合成红霉素，最终导致红霉素产量较低。而当正丙醇补加量充足时，既可以保证红霉素合成过程中前体的量，另一部分也可以进入三羧酸循环中，提高三羧酸循环的代谢通量，合成足够的能量和一些中间代谢物来维持菌体的生物活性，最终提高红霉素的产量。这对工业红霉素的发酵生产具有一定的指导作用，同样的调控策略也可以推广到其他抗生素的发酵优化过程中。

总结上述实验过程，红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法包括如下步骤：

(1)根据电子嗅内各气敏传感器对红霉素发酵液内不同浓度的正丙醇的响应值筛选出合适的气敏传感器通道；

(2)在所述红霉素发酵液内混合加入不同量的油，并通过第(1)步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

(3)根据第(2)步得到的响应值判断第(1)步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第(1)步；

(4)每次改变所述红霉素发酵液的搅拌速度、空气流量、温度和压力中的一个参数，通过第(1)步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

(5)根据第(4)步得到的响应值判断第(1)步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第(1)步；

(6)将最终确定的气敏传感器通道对所述红霉素发酵液中的正丙醇浓度的响应值与所述正丙醇浓度建立拟合方程；

(7)通过拟合方程的曲线确定正丙醇在所述红霉素发酵液中的实时补给量。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）根据电子嗅内各气敏传感器对红霉素发酵液内不同浓度的正丙醇的响应值筛选出合适的气敏传感器通道；

（2）在所述红霉素发酵液内混合加入不同量的油，并通过第（1）步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

（3）根据第（2）步得到的响应值判断第（1）步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第（1）步；

（4）每次改变所述红霉素发酵液的搅拌速度、空气流量、温度和压力中的一个参数，通过第（1）步中的气敏传感器通道测出不同的响应值；

（5）根据第（4）步得到的响应值判断第（1）步筛选所述气敏传感器通道是否合理，如果不合理则重新返回第（1）步；

（6）将最终确定的气敏传感器通道对所述红霉素发酵液中的正丙醇浓度的响应值与所述正丙醇浓度建立拟合方程；

（7）通过拟合方程的曲线确定正丙醇在所述红霉素发酵液中的实时补给量。

2.根据权利要求1所述的红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，其特征在于：所述第（1）步中的正丙醇浓度为50至2000ppm。

3.根据权利要求1所述的红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，其特征在于：所述第（2）步中加入的油量为所述正丙醇的0至2倍。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的红霉素发酵过程中电子嗅检测正丙醇的方法，其特征在于：所述第（4）步中的温度为20至40℃；搅拌速度为100至500rpm；空气流量为0.5至2.5vvm；所述压力为0至1atm。