CN101948772B - 降解多环芳烃的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了降解多环芳烃的菌株及其构建方法和应用，本发明所提供的微生物亲本是鞘氨醇单胞菌GY2B(sphingomonas)和假单胞菌GP3A(Pseudomonas)两株革兰氏阴性菌，用此两株菌原生质体进行融合，而亲本基因在同一个细胞内重新组合，构建出基因工程特效菌。该菌株综合了二亲株的高降解性、高适应性的优势，利于处理多环芳烃PAHs。
Description
技术领域
本发明涉及一种特效菌株及其构建方法，尤其是一种用于高效降解多环芳烃PAHs微生物新菌种的生物构建和应用技术，更具体而言是环境中应用很广泛的两株革兰氏阴性菌原生质体融合的特效菌株及其构建方法。
背景技术
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)，是指一类由两个或两个以上苯环以线状、角状或成簇形式构成的独特的持久性有机污染物，多环芳烃中含有π键形成的共扼体系，由于电子具有较强的流动性，使得整个分子体系比较稳定。正是因为这种比较强的稳定性，使多环芳烃这类物质能够广泛地存在于环境中。其中一些PAHs会在生物活体内产生种种有害效应，包括细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、致癌、致突和致畸变等[2]，随着煤、石油在工业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，多环芳烃的污染已成为世界各国共同关注的问题。
在外力(诱导剂或促融剂)作用下，2个或2个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成1个细胞，这个新细胞(杂合细胞)得到了来自2个细胞的遗传物质(包括细胞核的染色体组合和核外基因)，将具有新的遗传学或生物学特性。原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中，原生质体融合技术已成为关键技术。
PAHs的微生物降解已成为国内外污染环境修复的重要手段，具有处理形式多样、成本低、对环境影响小等优点，目前降解PAHs的微生物研究主要是筛选高效的降解菌株或者构建高效菌群，高效降解菌株主要是基于低分子量的PAHs(LMW-PAHs)，他们能以LMW-PAHs为唯一碳源，却不能以高分子量PAHs(HMW-PAHs)为唯一碳源，从而不能有效降解。高效菌群一般是将几种优势菌简单地混合构建在一起，这样的菌群很难实现作用最大化，有时甚至因为种间的抑制而产生负面效应。采用原生质体融合技术可以将几种优势菌融合在一个细胞内，构建一个新的菌种，采用此菌种处理PAHs是一次全新的尝试。基于原生质体融合技术的特点和优点，首次尝试使用环境中重要的污染物降解者—假单胞菌和鞘氨醇单胞菌作为亲本进行融合。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种降解多环芳烃的高效菌株及其构建方法和应用。本发明所提供的融合菌株为假单胞菌F14(Pseudomonas sp.F14)，已于2010年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2010103，是由鞘氨醇单胞菌GY2B(sphingomonas sp.)，GenBank登录号DQ139343，保藏编号为CCTCC M 206019和假单胞GP3A(Pseudomonas sp.)，GenBank登录号为EU233280，保藏编号为CCTCC NO：M 207166的两株革兰氏阴性菌株原生质体融合的菌株，将两株菌的基因和优势，通过体内重组与整合，构建在一个菌株细胞内，用于处理多环芳烃PAHs。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
降解多环芳烃的高效菌株，是由鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)GY2B CCTCC NO：M 206019原生质体和假单胞菌(Pseudomonas sp.)GP3A CCTCC NO：M 207166原生质体融合得到，保藏编号为CCTCC NO：M 2010103。
所述的降解多环芳烃的高效菌株的构建方法，包括以下步骤；
(1)在细菌对数生长初期的鞘氨醇单胞菌GY2B和假单胞菌GP3A的菌体中分别加入青霉素和EDTA振荡培养，再加入溶菌酶振荡培养后，离心收集原生质体；
(2)等体积的鞘氨醇单胞菌GY2B的原生质体与假单胞菌GP3A的原生质体混合，离心收集菌体；在菌体中加入2ml高渗缓冲液SMM和18ml诱导液在36℃融合5min；
(3)经离心后收集菌体，高渗缓冲液SMM清洗后，涂布于双抗夹层再生培养基，在30℃条件下培养7天，在双抗夹层再生培养基上长出的菌落即是保存号为CCTCC NO：M2010103的菌落。
所述诱导液的配制方法：用高渗缓冲液SMM配制含有聚乙二醇、CaCl2和二甲基亚砜的混合溶液，其中聚乙二醇40％w/v，CaCl210mmol/L，二甲基亚砜15％v/v。
所述高渗缓冲液SMM为在0.5mol/l蔗糖的溶液中加入0.02mol/l的顺丁稀二酸和0.02mol/l MgCl2·6H2O，调节pH＝6.5，121℃灭菌20min。
所述双抗夹层再生培养基由上下两层培养基组成，下层培养基(10ml)为：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.02mol/L，L-丝氨酸0.1mol/L，琼脂20g/L，头孢他啶抗生素80mg/L，哌拉西林钠80mg/L；上层培养基(5ml)：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖10g/L，NaCl5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.02mol/L，L-丝氨酸0.1mol/L，琼脂8g/L，头孢他啶抗生素80mg/L，哌拉西林钠80mg/L。
本发明所述的降解多环芳烃的高效菌株在处理多环芳烃PAHs中的应用。
本发明相对于现有技术所具有的优点和有益效果：
(1)融合构建F14特效菌株的成本，低于分子克隆；
(2)原生质体融合菌株的稳定遗传性能稳定、重现性好，同时含有两亲株的功能优势；
(3)原生质体融合技术操作较分子克隆简便，设备要求简单；
(4)原生质体融合是自然基因在细胞内重组，没有创造新基因，不存在基因污染问题。
总之，本发明是两种革兰氏阴性菌原生质体融合的原创性的生物技术。是应用环境降解菌中普遍存在的假单胞菌和鞘氨醇单胞菌原生质体融合技术构建特效菌处理多环芳烃PAHs的首例。本发明亲株1GY2B是菲降解菌属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)，具有高降解性，亲株2GP3A是芘降解菌属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，具有高适应性。融合二亲株，通过基因在同一个细胞内的重组整合，获得了特效菌F14，集中了二亲株的高降解性、高适应性的优势，利于高效处理PAHs。使用效果：F14在30℃降解率可以达到100.0％，在20℃降解率可以达到82.9％，在36℃降解率可以达到99.7％。而GY2B在20℃和35℃降解率都约为50％左右。GY2B降解初始浓度为230mg/L的菲，在48h降解率为70％左右，此后菲浓度不再减少，而F14降解初始浓度为230mg/L的菲在48h降解率可达88.9％，在72h降解率可达99.9％。F14对环境中的pH适应范围也比GY2B稍广，GY2B在pH为7～10的范围之间降解效果好，在pH＝6.5时的降解率约为45％左右，而F14在pH＝6.5时的降解率可达99.8％。
附图说明
图1为本发明亲株1鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)GY2B平板菌落照片
图2为本发明亲株2假单胞菌(Pseudomonas)GP3A平板菌落照片
图3为本发明二亲株融合后得到的融合子F14平板菌落照片
图4为本发明亲株1鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)GY2B光学显微镜照片
图5为本发明亲株2假单胞菌(Pseudomonas)GP3A光学显微镜照片
图6为本发明二亲株融合后得到的融合子F14光学显微镜照片
图7为本发明亲株1鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)GY2B电子显微镜照片
图8为本发明亲株2假单胞菌(Pseudomonas)GP3A电子显微镜照片
图9为本发明二亲株融合后得到的融合子F14电子显微镜照片
本发明的微生物保藏资料：2010年04月26日保藏，保藏编号是CCTCC M 2010103鞘氨醇单胞菌GY2B与假单胞菌GP3A两株革兰氏阴性菌原生质体融合的高效菌F14。中国典型微生物保藏中心。地址：武汉市武昌珞珈山
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明近一步进行说明。
实施例1
本发明由鞘氨醇单胞菌GY2B和假单胞菌GP3A原生质体先制备再进行融合。以下为具体构建方法：
A.高渗缓冲液SMM：在0.5mol/l蔗糖的溶液中加入0.02mol/l的顺丁稀二酸和0.02mol/lMgCl2·6H2O，调节pH＝6.5，121℃灭菌20min。
B.诱导液：用高渗缓冲液SMM配制含有聚乙二醇、CaCl2和二甲基亚砜的混合溶液，其中聚乙二醇40％w/v，CaCl210mmol/L，二甲基亚砜15％v/v，0.45μm膜过滤除菌，常温贮藏。
C.溶菌酶：购自BBI公司，酶活＞20，000U/mg，称取溶菌酶20mg，溶于SMM高 渗液中，终浓度为5mg/ml，0.45μm膜过滤除菌，于-20℃贮藏备用
D.双抗夹层再生培养基由上下两层培养基组成，下层培养基(10ml)为：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.02mol/L，L-丝氨酸0.1mol/L，琼脂20g/L，头孢他啶抗生素80mg/L，哌拉西林钠80mg/L；上层培养基(5ml)：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.02mol/L，L-丝氨酸0.1mol/L，琼脂8g/L，头孢他啶抗生素80mg/L，哌拉西林钠80mg/L。
E.完全培养基(CM)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，NaCl 5g，酵母粉5g，蒸馏水1L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min
F.磷酸盐缓冲液：KH2PO48.5g，K2HPO4·H2O 21.75g，Na2HPO4·12H2O 33.4g，(NH4)Cl 5.0g，蒸馏水1L；调节pH＝7.0；
(1)鞘氨醇菌GY2B原生质体的制备预处理：用完全培养基(CM)培养细菌，在细菌对数生长初期加入0.3U/ml青霉素继续振荡培养至对数期(OD600＝1)，3000×g，4℃离心10min，收集菌体并用磷酸缓冲液洗涤两遍，收集菌体。将菌体悬浮于高渗缓冲液SMM中，加入0.1M EDTA(pH＝8.0)使其终浓度为0.01M。以110r/min在37℃条件下振荡20min，3000×g，4℃离心10min，收集菌体并用磷酸缓冲液洗涤两遍
(2)假单胞细菌GP3A原生质体的制备预处理：用完全培养基(CM)培养细菌，在细菌对数生长初期加入0.7U/ml青霉素继续振荡培养至对数期(OD600＝1)，3000×g，4℃离心10min，收集菌体并用磷酸缓冲液洗涤两遍，收集菌体。将菌体悬浮于高渗缓冲液SMM中，加入0.1M EDTA(pH＝8.0)使其终浓度为0.01M。以110r/min在37℃条件下振荡20min，3000×g，4℃离心10min，收集菌体并用磷酸缓冲液洗涤两遍
(3)鞘氨醇菌GY2B原生质体的制备：将收集到的菌体悬浮于SMM中，加入终浓度为5mg/ml的溶菌酶，在37℃条件下水浴振荡培养80min，3000×g，4℃离心收集原生质体并用SMM缓冲液洗涤两遍
(4)假单胞细菌GP3A原生质体的制备：将收集到的菌体悬浮于SMM中，加入终浓度为5mg/ml的溶菌酶，在37℃条件下水浴振荡培养100min，3000×g，4℃离心收集原生质体并用SMM缓冲液洗涤两遍
(5)融合：等体积的鞘氨醇单胞菌GY2B的原生质体与假单胞菌GP3A的原生质体混合，离心收集菌体。在沉淀菌体中加入2mi高渗缓冲液SMM和18ml诱导液，36℃水浴诱导融合5min。3000×g，4℃离心10min，收集融合产物，清洗并将其涂布于双抗固体夹层再生培养基上，在30℃条件下培养7天，在双抗固体夹层再生培养基上长出的菌落即是保存号为CCTCC NO：M 2010103的菌落。
电子扫描显微镜(SEM)形态鉴定：对亲株1鞘氨醇细菌GY2B、亲株2假单胞细菌GP3A及融合子F14的单菌落细胞，用SEM放大1万倍摄像，确定F14菌株的形态特征即不同于亲株1，也不同于亲株2，如图1-3所示，F14比GY2B和GP3A稍大，白色圆形，光滑不透明，有光泽，湿润。
实施例2：
革兰氏阴性菌GY2B和GP3A融合构建工程菌技术应用
如表1所示F14能在同时含有80μg/ml的头孢他啶和80μg/ml的哌拉西林钠培养基上生长，二亲株各自不能。F14比亲株对环境条件有更广的适应性，将F14接种在初始浓度为100mg/L的摇瓶中，以150r/min的转速检测不同温度下的降解率。F14在30℃降解率可以100.0％，在20℃降解率可以达到82.9％，在36℃降解率可以达到99.7％。而GY2B在20℃和35℃降解率都约为50％左右。将F14接种在不同初始浓度的摇瓶中，转速为150r/min，温度为30℃，检测降解率。GY2B降解初始浓度为230mg/L的菲，在48h降解率为70％左右，此后菲浓度不再减少，而F14降解初始浓度为230mg/L的菲在48h降解率可达88.9％，在72h降解率可达99.9％。GY2B在pH为7～10的范围之间降解效果好，在pH＝6.5时的降解率约为45％左右，而F14在pH＝6.5时的降解率可达99.8％。表1为高效菌株F14原生质体融合的双抗生化鉴定。
表1
重复实施例1中的步骤(1)～(4)在鞘氨醇单胞菌GY2B和假单胞菌GP3A的菌体中分别加入青霉素和EDTA振荡培养，再加入溶菌酶振荡培养后，离心收集原生质体；将原生质体分别涂布于各自的完全再生培养基上；计算原生质体再生率，结果见表1。
GP3A菌株完全再生培养基(CMR)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，NaCl 5g，酵母粉5g，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.03mol/L，L-丝氨酸0.1mol/L，蒸馏水1L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
GY2B菌株完全再生培养基(CMR)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，NaCl 5g，酵母粉5g，蔗糖0.5mol/L，MgCl20.02mol/L，CaCl20.02mol/L，L-丝氨酸0.05mol/L，蒸馏水1L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
高效菌株F14及其双亲菌细胞电子扫描显微镜(SEM)形态学鉴定
1.细菌固定：营养肉汤培养的过夜的细胞用0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)清洗三遍，每次10min，加入4℃预冷的2.5％体积分数戊二醛，在4℃固定12h，吸出固定剂，用磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗3次，每次30min，再用4℃预冷的1％四氧化锇进行固定3小时，然后用0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗3次，每次5min。
2.脱水：用系列梯度(体积分数)乙醇逐级脱水30％→50％→70％→80％→90％每个浓度15分钟，100％时脱水三次，每次10分钟。30％、50％、70％在4℃冰箱内脱水，其 它浓度乙醇在室温脱水。
3.替换：将乙醇倒掉，换成叔丁醇重复进行步骤(2)。
4.干燥：用JFD-310冷冻干燥仪进行干燥。
5.喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后用JFC-1600离子溅射镀金膜约10nm。
6.观察：利用JSM-6360LV扫描电子显微镜进行观察并拍照。
条件：EHT＝25.00KV
7.高效降解菌株F14及其二亲本扫描电镜的细胞尺寸如表2所示，F14的长都小于双亲，直径大于双亲，体积也都大于双亲。
表2
Claims (2)
1.降解多环芳烃的菌株，其特征在于，假单胞菌F14(Pseudomonas sp.)是由鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)GY2B CCTCC NO：M 206019原生质体和假单胞菌(Pseudomonassp.)GP3A CCTCC NO：M 207166原生质体融合得到，保藏编号为CCTCC NO：M 2010103。
2.权利要求1所述的降解多环芳烃的菌株在处理菲中的应用。
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