CN114085794B - Arc9-409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用 - Google Patents

Arc9-409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株Arc9‑409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用，属于微生物领域，所述菌株已于2021年1月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021130。本发明菌株能够合成银@氯化银纳米银颗粒，颗粒均匀，分散良好，具有抑菌作用。

Description

Arc9-409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一株Pseudoalteromonassp.Arc9-409菌株及其在生物合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用。
背景技术
由于长期暴露于低温、高盐浓度、高氧浓度和紫外线辐射条件，北极地区海洋细菌通过进化形成特殊的生理生化特征克服环境胁迫条件生存。微生物通过生物矿化减轻氧化损伤和活性氧的胁迫毒性。生物纳米银的合成往往与生物抗银离子胁迫和电子传递链引导的氧化还原反应相关。因此我们推测，北极海洋环境中存在具有还原银离子能力的活性菌株。
研究发现，细菌(包括放线菌)、真菌(包括酵母菌)和植物组织都可以借助生物反应体系还原银离子生成银纳米颗粒，金属纳米颗粒的生物合成主要涉及金属离子捕获、还原、封端以及晶体稳定四个步骤。光照、时间、pH等外界因素也会影响纳米颗粒的数量、尺寸、形貌和单分散性。在南北极典型寒冷生物圈中，海洋细菌长期暴露于低温、高盐、高氧和强紫外线辐射等胁迫环境中，这对细菌造成极大的氧胁迫和生存压力。在氧化胁迫下，极区微生物较常规环境微生物，更易于进化出高水平的抗氧化活性，形成细菌生长和生存最重要机制之一。实验室前期的研究结果证明，纳米颗粒的形成可能与极地微生物的抗氧化系统和代谢适应性密切相关。因此，从长期生存于氧胁迫的环境中，筛选获得还原银离子的菌株是合成纳米颗粒的新途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一株Pseudoalteromonassp.Arc9-409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一株Pseudoalteromonassp.Arc9-409菌株，所述菌株已于2021年1月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021130。
本发明还提供所述菌株Pseudoalteromonassp.Arc9-409在生物合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果:
本发明菌株能够合成银@氯化银纳米银颗粒，颗粒均匀，分散良好，具有抑菌作用。
附图说明
图1菌株上清液与硝酸银的混合液在光照条件下孵育48h后的UV-vis光谱图。
图2基于16S rRNA基因序列的银离子还原菌株的系统发育树。
图3菌株上清液与硝酸银混合液在黑暗条件下孵育24h后的UV-vis光谱图。
图4电镜下银@氯化银纳米颗粒。
图5为银@氯化银纳米颗粒的X射线能谱。
图6为银@氯化银纳米颗粒的X射线衍射和衍射图谱。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
以中国第九次北极科考的海洋沉积物为样品，分离、培养并纯化获得不同种类的微生物，从中筛选还原银离子并封端形成纳米颗粒的菌株，探究光照、pH、银离子浓度对合成纳米颗粒的影响。以期为研究、开发和利用北极丰富的微生物资源提供参考。
本发明实施例中选用的培养基配方如下：
改良的Zobell 2216E液体培养基：胰蛋白胨5g，酵母粉1g，过滤陈海水：超纯水(V/V，2:1)1L；
YP培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，超纯水1L。
实施例1筛选得到合成纳米银/氯化银的菌株
1、样品来源：中国第九次北极科学考察(2018.07–2018.09)采集的26个站位的海洋沉积物，置于灭菌的塑料样品瓶中，于4℃保存。
2、筛选办法：
(1)菌株富集培养和分离纯化
取约1g沉积物样品于含有5mL改良的Zobell 2216E液体培养基的试管中，混匀后置于15℃恒温摇床中，于150r/min培养7d。观察培养液浑浊度，采用无菌水进行梯度稀释后，取100μL适当浓度的培养液均匀涂布于固体培养基(改良的Zobell 2216E液体培养基中加入15g/L琼脂)，置于15℃培养箱中培养14d。根据菌落的不同颜色以及不同形态特征，挑取单菌落，并进一步在固体培养基上分离纯化，获得纯菌株。
(2)银离子还原菌株的筛选
将培养获得的菌株接种于含5mL YP培养基的试管中，置于15℃ 150r/min恒温摇床中培养24–48h。取5mL菌液于4℃ 14000×g离心20min，收集上清液于0.22μm滤膜过滤进一步除菌体，将获得的无细胞上清液置于EP管中待用。
向无细胞上清液中加入AgNO3溶液使Ag+终浓度为2mmol/L。将装有反应液的EP管置于1200Lux 30℃ 150r/min光照恒温振荡培养箱孵育48h，取4mL反应液在紫外可见分光光度计上记录300–700nm波长范围内的UV-vis光谱。根据在410nm波长处是否出现表面等离子共振特征吸收峰，判断银离子还原和纳米银形成的情况。将相同处理过的YP培养基反应液作为阴性对照。
经过上述步骤，从中国第九次北极科学考察采集的26个站位的海洋沉积物中，富集培养并分离纯化获得317株细菌。将菌株分别接种于YP培养液中培养至OD600>1.5，取培养上清液与AgNO3混合(Ag+终浓度为2mmol/L)，置于光照条件下孵育，经UV-vis扫描初步筛选得到10株具有合成纳米银活性的菌株，其中包括Arc9-409。
由图1可见，YP培养基对照组于光照条件下在410nm波长处无吸收峰，而菌株上清液与AgNO3的混合反应液在410nm处出现特征吸收峰。实验组中混合液由淡黄色逐渐转变为棕红色。实验初步证明了菌株Arc9-409在光照下具有还原银离子并合成纳米银的能力。这株菌株从水深52.43m站位的沉积物样品中分离获得，属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属。菌株已于2021年1月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021130。系统分类地位见图2。
其中菌株pseudoalteromonassp.arc9-409的16sRNA的序列如下：
Agtagcttgctactttgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgcttgggaacatgccttgaggtgggggacaacagttggaaacgactgctaataccgcataatgtctacggaccaaagggggcttcggctctcgcctttagattggcccaagtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagtcaggaggaaaggttagtagttaatacctgctagctgtgacgttactgacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtacgcaggcggtttgttaagcgagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatttcgaactggcaaactagagtgtgatagagggtggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccgatggcgaaggcagccacctgggtcaacactgacgctcatgtacgaaagcgtggggagcaaacgggattagataccccggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagaagctcggagcctcggttctgtttttcaaagctaacgcattaagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctacacttgacatacagagaacttaccagagatggtttggtgccttcgggaactctgatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagttgctagcaggtaatgctgagaactctaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgtgtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagtgctgcgaacctgcgaaagtaagcgaatcacttaaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcgtatcagaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagatagtctaaccc.
Pseudoalteromonassp.Arc9-409的菌落表面光滑，白色，有光泽，中央隆起，边缘清晰。革兰氏染色阴性，杆状。
菌株Pseudoalteromonassp.Arc9-409的生长温度实验，设置5℃、15℃、25℃、37℃，150rpm，结果显示菌株Arc9-409在37℃不生长，最适生长温度为15℃。
所述菌株Pseudoalteromonassp.Arc9-409能够水解明胶。
(3)光照
将初步筛选获得的能够合成纳米银颗粒的菌株培养上清液与AgNO3溶液混合，置于1200Lux 30℃ 150r/min光照恒温摇床中孵育24h，设不密封的光照组(A)，锡纸密封避光组(B)。使用紫外可见分光光度计在300–700nm波长范围内表征反应液获得UV-vis吸收光谱。
由图1和图3可知，去除光照条件后，菌株Arc9-409的银离子还原能力有下降，菌株Arc9-409的合成反应液在410nm波长处出现特征吸收峰，初步推断其具有较强的合成银纳米材料的能力。
实施例2
1)透射电子显微镜(TEM)
将合成的纳米材料溶液滴于覆有碳膜的铜网(200目)上，用滤纸吸净多余液体，置于烘干机中烘干，根据反应液浓度重复1–3次。采用透射电子显微镜(TEM)在100KV加速电压下观察纳米颗粒的形貌。研究采用TEM对反应液中纳米材料的粒径、形貌和单分散性进行表征。从图4中可以看出，银纳米材料呈规则的圆形或近圆形颗粒状，单分散性良好，无明显聚集。说明溶液中的天然封端剂起到了良好的封端作用。
2)X射线能谱(EDS)
将合成的纳米材料溶液经真空冷冻干燥，获得深棕色粉末状纳米颗粒后，采用X射线能谱进行元素识别。如图5所示，X射线能谱分析检测结果表明，在3keV处出现1个Ag元素特征光学吸收峰，且纳米颗粒中存在一定量的Cl元素，二种元素分别占总纳米颗粒总质量的6.53％和2.08％。此外，图谱中Ni、Si和Al记录信号来自托盘，而非纳米材料本身。强的C和O信号可能来源于纳米颗粒附着的蛋白或表面覆盖的封端蛋白。
3)X射线衍射和衍射图谱(XRD)
采用X射线衍射和衍射图谱分析进一步确定Ag和Cl的晶相组成和晶体结构。
JCPDS(Joint Committee on Powder Diffraction Standards)，是粉末衍射标准联合委员会为X射线衍射分析收集、校订的各种物质的衍射数据，也称其为JCPDS卡片。如图6所示，结果表明，XRD谱在2θ＝32.24、46.13、54.88、57.52、67.2和76.8处出现特征吸收峰，分别对应AgCl的(200)、(220)、(311)、(222)、(400)和(420)晶面，这与JCPDS文件中AgCl固体(31-1238)的数据基本吻合。在2θ＝38.30、44.01、64.24和77.48处出现与JCPDS卡片中面心立方银(65-2871)相匹配的特征吸收峰，分别对应(111)、(200)、(220)和(311)晶面，这说明纳米颗粒中存在面心立方结构的单质银。
综上，菌株Arc9-409合成的纳米颗粒本质为纳米粒径的Ag和AgCl，即生物源性Ag@AgCl纳米颗粒(Ag@AgCl NPs)。
序列表
<110> 自然资源部第一海洋研究所
<120> Arc9-409菌株及其在合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1367
<212> DNA
<213> 假交替单胞菌Arc9-409(Pseudoalteromonassp. Arc9-409)
<400> 1
agtagcttgc tactttgctg acgagcggcg gacgggtgag taatgcttgg gaacatgcct 60
tgaggtgggg gacaacagtt ggaaacgact gctaataccg cataatgtct acggaccaaa 120
gggggcttcg gctctcgcct ttagattggc ccaagtggga ttagctagtt ggtgaggtaa 180
tggctcacca aggcgacgat ccctagctgg tttgagagga tgatcagcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 300
gcctgatgca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagt 360
caggaggaaa ggttagtagt taatacctgc tagctgtgac gttactgaca gaagaagcac 420
cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcgagcgtta atcggaatta 480
ctgggcgtaa agcgtacgca ggcggtttgt taagcgagat gtgaaagccc cgggctcaac 540
ctgggaactg catttcgaac tggcaaacta gagtgtgata gagggtggta gaatttcagg 600
tgtagcggtg aaatgcgtag agatctgaag gaataccgat ggcgaaggca gccacctggg 660
tcaacactga cgctcatgta cgaaagcgtg gggagcaaac gggattagat accccggtag 720
tccacgccgt aaacgatgtc tactagaagc tcggagcctc ggttctgttt ttcaaagcta 780
acgcattaag tagaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac 840
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac 900
ctacacttga catacagaga acttaccaga gatggtttgg tgccttcggg aactctgata 960
caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020
agcgcaaccc ctatccttag ttgctagcag gtaatgctga gaactctaag gagactgccg 1080
gtgataaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atggccctta cgtgtagggc 1140
tacacacgtg ctacaatggc gcatacagag tgctgcgaac ctgcgaaagt aagcgaatca 1200
cttaaagtgc gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg 1260
ctagtaatcg cgtatcagaa tgacgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
cgtcacacca tgggagtggg ttgctccaga agtagatagt ctaaccc 1367

Claims (2)

1.一株假交替单胞菌（ Pseudoalteromonas sp. ） Arc9-409菌株，其特征在于，所述菌株已于2021年1月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2021130。
2.权利要求1所述的假交替单胞菌Arc9-409菌株在生物合成银@氯化银纳米颗粒方面的应用。
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