CN103319621B - 具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抑菌活性的稀土多糖配合物合成方法。将多糖在搅拌下分散于异丙醇中，加入氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后加入氯乙酸溶液；于65℃不断搅拌下恒温反应4h；反应结束后，冷却至室温；旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；称取羧甲基化多糖，溶于去离子水中；向其中逐滴滴加稀土溶液，调pH至中性pH=7.00，直至溶液刚刚产生絮状沉淀为止；搅拌反应24h。反应结束后过滤，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到配合物固体。生成的稀土多糖配合物具有多糖诱导植物免疫反应和稀土的直接抑制和杀死病原菌细胞的双重作用。

Description

具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法

技术领域

本发明涉及一种具有抑菌活性的稀土多糖配合物合成方法。

背景技术

目前，用于抵抗病虫害、除草及促进农作物生长的主要为化学农药，然而这些化学农药的长期使用所造成的环境污染以及对人体健康的危害日益引起人们的重视。最近，生产原料来源广泛,对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好的生物农药已成为全球农药产业发展的新趋势。而生物农药主要是指直接利用生物产生的活性物质或生物活体作为农药，以及人工合成的与天然化合物结构相同的农药。生物农药是用具有杀虫、杀菌以及植物生长调节等作用的某些植物的部分，提取其有效成分加工合成的药剂，是取代化学农药，生产无公害农产品优先选用的农药品种。生物农药源于自然，具有低毒环保、安全高效、无残留等特点，是发展有机农药、促进农业可持续发展的理想农药。

多糖及其衍生物是自然界中含量最丰富的生物聚合物，存在于各类植物体及真菌中。研究表明多糖能够诱导植物的免疫反应。多糖处理植物后，能诱导植物启动防卫反应，并能使植物建立起应对生物与非生物胁迫的能力。在植物与病原菌的相互作用中发挥重要作用，增强植物抵御病菌侵害的能力。

稀土有着独特的电子层和核结构，易与O、N等硬酸配位形成配位化合物。稀土元素及其配合物具有很好的抑菌作用，且多数稀土配合物的抑菌活性高于配体及单独的稀土离子，主要是由于稀土与配体发生了协同作用。稀土元素的抑菌机理主要是直接作用于真菌细胞而将其杀死。由于其低毒环保的特性，使其抗菌性能在农业方面有着很好的应用前景。

因此，结合多糖与稀土不同的抑菌机理，合成稀土多糖配合物，充分发挥多糖诱导植物免疫反应功能和稀土直接杀死和抑制真菌细胞的协同作用，对于开发高效无毒环境友好的杀菌剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，采用该方法合成的稀土多糖配合物具有很强的抑菌活性，且安全无毒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，包括以下步骤：

1、称取0.8～1.2g多糖，在不断搅拌下分散于30mL异丙醇中，室温搅拌6h后，加入40mL60%（m/V）的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后在0.5h内加入60mL60%（m/V）的氯乙酸溶液，或将多糖溶于NaOH的溶液中，剧烈搅拌下加入25g氯乙酸；然后于65℃不断搅拌下恒温反应4h；反应结束后，冷却至室温；

2、旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；

3、将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；

4、称取0.8～1.2g羧甲基化多糖，溶于80.0mL去离子水中，向其中逐滴滴加0.02mol/L稀土溶液，滴加过程中用稀碱溶液调pH至中性pH=7.00，直至溶液刚刚产生絮状沉淀为止；滴加完毕后不断搅拌反应24h；

5、反应结束后、过滤，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到稀土多糖配合物固体。

所述的多糖从真菌发酵液、子实体或植物中提取得到。

本发明的具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，通过对多糖进行羧甲基化改性，在糖链上添加羧基，使糖通过羧基与稀土元素配位形成配合物，生成的配合物可以利用多糖和稀土的协同作用，即同时发挥多糖诱导植物免疫反应和稀土的直接抑制和杀死病原菌细胞的双重作用，对于开发高效无毒环境友好的杀菌剂具有重要的意义。

附图说明

图1、树舌多糖(a)；羧甲基树舌多糖(b)；羧甲基树舌多糖的La、Eu、Yb配合物(c～e)的核磁碳谱；

图2、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对a苹果腐烂病病菌、b棉花枯萎病病菌、c小麦全蚀病病菌、d柑橘炭疽病病菌、e白菜黑斑病病菌的抑制效果；

图3、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对苹果腐烂病病菌的抑制效果图；

图4、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对棉花枯萎病病菌的抑制效果图；

图5、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对小麦全蚀病病菌的抑制效果图；

图6、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对柑橘炭疽病病菌的抑制效果图；

图7、Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对白菜黑斑病病菌的抑制效果图。

具体实施方式

实施列1具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，包括以下步骤：

1、树舌灵芝多糖的提取：将树舌灵芝菌株MP-01接入培养基培养得到液体菌种，然后接入发酵罐培养，上清液浓缩后醇沉，最后将沉淀离心、洗涤、烘干即得树舌灵芝粗多糖。

2、称取0.8g树舌灵芝多糖在不断搅拌下分散于30mL浓度为0.03g/mL异丙醇中，室温搅拌6h后，加入40mL60%（m/V）的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后在0.5h内加入60mL60%（m/V）的氯乙酸溶液，于65℃不断搅拌下恒温反应4h；或者将2g多糖溶于250mL浓度为2.0moL/L的NaOH溶液中，剧烈搅拌下加入25g氯乙酸，然后在60℃下继续剧烈搅拌反应3h；反应结束后，冷却至室温；

3、旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；

4、然后将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；

5、称取0.8g羧甲基化多糖，溶于80mL水中，溶液呈棕红色（水溶性增强）；向其中逐滴滴加0.02mol/L稀土溶液，滴加过程中用稀碱溶液调pH至中性，直至烧杯中刚刚产生絮状沉淀为止；滴加完毕后不断搅拌反应24h；

6、反应结束后，将其用0.22μm针头滤器过滤掉其中的杂质，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到稀土多糖配合物固体。

由图1可以看出，树舌灵芝多糖羧甲基化后，在δ176.90ppm处出现-COO-的特征峰。与稀土元素La，Eu和Yb配位后，随着稀土元素原子序数增加，配位能力的增强，176.90ppm处的羧基峰逐渐变弱并消失。表明稀土主要通过羧基与多糖配位。

实施列2具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，包括以下步骤：

1、香菇多糖的提取：将香菇晒干粉碎成粉末，经乙醇脱脂、热水浸提、水提液浓缩醇沉，然后将沉淀离心、洗涤、烘干即得香菇粗多糖。

2、称取1.0g香菇多糖在不断搅拌下分散于30mL浓度为0.03g/mL异丙醇中，室温搅拌6h后，加入40mL60%（m/V）的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后在0.5h内加入60mL60%（m/V）的氯乙酸溶液，于65℃不断搅拌下恒温反应4h；或者将2g多糖溶于250mL浓度为2.0moL/L的NaOH溶液中，剧烈搅拌下加入25g氯乙酸，然后在60℃下继续剧烈搅拌反应3h；反应结束后，冷却至室温；

3、旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；

4、将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；

5、称取1.0g羧甲基化多糖，溶于80mL水中，溶液呈棕红色（水溶性增强）；向其中逐滴滴加0.02mol/L稀土溶液，滴加过程中用稀碱溶液调pH至中性，直至烧杯中刚刚产生絮状沉淀为止；滴加完毕后不断搅拌反应24h；

6、反应结束后，将其用0.22μm针头滤器过滤掉其中的杂质，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到稀土多糖配合物固体。

实施列3具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，包括以下步骤：

1、苦瓜多糖的提取：将苦瓜晒干粉碎成粉末，经乙醇脱脂、热水浸提、水提液浓缩醇沉，然后将沉淀离心、洗涤、烘干即得苦瓜粗多糖。

2、称取1.2g苦瓜多糖在不断搅拌下分散于30mL浓度为0.03g/mL异丙醇中，室温搅拌6h后，加入40mL60%（m/V）的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后在0.5h内加入60mL60%（m/V）的氯乙酸溶液，于65℃不断搅拌下恒温反应4h；或者将2g多糖溶于250mL浓度为2.0moL/L的NaOH溶液中，剧烈搅拌下加入25g氯乙酸，然后在60℃下继续剧烈搅拌反应3h；反应结束后，冷却至室温；

3、旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；

4、将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；

5、称取1.2g羧甲基化多糖，溶于80mL水中，溶液呈棕红色（水溶性增强）；向其中逐滴滴加0.02mol/L稀土溶液，滴加过程中用稀碱溶液调pH至中性，直至烧杯中刚刚产生絮状沉淀为止；滴加完毕后不断搅拌反应24h；

6、反应结束后，将其用0.22μm针头滤器过滤掉其中的杂质，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到稀土多糖配合物固体。

实施例4采用本发明的具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法制备的稀土多糖配合物的抑菌活性实验

采用菌丝生长速率法，即将供试药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速率来衡量化合物的毒力大小，一般多用于那些不产生孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌，测试Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对苹果腐烂病病菌（ValsamaliMiyabeetYamada）、棉花枯萎病病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）、小麦全蚀病病菌（Gaeumannomycesgraminis）、柑橘炭疽病病菌（Colletotrichumgloeosprioides）、白菜黑斑病病菌（Alternariabrassicae）5种植物病原菌的离体抑菌活性。

蒸馏水配置5个梯度浓度的Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物溶液，浓度分别为0.41、0.81、1.63、3.25、6.51mg/mL，蒸馏水做空白对照。

将土豆洗净，去皮，称取200g后切成小块。加入1000mL水中，加热煮沸30min，滤出滤液并定容至1000mL。再将滤液煮沸后，加入称好的17g琼脂、20g葡萄糖，边加边搅拌，待溶解后用量杯分装至250mL三角瓶中，加棉塞密封，经121℃、0.1Mpa、25min灭菌。

超净工作台紫外灭菌20min，将培养基溶解，稍冷后加入待测样品混匀，水做对照，倒平板：每个培养皿约10mL。用直径6mm打孔器从菌落边缘以同心圆打取生长速率一致的菌饼，用接种针将带有菌丝的一面接种到PDA平板中央，各做三个平行，然后置于27℃恒温培养箱中培养。

待对照组菌丝即将长满整个培养皿时，采用十字交叉法测量菌落直径（mm）。

结果表明：不同浓度Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对五种植物病菌都有较强的抑制效果，见图2～7所示；在浓度为6.5089mg/ml时，对苹果腐烂病菌和柑橘炭疽病菌的抑制率分别达到90%以上，且随浓度的增大抑制率增强。

从表1的毒力方程可以看出Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物对苹果腐烂病菌的抑制率与浓度呈现出良好的线性关系。其中对小麦全蚀病菌的综合抑菌效果最好，EC50=1.0602mg/mL。Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物的综合抑菌效果排序：小麦全蚀病菌>柑橘炭疽病菌>棉花枯萎病菌>苹果腐烂病菌>白菜黑斑病菌。

表1Yb-羧甲基树舌灵芝多糖-配合物毒力方程

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Claims (1)

1.具有抑菌活性的稀土多糖配合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)、称取0.8～1.2g多糖，在不断搅拌下分散于30mL异丙醇中，室温搅拌6h后，加入40mL60％m/V的氢氧化钠溶液，于85℃水浴回流1.5h，然后在0.5h内加入60mL60％m/V的氯乙酸溶液，或将多糖溶于NaOH的溶液中，剧烈搅拌下加入25g氯乙酸；然后于65℃不断搅拌下恒温反应4h；反应结束后，冷却至室温；

(2)、旋蒸除去异丙醇，并将反应体系的pH调为7.00，抽滤后蒸馏水透析3天，超纯水透析1天；

(3)、将透析液旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到白色棉絮状的羧甲基化多糖；

(4)、称取0.8～1.2g羧甲基化多糖，溶于80.0mL去离子水中，向其中逐滴滴加0.02mol/L稀土溶液，滴加过程中用稀碱溶液调pH至中性，直至溶液刚刚产生絮状沉淀为止；滴加完毕后不断搅拌反应24h；

(5)、反应结束后、过滤，滤液经抽滤旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得到稀土多糖配合物固体；

所述的多糖从真菌发酵液、子实体或植物中提取得到。