CN113388658A - 一种提升青霉素发酵生产单位的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提升青霉素发酵生产单位的方法。本发明首次揭示了青霉素发酵过程中新型调控策略，在发酵过程中通过调控电导率来调节硫酸根的补加速率，有效地提高了青霉素的产量。本发明提供了一种条件可控、过程控制简易、成本低廉的青霉素增产方案。

Description

一种提升青霉素发酵生产单位的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及一种提升青霉素发酵生产单位的方法。

背景技术

青霉素属于β-内酰胺类抗生素，是针对于革兰氏阳性菌感染常用的抗菌药品。自1929年弗莱明首次发现青霉素，距今已有近90年历史，作为第一个被发现的β-内酰胺类抗生素，青霉素仍然发挥着极其重要的作用。2003年，β-内酰胺类抗生素的年产值已经达到了150亿美元，青霉素类产品占其中的三分之一。

从青霉素发现到大规模生产以来，经过无数次的菌种筛选、物理和化学因素诱变育种、基因工程改良等不断的推进，逐渐获得了具有高产性能的青霉素发酵生产菌株，使得其生产能力有了很大的提升。同时，随着发酵过程工艺的不断优化探索，逐渐形成了青霉素现代化的自动化生产控制工艺，显著地提高了生产效率，降低了生产成本，使得该产品的生产能够很好地满足人们的需求。

产黄青霉菌发酵生产青霉素过程中，发酵工艺条件的优化控制非常关键。产黄青霉菌合成青霉素的过程受溶解氧、溶解二氧化碳浓度、pH、氨氮浓度、葡萄糖残留浓度、苯乙酸的残留浓度、氧消耗速率等很多因素的影响，尤其是在大型发酵罐中，底物浓度的梯度场及其混合时间也对青霉素的合成有着显著的影响[1]。通过对青霉素发酵过程中种子质量的控制，移种过程的精细操作和检查，pH值、氨氮等重要参数的控制，补料的动态调整等方面的精细化控制，可以有效地控制代谢方向，避免代谢异常。因此，很多研究者分别通过间歇式补料、连续补料、反馈式浓度控制等多种方式，实现了发酵过程中葡萄糖补加速率、氨氮控制水平、苯乙酸补加速率等的精确调控，促进了青霉素发酵生产单位的快速提升[2]。

穆军明[3]通过研究青霉素发酵过程菌丝形态的变化与产物合成之间的关系，进行了营养补加优化实验，同时将菌丝形态分化情况作为放罐的重要指标，以避免菌丝过度分化对提取阶段过滤效率的影响。张敬书[4]等研究了带放式发酵工艺，通过对青霉素发酵过程的低单位带放菌丝收集至带放罐再培养，可使单罐批发酵产量得率提高15％。

李云龙等[5]设计了后期倒种和后期补磷酸盐两种工艺优化策略，并通过代谢流分析，证实了优化工艺能够促进前体氨基酸及NADPH的合成，从而提升了青霉素产率。

尽管有了上述的改进，使青霉素的生物发酵生产的产量得以显著性提高，但是本领域仍然需要摸索各种发酵条件，对青霉素发酵技术进行改良，以期进一步提高其生产效率，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提升青霉素发酵生产单位的方法。

在本发明的第一方面，提供一种提高青霉素生物合成的产量(生产单位)的方法，所述方法包括：在发酵进行到青霉素快速合成期后，通过补加硫酸根离子控制发酵液的电导率，调控电导率数值在10～25ms/cm。

在一个优选例中，通过补加硫酸根离子控制发酵液的电导率，使得电导率数值在11～23ms/cm；较佳地在13～22ms/cm；更佳地在16～22ms/cm。

在另一优选例中，通过补加硫酸根离子控制发酵液的电导率，调控电导率数值在12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24ms/cm。

在本发明的另一方面，提供一种提高青霉素生物合成的产量(生产单位)的方法，所述方法包括：在发酵进行到青霉素快速合成期后，通过补加硫酸根离子控制发酵液的硫酸根浓度在11～28mg/mL。

在一个优选例中，控制发酵液的硫酸根浓度在12～26mg/mL。较佳地，控制硫酸根浓度在13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg/mL。

在另一优选例中，所述发酵进行到青霉素快速合成期为：发酵起始后无机盐(包括产生硫酸根离子的无机盐)进入快速消耗的阶段。

在另一优选例中，发酵起始后第30～90小时，较佳地第35～70小时，更佳地40～50小时。

在另一优选例中，所述发酵进行到青霉素快速合成期为发酵起始后第35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85小时。

在另一优选例中，利用青霉素生产菌进行所述生物合成；较佳地，所述青霉素生产菌为产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)；较佳地为产黄青霉菌HLPG-21。

在另一优选例中，所述的硫酸根离子来自于：硫酸钠，硫酸钾、硫酸铵。

在另一优选例中，发酵培养基包括：柠檬酸、玉米浆(包括50％玉米浆)、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、碳酸钙，玉米油；较佳地该培养基的pH值为5.5～5.8。

在另一优选例中，发酵培养基中包括：柠檬酸1.69g/L、50％玉米浆10ml/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、硫酸钠3.5g/L、硫酸镁2.0g/L、硫酸锰0.002g/L、硫酸亚铁0.01g/L、碳酸钙2.69g/L，玉米油2ml/L，消泡剂0.035ml/L其中各个组分可上下浮动1～50％，如浮动10％、20％、30％、40％等。

在另一优选例中，在发酵结束前5～20小时，不进行电导率的调控和硫酸根离子的补加；较佳地，在酵结束前10～15小时，不进行电导率的调控和硫酸根离子的补加。

在另一优选例中，发酵培养过程中流加葡萄糖，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.2g/L；较佳地，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.15g/L。

在另一优选例中，发酵培养过程中流加苯乙酸，控制苯乙酸残留浓度在0.2～0.6g/L；较佳地控制苯乙酸残留浓度在0.3～0.5g/L。

在另一优选例中，发酵培养时，还包括：调节pH在6.5±0.25；较佳地，调节pH在6.5±0.2；较佳地，利用氨水来进行pH调节。

在另一优选例中，通过硫酸铵来控制氨氮浓度不低于0.4g/L。

在另一优选例中，通过转速或空气流量调控溶氧浓度不低于60％；调节发酵温度为25±2℃。

在另一优选例中，在发酵起始后165～180小时结束发酵。

在另一优选例中，在发酵的最后5～25小时(如10、15、20、25小时)，不进行电导率的控制或硫酸根离子的补加。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不实施电导率控制时，常规工艺条件下的发酵过程中PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的曲线。

图2、发酵至一定阶段实施电导率控制，在电导率为13.0±1.2ms/cm条件下PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的曲线。

图3、发酵至一定阶段实施电导率控制，在电导率为17.3±0.8ms/cm条件下PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的曲线。

图4、不同电导率控制条件下的青霉素发酵代谢过程对比。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了青霉素发酵过程中新型调控策略。本发明人意外地发现，在发酵过程中通过调控电导率来调节硫酸根离子的补加速率，从而提供了一种条件可控、过程控制简易、成本低廉的调控策略。本发明的方法极为有效地提高了青霉素的产量。

如本发明所用，所述的“一级发酵”、“二级发酵”是指种子罐发酵。所述的“三级发酵”是以生产青霉素为目的的发酵。除非另外说明，本发明权利要求及说明书中所述的“发酵”、“培养”是指“三级发酵”。

除非另外说明，本发明权利要求及说明书中时间点的计算以“三级发酵”起始的时间点作为起始(0小时)。

如本发明所用，所述的“菌体生长期”是指发酵前期，即以青霉素生产菌生长扩繁为主的发酵阶段，该阶段会有青霉素的合成、但合成速率是相对低于“青霉素快速合成期”的。在本发明的一些优选方式中，所述的“菌体生长期”为发酵起始后的0～40小时、0～45小时、0～50小时、0～55小时或0～60小时。应理解，在发酵规模或发酵条件发生变化的情况下，不排除“菌体生长期”的时间可以超出这一优选方式中的时间范围，本领域技术人员在发酵过程中可以通过发酵过程分析来获得这一“菌体生长期”。

如本发明所用，所述的“青霉素快速合成期”是指发酵前期之后的青霉素生产阶段，即以青霉素的合成为主的发酵阶段，该阶段中青霉素生产菌继续生长扩繁、但生长扩繁速度低于“菌体生长期”。在本发明的一些优选方式中，所述的“青霉素合成期”为发酵起始的40、45、50、55或60小时之后。应理解，在发酵规模或发酵条件发生变化的情况下，不排除“青霉素合成期”的时间可以超出这一优选方式中的时间范围，本领域技术人员在发酵过程中可以通过发酵过程分析来获得这一“菌体生长期”。

如本发明所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

青霉素作为第一个被应用的β-内酰胺类抗生素，至今仍在医疗健康领域发挥着重要作用。青霉素发酵过程中，无论是青霉素合成还是菌体的生长，都需要合适量的氮源和碳源底物，同时，在青霉素的快速合成过程中，硫元素作为青霉素结构的组成部分，一定浓度的硫酸根离子浓度对于促进青霉素的合成也有着重要的作用。本发明人发现，以补糖为主的残糖控制工艺和氨氮离线测定值反馈的氨水和硫酸铵补加工艺，往往会使得硫酸根离子的供应成为限制性因素。如何更好地控制硫酸根离子的浓度和供给量，以及寻找合理的硫酸根离子在线反馈流加控制工艺非常关键。

以往发酵过程中，硫酸铵的补加往往在发酵液中氨氮低于控制浓度时才适当补加的模式，本发明人发现，这种模式会造成青霉素快速合成期硫元素的不足，从而限制青霉素单位的提升，不利于青霉素的高产。本发明人在深入的过程数据研究中意外地发现，青霉素发酵进入青霉素快速合成期后，电导率与硫酸根离子的浓度呈现较好的对应关系，从而，电导率可以指导青霉素发酵过程中硫酸根离子的补加。

基于本发明人的上述新发现，本发明提出了发酵过程中重要前体物质硫酸根离子的优化控制提升青霉素发酵单位的方法，该方法包括：在发酵进行到青霉素快速合成期时，通过补加硫酸根控制发酵液的电导率，调控电导率数值在10～25ms/cm；较佳地在11～23ms/cm；更佳地在16～22ms/cm。具体地，该电导率数值可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24ms/cm。

基于本发明人的上述新发现，本发明提出了发酵过程中重要前体物质硫酸根离子的优化控制提升青霉素发酵单位的方法，该方法包括：在发酵进行到青霉素快速合成期后，通过补加硫酸根离子控制发酵液的硫酸根浓度在12～28mg/mL；优选地12～26mg/mL。具体地，该硫酸根浓度可以在13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg/mL。

在以增加硫酸根离子为目的进行流加时，运用可以在发酵液中产生硫酸根离子的试剂来进行。作为本发明的优选方式，所述的硫酸根离子来自于：硫酸钠，硫酸钾、硫酸铵。

本发明的方法中，可以采用常规的青霉素发酵培养基进行产青霉素生产菌的培养。作为本发明的优选方式，所述的发酵培养基含有：柠檬酸、玉米浆(50％)、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、碳酸钙，玉米油。这一培养基配方配合本发明的发酵操作过程，为菌体生长以及青霉素的生产提供了良好的营养环境基础。尽管如此，应理解，在该发酵培养基基础上经过一定变化而获得的培养基或本领域已知的一些培养基，也可被应用于本发明中，配合本发明的电导率调控策略。上述列出的培养基中的各个组分均是本领域技术人员已知的组分，可以通过商业途径购买获得。有些组分可以是其本身或者是其水合物。

作为本发明的优选方式，在发酵的过程中，为了满足菌体生长以及生产所需，发酵过程中还进行其它一些原料的补料，包括：

a.以补充碳源为目的的补料；较佳地，以葡萄糖进行补料；更佳地，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.2g/L；较佳地，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.15g/L

b.以补充青霉素合成前体为目的的补料；较佳地，以苯乙酸进行补料；更佳地，控制苯乙酸残留浓度在0.2～0.6g/L；较佳地控制苯乙酸残留浓度在0.3～0.5g/L。

c.以调节氨氮浓度为目的的补料；较佳地，调节氨氮浓度不低于0.4g/L；更佳地，通过硫酸铵来控制氨氮浓度。应理解，硫酸铵以外其它的对于调节氨氮浓度有用的物质也是可用的。

d.以调节pH为目的的补料；较佳地，调节pH在6.5±0.25；更佳地，调节pH在6.5±0.2；更佳地，利用氨水来进行pH调节。应理解，氨水以外其它的对于调节pH值有用的物质也是可用的。

在本发明的优选实施方式中，补料液含有：葡萄糖，苯乙酸、硫酸铵，氨水。在发酵的过程中，采用流加的方式补加该补料液。

在发酵的过程中pH、温度以及罐压等条件，可以采用本领域中常用的用于青霉素生产菌的培养条件。作为本发明的优选方式，pH在6.5±0.25；温度25±2℃；罐压0.05±0.02Mpa，较佳地0.05±0.01MPa。

在发酵的最后阶段，如在最后5～25小时，不进行电导率的控制或硫酸根离子的补加，以充分消耗发酵液中的硫酸根离子。

本发明的方法适用于多种发酵规模的应用，适用于工业规模生产。例如，发酵规模为1～500000L；更具体如500000L，300000L，160000L，30000L，10000L，100L，50L，30L等。应理解，在不同的发酵规模下，一些发酵过程条件可以发生一些变化，而不限于本发明优选实施方式中所提供的，所述变化在本领域技术人员可以了解的范围内。

青霉素发酵过程中硫酸根是菌体生长和产物合成的重要组成部分，尤其是对于产物合成非常关键。然而，本领域现有技术中，对于硫酸根离子浓度的控制及其自动化控制模式的研究却比较少，而本发明的方法可以如此显著地提高青霉素产量，这是出乎意料的。此外，由于电导率的测定是一种方便快捷的检测方法，本发明的方法在显著提高青霉素产量的基础上，并不会增加发酵成本，进一步满足了生物反应过程高效低耗的要求，具有良好的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、生产菌株

产黄青霉菌HLPG-21，来源于上海国佳生化工程技术研究中心有限公司。

2、培养基与培养条件

斜面培养基(g/L)：

蔗糖13、酵母粉6.5、甘油5.3、NaCl 9.4、硫酸镁0.03、磷酸二氢钾1.2、琼脂20，pH6.8±0.25。培养温度为25℃，相对湿度45％～65％条件下避光培养168小时。

种子培养基(g/L)：

蔗糖20、玉米浆(50％)60、硫酸铵3.2、CaCO₃ 5，pH 5.8。接种量为1cm²斜面孢子，培养温度为25℃，相对湿度45％～65％，260rpm条件下避光培养45～50小时。

发酵培养基(g/L)：

柠檬酸1.69、玉米浆(50％)10ml、硫酸铵1.5、磷酸二氢钾3.5、硫酸钠3.5、硫酸镁2.0、硫酸锰0.002、硫酸亚铁0.01、碳酸钙2.69，玉米油2ml，聚醚消泡剂0.035ml，pH 5.6。接种比为35％，培养温度为25℃，220rpm条件下避光培养168h。每天补入15％苯乙酸钠0.2mL。

3、菌体浓度的测定

取发酵液10ml到刻度离心管，用台式离心机4000转离心处理15分钟，将上清液倒入量筒，计量固含物的离心体积比例，得到菌体的体积占比PMV(％)，每隔取样点复测定3次，取平均值得到菌体浓度PMV值。

4、青霉素浓度、苯乙酸浓度测定

去发酵液离心得到的上清后进行合理浓度的稀释，使用高效液相色谱法检测样品中青霉素G和苯乙酸浓度[6]。

青霉素发酵生产单位的定义：1mg青霉素钠定为1670单位，即1mg/mL为1670U/mL。

5、硫酸根离子浓度测定

根据文献“彭丹，地下水中硫酸根离子检测方法[7]”进行浓度测定。

6、氨氮浓度测定

采用甲醛滴定法进行上清液中氨氮浓度的测定[4]。

7、葡萄糖残留浓度测定

取发酵液上清，采用生化分析仪(山东科学院)进行酶膜法葡萄糖浓度测定。

8、活细胞传感器的使用

使用在线活菌量传感器(Hamilton online viable biomass)，将电极探头安装到发酵罐中，选用频率为680kHz进行在线活菌细胞量和发酵液电导率的在线采集。菌体干重含量(DCW)与电容值(Cap)之间的关系为(DCW＝0.78Cap+2.00)。

9、一级种子培养

在无菌条件下取制备好的米孢子5克接种到15L一级发酵罐，发酵体积为10L，初始pH为6.5～6.7，温度25℃，转速400rpm。培养75小时后，当pH回升到6.7～6.8时，菌浓PMV达到25％时，转接到二级种子罐中进行二级种子培养。

10、二级种子培养

在30升种子罐中，按照种子培养基配方配制17升的培养基组分，121℃灭菌30分钟，灭菌后无菌培养基体积控制在12升。待温度降到25℃时，接种培养好的一级种子5升。初始转速450rpm，通气量17L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度在0.5±0.1g/L，通过连续流加30％含量的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮浓度通过硫酸铵控制在0.5g/L，过程中通过转速和流量调整控制溶氧浓度不低于60％。当二级种子罐中菌浓达到32％，青霉素效价达到15000U/mL时移入三级发酵罐，以保证接入三级发酵的高菌量和菌体分化特性。

11、发酵过程培养

在50升发酵罐中，按照发酵培养基配方配制30升的培养基组分，121℃灭菌30分钟，灭菌后无菌培养基体积控制在20升。接种培养好的二级种子10升。初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖(含量为60％)控制残留浓度控制在0.45±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮浓度通过硫酸铵控制不低于0.4g/L，过程中通过转速和空气流量调整控制溶氧浓度不低于60％；根据发酵过程中电导率的测定值，通过流加硫酸钠溶液(30％浓度)控制电导率达到工艺设计目标。当发酵液体积达到36升时，带放出来6升。测定发酵过程中菌浓、效价、硫酸根离子浓度、苯乙酸浓度和氨氮浓度等。发酵培养172～175小时结束发酵。

实施例1、正常工艺条件下的发酵生产青霉素的过程曲线

根据一级种子和二级种子的培养方法得到长好二级种子，将10升二级种子移种到装有20升培养液的发酵培养基中，按照前述“11、发酵过程培养”的发酵工艺控制初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度控制在0.4±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮浓度通过硫酸铵控制在0.5g/L，过程中通过转速和流量调整控制溶氧浓度不低于60％。

发酵周期中PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的变化过程如图1。发酵过程中，电导率不利用硫酸钠进行调节，随着发酵培养的进行，培养液的电导率呈现下降的趋势，在发酵前期40h，随着菌体浓度的快速增长，培养液中的无机盐被快速消耗，电导率下降速率显著；随着菌体生长进入稳定区，产黄青霉菌次级代谢快速启动，电导率降低的趋势逐渐变缓，尤其是发酵周期110h后，当电导率降低到10以下时，青霉素的合成速率明显下降，173h发酵结束时的青霉素生产单位为121984U/mL。而且发酵过程中硫酸根离子浓度在40h内的菌体生长期，消耗速率较小，硫酸根离子浓度降低较慢；然而在青霉素合成期，硫酸根离子浓度快速下降，110小时时，硫酸根离子浓度快速从40h时的25mg/mL降低到了7.5mg/mL，之后稳定在5.8mg/mL；这个阶段的铵离子浓度变化与电导率的变化有较好的相关性。

实施例2、产物合成期控制电导率数值的条件下的青霉素发酵过程曲线(控制A)

按照一级种子和二级种子的培养方法得到长好二级种子，将10升二级种子移种到装有20升培养液的发酵培养基中，按照前述“11、发酵过程培养”的发酵工艺控制初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度控制在0.4±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮残留浓度通过流加硫酸铵溶液控制在0.5g/L，过程中通过转速和流量调整控制溶氧浓度不低于60％。

当发酵到60h，电导率降到接近16ms/cm时，连续流加硫酸钠，其使得电导率在发酵到75h时缓慢降到并维持在13.0±1.2ms/cm，160h后电导率不控制，消耗发酵液中残留的硫酸根离子。发酵周期中PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的变化过程如图2。从数据结果上可以看出，硫酸钠能够调控发酵液的电导率。

根据图2，随着硫酸钠的补加，75小时后，对应的硫酸根离子浓度在青霉素快速合成过程中控制在了16±1.7mg/mL，青霉素的合成速率显著高于对照批次。硫酸根离子的补加极大地促进了青霉素的快速合成，放罐单位达到了135370U/mL，比不实施硫酸钠进行电导率控制的正常工艺提升了11.0％。

实施例3、产物合成期控制电导率数值的条件下的青霉素发酵过程曲线(控制B)

按照一级种子和二级种子的培养方法得到长好二级种子，将10升二级种子移种到装有20升培养液的发酵培养基中，按照前述“11、发酵过程培养”的发酵工艺控制初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度控制在0.4±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮残留浓度通过流加硫酸铵溶液控制在0.5g/L，过程中通过转速和空气流量调整控制溶氧浓度不低于60％。

当发酵到45h，电导率降到18ms/cm时，通过连续流加硫酸钠调节电导率在17.3±0.8ms/cm。

160h后，电导率不控制，消耗发酵液中残留的硫酸根离子。

发酵周期中PMV、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的变化过程如图3。随着硫酸钠的补加，菌体的浓度增长速率较快，高于正常电导率不控制的工艺，对应的硫酸根离子浓度维持在了20.0±2.0mg/mL，青霉素的生成速率显著高于对照批次和控制策略A的合成速率。在高的硫酸根离子维持浓度下，青霉素能够保持较快的合成速率，放罐单位达到了146370U/mL，与对照相比提升了19.9％以上。

实施例4、青霉素快速合成期电导率控制在19.2±0.6ms/cm的条件下的青霉素发酵过程曲线(控制C)

按照一级种子和二级种子的培养方法得到长好二级种子，将10升二级种子移种到装有20升培养液的发酵培养基中，按照前述“11、发酵过程培养”的发酵工艺控制初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度控制在0.4±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮残留浓度通过流加硫酸铵溶液控制在0.5g/L，过程中通过转速和空气流量调整控制溶氧浓度不低于60％。

当发酵到40h，电导率降到20ms/cm时，通过连续流加硫酸钠调节电导率在19.2±0.6ms/cm。之后，对应的硫酸根离子浓度维持在了24±2.1mg/mL，青霉素能够保持较快的合成速率。

160h后，电导率不控制，消耗发酵液中残留的硫酸根离子。放罐时，青霉素单位达到了146450U/mL。

实施例5、霉素快速合成期电导率控制在12.1±0.7ms/cm(控制D)

按照一级种子和二级种子的培养方法得到长好二级种子，将10升二级种子移种到装有20升培养液的发酵培养基中，按照前述“11、发酵过程培养”的发酵工艺控制初始转速430rpm，通气量30L/min，罐压力0.05MPa，培养过程中通过流加葡萄糖控制残留浓度控制在0.4±0.1g/L，通过连续流加30％浓度的苯乙酸溶液控制其残留浓度在0.3～0.5g/L；培养过程中利用氨水调控pH在6.5±0.15，氨氮残留浓度通过流加硫酸铵溶液控制在0.5g/L，过程中通过转速和空气流量调整控制溶氧浓度不低于60％。

当发酵到80h，电导率降到12ms/cm时，通过连续流加硫酸钠调节电导率在11.1±0.7ms/cm。

160h后，电导率不控制，消耗发酵液中残留的硫酸根离子。对应的硫酸根离子浓度维持在了13.0±1.2mg/mL，青霉素放罐单位达到了135370U/mL。

实施例6、青霉素生产工艺中代谢过程比较

前面图1～图3中菌体的体积占比(PMV)、电导率、硫酸根离子浓度以及青霉素效价的曲线被整合于图4中，从而可以直观地比较不以电导率进行控制以及不同电导率控制条件下的青霉素发酵代谢过程对比。

根据图4，随着发酵培养40小时后电导率控制水平提升，硫酸根离子的浓度也相应增加，菌体的生长明显增强，尤其是青霉素的合成速率提升效果显著。特别是电导率控制在17～22ms/cm这一范围时，青霉素的合成速率呈现大大提高。

根据前述实施例的研究结果，本发明人综合了实施电导率调控前后的各个发酵策略的各项参数，如表1所示。

表1

因此，青霉素发酵进入青霉素快速合成期后，电导率与硫酸根离子的浓度呈现较好的对应关系。本发明的上述结果说明，电导率可以指导青霉素发酵过程中硫酸根离子的补加，电导率的有效调控，可以显著地提高青霉素发酵的产量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

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4.张敬书，赵艳丽，赵立强，周英壮，张冀，&邸晓涛，优化青霉素发酵带放再培养工艺，内蒙古石油化工，2010(9)，119～120。

5.李云龙，唐文俊，白成海，黄明志，储炬，庄英萍，青霉素生产工艺优化及代谢分析提高产量，中国抗生素杂志2019(6)。

6.Christensen L H，Mandrup G，Nielsen J，et a1.A robustliquidchromatographic method for measurement of medium，components during penicillinfermentations[J].Analytica Chimica Acta，1994，296(1)：51～62.

7.冉广芬，马海州，硫酸根分析技术及应用现状。盐湖研究，2009，17(4)：58.62。

Claims (10)

1.一种提高青霉素生物合成的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在发酵进行到青霉素快速合成期后，通过补加硫酸根离子控制发酵液的电导率，调控电导率数值在10～25ms/cm；或，

在发酵进行到青霉素快速合成期后，通过补加硫酸根离子控制发酵液的硫酸根离子浓度在11～28mg/mL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过补加硫酸根离子控制发酵液的电导率，使得电导率数值在11～23ms/cm；较佳地在13～22ms/cm；更佳地在16～22ms/cm；或

控制发酵液的硫酸根离子浓度在12～26mg/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵进行到青霉素快速合成期为：

发酵起始后无机盐进入快速消耗的阶段；或，

发酵起始后第30～90小时，较佳地第35～70小时，更佳地40～50小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用青霉素生产菌进行所述生物合成；较佳地，所述青霉素生产菌为产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)；较佳地为产黄青霉菌HLPG-21。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的硫酸根离子来自于：硫酸钠，硫酸钾、硫酸铵。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基包括：柠檬酸、玉米浆、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、碳酸钙，玉米油；较佳地该培养基的pH值为5.5～5.8。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵结束前5～20小时，不进行电导率的调控和硫酸根离子的补加；较佳地，在酵结束前10～15小时，不进行电导率的调控和硫酸根离子的补加。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中流加葡萄糖，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.2g/L；较佳地，控制残留葡萄糖浓度控制在0.45±0.15g/L。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中流加苯乙酸，控制苯乙酸残留浓度在0.2～0.6g/L；较佳地控制苯乙酸残留浓度在0.3～0.5g/L。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时，还包括：

调节pH在6.5±0.25；较佳地，调节pH在6.5±0.2；较佳地，利用氨水来进行pH调节；

通过硫酸铵来控制氨氮浓度不低于0.4g/L；

通过转速或空气流量调控溶氧浓度不低于60％；调节发酵温度为25±2℃；

在发酵起始后165～180小时结束发酵；或

在发酵的最后5～25小时，不进行电导率的控制或硫酸根离子的补加。

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