CN109735576A - 一种利用细菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；2)将得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO₂中的任意一种。本发明方法合成方法简单快速、绿色环保、成本低，得到的纳米产品粒径小、分散性好，具有良好的抑菌效果，尤其是抑制水稻白叶枯病菌的能力很好，能够作为防治水稻白叶枯等重要植物病害的抑菌剂。

Description

一种利用细菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其产品和 应用

技术领域

本发明涉及生物合成纳米材料领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其应用。

背景技术

细菌性叶枯病作为对世界水稻种植区最具破坏性的水稻病害之一，其造成的经济作物损失可高达50％的比重。当前尽管化学防治方法在控制病害发生、保证生产方面发挥着重要作用，但其对环境、消费者和细菌自身耐药性的发展有着潜在危害。当前用作金属杀菌剂的金属仅包括Cu、Ag、Zn。据已有报道，纳米ZnO作为一种广谱性杀菌材料，能够有效杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，对革兰氏阳性菌与阴性菌具有较强的抑菌作用，广泛应用于医学领域、涂料、包装等。

因而，生态友好型和生物相容性好的纳米金属氧化物绿色合成技术及其可应用产品将成为研究热点，传统制备纳米金属抑菌剂主要通过物理、化学等方法，但物理方法对设备要求高，而化学方法采用的化学试剂又对环境和人体健康造成危害。近年来，人们开始尝试利用植物、微生物等生物体内蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂制备纳米金属抑菌剂。

如专利申请文献CN107671305A公开了一种利用小叶女贞果实提取液快速制备纳米银抑菌剂的方法，专利申请文献CN106513707A公开了一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂及其的制备工艺，专利申请文献CN104355331A公开了一种利用黄蓍胶溶液制备单分散纳米ZnO的方法。

与传统制备方法相比，生物合成法不需添加任何还原剂、价格低廉，反应条件温和、绿色环保，合成效率高、利于工业化放大。因此，纳米生物合成法成为纳米合成领域的新热点，随着科技的进步，未来合成纳米材料技术的生产将朝着低成本、低消耗、低污染发展，未来农业生产中水稻病害的防治也必定朝着可持续、安全、无污染方向发展。

发明内容

本发明目的在于提供了一种利用多粘类芽孢杆菌上清制备纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO₂的方法，该制备工艺绿色环保、可大规模生产，得到的纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO₂均具有很好的抑菌效果，可作为水稻白叶枯抗菌剂使用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：

(1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；

(2)将步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；

步骤(2)中，所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO₂中的任意一种。

本发明方法将多粘类芽孢杆菌上清与金属氧化物溶液混合，细菌培养液上清中蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂制备出纳米金属氧化物；此外，多粘类芽孢杆菌的培养液上清中富含的特定蛋白质、脂类、多糖等生物大分子，能够与纳米金属氧化物结合而赋予其独特的理化性状和生物学特性，使产物结构更加稳定，抑菌效果更显著、生物兼容性更好。

步骤(1)中，所述LB液体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，121℃灭菌20min。

所述细菌最佳培养温度为20～40℃，优选为30℃，温度过高或者过低皆不适合细菌生长繁殖，从而影响其上清液成分；震荡速率150～250rpm/min，震荡速率在此范围内可以保证细菌菌体与培养基接触充分，提高生长效率。

所述细菌培养液进行离心取上清过程中，转速为5000～8000rcf/min，离心时间3～5min，在此范围内离心较充分，可保证上清液中不含有细菌菌体，有利于后续生物合成纳米颗粒。

上述过滤过程采用孔径不大于0.22μm的过滤器进行过滤，可以充分过滤掉细菌，从而得到无细胞的上清，有利于后续反应的进行。

优选地，所述培养方法为：将多粘类芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中培养12～18h，将得到的菌液以1％～3％的接种量转移至的LB液体培养基中，震荡培养12～18h，得到细菌培养液。

采用上述培养方法得到的细菌培养液中富含丰富的蛋白质、脂类、多糖等生物大分子，其经过离心、过滤后得到的无细胞上清可直接与金属氧化物溶液混合制备纳米材料，不仅简化了制备工艺，还能使产物结构更加稳定，提高产物的抑菌效果。

步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液的质量比为1～2：1，所述金属氧化物溶液的浓度为0.1～1mM。金属氧化物溶液用量过高会影响制得的金属氧化物纳米材料的抑菌效果，而用量过低相当于降低原材料的投入量，会导致合成效率低。浓度过低不足以合成纳米颗粒，浓度过高则不仅影响产物结构的稳定性与合成效率且会造成原材料不必要的浪费。

步骤(2)中，所述离心速率为8000～10000rcf/min，离心时间10～20min。离心速率过低、时间过短，会导致上清不够澄清，最终获得的纳米粉末含杂质；离心速率过高、时间过长则造成资源浪费。

本发明还公开了根据上述方法制得的纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO₂及其作为农用杀菌剂在防治水稻白叶枯病中的应用。

具体应用方法为：将所述纳米ZnO、MgO、MnO₂中任意一种溶于水制得浓度为4～8μg/ml溶液，再将溶液均匀喷施与可能爆发白叶枯病害的水稻苗上。若配制的抗菌剂浓度过低，对水稻白叶枯病菌不能产生较好的抑制效果，从而无法达到对水稻白叶枯病害进行有效防治；若抗菌剂浓度过高，则使水稻上残留过量的抗菌剂，造成不必要的浪费。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明的制备工艺简单、绿色环保、无需催化剂、成本低、能源消耗相对较少，十分适用于大规模生产；

(2)本发明方法制得的纳米金属氧化物平均粒径小、分散性好、结构稳定、具有良好的生物兼容性；所制备的纳米金属氧化物均能够产生活性氧，通过与细胞膜充分接触和相互作用，使细胞膜损伤、内容物流失而导致细菌死亡，具有显著的抑菌效果，能够杀死绝大多数白叶枯病原物，将其应用于防治水稻白叶枯病中，不仅可以起到很好的防治效果，还减轻了传统化学杀菌剂对环境的负担，在农业生产领域中有广阔的应用和推广前景。

附图说明

图1为实施例1～3中利用细菌上清液制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的流程图；

图2为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图；

图3为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的FTIR图；

图4为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的XRD图；

图5为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的SEM-EDS显微照片谱图；

图6为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂的TEM形貌特征图；

图7为实施例1～3中利用细菌上清液所制备的不同浓度纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂对水稻白叶枯病菌的生长、生物膜形成的影响；

图8为实施例1～3中利用细菌上清液所制备的不同浓度纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂对水稻白叶枯病菌生长密度的影响；

图9为实施例1～3中利用细菌上清液制备浓度8μg/ml纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO₂对水稻白叶枯病菌细胞壁破坏程度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

下列实施例所用的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)均为多粘类芽孢杆菌SX-3，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2015年11月11日，保藏编号为：CGMCC No.11638。

实施例1：利用细菌上清液合成纳米ZnO

(1)挑取多粘性芽孢杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基试管中，在30℃，200rpm/min过夜培养后，按照1％的接种量将得到的菌液转移至100ml的LB液体培养基中，在30℃，200rpm/min条件下培养过夜即可达到一定的浑浊度；

(2)将过夜培养得到细菌进行离心，转速6000rcf/min，离心4min，收集上清并使用直径13mm孔径0.22μm水系一次性针式过滤器进行过滤，得到无细胞上清液；

(3)将所得到的上清液与浓度为0.5mM的ZnO溶液按照1：1体积比例充分混合，并于室温条件下静置24h后进行离心，转速8000rcf/min，离心10min，将沉淀用蒸馏水洗涤两次，采用真空冷冻干燥法制备成粉状纳米材料。

(一)纳米ZnO特征分析

利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的纳米ZnO形态结构进行分析评价。

图2显示纳米ZnO的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2所示曲线可知，利用细菌上清液合成纳米ZnO在390nm处有最大吸收峰，在ZnO粉末特征吸收峰范围内；图3A显示的是纳米ZnO的FT-IR；图4A为其XRD图，其特征峰和ZnO粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的纳米ZnO，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为62.8nm；图5A为制得的纳米ZnO在TEM下形态，由图5B可知，样品中仅有Zn与O元素的存在，表明纳米ZnO的存在；图6为得到纳米ZnO的TEM显微照片，其粒径大小范围56.1～110.0nm，由图6A、B可知，所得到的纳米ZnO形貌保持良好。

(二)纳米ZnO杀菌效果评价

将不同质量的纳米ZnO溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的纳米ZnO溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定抑菌圈大小(图7A、B)、生物膜形成(图7C、D)，判断纳米ZnO抑菌活性。由图7B可知，16μg/ml浓度下抑菌圈直径1.7cm，生物膜生长抑制率高达74.5％，由此可知，随着纳米ZnO浓度升高，其杀菌效果越好。由图8可直观看出，相较于空白对照组，水稻黄单胞杆菌菌液吸光值随着所添加纳米ZnO浓度增加而降低，出现明显的白色沉淀。图9表示通过TEM直观判断纳米ZnO对细菌生物膜的破坏程度，发现空白对照组细胞壁完好，8μg/ml纳米ZnO处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出。

实施例2：利用细菌上清液合成纳米MgO

(1)挑取多粘性芽孢杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基试管中，在30℃，200rpm/min过夜培养后，按照1％的接种量将得到的菌液转移至100ml的LB液体培养基中，在30℃，200rpm/min条件下培养过夜即可达到一定的浑浊度；

(2)将过夜培养得到细菌进行离心，转速7000rcf/min，离心5min，收集上清并使用直径13mm孔径0.22μm水系一次性针式过滤器进行过滤，得到无细胞上清液；

(3)将所得到的上清液与浓度为0.5mM的按照2：1体积比例充分混合，并于室温条件下静置24h后进行离心，转速9000rcf/min，离心15min，将沉淀用蒸馏水洗涤两次，采用真空冷冻干燥法制备成粉状纳米材料。

(一)纳米MgO特征分析

利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的纳米MgO形态结构进行分析评价。

图2显示纳米MgO的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2所示曲线可知，利用细菌上清液合成纳米MgO在250nm处有最大吸收峰，在MgO粉末特征吸收峰范围内；图3A显示的是纳米MgO的FT-IR；图4A为其XRD图，其特征峰和MgO粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的纳米MgO，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为10.9nm；图5A为制得的纳米MgO在TEM下形态，由图5B可知，样品中仅有Mg与O元素的存在，表明纳米MgO的存在；图6为得到纳米MgO的TEM显微照片，其粒径大小范围10.1～18.8nm，由图6A、B可知，所得到的纳米MgO形貌保持良好。

(二)纳米MgO杀菌效果评价

将不同质量的纳米MgO溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的纳米MgO溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定抑菌圈大小(图7A、B)、生物膜形成(图7C、D)，判断纳米MgO抑菌活性。由图7B可知，16μg/ml浓度下抑菌圈直径1.3cm，生物膜生长抑制率高达80.2％，由此可知，随着纳米MgO浓度升高，其杀菌效果越好。由图8可直观看出，相较于空白对照组，水稻黄单胞杆菌菌液吸光值随着所添加纳米MgO浓度增加而降低，出现明显的白色沉淀。图9表示通过TEM直观判断纳米MgO对细菌生物膜的破坏程度，发现空白对照组细胞壁完好，8μg/ml纳米MgO处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出。

实施例3：利用细菌上清液合成纳米MnO₂

(1)挑取多粘性芽孢杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基试管中，在30℃，200rpm/min过夜培养后，按照1％的接种量将得到的菌液转移至100ml的LB液体培养基中，在30℃，200rpm/min条件下培养过夜即可达到一定的浑浊度；

(2)将过夜培养得到细菌进行离心，转速6000rcf/min，离心4min，收集上清并使用直径13mm孔径0.22μm水系一次性针式过滤器进行过滤，得到无细胞上清液；

(3)将所得到的上清液与浓度为0.5mM的MnO₂溶液按照2：1体积比例充分混合，并于室温条件下静置24h后进行离心，转速10000rcf/min，离心20min，将沉淀用蒸馏水洗涤两次，采用真空冷冻干燥法制备成粉状纳米材料。

(一)纳米MnO₂特征分析

利用紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱图(EDS)、透射电子显微镜(TEM)对合成的纳米MnO₂形态结构进行分析评价。

图2显示纳米MnO₂的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图，由图2所示曲线可知，利用细菌上清液合成纳米MnO₂在250nm处有最大吸收峰，在MnO₂粉末特征吸收峰范围内；图3A显示的是纳米MnO₂的FT-IR；图4A为其XRD图，其特征峰和MnO₂粉体衍射图的特征峰相符合，说明该生物合成法可以获得稳定的纳米MnO₂，通过Debye-Scherrer公式计算得其平均粒径为18.8nm；图5A为制得的纳米MnO₂在TEM下形态，由图5B可知，样品中仅有Mn与O元素的存在，表明纳米MnO₂的存在；图6为得到纳米MnO₂的TEM显微照片，其粒径大小范围19.8～63.9nm，由图6A、B可知，所得到的纳米MnO₂形貌保持良好。

(二)纳米MnO₂杀菌效果评价

将不同质量的纳米MnO₂溶于去离子水配制成4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的纳米MnO₂溶液与水稻白叶枯病菌互作，通过测定抑菌圈大小(图7A、B)、生物膜形成(图7C、D)，判断纳米MnO₂抑菌活性。由图7B可知，16μg/ml浓度下抑菌圈直径1.3cm，生物膜生长抑制率高达74.4％，由此可知，随着纳米MnO₂浓度升高，其杀菌效果越好。由图8可直观看出，相较于空白对照组，水稻黄单胞杆菌菌液吸光值随着所添加纳米MnO₂浓度增加而降低，出现明显的白色沉淀。图9表示通过TEM直观判断纳米MnO₂对细菌生物膜的破坏程度，发现空白对照组细胞壁完好，8μg/ml纳米MnO₂处理下细菌的细胞壁损伤、细胞明显有内容物流出。

Claims (9)

1.一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：

(1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；

(2)将步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；

步骤(2)中，所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO₂中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养温度20～40℃，震荡速率150～250rpm/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的离心转速为5000～8000rcf/min，离心时间为3～5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用孔径不大于0.22μm的过滤器进行过滤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养方法为：将多粘类芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中培养12～18h，将得到的菌液以1％～3％的接种量转移至的LB液体培养基中，震荡培养12～18h，得到细菌培养液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液的体积比为1～2：1，所述金属氧化物溶液的浓度为0.1～1mM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的离心转速为8000～10000rcf/min，离心时间为10～20min。

8.一种金属氧化物纳米材料，其特征在于，所述金属氧化物纳米材料由权利要求1～7任一项所述方法制得。

9.根据权利要求8所述的金属氧化物纳米材料作为农用杀菌剂在防治水稻白叶枯病中的应用。