CN107699519B - 一株硫酸盐还原菌，分离鉴定方法及其应用 - Google Patents

一株硫酸盐还原菌，分离鉴定方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种硫酸盐还原菌（Sulfate‑Reducing Bacteria），即梭菌LYS08，Clostridium sp.LYS08，于2017年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，CCTCC NO：M 2017562，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。同时提供了硫酸盐还原菌的分离鉴定方法，具体对沼液进行的第三代富集培养液稀释的菌悬液加到冷却至40‑50℃的琼脂培养基，凝固后放入厌氧罐中置于45℃下培养，至菌落长出；将长出的黑色单菌落接种至SRB选择培养基中进行增殖培养，再进行分离，增殖培养，如此重复3次固液交替的分离过程后，即可分离分离得到硫酸盐还原菌LYS08。本发明将所述的硫酸盐还原菌在降解SO4 2‑上的应用。

Description

一株硫酸盐还原菌，分离鉴定方法及其应用
技术领域
本发明提供一种硫酸盐还原菌，并提供了该硫酸盐还原菌的分离及鉴定方法。
背景技术
硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB)是一类能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等氧化态硫化物还原为H2S的微生物，广泛存在于各种自然或生产条件下的缺氧环境中(如厌氧泥浆、淡水沉积物、油田管道系统、人或动物的口腔和胃肠道内)，在硫元素的地球生物循环及环境保护中发挥着极其重要的作用。SRB因其在不同的生物化学反应过程中扮演着不同角色而成为人们关注和研究的热点，如在沼气发酵系统中SRB和产甲烷菌会存在对乙酸、氢和较高级脂肪酸等基质的竞争而影响甲烷产量，研究利用SRB处理含高浓度硫酸盐的有机废水，探索如何控制SRB造成微生物腐蚀及腐蚀机理。此外，李军等利用富集培养的硫酸盐还原菌污泥对木屑进行生物降解处理，发现木屑中的木质素和纤维素能被有效降解。由此可见，SRB具有重要的科研和实际应用价值。
发明内容
本发明利用硫酸盐还原菌选择性培养基和浇注倒平板的方法从一组能高温发酵蔬菜废叶产甲烷的菌群中分离获得一株细菌，对其16S rRNA基因进行全序列测序比对分析，结果显示该菌与GenBank中一株厌氧细菌的相似性最高(为95％)，但序列Blast比对结果中没有SRB类细菌。对分离获得的菌株进行定性检测，结果表明该菌能使含有亚铁盐的液体培养液变黑且在瓶口处可闻到臭鸡蛋味。因此，综合上述信息初步判断分离获得的菌株为一株新发现的SRB，并对其生理与形态特征以及生长性质进行了研究。
硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria)，及梭菌LYS08，Clostridiumsp.LYS08，于2017年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，CCTCC NO：M2017562，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明所提供的硫酸盐还原菌的分离鉴定方法，包括如下步骤：
(1)用SRB富集培养基对沼液进行三代富集培养；
(2)对第三代富集培养液稀释至10-3、10-4、10-5的菌悬液；取各稀释度菌悬液分别加到已冷却至40-50℃的琼脂培养基，每个稀释度倒3块平板，待琼脂培养基凝固后放入厌氧罐中置于45℃下培养至长出菌落；
(3)挖取平板中长出的黑色单菌落，接种至SRB选择培养基中进行增殖培养，再对菌液进行上述的浇注倒平板分离，然后再挖取单菌落转液体培养基增殖，如此重复3次固液交替的分离过程后，即可分离得到硫酸盐还原菌LYS08，即梭菌LYS08，Clostridiumsp.LYS08；
(4)将分离获得的LYS08菌株接种至SRB鉴定培养基中培养，4-6h后培养液完全变黑，15-22h后培养瓶底部出现黑色沉淀，由此判断LYS08菌株属硫酸盐还原菌。
所述的步骤(1)中，所述的沼液为蔬菜废液沼气发酵罐的沼液。
所述的步骤(2)中，所述的琼脂培养基的配方包括如下重量份的原料CaCl2 0.05-0.1份，柠檬酸三钠3-5份，MgSO4·7H2O 1.5-2.5份，KH2PO4 0.2-0.8份，NH4Cl 0.05-0.3份，酵母粉0.5-2份，刃天青0.0005-0.002份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 1-3份，Na2S2O3 1-3份，琼脂10-20份。进一步优选为所述的琼脂培养基CaCl2 0.08份，柠檬酸三钠4.76份，MgSO4·7H2O2.0份，KH2PO4 0.5份，NH4Cl 0.1份，酵母粉1份，刃天青0.001份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 2份，Na2S2O3 2份，琼脂15份。
所述的步骤(3)中，SRB选择培养基的配方包括如下重量份的原料CaCl2 0.05-0.1份，柠檬酸三钠3-5份，MgSO4·7H2O 1-3份，KH2PO4 0.1-1份，NH4Cl 0.05-0.3份，酵母粉0.5-2份，刃天青0.0005-0.002份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 1-3份，Na2S2O3 1-3份；培养基制作方法：CaCl2，柠檬酸三钠，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NH4Cl，酵母粉，刃天青，溶于800ml去离子水中，调整pH＝7.5，定容至1L，121℃，20min下自动灭菌，Na2S2O3分别配成100倍的母液，过滤灭菌，后加入培养液中即可。进一步优选为SRB选择培养基CaCl2 0.08份，柠檬酸三钠4.76份，MgSO4·7H2O 2.0份，KH2PO4 0.5份，NH4Cl 0.1份，酵母粉1份，刃天青0.001份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 2份，Na2S2O3 2份。培养基制作方法：CaCl2，柠檬酸三钠，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NH4Cl，酵母粉，刃天青，溶于800ml去离子水中，调整pH＝7.5，定容至1L，自动灭菌(121℃，20min)。Na2S2O3分别配成100倍的母液，过滤灭菌，后加入培养液中。
所述的步骤(3)中，增殖培养温度为55℃，培养基初始pH为77.5，培养时间为12h。
所述的步骤(4)中，所述的步骤(4)中，SRB鉴定培养基的配方包括如下重量份的原料CaCl2 0.05-0.1份，柠檬酸三钠3-5份，MgSO4·7H2O 1-3份，KH2PO4 0.1-1份，NH4Cl 0.05-0.3份，酵母粉0.5-2份，刃天青0.0005-0.002份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 1-3份，Na2S2O3 1-3份。进一步优选为CaCl2 0.08份，柠檬酸三钠4.76份，MgSO4·7H2O 2.0份，KH2PO4 0.5份，NH4Cl 0.1份，酵母粉1份，刃天青0.001份，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 2份，Na2S2O3 2份。
所述的步骤(3)接种时，以预培养3天的LYS08培养物作为接种种子液，接种前先用无菌注射器向每瓶培养基中添加质量浓度为0.1g/mL的过滤除菌的硫代硫酸钠，然后按质量分数为3-8％的接种率接种。
本发明将所述的硫酸盐还原菌在降解SO4 2-上的应用。
本发明从一组能高温发酵蔬菜废叶产甲烷的菌群中分离获得一株细菌LYS08，该菌能使SRB鉴定培养液变黑，单菌落在含有Fe2+盐的固体培养基中表现为黑色。对LYS08生长过程中SO4 2-浓度变化的检测结果表明，该菌具有降解转化SO4 2-的能力，且对SO4 2-的单日转化率可达29.5％。因此，初步判断菌株LYS08为一株SRB。
基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示，LYS08与一株梭菌属(Clostridium)的厌氧菌株Anaerobic bacterium Glu3(登录号为AY756145.2)有较近的亲缘关系，而与目前已知的SRB类菌株的亲缘关系较远，该结果表明LYS08很可能为一株新发现的SRB，且梭菌属类的细菌中很可能存在未分类的新的SRB菌属。进一步明确LYS08的生物学分类地位，需结合其生理生化特性、DNA中GC含量以及异化型亚硫酸盐还原酶(Dissimilatory SulfiteReductase，简称DSR)基因检测等指标进行综合判断。
LYS08菌株革兰氏染色为阴性，菌体细胞呈杆状、稍弯曲、无鞭毛，宽度为0.4μm～0.6μm，长度在1.8μm～2.0μm之间，属高温菌。最适生长温度为50℃，最适生长pH值为7.0～7.5。菌株生长增殖较快，在培养基初始pH为7.5和培养温度为55℃条件下，培养12h即可进入对数生长期。
附图说明
图1为菌株分离过程中的实验照片，左图为SRB富集培养基对沼液进行的三代富集培养；右图为浇注倒平板分离图。
图2为LYS08菌株生理特性检测结果，左上为LYS08在SRB鉴定培养基中培养的实验现象，左下为LYS08革兰氏染色结构；右图为LYS08菌株扫描电镜照片。
图3为基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树。
图4为生物量OD600和pH变化。
图5为ORP变化。
图6为LYS08菌株培养过程中SO4 2-浓度变化。
图7为温度对LYS08菌株生长的影响。
图8为初始pH对LYS08菌株生长的影响。
图9为不同初始pH条件下pH的变化。
具体实施方式
实施例1
菌源为本研究室蔬菜废叶沼气发酵罐的沼液，先用SRB富集培养基对沼液进行三代富集培养(培养照片见图1，注：第一代富集培养时向培养基中添加了亚铁盐，培养过程中培养基变黑，说明菌液中存在硫酸盐还原菌；浇注倒平板长出的黑色菌落即为硫酸盐还原菌)，然后再进行菌株分离。由于SRB菌多为厌氧菌或兼性厌氧菌，所以富集培养时需要对培养基进行石蜡液封以隔绝空气。
菌株分离过程：先对第3代富集培养液进行倍比稀释，选稀释度为10-3、10-4、10-5的菌悬液进行后续分离；取各稀释度菌悬液0.5mL分别加到50mL已冷却至50℃左右的琼脂培养基(采用SRB鉴定培养基配方配制)，每个稀释度倒3块平板，待培养基凝固后放入厌氧罐中置于55℃培养；挖取平板中长出的黑色单菌落(周围尽量不要有其他菌落)，接种至SRB选择培养基中进行增殖培养，之后再对菌液进行上述的浇注倒平板分离，然后再挖取单菌落转液体培养基增殖，如此重复3次“固液交替”的分离过程后，保藏菌种并测序鉴定。采用上述方法，本研究分离得到一株硫酸盐还原菌，命名为LYS08。
LYS08菌株活化转接和生长性质研究均采用SRB选择培养基，培养时采用厌氧培养。将10mL SRB选择培养基分装至20mL西林瓶中，高纯氮置换空气后，用丁基橡胶塞和铝封盖密封，灭菌后即得试验所需的培养基。正式试验时，以预培养3天的LYS08培养物作为接种种子液，接种前先用无菌注射器向每瓶培养基中添加0.2mL过滤除菌的硫代硫酸钠浓液(浓度为0.1g/mL)，然后按5％的接种率接种。每个数据监测点设3组平行。具体进行的步骤如下：本发明所提供的硫酸盐还原菌的分离鉴定方法，包括如下步骤：
(1)用SRB富集培养基对蔬菜废液沼气发酵罐的沼液进行三代富集培养；
(2)对第三代富集培养液稀释至10-3、10-4、10-5的菌悬液；取各稀释度菌悬液分别加到已冷却至40-50℃的琼脂培养基，每个稀释度倒3块平板，待琼脂培养基凝固后放入厌氧罐中置于45℃下培养至长出菌落；所述的琼脂培养基中CaCl2 0.08g，柠檬酸三钠4.76g，MgSO4·7H2O 2.0g，KH2PO4 0.5g，NH4Cl 0.1g，酵母粉1g，刃天青1mg，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O2g，Na2S2O3 2g，琼脂15g。
(3)挖取平板中长出的黑色单菌落，接种(接种时，以预培养3天的LYS08培养物作为接种种子液，接种前先用无菌注射器向每瓶培养基中添加质量浓度为0.1g/mL的过滤除菌的硫代硫酸钠，然后按质量分数为3-8％的接种率接种。)至SRB选择培养基中，55℃下，控制SRB选择培养基的pH为7.5进行增殖培养12h，再对菌液进行上述的浇注倒平板分离，然后再挖取单菌落转液体培养基增殖，如此重复3次固液交替的分离过程后，即可分离分离得到硫酸盐还原菌LYS08；所述的SRB选择培养基CaCl2 0.08g，柠檬酸三钠4.76g，MgSO4·7H2O2.0g，KH2PO4 0.5g，NH4Cl 0.1g，酵母粉1g，刃天青1mg，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 2g，Na2S2O3 2g。培养基制作方法：CaCl2，柠檬酸三钠，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NH4Cl，酵母粉，刃天青，溶于800ml去离子水中，调整pH＝7.5，定容至1L，自动灭菌(121℃，20min)。Na2S2O3分别配成100倍的母液，过滤灭菌，后加入培养液中。
(4)将分离获得的LYS08菌株接种至SRB鉴定培养基(CaCl2 0.08g，柠檬酸三钠4.76g，MgSO4·7H2O 2.0g，KH2PO4 0.5g，NH4Cl 0.1g，酵母粉1g，刃天青1mg，(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 2g，Na2S2O3 2g。)中培养，4-6h后培养液完全变黑，15-22h后培养瓶底部出现黑色沉淀，由此判断LYS08菌株属硫酸盐还原菌。
生理特性及系统发育分析
由于SRB具有以硫酸盐等氧化态硫化物作为电子受体代谢生成H2S的特性，而H2S可与多种重金属离子发生沉淀反应(如硫化亚铁)，所以目前初步定性判断SRB的方法为向培养基中添加二价铁盐，若培养液变黑或固体培养基长出黑色菌落，且可以闻到H2S的臭鸡蛋味，则说明有SRB存在。将分离获得的LYS08菌株接种至SRB鉴定培养基中培养，5h后培养液完全变黑，18h后培养瓶底部出现黑色沉淀(见图2)，由此判断LYS08菌株属硫酸盐还原菌。LYS08菌株革兰氏染色结果呈阴性，扫描电镜观察结果显示其细胞呈杆状、稍有弯曲、无鞭毛，菌体宽度为0.4μm～0.6μm，长度在1.8μm～2.0μm之间。
根据LYS08的16S rRNA基因序列在GenBank中进行Blast比对分析，结果显示Uncultured bacterium(AB487354.1)、Uncultured Clostridiales bacterium(JN873219.1)和Anaerobic bacterium Glu3(AY756145.2)等3株菌与LYS08相似性最高(均为95％)，且比对结果中未见SRB类的细菌。选取与LYS08同源性较高的16S rRNA基因序列和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)等常见SRB菌属的部分菌株的16S rRNA基因序列，采用邻接法构建LYS08的系统发育树如图3所示(注：LYS08为分离菌株的编号；分支节点上的数字代表在1000次构树过程中的自展值；括号中的序号为GenBank登录号；标尺代表的序列差异度为2％。)。由系统发育树可知，LYS08菌株与梭菌属(Clostridium)的厌氧菌株Anaerobicbacterium Glu3(登录号为AY756145.2)有较近的亲缘关系，与已知的脱硫肠状属菌株有一定的亲缘关系，而与脱硫弧菌属和脱硫单胞菌属菌株的亲缘关系较远。
分离条件下的生长特性
LYS08菌株分离过程中的培养条件为：培养基初始pH为7.5，55℃静置培养。在分离条件下培养时，LYS08菌株生长过程中生物量OD、pH和氧化还原电位(Oxidation ReductionPotential，简称ORP)的变化如图4和图5所示。刚接种时OD值为0.022，培养12h后OD值上升至0.077，在此期间LYS08生长处于迟缓期；12h至24h菌株处在对数生长期，OD值快速上升，培养24h后OD达到最大值(为0.218)；24h至36h菌株进入稳定生长期，培养36h后的OD值相比24h时稍有下降，为0.204；36h后进入衰亡期，生物量开始明显下降。
伴随着LYS08的快速增殖，培养体系pH也随之快速下降。当OD值上升到最大值时，对应pH下降到较低值6.79，之后pH在6.8～6.9之间波动。SRB的生长需要其所在环境中的ORP在-100mv以下。本试验培养体系初始ORP为-313mv，12h后ORP下降至-394mv，之后稳定在-380mv～-400mv，整个过程中的ORP均完全满足SRB的生长需求。SRB可以耐受的pH范围较广，一般在5.5～9.5之间都能生长，最适生长pH为7.0～8.0。综上所述，LYS08培养后期的pH和ORP都处于较适宜SRB生长的范围，该结果表明菌株培养后期生物量OD600的下降与培养体系pH和ORP关系不大。
由生物量变化的分析可知，LYS08菌株培养过程中迟缓期、对数期和稳定期维持的时间都较短(均为12h)，且培养36h后就进入衰亡期，该生长现象可能与本试验的培养方法有关。本试验的菌株培养是在20mL的西林瓶(内装10mL培养液)中进行的，体系较小且密闭，而5％(v/v)的接种率相对培养体系而言又偏大，导致生物量增长以及碳源、氮源等营养物质消耗过快，所以前三个生长阶段维持时间较短。更重要的一点是，由于LYS08代谢产生的H2S无法排出培养体系，使培养液中H2S浓度越积越高，所以排除外界环境pH和ORP的干扰影响后，LYS08菌株生长过早进入衰亡期的原因是H2S对LYS08产生毒害作用并抑制其代谢活性。硫化物中对微生物有抑制作用主要是溶解性H2S，H2S分子呈电中性，更容易穿过带负电的菌体细胞膜而破坏其胞内蛋白质，最终抑制微生物的生长代谢。
LYS08菌株培养过程中SO4 2-浓度变化如图6所示(注：试验时培养基初始pH为7.5，培养温度为55℃)。试验结果表明：培养液初始SO4 2-浓度为1.12g/L，培养1天后SO4 2-浓度上升到1.28g/L，这与菌株初期生长缓慢以及培养基中的S2O3 2-被氧化成SO4 2-有关；培养第1天至第2天，SO4 2-浓度大幅下降，到培养第2天时SO4 2-浓度为0.90g/L，LYS08在1天之内的SO4 2-转化率为29.5％，之后直至实验结束SO4 2-浓度基本维持在0.90g/L左右，该结果表明LYS08具有代谢转化SO4 2-的能力，且培养2天之后LYS08代谢活动已停滞。对于LYS08菌株不能持续代谢转化SO4 2-，其原因还是与培养体系中的H2S不能排放到体系外有关，所以在利用SRB降解SO4 2-时需尤其注意H2S毒害抑制影响。
SRB按其适宜的生长温度高低可分为中温型和高温型，两类菌的最适生长温度分别为30℃～40℃和55℃～60℃。为考察温度对LYS08菌株生长的影响，本试验研究了LYS08在35℃～65℃等不同培养温度条件下的生长情况(见图7，注：培养基初始pH为7.5)。试验结果表明：菌株在40℃～55℃范围内都能较好地生长，不同的是达到最大生物量OD600的时间不同；50℃和55℃培养时最大OD值出现在培养第24h，而40℃和45℃培养时菌株生长相对滞后，存在明显的迟缓期，培养第72h后才达到最大OD值，可见LYS08菌株为高温型SRB；LYS08在60℃和65℃条件下不能生长，在35℃时虽能生长但活性较低，且适应期将近120h，培养168h后OD值仅为0.154。综合比较，LYS08菌株最适生长温度为50℃。
控制培养温度为50℃及其他因素一定的条件下，LYS08菌株在培养基不同初始pH时的生长情况如图8所示。由图8可知，LYS08最适生长pH值为7.0～7.5，初始pH在6.5～8.0之间时均能较好生长，且不同初始pH值(6.5、7.0、7.5和8.0)实验组监测到的生长曲线基本一致；在初始pH为6.0时，LYS08生长的迟缓期较长，到培养第3天后OD值才明显上升，之后进入对数增长期，培养第4天时达到其他组的生物量水平。
不同初始pH条件下培养体系pH随时间变化的结果(见图9)显示，虽然各实验组初始pH不同，但随着培养时间的延长各组pH变化均趋向于6.5～6.8之间。初始pH为8.0、7.5和7.0的实验组pH变化呈先下降后平稳波动，初始pH为6.5的实验组pH始终保持在6.5左右，而初始pH为6.0的实验组随着后期生物量的上升pH呈上升趋势。结合图8综合分析可知，LYS08菌株快速增殖时会因培养基初始pH值的不同而导致培养体系pH呈现多样性变化，对于该现象目前还无法解释，具体原因有待进一步研究。

Claims (2)

1.硫酸盐还原菌，所述硫酸盐还原菌为梭菌（Clostridium sp.）LYS08，于2017年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017562。
2.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌在降解SO4 2-上的应用。
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