CN104673684A - 一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用 - Google Patents

一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用 Download PDF

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Abstract

一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用，属于微生物技术领域。该菌株分离于本实验室反应器中的活性污泥样品，2015年01月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10456。该菌株可以在含有0.05g/L四环素和0.05g/L土霉素的改良马丁培养基中生长。该菌株具有合成金纳米颗粒的能力，可催化氯金酸合成球形、多边形、等边三角形等不同形态的金纳米颗粒。在一定范围内，合成的金纳米颗粒的量随菌体浓度以及氯金酸浓度的增大而增加。显示了其在微生物合成金纳米颗粒领域的潜在应用价值，该菌株为金纳米颗粒的绿色合成提供了一株新的微生物资源。

Description

一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用
技术领域
本发明涉及一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用，属于微生物技术领域。
技术背景
金纳米颗粒由于具有高度的稳定性和独特的光、电、光热等性能，在生物技术、电气、医学和农业等领域具有广泛的应用前景。传统物理合成方法能耗高、设备复杂，化学合成方法使用的封端剂和有机溶剂对环境造成负面的影响。生物法合成的金纳米颗粒绿色无毒、环境友好，且微生物资源广泛，日渐成为纳米生物技术领域的关注热点。
目前已有关于细菌、放线菌、真菌及酵母菌合成金纳米颗粒的报道，早在1980年，Beveridge等人就利用Bacillus subtilis 168在细胞壁上合成金纳米颗粒；Ahmad等人利用放线菌Thermomonospora sp.合成平均粒径在8 nm左右的金纳米颗粒；同时有研究发现真菌Neurospora crassa能够还原Au3+，在细胞内外形成尺寸外形较为均一的金纳米颗粒；酵母菌Candida guilliermondii能够合成分散性良好的近球状金纳米颗粒。
在微生物合成金纳米颗粒的报道中，真菌因能耐受更高浓度的金属离子，并且可以分泌大量与合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物，可以将可溶性金属离子还原成纳米颗粒，合成的纳米颗粒产量高且易与真菌分离。此外，真菌菌体表面有大量的阳离子吸附位点，因此对金属离子有很好的吸附还原作用。相比于其它微生物，真菌合成的金纳米颗粒产量大、尺寸较为均一、分散性好、易于分离，奠定了其在金纳米颗粒合成及应用方面的基础。
与其他真菌相比，Trichoderma可以分泌多种胞外酶和代谢物，如纤维素酶，葡糖苷酶，β葡糖苷酶，β-1,3-葡糖苷酶和蛋白质等，并且其产量更大，因此常被用于工业生产。目前已有较多研究报道Trichoderma具有胞外合成纳米颗粒的能力。美国的一项专利保护了Trichoderma reesei胞外合成纳米颗粒的能力，其生成的纳米颗粒粒径为5-50nm。Mukherjee等人利用Trichoderma asperellum胞外合成粒径为13-18nm的银纳米颗粒。同时，Mohammed-Fayaz等人也发现Trichoderma viride可以胞外合成粒径为2-4nm的银纳米颗粒和银胶质。目前报道的多为Trichoderma合成银纳米颗粒，仅有一篇文献报道了Trichoderma可以合成金纳米颗粒，Aradhana Mishra等人利用Trichoderma viride的无细胞提取物作用氯金酸，在30℃下，仅10min就合成了金纳米颗粒。本研究中，菌株Trichoderma sp. WL-Go的发现将为真菌合成金纳米颗粒领域提供一株性能优良的微生物资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株菌资源及其在合成金纳米颗粒方面的应用，该菌株可以催化氯金酸合成不同形态的金纳米颗粒，在绿色合成纳米金领域具有重要的应用价值。
本发明所涉及一株木霉菌株 (拉丁文分类命名为Trichoderma sp.)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 10456，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年01月28日。
该菌株WL-Go属于真菌，菌丝形态为管状细丝，分枝丰茂，孢子形态呈两端钝圆形。经26S rRNA基因序列测定，其与Trichoderma具有100%的相似性，因此该菌分类命名为Trichoderma sp.。其26S rRNA基因序列的GenBank登录号为KP676894。
该菌株分离于本实验室反应器中的活性污泥样品，所述菌株的液体培养基为加入0.05 g/L四环素和0.05 g/L土霉素的改良马丁培养基，所述改良马丁培养基的组成为：葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L，pH 6~7；该菌株的固体培养基为对应的液体培养基中加入2%琼脂，液体培养基或固体培养基在115℃湿热灭菌20 min后使用，菌株在30℃，150 rpm条件下培养2~3天。
所述菌株可催化氯金酸合成球形、多边形、三角形等不同形态的金纳米颗粒。在一定范围内，合成的金纳米颗粒的量随菌体浓度以及氯金酸浓度的增大而增加。
本发明的有益效果是：一株从本实验室反应器的活性污泥样品中分离得到的木霉菌株WL-Go，具有较好的合成金纳米颗粒的能力。该菌株可催化氯金酸合成球形、多边形、三角形等不同形态的金纳米颗粒。且在一定范围内，合成的金纳米颗粒的量随菌体浓度以及氯金酸浓度的增大而增加。说明该菌在微生物合成金纳米颗粒领域具有一定的应用价值，该菌株为绿色合成金纳米颗粒提供了一株性能优良的菌资源。
附图说明
图1 菌株WL-Go扫描电镜图片。
图2 菌株WL-Go的系统发育树。
图3 菌株WL-Go在改良马丁培养基中的生长曲线。
图4 不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒紫外全波扫描图。
图5 不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征。
图6 不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒紫外全波扫描图。
图7 不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征。
具体实施方式
实施例1：菌株的获得
木霉菌WL-Go于2014年将本实验室反应器中的污泥样品在加入四环素 0.05 g/L、土霉素 0.05 g/L的改良马丁培养基 (葡萄糖10 g/L、(NH4)2SO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，pH 6~7) 的平板上进行反复的稀释涂布，并利用上述加入四环素 0.05 g/L、土霉素 0.05 g/L的改良马丁培养基于30℃，150 rpm条件下培养菌液，最终获得纯菌，命名为WL-Go。对菌株进行扫描电镜观察，方法是：(1) 从WL-Go菌液中取菌球2个，将球体搅碎，用0.1 mol/L的PBS缓冲液 (pH 7.0) 漂洗2次，4℃，8000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体。(2) 用5%戊二醛溶液将菌液悬起，4℃过夜固定。然后4℃，8000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体。(3) 用30、50、70、90、95、100%乙醇对样品进行梯度脱水，每个梯度15min。(4) 自然干燥后，在扫描电子显微镜下观察样品。菌株WL-Go的菌丝形态为管状细丝，分枝丰茂，如图1中左侧图片所示，孢子形态呈两端钝圆形，大小为1 μm左右，如图1中右侧图片所示。
该菌株于2015年01月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No. 10456。
实施例2：菌株的26S rRNA分子鉴定
提取菌株WL-Go的基因组DNA，通过PCR扩增26S rRNA基因序列，利用BLAST程序对序列进行同源对比，得到与其最相近的菌种为木霉菌 (Trichoderma)，26S rRNA基因序列相似性为100%，因此判定菌株WL-Go为木霉菌。图2为菌株WL-Go的26S rRNA基因的系统发育树，菌株WL-Go的26S rRNA基因序列如下。
>WL-Go 26S rRNA gene sequence
TGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCTCCGGGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGGTGAGGTGCCGCCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGCTGGCCACCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACCTTGAAAAGAGGGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCGCGGCGGATCATCCGGGGTTCTCTCCGGTGCACTTCGCCGCGTTCAGGCCAGCATCAGTTCGTCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCATAATACCCTGCGGTGGACTGAGGACCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCACCAGCGAC。
实施例3：菌株WL-Go的生长曲线
利用实施例1中的菌液进行培养，培养基与实施例1中的培养基相同，115℃湿热灭菌20 min，起始接菌量为10%，30℃，150 rpm条件下培养。菌株WL-Go的生长情况如图3所示，由图可知菌株WL-Go生长从第24 h进入对数生长期，第48 h进入稳定期。
实施例4：不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒及紫外全波扫描图
取实施例3中培养40 h (对数中后期) 的菌体湿重0.2 g，超纯水洗涤菌体2~3次，并用超纯水悬起菌体。在2 mL的上述反应体系中分别加入终浓度为0.5、1.0、2.0 mmol/L的氯金酸溶液，于30℃，150 rpm摇床中培养8 h。不同氯金酸浓度体系呈现不同程度的紫色，0.5 mmol/L 氯金酸体系中紫色最浅，2.0 mmol/L 氯金酸体系中紫色最深，1.0 mmol/L 氯金酸体系中紫色程度在上述二者之间。
将上述三种不同氯金酸浓度的反应混合液超声破碎30 min，并于3000 rpm离心4 min，可将纳米级金颗粒留在上清液中，较大的金颗粒和菌体收集于底部沉淀中。采用紫外全波扫描，观察溶液中生成的金纳米颗粒情况，如图4所示。三种不同氯金酸浓度下，紫外全波谱图中均在550 nm左右出现金纳米颗粒的特征吸收峰，氯金酸浓度为0.5 mmol/L时，特征吸收峰值最小；为1.0 mmol/L时，特征吸收峰值居中；为2.0 mmol/L时，特征吸收峰值最大。说明生成的金纳米颗粒随氯金酸浓度的增大而增加。
实施例5：不同氯金酸浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征
将实施例4中不同氯金酸浓度条件下合成的产物进行透射电镜表征。结果如图5中a-c所示，对应的氯金酸浓度分别为0.5、1.0、2.0 mmol/L。由图可知，不同氯金酸浓度下合成的金纳米颗粒形貌基本相同，以球形和多边形最多，等边三角形次之，并且随着氯金酸浓度的增大，合成的三角形金纳米颗粒数量增多，尺寸增大。
实施例6：不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒及紫外全波扫描图
用超纯水洗涤实施例3中培养40 h (对数中后期) 的菌体2~3次，分别取菌体湿重0.1、0.2、0.3、0.5 g，并用超纯水悬起菌体。在2 mL上述反应体系中加入终浓度为1.0 mmol/L的氯金酸溶液，于30℃，150 rpm摇床中培养8 h。不同菌体浓度体系呈现不同程度的紫色，其中0.5 g菌体浓度下反应液的颜色为紫色偏粉，0.1 g菌体浓度下反应液的颜色为紫色，但是较浅，0.2 g菌体浓度下紫色稍深，0.3 g菌体浓度下紫色最深。
将上述不同菌体浓度的反应混合液超声破碎30 min，于3000 rpm离心4 min。采用紫外全波扫描，观察溶液中生成的金纳米颗粒情况，如图6所示。不同菌体浓度下，紫外全波谱图中均在550 nm左右出现金纳米颗粒的特征吸收峰，菌体浓度为0.5 g时，特征吸收峰值最小；菌体浓度为0.1 g时，特征吸收峰值稍高；菌体浓度为0.2 g时，特征吸收峰值较大；菌体浓度为0.3 g时，特征吸收峰值最大。说明在一定范围内，菌体浓度越大，生成的金纳米颗粒越多。
实施例7：不同菌体浓度下菌株WL-Go合成金纳米颗粒的透射电镜表征
将实施例6中不同菌体浓度条件下合成的产物进行透射电镜表征。结果如图7中a-d所示，对应的菌体浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5g。由图可知，不同菌体浓度下合成的金纳米颗粒以球形和多边形最多，等边三角形次之，并且随着菌体浓度的增大，合成的三角形金纳米颗粒数量不断减少。
基因序列和氨基酸序列表
<110> 曲媛媛，沈文丽，厉舒帧，张照婧，李端行，李会杰，马桥，周集体
<120>一株木霉菌及其在合成金纳米颗粒中的应用
<210> 1
<211> 550
<212> DNA
<213> 木霉菌（Trichodermasp.）
<400> 1
TGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGG50
CCCCTCCGGGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGGTGAGGTGC100
CGCCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTG150
GCTGGCCACCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGG200
GAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATATTGGC250
CAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACCTT300
GAAAAGAGGGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTG350
ACCAGACTTGGGCGCGGCGGATCATCCGGGGTTCTCTCCGGTGCACTTCG400
CCGCGTTCAGGCCAGCATCAGTTCGTCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAA450
CGTGGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCATAATACCCTGCGGTGG500
ACTGAGGACCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCACCAGCGAC550
 

Claims (3)

1.一株木霉菌 (Trichoderma sp. WL-Go)，其特征在于：所述木霉菌株的登记入册编号为CGMCC No. 10456，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年01月28日。
2.根据权利要求1所述的一株木霉菌，其特征在于：所述木霉菌株的液体培养基为加入0.05 g/L四环素和0.05 g/L土霉素的改良马丁培养基，所述改良马丁培养基的组成为：葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L，pH 6~7；该菌株的固体培养基为对应的液体培养基中加入2%琼脂，液体培养基或固体培养基在115℃湿热灭菌20 min后使用，菌株在30℃，150 rpm条件下培养2~3天。
3.根据权利要求1所述的一株木霉菌在合成金纳米颗粒中的应用，其特征在于：所述菌株催化氯金酸合成球形、多边形、三角形不同形态的金纳米颗粒。
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