CN103509825A

CN103509825A - 多粘类芽孢杆菌Jaas cd 无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法

Info

Publication number: CN103509825A
Application number: CN201210214095.8A
Authority: CN
Inventors: 张昕; 林玲; 邓晟; 周益军
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2014-01-15

Abstract

本发明选用多粘类芽孢杆菌Jaas cd的无细胞滤液胞外还原制备纳米银粒子，制备方法为：首先培养获得Jaas cd的无细胞滤液，以每100ml Jaas cd无细胞滤液，加入100～200μl 1mol/LAgNO₃的比例，室温静置24～72h，15000r/min离心30～60min，沉淀用无水乙醇荡洗3次，60℃烘干成粉末，即可得到纳米银粒子。采用紫外-可见全波长扫描(UV-Vis)、透射电镜扫描(TEM)、X射线粉末衍射分析(XRD)、傅里叶红外光谱分析(FT-IR)等方法验证纳米银粒子的形成。透射电镜观察获得的纳米银粒子粒度在20～50nm之间，形态均一，分散性较好。

Description

多粘类芽孢杆菌Jaas cd 无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法

技术领域

本发明涉及微生物及纳米材料领域，涉及采用多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Jaas cd无细胞滤液胞外制备银纳米颗粒的绿色合成方法。

背景技术

纳米材料可以广义地理解为三维空间中至少在一维方向上为纳米尺度(1～100nm)或以它们作为基本单位构成的一类材料。相比于常规材料，纳米材料具有优异的性能，主要取决于其独特的微观结构。由于其具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，因而纳米材料显示出不同于常规材料的热、光、电、磁和催化等性能(Bhatt，2003；Bohr，2002)。纳米材料在生物医药领域已得到快速发展，尤其是在医药制剂领域取得的成果更加引人注目，如增加药物生物利用度，提高药物稳定性，建立新的药物控释系统，改善药物输送等(Sanjeeb KS，2003；Nathaniel and Mihrimah，2006)。纳米材料在医药领域的成功引起了人们将纳米材料应用到农业植保领域的浓厚兴趣，例如将农药分子进行纳米胶囊化包裹，可改变其溶解度，提高有效使用率，增强其在植株体内靶向性输送；以纳米颗粒作为农药载体，因其具有超微小的体积，渗透性强，较易进入害虫和病原菌体内，同时因其比表面积大，可有效吸附药物，提高药物局部浓度，在同等药效下，可有效减少给药剂量(Remya N，2010)。

银作为传统杀菌剂，具有高效、安全无毒、抗菌谱广、无耐药性等优点。但由于银离子化学性质活泼，在光照、受热等作用下容易被氧化，另外银离子也会与卤族元素阳离子形成卤化银沉淀，从而导致抗菌性能下降。利用纳米技术将银加工成纳米级的银微粒后，其颗粒变小，易于进入微生物细胞体内；比表面积增大，增加了纳米银与微生物接触的概率，增强抑菌活性；耐热性好，稳定性高，不会与卤族元素形成卤化物沉淀；同时发现，纳米银颗粒粒径愈小，其抑菌活性愈强(Kim，2009；Young KJ，2009)。纳米银已广泛用于生产抗菌防臭纤维、抗菌材料、抗菌涂料、抗菌陶瓷、医药载体、水质净化等领域(Mallick K，2006)。据调查，在800多个含有纳米材料的消费产品中，近30％的产品含有纳米银(Susan WP，2009)。对于有关纳米银杀菌作用的原理，多数学者认为，纳米银接触微生物后，与菌体蛋白酶的巯基结合，使微生物丧失活性而死亡(Cho，2005)；其次，纳米银可与致病菌DNA碱基结合并形成交叉链接，置换嘌呤和嘧啶中相邻氮之间的氢键，使DNA变性而不能复制，起到抑制或杀灭病原菌的效果(Kvitek，2008；Morones，2005)。纳米银作为需求增长最快的纳米材料，其对人以及环境的安全性也逐渐引起人们的重视。美国公共卫生局于1990年在《关于银毒性的调查报告》中说明，银对人体无明显毒副作用，纳米银是安全的用药方式。随后，一系列动物毒性实验和临床应用均证实纳米银属实际无毒级(Thabet MT，2010；Susan WP，2009)。

目前纳米银制备方法主要采用液相化学还原法、光化学还原法、微乳液法等化学方法和高能球磨、激光溅射、激光烧蚀等物理方法(周全法，2008)。物理方法所得产品质量高，但对设备要求和能耗较高，且对纳米银颗粒形貌的调控能力有限，不利于工业化生产；化学方法由于其工艺相对简单，操作相对容易，生产成本较低，是较常采用的方法，但其所用的化学试剂对人体和环境有一定的危害(Andersson M，2005)。近年来，纳米材料制备过程绿色化的研究日趋活跃，微生物还原法制备纳米银粒子具有安全、环保、反应条件温和、所得纳米银粒子稳定性高等优点，成为具有发展前景的纳米银制备新方法(Prasad TN，2011；Krishnan V，2010)。当前用于合成纳米银的微生物主要来自于细菌(Sahar Z，2011；Sintubin L，2009)和真菌(Musarrat J，2010；Kathiresan K，2009)。细菌相对于真菌而言，具有繁殖速度快、遗传转化操作简单等优点，因而更多地被用于合成纳米银粒子。细菌合成纳米银粒子主要采用菌液胞内合成与上清液胞外合成两种方法，由于Ag⁺具有较强的杀菌作用，只有少数对Ag⁺有较强抗性的菌株才能采用菌液胞内合成的方法，因此具有较大的局限性，同时菌液合成的纳米银颗粒大多吸附在菌体细胞壁表面或内部，后期分离困难。而上清液胞外合成法因为选用细菌上清液，所以不存在拮抗Ag⁺的问题，同时后期分离方便快捷，已成为细菌合成纳米银方法研究的重点。已有报道表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Saifuddin N，2009)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(Shahverdi AR，2007)、地衣芽孢杆菌(Bacillus liheniform)(Kalimuthu K，2008)可采用上清液胞外合成法合成纳米银粒子。

发明内容

本发明的目的旨在于提供一种反应条件温和，既简便快捷，又经济环保的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Jaas cd胞外合成纳米银粒子制备方法。

本发明包括以下步骤：

1)Jaas cd无细胞滤液的制备：Jaas cd于装有100ml LB的摇瓶中，30℃，150r/min振荡培养12～24h，5000r/min离心15～30min，收集菌体，去离子水荡洗3次，去除残留培养基。菌体重悬于100ml去离子水，30℃，150r/min振荡培养12～36h。12000r/min离心15～30min，收集上清，0.22μm滤膜过滤，获得Jaas cd无细胞滤液。

2)纳米银粒子的合成与表征：取100ml Jaas cd无细胞滤液，加入100～200μl 1mol/LAgNO₃，室温放置24～72h，15000r/min离心30～60min，沉淀用无水乙醇荡洗3次，

60℃烘干成粉末，得到纳米银粒子。

3)在上述过程中，如权利要求所述的多粘类芽孢杆菌合成银纳米颗粒的制备方法，所得银纳米颗粒的粒径在20～50nm之间。该方法条件温和，所用试剂环境友好，为纳米银的绿色合成提供了一种新的思路。

附图说明

图1本发明所制备的纳米银粒子的紫外-可见光谱图。

图2本发明所制备的纳米银粒子的透射电镜扫描图。

图3本发明所制备的纳米银粒子的X射线粉末衍射扫描图。

图4本发明所制备的纳米银粒子的傅里叶变换红外光谱扫描图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1)Jaas cd于装有100ml LB的摇瓶中，30℃，150r/min振荡培养12h，5000r/min离心15min，收集菌体，去离子水荡洗3次，去除残留培养基。菌体重悬于100ml去离子水，30℃，150r/min振荡培养12h。12000r/min离心30min，收集上清，0.22μm滤膜过滤，获得Jaas cd无细胞滤液。

2)取100ml Jaas cd无细胞滤液，加入200μl 1mol/L AgNO₃，室温放置24h，15000r/min离心30min，沉淀用无水乙醇荡洗三次，60℃烘干成粉末。用透射电镜(TEM)观察所得粉末，其中银纳米颗粒的形貌均为近球形，粒径分布在20～50nm。

实施例2

1)Jaas cd于装有100ml LB的摇瓶中，30℃，150r/min振荡培养12h，5000r/min离心15min，收集菌体，去离子水荡洗3次，去除残留培养基。菌体重悬于100ml去离子水，30℃，150r/min振荡培养24h。12000r/min离心30min，收集上清，0.22μm滤膜过滤，获得Jaas cd无细胞滤液。

2)取100ml Jaas cd无细胞滤液，加入100μl 1mol/LAgNO₃，室温放置36h，15000r/min离心30min，沉淀用无水乙醇荡洗三次，60℃烘干成粉末，得到纳米银粒子。

实施例3

1)Jaas cd于装有100ml LB的摇瓶中，30℃，150r/min振荡培养24h，5000r/min离心15min，收集菌体，去离子水荡洗3次，去除残留培养基。菌体重悬于100ml去离子水，30℃，150r/min振荡培养36h。12000r/min离心30min，收集上清，0.22μm滤膜过滤，获得Jaas cd无细胞滤液。

2)取100ml Jaas cd无细胞滤液，加入150μl lmol/LAgNO₃，室温放置24h，15000r/min离心30min，沉淀用无水乙醇荡洗三次，60℃烘干成粉末，得到纳米银粒子。

Claims

1.纳米银粒子的多粘类芽孢杆菌无细胞滤液胞外合成方法，其特征在于所用菌株Jaas cd为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，于2005年3月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保存，保藏号CGMCC No.1325。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于选用Jaas cd无细胞滤液胞外合成纳米银粒子。

1)Jaas cd于装有100ml LB的摇瓶中，30℃，150r/min振荡培养12～24h，5000r/min离心15～30min，收集菌体，去离子水荡洗3次，去除残留培养基，菌体重悬于100ml去离子水，30℃，150r/min振荡培养12～36h。12000r/min离心15～30min，收集上清，0.22μm滤膜过滤，获得Jaas cd无细胞滤液。

2)取100ml Jaas cd无细胞滤液，加入100～200μl 1mol/L AgNO3，室温静置24～72h，15000r/min离心30～60min，沉淀用无水乙醇荡洗3次，60℃烘干成粉末，得到纳米银粒子。

3.如权利要求1所述的纳米银粒子的多粘类芽孢杆菌无细胞滤液胞外合成方法，其特征在于步骤2中，反应体系中体积比为1ml Jaas cd无细胞滤液比1～2μl AgNO₃溶液，AgNO₃摩尔浓度为1mol/L，室温静置时间为24～72h。