JP6885928B2

JP6885928B2 - オンラインでの酸素消耗速度と導電率の同時制御によるコエンザイムｑ１０の発酵製造プロセス

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Publication number: JP6885928B2
Application number: JP2018512524A
Authority: JP
Inventors: 洪巍于; 勇呂; 永李; 剣波陳; 召峰陳; 偉鋒李; 紅梅張; 永強朱
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2036-10-21
Also published as: KR20180042282A; WO2017071529A1; CA2996363C; EP3339452A4; US20180245113A1; KR102015829B1; JP2018530999A; EP3339452B1; AU2016345237B2; CA2996363A1; US10982242B2; CN105420417B; CN105420417A; AU2016345237A1; EP3339452A1

Description

本発明は発酵分野に関わり、さらに具体的にいうと、最適化された紅色細菌（Rhodobacter sphaeroides）等の微生物が発酵してコエンザイムＱ１０を製造する方法および関連する操作、制御のプロセス方法に関わり、代謝パラメータの酸素消耗速度と栄養供給指標の導電率の同時制御による発酵でコエンザイムＱ１０を製造する新しいプロセスである。

コエンザイムＱ_１０（ＣｏＱ_１０）はユビキノン、ユビデカレノンとも呼ばれ、化学名は２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−デシルイソペンテニルベンゾキノンである。コエンザイムＱ_１０は一つの代謝活性化剤であり、その生物活性はキノン環の酸化還元特性および側鎖の物理化学的性質から形成され、抗酸化性、遊離基（フリーラジカル）除去、有機体免疫力の向上、抗老化等の機能を持っている。臨床では、各種類の心臓病、癌、糖尿病、急性慢性肝炎、パーキンソン症等の治療に汎用され、また化粧品や抗老化の健康食品の面においても広く使われている。

微生物発酵法でコエンザイムＱ_１０を製造するのが国内外においてほとんどの製造方法であり、生物活性が高く、原材料の制限がないという特徴があり、菌株を選定して培養、発酵プロセス最適化等の方法で発酵の生産能力を向上することができる。しかし、生物発酵法には制御しにくいという特性があり、従来の発酵工程における制御パラメータ（ｐＨ、ＤＯ、細菌濃度、含有量等）が発酵の全体工程を正確的に反映、制御することが難しくなったため、さらに信頼性が高くて速度が速いパラメータを導入して発酵状態を反映させると共に、これらのパラメータを基に積極的かつ有効的な対策を講じて発酵の全体工程を制御する必要がある。

報告されたコエンザイムＱ１０発酵に関連する技術研究において、遺伝子工程の技術改善によってコエンザイムＱ１０の生産レベルを向上する、または菌種誘発処理、簡単な窒素資源の最適化、製造中におけるリン酸塩の添加量等、単独の要素の調整実験を通して産物の合成に対する影響を見るのがほとんどである。製造中の糖の補充速度で発酵過程を制御、改善する特許文献も報告されている。これらの研究と技術は単独の要素からコエンザイムＱ１０の生産量の向上を研究しているため、ある程度の役割を果たしているが、根本的にコエンザイムＱ１０を生産した細菌母体動態の生理過程と栄養需要に対しての分析が不足であり、コエンザイムＱ１０の発酵に一番影響を与えている二つのパラメータ（酸素の消耗と栄養供給レベル）を調査、制御して生産能力を向上する目的を達成する適切な方法が発見できていない。

報告された材料補充のプロセスにおいて、一般的には分割材料補充、または流加材料補充の方法で補充する。しかし、補充の時間および量は経験値、またはオフラインでサンプリングして基質の濃度を測定することによって決めるため、客観的には補充が遅れる、入れ過ぎおよび不足の現象を発生する可能性がある。導電率で発酵システムにおけるイオンの濃度を表すことができ、培養システムにおける細菌母体の栄養の消耗状況を直接反映することができる。特に無機イオンの消耗状況は、オンライン導電率電極で細菌母体の栄養に対する消耗レベルをリアルタイムに反映することを実現でき、材料補充プロセスの補充時間と補充速度の指標となることが実現された。今まで報告された発酵中の導電率は、発酵工程の変化のモニタのみに使われ、材料補充の制御をフィードバックすることはほとんどなかった。

コエンザイムＱ１０を生産する細菌は時間によって酸素と栄養に対しての需要も異なり、製造中の酸素と栄養の供給レベルを合理的に制御すると、根本から発酵の全工程を制御することができ、また、工程の制御も簡単で、生産の安定を確保し、製造コストを削減することができる。

特許ＣＮ１０２８７６７４３Ａにおいて、オンラインでの酸素の消耗速度を段階分けして制御するプロセスが公開され、コエンザイムＱ１０の累積が著しく向上された。

中国特許出願公開第１０２８７６７４３号明細書

本発明が解決する技術問題は、酸素消耗速度ＯＵＲと栄養供給パラメータの導電率を組み合わせ、同時に制御することによるコエンザイムＱ１０発酵の新しいプロセスを提供することにある。このプロセスは、発酵の全工程を参照するデータでコエンザイムＱ１０の発酵生産レベルを安定的に向上することができ、大規模の工業化生産に適用される。

オンラインでの酸素消耗速度と導電率をともに制御する、コエンザイムＱ１０の発酵生産のプロセスであり、コエンザイムＱ１０を菌株が製造するときの発酵において、酸素の消耗速度を３０−１５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの間で制御し、かつ導電率を５．０−３０．０ｍＳ／ｃｍの間で制御し、細菌母体の成長とコエンザイムＱ１０の合成および累積の開始を促進する。

図１には既存技術における、コエンザイムＱ１０の発酵プロセスの間のＯＵＲ、ＣＥＲ、ＤＯ、導電率、細菌濃度、撹拌速度、空気流量の時間による変化を示している。図２ａには、実施例１（連続材料補充、曲線Ｃ）、実施例３（間欠的分割材料補充、曲線Ｂ）、実施例４（普通は葡萄糖とリン酸カリウム塩だけを補充する。曲線Ａ）の三つの材料補充方法における時間による導電率の変化曲線を示している。図２ｂには、実施例１（連続材料補充、曲線Ｃ）、実施例３（間欠的分割材料補充、曲線Ｂ）、実施例４（普通は葡萄糖とリン酸カリウム塩だけを補充する。曲線Ａ）の三つの材料補充方法における時間による細菌濃度の変化曲線を示している。図２ｃには、実施例１（連続材料補充、曲線Ｃ）、実施例３（間欠的分割材料補充、曲線Ｂ）、実施例４（普通は葡萄糖とリン酸カリウム塩だけを補充する。曲線Ａ）の三つの材料補充方法における時間によるコエンザイムＱ１０濃度の変化曲線を示している。

本発明者らは幅広くて深い研究を通じて、コエンザイムＱ１０の発酵中にオンラインでの酸素消耗速度（ＯＵＲ）を制御し、発酵システムの安定的かつ高レベルの酸素消耗速度（３０−１５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈ）を維持し、材料補充で安定した導電率レベル（５．０−３０．０ｍＳ／ｃｍ）を維持することによって、コエンザイムＱ１０の生産量を大幅に向上することができることを見出した。導電率は媒体中の電流伝達密度であり、反応溶液中のイオン濃度をある程度反映することができ、もし発酵液において導電率が微生物の栄養パラメータと環境指標を代表しているのであれば、適切な導電率は微生物の成長環境の安定を維持することができ、微生物の成長と産物の累積を確保する。ＯＵＲは微生物の酸素消耗速度であり、微生物の酸素に対する需要量を正確に表すことができる。導電率とＯＵＲを共同で制御する新しい方法でコエンザイムＱ１０の生産菌種の快速成長と産物累積のための十分な栄養と酸素の提供を確保する。

コエンザイムＱ１０を菌株が製造する発酵の間に、酸素の消耗速度を３０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの間に制御することが好ましい。

コエンザイムＱ１０を菌株が製造する発酵の間に、発酵液の導電率を１０−２０ｍＳ／ｃｍの間に制御することが好ましい。

本発明において、上記の酸素消耗速度は撹拌速度と空気の流量で調整し、上記の導電率は流加材料補充（flow feeding）または分割材料補充（feed-batch）の方法で調整する。

ここで、流加材料補充または分割材料補充時に使う材料補充液の配合は下記のとおりである。

材料補充液１Ｌで計算すると、酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０、材料補充培養基の導電率は１３．５〜２３ｍＳ／ｃｍである。

本発明の発酵プロセスは下記の内容を含む。種の培養で得たコエンザイムＱ１０の生産菌株を発酵培養基が入った発酵タンクに接種し、発酵に適する条件でコエンザイムＱ１０の生産菌株を培養し、培養中に酸素の消耗速度と培養液の導電率を測定し、測定結果によって発酵条件の調整を行う。

さらに、上記の発酵工程は段階を分けて行われ、その手順は下記の内容を含む。
（１）０〜２４時間の間、撹拌回転速度を４００ｒｐｍに、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎに制御し、酸素消耗速度が低いレベルからすぐ３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに上昇した後に３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈで維持し、導電率が高いレベルから７−１６ｍＳ／ｃｍまで下がる。
（２）２４〜３６時間の間、撹拌回転速度を４５０ｒｐｍまで上げ、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎで維持し、酸素消耗速度が５０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈである。
（３）３６〜６０時間の間、撹拌回転速度を４５０ｒｐｍで維持し、空気流量を１６Ｌ／ｍｉｎまで増やし、酸素消耗速度が６０−７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈである。
（４）６０〜９０時間の間、撹拌回転速度を４５０ｒｐｍで維持し、空気流量を２０Ｌ／ｍｉｎまで増やし、酸素消耗速度が７０−９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈである。
（５）９０〜１００時間の間、撹拌回転速度を４００ｒｐｍに制御し、酸素消耗速度が７０−９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈである。
（６）１００時間の後に、空気流量を１６Ｌ／ｍｉｎに制御し、酸素消耗速度が５０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈである。

手順（２）〜（６）の中細菌母体の成長と培養基中の基質の消耗に伴って、導電率が下がり、培養基の導電率が１５ｍＳ／ｃｍ以下になると、分割材料補充または流加材料補充を始め、発酵液の導電率を１０−２０ｍＳ／ｃｍの間に維持させる。

（７）固体液体分離の方法によって、発酵液の中の微生物細胞を取り集める。
（８）微生物細胞から有機溶剤を利用してコエンザイムＱ１０を採取する。

上記発酵の間に、酸素の消耗速度を３０−９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの間に、導電率を１０〜２０ｍＳ／ｃｍの間に維持し、酸素消耗速度と導電率による材料補充を同時に制御するフィードバックによって、コエンザイムＱ１０の細菌母体の乾燥重量ＤＣＷの成長速度が０．８−１．０ｇ／Ｌ・ｈとなり、コエンザイムＱ１０産物の合成速度が５０−１００ｍｇ／Ｌ・ｈとなる。

本発明において記載される酸素消耗速度は下記の計算式で計算する。

ここで、Ｆ_ｉｎ：流入ガス流量（Ｌ／ｍｉｎ）、Ｖ：発酵液体積（Ｌ）、Ｃ_{不活性ｉｎ}，Ｃ_Ｏ２ｉｎ，Ｃ_{ＣＯ２ｉｎ}：それぞれ流入ガス中の不活性ガス、酸素、二酸化炭素の質量分率、Ｃ_{Ｏ２ｏｕｔ}，Ｃ_{ＣＯ２ｏｕｔ}：それぞれ排出ガス中の酸素、二酸化炭素の質量分率、Ｐ_ｉｎ：流入ガスの絶対圧力（Ｐａ）、ｔ_ｉｎ：流入ガスの温度（℃）、ｈ：流入ガスの相対湿度（％）である。

コエンザイムＱ１０発酵は酸素と基質を消耗する生産、発酵の工程で、酸素の供給と栄養の変化は細菌母体と産物の合成に重要な影響を与えている。本発明者らは１０Ｌ、１５Ｌ、４０Ｌの発酵タンクにおいてＯＵＲを制御変数として段階を分けて酸素を供給するときに、葡萄糖とリン酸カリウム塩だけを流加する、葡萄糖とリン酸カリウム塩を流加するとともに分割して材料補充培養基を補足する、葡萄糖、リン酸カリウム塩、材料補充培養基を流加するという三つの材料補充の補足方法が発酵に対する影響を調査した。３つの供給モードが発酵に及ぼす影響および実験は、ＯＵＲを制御変数として段階を分けて酸素の供給を制御し、最初は酸素の供給を高いレベルに維持させ、工程の後半は回転速度や通気量の低減で酸素の供給を下げ、同時に発酵中に材料補充を通じて導電率を安定な状態に維持させることは細菌母体の成長状態とコエンザイムＱ１０の合成速度を促進することができることを示した。

このため、本発明者らはＯＵＲを酸素供給の制御変数として、導電率を栄養の制御変数として段階を分けた協同制御方法を提供し、最初の段階は高いレベルの酸素供給を維持して細菌母体の快速成長とコエンザイムＱ１０合成の快速開始を促進し、中後段階に回転速度と通気量を減らすことによって酸素の供給を下げ、細菌の呼吸代謝を制御することによって高い比生産速度と基質の転化率を維持することができる。全体の工程において材料の補充によって安定した導電率、安定した細菌母体の生産環境を維持して高いコエンザイムＱ１０の合成速度を確保することができる。

発酵中に、酸素の供給は回転速度、通気量または基質の添加を通じて、発酵の排気ガスシステム中の酸素濃度と二酸化炭素の濃度を検出することによって上記の酸素消耗速度を算出し、栄養は導電率で材料補充を管理し、発酵中の酸素の供給と栄養のバランスの調整を実現する。

＜酸素消耗速度、導電率の制御＞
本発明は、酸素消耗速度（ＯＵＲ）を制御変数として導電率と協同で制御し段階を分けて酸素を供給する制御方法で、紅色細菌（Rhodobacter sphaeroides）等の微生物の発酵でコエンザイムＱ１０を製造する新しい制御プロセスである。本発明の実験は、発酵中における最初の段階での高いレベルの酸素供給と最後の段階での酸素供給の制限によって、発酵中における材料補充で安定した導電率を維持することによって、高い比生産速度と基質の転化率を維持することができ、コエンザイムＱ１０の生産率を大幅に向上し、基質の利用率を向上して原料の無駄を下げ、コストを削減することができることを示した。

＜生産菌株＞
本発明の方法に適用されるコエンザイムＱ１０の菌株は特別の制限がなく、既存のコエンザイムＱ１０の生産菌株を使っても良い。通常の方法の改善または遺伝子工程方法の改善を応用した工程菌を使っても良い。代表的なものは生産菌最適化紅色細菌（Rhodobacter sphaeroides）で、保管番号はＣＧＭＣＣＮｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９８、ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９９である。

上記の保管番号がＣＧＭＣＣＮｏ．５９９７、ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９８、ＣＧＭＣＣＮｏ．５９９９である菌株の保管会社は、全て中国微生物菌種保管管理委員会普通微生物センター（保管会社の住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号中国科学院微生物研究所。保管日付：２０１２年４月１３日）である。

特許ＣＮ１０３５０９７１８Ａ、ＣＮ１０３５０９８１６Ａ、ＣＮ１０３５０９７２９Ａにおいて遺伝子工程方法で菌種を改善する方法が公開され、コエンザイムＱ１０の合成の生産菌を得た後に、通常のコエンザイムＱ１０の合成に適する条件で培養し、コエンザイムＱ１０を合成することができる。本研究では、プロセス条件を改善することによって、遺伝子方法改善後の菌種でさらに合成量の多いコエンザイムＱ１０が得られることが分かった。

＜培養基（培地）＞
本発明の方法に使う種瓶培養基の配合には特別な制限がなく、各種の通常の培養基でも良い。１Ｌの培養基中に酵母粉１ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム１、クエン酸鉄０．００２８ｇ、リン酸２水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素２カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇであり、ｐＨ値７．０である。

上記発明の内容において種タンク培養基の配合は、１Ｌ培養基中に酵母粉１ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、クエン酸鉄０．００２８ｇ、リン酸２水素カリウム０．６ｇ、リン酸水素２カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇであり、ｐＨ値７．０である。

上記発明の内容において発酵タンク培養基の配合は、１Ｌ培養基中に酵母粉８ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、塩化ナトリウム２．８ｇ、クエン酸鉄０．００５ｇ、クエン酸鉄０．６ｇ、リン酸水素２カリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム１２．５５ｇ、塩化カルシウム０．１ｇであり、ｐＨ値７．０である。

発酵中に発酵液システムの導電率が合理範囲内に安定できることを確保するため、使用する材料補充培養基の配合は、１Ｌの材料補充液中に酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０、材料補充培養基の導電率は１３．５〜２３ｍＳ／ｃｍである。

上記発明の内容において発酵タンクの体積は１０Ｌ〜２００ｍ^３で１５Ｌ〜１５０ｍ^３であることが好ましい。

本発明のメリットは、
（１）コエンザイムＱ１０の発酵工程について全面的かつ正確な検査と分析を行い、発酵中に成長を制御する重要なパラメータＯＵＲと導電率に対してのデジタル制御が実現でき、プロセスの管理が簡単で、操作性が良く、生産効率を著しく向上した。
（２）本発明はコエンザイムＱ１０の生産量を効率よく向上し、製造コストを削減することができ、操作が簡単で、環境保護節約の特徴を有し、さらなる工業化の拡大と活用に有利である。
ことにある。

下記の具体的実施例を通じて本発明をさらに述べる。これらの実施例は本発明を説明するためだけであり、本発明の保護範囲を制限するためではないことを理解すべきである。下記の事例中に具体条件の実験方法が記載されていなく、通常は一般の条件に従って実施する。特別の説明がない限り、全ての百分率と数は重量で計算する。

本発明において使用する機器は、１０Ｌの発酵タンク（上海保興生物設備有限公司製造）、１５Ｌの発酵タンク（上海国強生化装備有限公司製造）、排気ガス質量分析器（アメリカＥｘｔｒｅｌ社のＭＡＸ３００−ＬＧ）、オンライン導電率測定器（メトラー・トレド社）である。

本発明の実施例において使われるコエンザイムＱ１０を生産する菌種は紅色細菌（Rhodobacter sphaeroides）である。

＜実施例１：連続流加材料補充のプロセス＞
（１）種の培養：無菌水で培養した斜め面を洗浄し、細胞１０^８〜１０^９個／Ｌの菌懸濁液を作る。その後１０ｍＬを容量５００ｍＬ／１０００ｍＬの種瓶の中に移し、３０℃、１８０〜２５０ｒｐｍの条件の下で２２〜２６時間培養すると種液が得られる。

（２）発酵の培養：手順（１）で得られた種液を１０Ｌの発酵タンクに接種し、接種量は１０％であり、培養温度を２９−３３℃で、タンク内の圧力を０．０３〜０．０５ＭＰａで維持する。酸素の供給は段階を分けて制御する方法を使用し、接種後の初期撹拌回転速度は５００ｒｐｍであり、空気流量は６Ｌ／ｍｉｎである。接種後、成長延滞期が終わると共に、細菌母体の快速成長が始まり対数成長期に入り、ＯＵＲがすぐ上がり、２４時間の間、３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの間に維持し、回転速度は５００−７００ｒｐｍであり、タンク内に残る葡萄糖を０．５−２．０％の間に制御して１１０時間ほど培養する。この間に細菌母体の成長状況によってプロセスのパラメータを調整して葡萄糖の連続補充を開始し、酸素の消耗速度の変化によってプロセスのパラメータを調整すると共に導電率の変化によって材料補充培養基を流加する。

発酵中酸素供給の制御：紅色細菌の発酵でコエンザイムＱ１０を製造する間に、大量の酸素供給は細菌母体の成長を効率的に促進することができるが、酸素が制限される場合、細菌母体の形態が変形になり、同時にコエンザイムＱ１０の合成がすぐ始まるため、紅色細菌の発酵でコエンザイムＱ１０を製造する間は段階を分けて酸素を供給する方法で調整を行う。１０Ｌの発酵タンク中の発酵が開始した後に、細菌母体の成長に従って、ＯＵＲ、ＣＥＲが少しずつ増えることは、細菌母体の酸素消耗量が段々増え、酸素を２０ｈ溶解し１−５％まで下がり、ＯＵＲとＣＥＲの成長が安定期間に入ることを示すが、細菌母体がまだ指数成長期にあり、細菌母体の量が成長を継続することは、細菌母体が既にその最大の呼吸強度に達していて、酸素の供給は既に制限要素になっていることを示す。段階を分けて酸素の供給を高めて細菌母体の成長を増やし、最後の段階で酸素の供給を下げてコエンザイムＱ１０の合成を促進し基質の消耗を下げる。０〜２４時間に撹拌回転速度を５００ｒｐｍに、空気流量を６Ｌ／ｍｉｎに制御する。細菌母体の成長に従ってＯＵＲが少しずつ安定状態に入り、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに達する。この段階では細菌母体はまだ指数成長期にあり、酸素の供給は既に制限条件になっている。撹拌回転速度と通気量を増やすことによって酸素供給レベルを向上し、２４〜３６時間の間、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、３６〜６０時間の間、ＯＵＲを６０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、細菌母体の成長を促進する。６０時間後、この段階は徐々に安定期に入り、細菌母体の成長が止まり、コエンザイムＱ１０がすぐ合成して累積し、酸素の供給を少しずつ減らすことによってコエンザイムＱ１０比生産速度を高いレベルに維持させる。６０〜９０時間の間、ＯＵＲを７０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、９０〜１００時間の間、ＯＵＲを６０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、１００時間後、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持する。

発酵中の材料補充プロセスの制御：紅色細菌でコエンザイムＱ１０を発酵する間に、基質の栄養濃度が細菌母体の成長と産物の累積に同時に影響し、発酵の間に培養基の栄養基質の消耗に従って導電率が下がり、細菌母体の成長環境が変わり、細菌母体の成長と代謝を発生する。一般の発酵工程においては、葡萄糖とリン酸カリウム塩のみ流加する。本材料補充のプロセスでは、一般のプロセスにおいて残糖と溶解リンによって葡萄糖とリン酸２水素カリウムを補充するほか、同時に細菌母体の増殖、発酵液中栄養基質の消耗、導電率の少しずつの低下に従って、導電率が１５．０ｍＳ／ｃｍまで下がったときに、材料補充培養基を流加する。材料補充培養基の配合は１Ｌの材料補充液の中に、酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０、材料補充基の導電率は１３．５〜２３ｍＳ／ｃｍであり、培養基の加入速度を制御することによって導電率を１０−２０ｍＳ／ｃｍ範囲内に維持させる。図２ａにおける曲線Ｃはこの材料補充のプロセスにおける導電率の変化傾向を表し、全工程の残糖は０．５〜２．０％に維持され、１１０時間後に発酵が終わって力価が３３５０ｍｇ／Ｌに達する。

＜実施例２：連続流加材料補充のプロセス＞
（１）種の培養：無菌水で培養した斜め面を洗浄し、１０^８〜１０^９個細胞／ｍＬの菌懸濁液を作る。その後１０ｍＬを容量が５００ｍＬ／１０００ｍＬの種瓶に移し、３０℃、１８０−２５０ｒｐｍの条件で２２−２６時間培養する。

（２）発酵培養：手順（１）で得られた種液を１５Ｌの発酵タンクに接種し、接種量は１０％であり、培養温度を２９−３３℃で、タンク内の圧力を０．０３〜０．０５ＭＰａで維持する。酸素の供給は段階を分けて制御する方法を使用し、接種後の初期撹拌回転速度は５００ｒｐｍであり、空気流量は９Ｌ／ｍｉｎである。接種後、成長延滞期が終わると共に、細菌母体の快速成長が始まり対数成長期に入り、ＯＵＲがすぐ上がり、２４時間の間、３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈで維持し、回転速度は５００−７００ｒｐｍであり、タンク内に残る葡萄糖を０．５−２．０％の間に制御し、１１０時間ほど培養する。この間に細菌母体の成長状況によってプロセスのパラメータを調整して葡萄糖の連続補充を開始し、酸素の消耗速度の変化によってプロセスのパラメータを調整すると共に導電率の変化によって材料補充培養基を流加する。

発酵中の酸素供給の制御は段階を分けて酸素を供給する方法で調整する。段階を分けて酸素の供給をすることによって細菌母体の成長を増やし、最後の段階で酸素の供給を減らすことによってコエンザイムＱ１０の合成を促し、基質の消耗を減少する。０〜２４時間の間、撹拌回転速度を５００ｒｐｍに、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎに制御し、細菌母体の成長に従ってＯＵＲが少しずつ安定状態に入り、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに達する。この段階では細菌母体はまだ指数成長期にあり、酸素の供給は既に制限条件になっている。撹拌回転速度と通気量を増やすことによって酸素供給レベルを向上し、２４〜３６時間の間、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、３６〜６０時間の間、ＯＵＲを６０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、細菌母体の成長を促進する。６０時間後、この段階は徐々に安定期に入り、細菌母体の成長が止まり、コエンザイムＱ１０がすぐ合成して累積し、酸素の供給を少しずつ減らすことによってコエンザイムＱ１０比生産速度を高いレベルに維持させる。６０〜９０時間の間、ＯＵＲを７０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、９０〜１００時間の間、ＯＵＲを６０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、１００時間後、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持する。

発酵中の材料補充プロセスの制御：本材料補充のプロセスでは、一般のプロセスにおいて残糖と溶解リンによって葡萄糖とリン酸２水素カリウムを補充するほか、同時に細菌母体の増殖、発酵液中栄養基質の消耗、導電率の少しずつの低下に従って、導電率が１５．０ｍＳ／ｃｍまで下がったときに、材料補充培養基を流加する。材料補充培養基の配合は１Ｌの材料補充液の中に、酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０、材料補充基の導電率は１３．５〜２３ｍＳ／ｃｍであり、培養基の加入速度を制御することによって導電率を１０−２０ｍＳ／ｃｍ範囲内に維持させる。全工程の残糖は０．５〜２．０％に維持され、１１０時間後に発酵が終わって力価が３４２０ｍｇ／Ｌに達する。

＜実施例３：分割材料補充のプロセス＞
（１）種の培養：無菌水で培養した斜め面を洗浄し、１０^８〜１０^９個細胞／ｍＬの菌懸濁液を作る。その後１０ｍＬを容量が５００ｍＬ／１０００ｍＬの種瓶に移し、３０℃、１８０−２５０ｒｐｍの条件で２２−２６時間培養する。

（２）発酵培養：手順（１）で得られた種液を１０Ｌの発酵タンクに接種し、接種量は１０％であり、培養温度を２９−３３℃で、タンク内の圧力を０．０３〜０．０５ＭＰａで維持した。酸素の供給は段階を分けて制御する方法を使用し、接種後の初期撹拌回転速度は５００ｒｐｍであり、空気流量は６Ｌ／ｍｉｎである。接種後、成長延滞期が終わると共に、細菌母体の快速成長が始まり対数成長期に入り、ＯＵＲがすぐ上がり、２４時間の間、３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈで維持し、回転速度は５００−７００ｒｐｍであり、タンク内に残る葡萄糖を０．５−２．０％の間に制御し、１１０時間ほど培養する。この間に細菌母体の成長状況によってプロセスのパラメータを調整して葡萄糖の連続補充を開始し、酸素の消耗速度の変化によってプロセスのパラメータを調整すると共に導電率の変化によって材料補充培養基を流加する。

発酵中の酸素供給の制御は段階を分けて酸素を供給する方法で調整する。段階を分けて酸素の供給をすることによって細菌母体の成長を増やし、最後の段階で酸素の供給を減らすことによってコエンザイムＱ１０の合成を促し、基質の消耗を減少する。０〜２４時間の間、撹拌回転速度を５００ｒｐｍに、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎに制御し、細菌母体の成長に従ってＯＵＲが少しずつ安定状態に入り、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに達する。この段階では細菌母体はまだ指数成長期にあり、酸素の供給は既に制限条件になっている。撹拌回転速度と通気量を増やすことによって酸素供給レベルを向上し、２４〜３６時間の間、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、３６〜６０時間の間、ＯＵＲを６０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、細菌母体の成長を促進する。６０時間後、この段階は段々安定期に入り、細菌母体の成長が止まり、コエンザイムＱ１０がすぐ合成して累積し、酸素の供給を少しずつ減らすことによってコエンザイムＱ１０比生産速度を高いレベルに維持させる。６０〜９０時間の間、ＯＵＲを７０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、９０〜１００時間の間、ＯＵＲを６０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持し、１００時間後、ＯＵＲを５０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに維持する。

発酵中の材料補充のプロセスは間欠式分割材料補充の方法を使用し、発酵の間にそれぞれ２０、４０、６０時間のときに発酵液体積が２０％の材料補充培養基を補充し、材料補充培養基の配合は、１Ｌの材料補充液中に酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ、リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０である。細菌母体の成長に従って、培養基質が消耗され、導電率が少しずつ下がり、毎回の材料補充の後に、導電率が大幅に上がり、その後少しずつ下がり、図２ａにおける曲線Ｂはこの材料補充の方法における発酵中の導電率の変化傾向を表している。全工程においての残糖は０．５〜２．０％に維持され、１１０時間後に発酵が終わり、力価が３０１３ｍｇ／Ｌに達する。

＜実施例４：対照例＞
（１）種の培養：無菌水で培養した斜め面を洗浄し、１０^８〜１０^９個細胞／ｍＬの菌懸濁液を作る。その後１０ｍＬを容量が５００ｍＬ／１０００ｍＬの種瓶に移し、３０℃、１８０−２５０ｒｐｍの条件で２２−２６時間培養する。

発酵中の材料補充工程の制御：既存の培養プロセスを対照例として、発酵の間に発酵液中の残糖の量と溶解リンの濃度によって葡萄糖とリン酸カリウム塩を補充する。本対照例のプロセス工程において、細菌母体の成長に従って、基質が消耗され導電率が少しずつ下がっていく。図２ａにおける曲線Ａは対照例材料補充のプロセスにおける導電率の変化傾向を表している。全工程の残糖は０．５〜２．０％に維持され、１１０時間後に発酵が終わり、力価が２８４３ｍｇ／Ｌに達する。

既存のコエンザイムＱ１０の材料補充分割培養プロセスでは、段階を分けて酸素の供給を制御して細菌母体の成長とコエンザイムＱ１０の累積を向上している。図１において、発酵中の撹拌回転速度と流量の調整をしたときのＯＵＲ、ＣＥＲと導電率の変化状況を反映している。発酵の最初段階では、細菌母体の成長に従って、ＯＵＲ、ＣＥＲが少しずつ増えることは、細菌母体の酸素消耗量が徐々に増えることを表し、２６時間後にＯＵＲ、ＣＥＲの成長が安定状態に入り、導電率が細菌母体の基質の消耗および材料補充で発生した希釈によって徐々に下がるが、細菌母体がまだ指数成長期にあり、細菌母体の量がまだ増えていることは、細菌母体が既にその最大の呼吸強度に達していて、酸素の供給は既に制限要素になっていることを示す。同時に導電率の低下も、栄養濃度が消耗され、細菌母体生産環境の栄養の不均一を発生しやすいことを意味している。

本発明者らは、１０Ｌと１５Ｌの実験タンクにおいて段階を分けて酸素の供給を制御するプロセスにおいて、それぞれの材料補充方法でオンライン導電率が基質濃度を反映して培養基を補充することがコエンザイムＱ１０の発酵に対して影響することを調査した。図２ａ〜２ｃは、材料補充の方法によってのコエンザイムＱ１０発酵中における導電率、細菌濃度およびコエンザイムＱ１０濃度の変化を表している。

発酵中に、細菌母体の成長、基質の消耗、材料補充で発生した基質の濃度の希釈が全て導電率の低下を発生している。図２ａからみると、分割材料補充と流加材料補充が両方とも基質濃度を安定させる役割を果たしていることが分かる。

図２ｂからみると、発酵中における培養基を補充することによる細菌濃度への影響はそれほど著しくないことが分かる。特に発酵の前期と後期では、材料補充の方法によって発酵前期の濃度が少ししか上がらないため、培養基の補充が発酵の後期の状態に有利であることが分かる。

図２ｃからみると、導電率が１５ｍＳ／ｃｍに下がってから培養基を流加し、基質濃度の安定性を維持することは発酵の中の後期の累積を著しく向上できることが分かる。

上記の説明によると、コエンザイムＱ１０発酵の間は段階を分けた酸素供給および流加材料補充の酸素供給の方法で発酵工程を調整する。従って、発酵工程の成長段階と前期の合成段階では高いレベルの酸素供給で細菌母体の快速成長とコエンザイムＱ１０の快速開始を促進し、細菌母体が快速の消耗段階に入るときに培養基を流加して必要な栄養基質を補充し、細菌母体の成長環境を維持する。細菌母体が安定期に入ると、段階を分けて高いコエンザイムＱ１０比生産速度を維持して基質葡萄糖の消耗を減らす。この段階を分けての酸素供給および材料補充方法は、確実に生産菌の最良の生理学的な特性状態が得られ、コエンザイムＱ１０の生産コストを削減することができる。

Claims

オンラインでの酸素消耗速度と導電率の同時制御によるコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセスであって、
コエンザイムＱ１０を紅色細菌（Rhodobacter sphaeroides）が製造するときの発酵において、酸素消耗速度を３０〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈの間に制御し、それと共に導電率が１０〜２０ｍＳ／ｃｍの間で安定し、細菌の成長とコエンザイムＱ１０の合成を促して累積を行い、
前記酸素消耗速度を撹拌速度と空気流量で調整し、前記導電率を流加材料補充または分割材料補充の方法で調整し、
前記流加材料補充または前記分割材料補充のときに使われる材料補充液の処方が、
材料補充液１Ｌで計算すると、酵母粉８〜１２ｇ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ、硫酸マグネシウム１〜２ｇ、塩化ナトリウム３〜６ｇ、リン酸２水素カリウム２〜４ｇ，リン酸水素２カリウム２〜４ｇ、塩化カルシウム１〜２ｇ、ビオチン０．０１３〜０．０２５ｇであり、ｐＨ値７．０、材料補充培養基の導電率が１３．５〜２３ｍＳ／ｃｍである、ことを特徴とするコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセス。
請求項１に記載のコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセスであって、
種の培養で得たコエンザイムＱ１０の生産菌株を発酵培養基が入った発酵タンクに接種し、発酵に適する条件でコエンザイムＱ１０の生産菌株を培養し、培養中に前記酸素消耗速度と培養液の前記導電率を測定して、その測定の結果によって発酵条件の調整を行うことを特徴とするコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセス。
請求項２に記載のコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセスであって、
前記発酵の過程が段階毎に分けられて行われ、その手順は、以下のステップ（１）〜（８）を含み、
（１）０〜２４時間の間、撹拌回転速度を４００ｒｐｍに、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎに制御し、酸素消耗速度が低いレベルからすぐ３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに上昇した後に３０−５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈで維持し、導電率が高いレベルから７−１６ｍＳ／ｃｍまで下がるステップ、
（２）２４〜３６時間の間、撹拌回転速度を４５０ｒｐｍまで上げ、空気流量を９Ｌ／ｍｉｎで維持し、酸素消耗速度が５０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈであるステップ、
（３）３６〜６０時間の間、撹拌回転速度が４５０ｒｐｍで維持し、空気流量を１６Ｌ／ｍｉｎまで増やし、酸素消耗速度が６０−７０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈであるステップ、
（４）６０〜９０時間の間、撹拌回転速度を４５０ｒｐｍで維持し、空気流量を２０Ｌ／ｍｉｎまで増やし、酸素消耗速度が７０−９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈであるステップ、
（５）９０〜１００時間の間、撹拌回転速度を４００ｒｐｍに制御し、酸素消耗速度が７０−９０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈであるステップ、
（６）１００時間の後に、空気流量を１６Ｌ／ｍｉｎに制御し、酸素消耗速度が５０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈであるステップ、
（７）固体液体分離の方法によって発酵液の中の微生物細胞を取り集めるステップ、
（８）微生物細胞から有機溶剤を利用してコエンザイムＱ１０を採取するステップ、
ステップ（２）〜（６）において、発酵液の導電率を１０〜２０ｍＳ／ｃｍの間に維持することを特徴とするコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセス。
請求項２に記載のコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセスであって、
前記発酵タンクの体積が、１０Ｌ〜１５０ｍ^３であることを特徴とするコエンザイムＱ１０の発酵製造プロセス。