CN105517453B - 包括金属、金属纳米颗粒的益生细菌和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及选自乳酸细菌如乳杆菌属和双歧杆菌的包括金属和/或金属纳米颗粒的益生细菌，和包括这些细菌的食品和药物组合物。本发明还提供获得这些细菌的方法和这些细菌用于治疗和预防矿物质缺乏病症、作为消化道成像造影剂和用于治疗癌症的应用。

Description

包括金属、金属纳米颗粒的益生细菌和其应用

发明领域

本发明列入益生细菌领域内，并且更具体地涉及负载金属离子和/或金属纳米颗粒的益生细菌、这些益生细菌用于预防或治疗矿物质缺乏疾病的应用、这些细菌作为消化道成像造影剂的应用、和这些细菌用于癌症治疗的应用。

发明背景

矿物质是生命所需的五个基本组的养分之一。微量养分营养不良波及＞50％的世界人口。具体而言，铁、锌和钙被认为是在大多数发展中国家中新出现的公众健康问题。在发达国家中，由于舒适和愉悦胜于健康的不正确饮食习惯，也存在严重的矿物质缺乏问题。缺铁是世界上最常见的营养问题。除了波及发展中国家的很多儿童和妇女外，其也是唯一的在工业化国家中明显普遍的养分缺乏。缺铁性贫血的后果非常严重。幼儿缺铁导致的贫血已非常普遍，因为一般婴幼儿饮食中可生物利用的铁的水平很低，而其快速生长需要远远更高水平的铁。缺铁性贫血(IDA)的后果非常严重，因为其与认知和精神运动发育受损、生长减少和感染抵抗力降低有关。

为增加这些矿物质的日摄入量，包含这些金属的不同无机和有机形式的多种食品补充剂可商业获得。无论如何，众所周知无机盐具有很低的生物利用度。有机盐——通常基于葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、或其他分子——的特征在于全身性效果较高。为缺铁性贫血开处的铁补充剂的治疗剂量可引起胃肠道副作用如恶心、呕吐、便秘、腹泻、深色排便、和/或腹痛。因此，需要提供新型制剂以最小的胃肠道副作用用于金属补充，具体地用于铁补充。

发明概述

第一方面，本发明涉及细菌，该细菌选自乳酸细菌和双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌，包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。

第二方面，本发明涉及获得包括结合于其表面的至少一种金属的选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌的细菌的方法，包括使所述细菌与至少所述金属接触，其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下和在其中所述细菌的生长大幅(实质，substantially)减少的温度下进行。

第三方面，本发明涉及通过根据第二方面的方法可获得的细菌。

第四方面，本发明涉及根据第一方面的细菌或根据第三方面的细菌的生物纯培养物。

第五方面，本发明涉及食品，其包括根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物。

第六方面，本发明涉及药物组合物，其包括根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物和药学上可接受的载体。

第七方面，本发明涉及细菌，其选自第一方面所述的细菌和第三方面所述的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其用于治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况，其中细菌包括在所述疾病或状况中缺乏的金属，并且其中细菌或培养物被口服给予。

第八方面，本发明涉及细菌，其选自第一方面所述的细菌和第三方面所述的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其用于治疗癌症，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

第九方面，本发明涉及在对象肠道中递送金属的非治疗方法，包括口服给予根据第一方面的细菌或第三方面所述的细菌或第四方面所述的生物纯培养物。

第十方面，本发明涉及根据任何第一方面的细菌或根据第三方面的细菌或根据第四方面的生物纯培养物作为造影剂用于磁共振成像的应用，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

第十一方面，本发明涉及对象消化道的磁共振成像方法，包括：

(i)口服给予所述对象根据第一方面的细菌、或根据第三方面的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物、或造影剂——其包括根据第一方面的细菌、或根据第三方面的细菌、或根据第四方面的生物纯培养物，其中金属被包含在纳米颗粒中，和

(ii)检测对象消化道中的金属纳米颗粒。

附图简述

图1.嵌入无定形环氧树脂的人工磁性细菌微调层的透射电子显微镜图像。a)阳性和b)阴性磁赤铁矿(maghemite)纳米颗粒，和c)无EPS生物膜的细菌。在细菌包含EPS生物膜和纳米颗粒为阳性时，注释为纳米颗粒接枝发生。d)含磁赤铁矿细菌的Fe作图显示铁在细菌外表面选择性积累。

图2.与阳性磁赤铁矿纳米颗粒一起温育后形成葡萄干布丁样的双歧杆菌的典型非造影TEM图像。

图3.(a)人工磁性细菌在含水介质中分散，然后(b)磁性细菌通过磁场分离。

图4.在存在外部磁体的情况下绿色SYTO9染料标记的人工磁性细菌在聚赖氨酸上的沉积。

图5.铁从胃和肠模拟介质中的含氧化铁纳米颗粒细菌去除的时间依赖性。注意，肠介质中的铁去除水平显著高于胃。

图6.胃和肠模拟介质中钙去除细菌的时间依赖性。

图7.胃和肠模拟介质中锌去除细菌的时间依赖性。

图8.(A)SEM图像，显示与Ca2+一起温育后的细菌。(B)EDX光谱，显示Ca的3.8eV特征Kα峰。

图9.(A)SEM图像显示与一起磁赤铁矿和Ca2+温育后的细菌。(B)EDX光谱，分别显示Fe和Ca的6.2eV和3.8eV特征Kα峰。

图10.给予含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌6h后的小鼠MRI全身图像。由于磁性纳米颗粒积累造成的阳性(深暗)造影，一些上肠道部分的形态明显。

图11.给予含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌12h后的小鼠MRI全身图像。由于磁性纳米颗粒积累造成的阳性(深暗)造影，一些下肠道部分的形态明显。

发明详述

本发明的发明人已观察到，乳酸细菌或双歧杆菌属细菌能够以pH依赖性方式使金属纳米颗粒结合至其表面。细菌和金属纳米颗粒之间的联合在纳米颗粒具有表面正电荷的那些pH条件下是稳定的(图1)。此外，发明人已观察到，金属纳米颗粒稳定联合细菌的pH条件与胃的酸性pH条件重叠，而肠道的pH条件允许金属纳米颗粒和细菌之间解离，和随后的金属纳米颗粒递送(实施例2)。基于这种性质，发明人已研发出通过口服给予根据本发明的包含金属和/或金属纳米颗粒的细菌来将金属补充剂给予对其有需要的对象的方法。这些细菌以及这些细菌的培养物也可被配制成药物组合物，或构成食品或营养产品的部分。此外，基于乳酸细菌和双歧杆菌到达肿瘤低氧区域的能力，纳米颗粒联合型细菌还可用于将目标化合物靶向肿瘤。进一步，携载结合至其表面的磁性纳米颗粒的细菌能够在经历施加射频范围内的交变磁场时选择性增加肿瘤附近温度(体温过高)时破坏肿瘤细胞。

最后，发明人还观察到，金属纳米颗粒负载型细菌适于通过磁共振(MRI)成像胃肠道系统(实施例4)。因此，这些细菌也适于用作口服性MRI造影剂。

细菌和培养物

第一方面，本发明涉及细菌，下文“本发明的细菌”，其选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌，包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。

本发明的细菌选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌。

术语“乳酸细菌”或“LAB”，如本文所用，指代任何能够生成乳酸或其衍生物中的至少一种(包括但不限于，乙酸或丙酸)作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的细菌：因此该术语意图包括生成丙酸作为碳水化合物发酵产物的丙酸细菌(PAB)。乳酸细菌的示例性非限制性实例是下列属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、足球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和链球菌属(Streptococcus)；以及下列目属：乳杆菌目气球菌属(LactobacillalesAerococcus)、肉品杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。一般，乳酸细菌选自下列物种：明串珠菌属、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副胚牙乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)。

在优选的实施方式中，乳酸细菌是乳杆菌属细菌。术语“乳杆菌属”，如本文所用，指代NCBI数据库中通过分类学(Taxonomy)ID 1578描述的属。在具体实施方式中，乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌。在更优选的实施方式中，乳酸细菌是发酵乳杆菌。术语“发酵乳杆菌”(“Lactobacillus fermentum”或“L.fermentum”)指代在NCBI数据库中通过分类学ID 1613描述的乳杆菌属的种。

术语“双歧杆菌属细菌”或“双歧杆菌”，如本文所用，指代在NCBI数据库中通过分类学(Tanoxonomy)ID 1678描述的细菌的属。适当的双歧杆菌的示例性非限制性实例是下列的种：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidium)、长双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)。在具体实施方式中，双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、幼儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantum)和动物双歧杆菌。在更优选的实施方式中，双歧杆菌属细菌是短双歧杆菌。术语“短双歧杆菌”(“Bifidobacteriumbreve”或“B.breve”)指代在NCBI数据库中通过分类学ID 1685描述的双歧杆菌属物种。

在另一具体实施方式中，本发明的乳酸细菌或双歧杆菌是能够在口服摄入后被转运至乳腺的细菌。关于检测转运至乳腺的能力，可利用WO2004003235描述的用于检测微生物在口服摄入后至乳汁转运的试验。这种细菌的实例被公开于国际申请WO2008145756。在更具体的实施方式中，能够在口服摄入后被转运至乳腺的乳酸细菌或双歧杆菌属细菌选自：

-在CECT中以登录号7263保藏的短双歧杆菌，

-在CECT中以登录号5716保藏的发酵乳杆菌，

-在CECT中以登录号5711保藏的棒状乳杆菌，

-在CECT中以登录号5713保藏的唾液乳杆菌，

-在CECT中以登录号5714保藏的加氏乳杆菌，

-在CECT中以登录号7264保藏的短双歧杆菌，

-在CECT中以登录号7260保藏的罗伊乳杆菌，

-在CECT中以登录号7262保藏的胚牙乳杆菌，

-在CECT中以登录号7265保藏的发酵乳杆菌，

-在CECT中以登录号7266保藏的罗伊乳杆菌，

-在CECT中以登录号7410保藏的海氏肠球菌(Enterococcus hirae)，

-在CECT中以登录号7412保藏的胚牙乳杆菌，

-在CECT中以登录号7411保藏的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，

-在CECT中以登录号7409保藏的唾液乳杆菌，和

-在CECT中以登录号7413保藏的罗伊乳杆菌。

本发明的细菌包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒。本文所用的术语“金属纳米颗粒”指代包括金属的纳米颗粒。本文所用的术语“纳米颗粒”指代直径范围为约1至约1000纳米的颗粒。在具体实施方式中，根据本发明使用的纳米颗粒一般具有如下范围的平均粒径：2至50nm，优选4至10nm，更优选8nm。平均粒径是平均最大颗粒尺寸，可理解，颗粒不一定是球形的。颗粒尺寸可利用常规技术如显微镜技术(例如，透射电镜)常规地测量。在一个实施方式中，根据本发明使用的纳米颗粒具有球形的或基本上球形的形状。形状可通过常规光学或电子显微镜技术常规地评估。

术语“金属”，如本文所用，指代作为良好的电和热导体的任何元素、化合物或合金。在具体实施方式中，金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。在优选实施方式中，金属选自铁、钙、锌、硒及其组合。在更优选的实施方式中，金属是铁。

在具体实施方式中，当金属是硒时，其不是硒代半胱氨酸形式。

金属可以是零氧化态或氧化物形式。在更具体的实施方式中，金属是氧化物形式。术语“金属氧化物”，如本文所用，指代金属元素的任何氧化物。术语“氧化物”指代包含一个或多个-2氧化态氧原子以及其他元素的任何化学化合物。在具体实施方式中，金属氧化物氧化铁。可构成本发明细菌的纳米颗粒的部分的氧化铁的示例性非限制性实例是磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。在具体实施方式中，氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。

在还更优选的实施方式中，氧化铁是磁赤铁矿。

术语“磁赤铁矿”，如本文所用，指代式γ-Fe₂O₃限定的氧化铁矿物质。

术语“磁铁矿”，如本文所用，指代式Fe₃O₄限定的氧化铁矿物质。

术语“赤铁矿”，如本文所用，指代式α-Fe₂O₃限定的氧化铁矿物质。

术语“针铁矿”，如本文所用，指代式α-FeO(OH)限定的氧化铁矿物质。

术语“水铁矿”，如本文所用，指代式(Fe³⁺)₂O₃·0.5H₂O或式式[Fe³⁺ ₁₀O₁₄(OH)₂]限定的氧化铁矿物质。

在本发明细菌的具体实施方式中，纳米颗粒是磁性纳米颗粒。术语“磁性纳米颗粒”，如本文所用，指代具有铁磁性和/或超顺磁性表现的任何纳米颗粒。非限制性的适当实例可包括Fe₂O₃、Fe₃O₄、Fe₂O₄、Fe_xPt_y、Co_xPt_y、MnFe_xO_y、CoFe_xO_y、NiFe_xO_y、CuFe_xO_y、ZaFe_xO_y，和CdFe_xO_y，其中x和y在1和6之间变化，取决于本领域已知的合成方法。在优选实施方式中，磁性纳米颗粒包括氧化铁。在更优选的实施方式中，磁性纳米颗粒包括磁赤铁矿。

可附着至根据本发明第一方面的细菌的纳米颗粒可通过本领域技术人员已知的方法获得，如，例如，Massart描述的方法(Massart，R.IEEE Trans.Magn.1981，1247-1248)，如实施例1示例。

在优选实施方式中，纳米颗粒直接结合至细菌，即，其不包含任何朝向外侧的化学基团或任何可与细菌壁组分形成相互作用的包衣。在优选实施方式中，不用胺基团官能化纳米颗粒。在另一优选的实施方式中，不用聚合物组分涂覆金属纳米颗粒。在还更优选的实施方式中，不用聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)-b-聚(L-组氨酸)-b-聚-(乙二醇)(PLGA-PLH-PEG)涂覆纳米颗粒。

在具体实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒和至少一种另外的金属，例如，2、3、4或更多种另外的金属。在此具体实施方式中，所述另外的金属不同于构成金属纳米颗粒的金属。在更具体的实施方式中，另外的金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。在优选实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和一种或多种另外的金属，该另外的金属选自锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。在更具体的实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和一种或多种另外的金属，该另外的金属选自钙、锌、硒及其组合。在更具体的实施方式中，细菌包括金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒包括铁，优选氧化铁，更优选磁赤铁矿，和进一步包括金属，该金属选自锌和钙，更优选其包括锌和钙。

第二方面，本发明涉及本发明第一方面所述细菌的生物纯培养物。

术语“生物纯培养物”，如本文所用，指代这样的培养物：在其中发现，与培养物中存在的其他生物体相比，本发明细菌的比例为95％或更高(例如，96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％)。术语“培养物”，如本文所用，指代本发明细菌的菌群。培养物可包括本发明细菌以外的成分，如培养基或可被添加至培养基、有益于培养物生长或维持的任何其它物质。术语“培养基(culture medium)”或“介质(medium)”在本领域已知，总体上指代用于活细胞培养的任何物质或制剂。关于细胞培养物所用的术语“介质”包括在细胞周围环境的组分。介质可以是固相、液相、气相或相位和材料的混合物。介质包括液体生长介质以及不维持细胞生长的液体介质。介质还包括胶状介质，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态介质包括在皮氏培养皿或其它固体或半固体载体上生长的细胞所暴露的气相。术语“介质”还指代意图用于细胞培养的材料，即使其还未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富养分液体是介质。类似地，在与水或其它液体混合时适于细胞培养的粉末混合物可被称为“粉末状介质”。“确定的介质”指代由化学上确定的(通常是纯化的)组分制成的介质。“确定的介质”不包含表征不清的生物学提取物，如酵母提取物和牛肉汤。“富介质”包括被设计以支持具体物种的大多数或所有可存活形式生长的介质。富介质通常包括复杂的生物学提取物。本领域已知的适于乳酸细菌或双歧杆菌培养物的任何常规培养基可用于本发明，如，例如，MRS介质、HANK介质、APT介质、RCM介质、LM17介质、GM17介质和Elliker介质。在具体实施方式中，可构成本发明生物纯培养物的部分的培养基是MRS介质。适于乳酸细菌和双歧杆菌培养的MRS介质和其他介质的描述可见于Handbook ofCulture Media for Food Microbiology，Vol.34，Janet E.L.Corry、G.D.W.Curtis、Rosamund M.Baird编著。

获得细菌的方法

第三方面，本发明涉及获得选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌、包括结合于其表面的至少一种金属的细菌的方法，包括使所述细菌与至少所述金属接触，其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下并且在其中所述细菌的生长大幅(实质，substantially)减少的温度下进行。

术语“乳酸细菌”、“双歧杆菌属细菌”、和“金属”已在前文关于本发明第一方面进行过描述。

根据第三方面的方法，乳酸细菌或双歧杆菌属细菌与金属之间的接触应在存在至少一种二价阳离子盐的情况下进行。术语“二价阳离子盐”，如本文所用，指代其中二价阳离子偶联至反离子或处于溶液中的化合物。术语“二价阳离子”，如本文所用，指代处于正氧化态，产生价态为2的正电荷的元素。二价阳离子的实例是Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cr²⁺、Se²⁺和Si²⁺。优选地，二价阳离子盐选自钙盐、镁盐及其组合。更优选地，二价阳离子盐选自氯化钙、氯化镁及其组合。还更优选，二价阳离子盐是氯化钙和氯化镁的组合。不希望束缚于任何具体理论，认为盐的添加能够影响细菌表面，增加其多孔性，从而增加金属结合。

根据第三方面的方法，乳酸细菌或双歧杆菌与金属之间的接触应在其中所述细菌的生长大幅减少的温度条件下进行。术语“最低生长温度”，如本文所用，指代这样的温度：在该温度以下不发生持续平衡的细菌生长。适于实施根据本发明的方法的生长温度根据细菌而变化，并且应针对每个物种和细菌菌种来确定。本领域技术人员已知确定其中细菌生长大幅减少的温度条件的方法和技术，如Shaw等描述的方法(Shaw等，Journal ofBacteriology，1971，Vol.105(2)：683-684)。在具体实施方式中，乳酸细菌或双歧杆菌与金属之间的接触在0℃和10℃之间包括的温度，更优选在0℃下进行。

在优选实施方式中，实施接触金属的温度是细菌生长减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或更多(相对于细菌在其最佳生长温度的生长)的温度。

在具体实施方式中，在与金属一起温育前，乳酸细菌或双歧杆菌被冷却至最低生长温度(例如，0℃)以下的温度——例如，通过将乳酸细菌或双歧杆菌培养物在冰上保存一段时间，例如，10分钟。

将要根据第三方面所述的方法通过金属修饰的乳酸细菌或双歧杆菌可通过在本领域技术人员已知的标准培养条件下培养适当的细菌来获得。在具体实施方式中，乳酸细菌或双歧杆菌得自在MRS介质中的24小时培养。在优选实施方式中，细菌——为获得包括结合于其表面的金属的细菌其将要通过第三方面所述的方法处理——已在不包括所述金属的培养基中生长。不希望束缚于任何具体理论，认为由于细菌与金属在不允许显著细菌生长的条件下接触，金属不显著进入细菌，而是合并到细菌表面上。

在第三方面的方法的具体实施方式中，使乳酸细菌或双歧杆菌与纳米颗粒中包含的金属接触。术语“纳米颗粒”在前文已被定义。在此具体实施方式中，所述接触应在金属纳米颗粒具有正表面静电电荷的pH下进行。术语“表面静电电荷”，如本文所用，指代可通过纳米颗粒的ζ电位测量的静电电荷或粒子。术语“ζ电位”指代滑动面位置处的界面双层(DL)相对于远离界面的流体主体中的点的电位。换句话说，ζ电位是分散介质与附着于分散颗粒的流体静止层之间的电位差。本领域技术人员已知如何基于实验确定的电泳迁移率或动态电泳迁移率计算纳米颗粒的ζ电位(Delgado AV等，2005，Pure Appl.Chem.77(10)：1753-1850；Dukhin AS和Goetz PJ，″Ultrasound for characterizing colloids″，Elsevier，2002)。

金属纳米颗粒的表面静电电荷呈阳性的pH将取决于纳米颗粒组成，并且可由本领域技术人员确定。例如，当金属纳米颗粒包括磁赤铁矿时，pH应低于5。在优选实施方式中，当金属纳米颗粒包括磁赤铁矿时，在pH 2下温育乳酸细菌或双歧杆菌和磁赤铁矿纳米颗粒。

这些实验条件保留细菌的生物膜EPS(胞外聚合物物质)。EPS的存在似乎为接枝金属纳米颗粒至细菌所需(图1c)。事实上，当按照标准方案(Molecular cloning：alaboratory manual.Vol.2.John J.Sambrook，David David，William Russell CSHLPress，2001)将EPS生物膜去除时，阳性金属纳米颗粒不被固定至细菌外表面(图1c)。

在具体实施方式中，在温育乳酸细菌或双歧杆菌培养物与金属前进行干燥步骤。所述干燥步骤可通过技术人员已知的任何适当的技术进行，如细胞培养物离心和介质滗析(倾析，decantation)。

在第三方面的方法的具体实施方式中，使乳酸细菌或双歧杆菌与两种或更多种金属接触。在更具体的实施方式中，使细菌与纳米颗粒中包括的第一金属接触，所述接触在纳米颗粒具有阳性静电电荷的pH下进行，并且至少一种另外的金属不同于纳米颗粒中包括的金属。在还更具体的实施方式中，使细菌与下列接触：铁纳米颗粒，例如，磁赤铁矿纳米颗粒；和选自钙、锌、硒及其组合的另外的金属，优选选自钙、锌及其组合的另外的金属，更优选钙和锌的组合。

金属可通过下列提供：包括包含所述金属的化合物(例如，所述金属的盐)的溶液，或包括包含所述金属的纳米颗粒的溶液。

当需要包括超过一种另外金属的细菌时，可在相同步骤中使乳酸细菌或双歧杆菌与这些另外的金属接触，即，将细菌与包括不同的另外的金属的溶液一起温育，或优选地，乳酸细菌或双歧杆菌和各不同金属之间的接触可在不同的相继温育步骤中进行。在具体实施方式中，额外的步骤(一个或多个)在乳酸细菌或双歧杆菌与金属纳米颗粒温育前进行。在更具体的实施方式中，每个额外的使细菌与另外的金属接触的步骤之后是干燥步骤。所述干燥步骤可包括，例如，离心细菌和含金属溶液的混合物，和去除溶液。

在具体实施方式中，第三方面的方法包括下列步骤：

-使乳酸细菌或双歧杆菌与第一金属(例如，钙)接触。

-使乳酸细菌或双歧杆菌与第二金属(例如，锌)接触。

-使乳酸细菌或双歧杆菌与包括第三金属(例如，铁，优选磁赤铁矿)的纳米颗粒接触。

进一步方面，本发明还涉及通过第三方面的方法可获得的细菌、通过第三方面的方法获得的细菌和其生物纯培养物。术语“生物纯培养物”在前文已被定义。

食品和药物组合物

第一方面所述的细菌和通过第三方面的方法可获得的细菌均可以食品形式或以药物组合物形式被口服给予对象。

因此，另一方面，本发明涉及包括根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物的食品。

术语“食品”，如本文所用，指代适于人和/或动物食用的物质或组合物。根据本发明的食品可涉及准备食用的食品。然而，可选地或另外地，如本文所用的术语食品可意为用于制备食品的一种或多种食物材料。可用于本发明的适宜食品的非限制性实例是乳汁、酸乳、奶酪、凝乳、发酵乳汁、乳汁基础的发酵产物、发酵谷物基础的产物、发酵肉类产物、其他乳汁基础的或谷物基础的粉末、临床营养配方、冰淇淋、果汁、面包、蛋糕或糖果、动物饲料制剂、半合成或合成膳食制剂、婴幼儿配方、临床营养配方、冰淇淋、果汁、面粉、面包、蛋糕、糖果或口香糖。本领域技术人员已知如何由益生细菌(例如，本发明的细菌)制备食品。

另一方面，本发明涉及包括根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物和药物活性赋形剂的药物组合物。

术语“药物组合物”，如本文所用，指代意图用于治疗的组合物。药物组合物针对口服给予，并且可采用片剂、胶囊、细菌悬浮液、干型口服补充剂、湿型口服补充剂、干管喂食(dry tube feeding)或湿管喂食(wet tube feeding)形式。

术语″药学上可接受的载体″，如本文所用，意为从一个器官或身体部分至另一器官或身体部分运载或运输对象剂所涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是在与制剂其他成分可相容意义上″可接受的″。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇、solutol和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于药物制剂的其他无毒相容性物质，如DMSO(二甲基亚砜)和其衍生物。Remington′s PharmaceuticalSciences.Ed.by Gennaro，Mack Publishing，Easton，Pa.，1995公开了用于配制药物组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。

适于口服给予的药物形式包括任何固体组合物(片剂、锭剂、胶囊、粒剂等)或液体组合物(溶液、细菌悬浮液、乳液、糖浆等)，并且可包含本领域已知的常规赋形剂，如粘合剂，例如，糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如，乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；用于制备片剂的润滑剂，例如，硬脂酸镁、崩解剂，例如，淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂，如月桂基硫酸钠。

食品或药物组合物中的本发明细菌的需要剂量将根据下列而变化：疾病性质或组合物的建议用途、预防性还是治疗性使用、和涉及的生物类型。

本发明细菌的任何适宜剂量可用于本发明，条件是毒性效应不超过治疗效应。治疗效力和毒性可利用实验动物通过标准药物程序确定，如通过计算ED(群体50％治疗有效的剂量)或LD(群体50％致死的剂量)统计。毒性效应与治疗效应的剂量比是治疗指数，其可表示为LD/ED比。然而，本发明细菌在个体中的活性自然是剂量依赖性的，以及取决于细菌的金属纳米颗粒负载。优选呈现大治疗指数的组合物。利用从动物研究获得的数据配制一定范围的人或动物使用的剂量。这种组合物包含的剂量优选在具有很少或无毒性的包括ED的循环浓度范围内。剂量根据所用剂型、患者敏感性、和给予途径在此范围内变化。确切剂量将由医生基于需要治疗的对象相关的因素确定。例如，关于制备根据本发明的食品，本发明的细菌被掺入适当载体，掺入量为10⁵cfu/g至约10¹²cfu/g载体材料，优选约10⁶cfu/g至约10¹¹cfu/g载体材料，更优选约10⁶cfu/g至约10¹⁰cfu/g载体材料。

在药物组合物的情况下，本发明细菌的剂量应为约10⁵cfu/g至约10¹⁴cfu/g载体材料，优选约10⁶cfu/g至约10¹³cfu/g载体材料，更优选约10⁷cfu/g至约10¹²cfu/g载体材料。用于本发明的目的，缩写词cfu应表示“菌落形成单位”，其被限定为通过琼脂板上的微生物学计数揭示的细菌细胞数。

剂量和给予被调整以提供充足水平的金属纳米颗粒或保持期望的效果。可纳入考虑的因素包括疾病状态严重程度、对象总体健康状况、对象年龄、体重、和性别、给予时间和频率、药物组合(一种或多种)、反应敏感度、和治疗响应。长效组合物可每3至4天、每周、或每两周被给予，取决于具体制剂的半衰期和清除速率。

金属缺乏引起的疾病的治疗和/或预防方法

本发明的细菌适于用作需金属对象的口服补充剂。通过本发明的细菌给予金属是有利的，除其他原因外，还因为金属纳米颗粒特异性地在肠道中释放，避免金属在胃中释放，这通常导致不需要的副作用(实施例2，图5)。此外，与乳酸细菌或双歧杆菌联合的不同金属，如钙或锌，也在胃和肠道条件中释放(实施例2，图6和7)，这使这些细菌成为适于多金属口服补充的平台。因此，另一方面，本发明涉及选自第一方面所述的细菌和通过第三方面的方法可获得的细菌的细菌、或其生物纯培养物，其用于治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况，其中细菌包括所述疾病或状况缺乏的金属，并且其中所述细菌或培养物被口服给予。

另一方面，本发明涉及选自第一方面所述的细菌和通过第三方面的方法可获得的细菌的细菌、或其生物纯培养物在制备用于治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况的药物中的应用，其中细菌包括所述疾病或状况缺乏的金属，并且其中所述细菌或培养物被口服给予。

另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防与金属缺乏相关的疾病或状况的治疗方法，包括给予对象治疗有效量的选自第一方面所述的细菌和通过第三方面的方法可获得的细菌的细菌、或其生物纯培养物，其中所述细菌包括所述疾病或状况缺乏的金属，并且其中所述细菌或培养物被口服给予。

术语“金属”已连同本发明的细菌一起被定义。在治疗和/或预防金属缺乏引起的疾病的方法的具体实施方式中，金属是钙或锌。在具体实施方式中，金属是“金属阳离子”。术语“金属阳离子”，如本文所用，指代处于正氧化态，产生正电荷的金属元素。在具体实施方式中，金属阳离子是二价金属阳离子，即，价态为2的金属阳离子。二价金属阳离子的实例是Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cr²⁺、Se²⁺和Si²⁺。在具体实施方式中，二价金属阳离子是Ca²⁺或Zn²⁺。

在治疗和/或预防方法的另一具体实施方式中，细菌包括多于一种金属，例如，2、3、4、5或更多种金属。在更具体的实施方式中，细菌包括钙和锌。

包括至少一种可用于治疗和/或预防金属缺乏引起的疾病的方法的金属的乳酸细菌或双歧杆菌可通过使所述乳酸细菌或双歧杆菌与所述金属接触而获得。本申请实施例2中提供了用于获得包括一种或多种金属的所述细菌的示例性非限制性方法。

在具体实施方式中，将金属与细菌表面联合。

在另一具体实施方式中，被包含在纳米颗粒中的金属结合至细菌表面。术语“纳米颗粒”以及其具体和优选的实施方式已在前文进行过描述。

在具体实施方式中，乳酸细菌或双歧杆菌包括金属纳米颗粒、和不同于纳米颗粒中包括的金属的至少一种另外的金属。优选地，金属纳米颗粒包括氧化物，更优选氧化铁，还更优选磁赤铁矿。优选地，至少一种另外的金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。更优选的，另外的金属是钙、锌、硒或其组合。还更优选地，另外的金属是钙和锌。

在具体实施方式中，当金属是硒时，其不是硒代半胱氨酸形式。

在更具体的实施方式中，乳酸细菌或双歧杆菌包括磁赤铁矿纳米颗粒、钙和锌。

术语“治疗”，如本文所用，指代任何过程、行为、应用、处理、或类似形式，其中向对象(或患者)(包括人)提供医疗救助，目的是直接或间接改善对象状况、或减缓对象状况或障碍的进程、或减轻被治疗疾病或障碍的至少一种症状。

术语“预防”，如本文所用，意为本发明的细菌可用于给予患者，而该患者在被给予时还未被诊断为可能患有障碍或疾病，但一般被预测会罹患该障碍或疾病或该障碍或疾病风险增大。根据本发明，本发明的细菌会减缓障碍或疾病症状的发生、延迟障碍或疾病的发作、或根本上防止个体罹患该障碍或疾病。

术语“患者”或“对象”，如本文所用，指代任何动物，优选哺乳动物，包括但不限于，家养和农场动物、灵长类和人，例如，人、非人灵长类、牛类、马类、猪类、绵羊类、山羊类、犬类、猫类、或啮齿类。在优选实施方式中，对象是任何年龄或种族的人。在具体实施方式中，对象患有与金属缺乏相关的疾病。在另一具体实施方式中，对象还未被诊断患有与金属缺乏相关的疾病，但被认为罹患所述疾病的风险增大。

术语“与金属缺乏相关的疾病或状况”，如本文所用，指代呈现一种或多种金属的低血清水平的状况。被认为是低血清水平的金属血清水平根据诸如性别和年龄的参数而变化，并且被本领域技术人员已知。金属缺乏可源于所述金属的摄入、消化、吸收或利用不足。

在具体实施方式中，与金属缺乏相关的疾病或状况选自与铁缺乏相关的疾病或状况、与锰缺乏相关的疾病或状况、与钴缺乏相关的疾病或状况、与镍缺乏相关的疾病或状况、与钙缺乏相关的疾病或状况、与锌缺乏相关的疾病或状况、与镁缺乏相关的疾病或状况、与钾缺乏相关的疾病或状况、与铜缺乏相关的疾病或状况、与铬缺乏相关的疾病或状况、与硒缺乏相关的疾病或状况、与硅缺乏相关的疾病或状况和与碘缺乏相关的疾病或状况。

与金属缺乏相关的疾病或状况的示例性非限制性实例为下列：

-与铁缺乏相关的疾病或状况：虚弱、疲劳、皮肤苍白、气促、贫血、自身免疫低下、抑郁、低血压、语言障碍、记忆力差和感冒。

-与锰缺乏相关的疾病或状况：注意缺陷多动障碍(ADHD)、哮喘、腕管综合征、癫痫发作、性欲缺乏、流产、生长迟缓和恶梦。

-与钴缺乏相关的疾病或状况：恶性贫血、严重疲劳，气促和低甲状腺。

-与镍缺乏相关的疾病或状况：高血糖(高血糖)、低血压、抑郁、肝脏疾病、贫血，低胃酸、窦充血、疲劳和低肾上腺。

-与钙缺乏相关的疾病或状况：佝偻病、骨软化症、骨质疏松、退缩龈、经前期综合征、恐慌发作、肌肉痉挛、肺弱、腰痛、肾结石、失眠、骨骼脆弱、骨刺和钙沉积。

-与锌缺乏相关的疾病或状况：味觉丧失、嗅觉丧失、生长迟缓、性发育延迟、伤口愈合慢、ADHD、脱发、出生缺陷、体味、脑障碍、腹泻、心脏缺陷、疝、性无能、肺障碍和前列腺障碍。

-与镁缺乏相关的疾病或状况：肌无力和痉挛、恶心，心律失常、ADHD、动脉钙化、低钙吸收、惊厥、抑郁、胃肠道障碍、生长障碍、经期偏头痛、骨质疏松、震颤、心情易变和昏晕。

-与钾缺乏相关的疾病或状况：恶心、厌食症、易激、肌无力、恐惧、精神疾病、低能(low energy)、疼痛和刺痛、酸性(acidity)、暴力倾向、多疑、缺乏抱负、不安和消极。

-与铜缺乏相关的疾病或状况：ADHD、贫血、关节炎、暴力、脑瘫、高胆固醇、眼睑下垂、白发、疝、肝脏、硬化、学习问题、低血糖、高中风风险和静脉曲张。

-与铬缺乏相关的疾病或状况：ADHD、意外体重下降、精子计数低、糖尿病、躁狂抑郁、学习问题、生长问题、多动、冠状血管疾病、白内障和糖水平异常。

-与硒缺乏相关的疾病或状况：老年斑、皮肤老化、阿尔茨海默氏症、癌症、囊性纤维化、疲劳、心悸、HIV、甲状腺功能减退、肝损伤、肌无力和脊柱侧凸。

-与硅缺乏相关的疾病或状况：发脆、指甲和趾甲脆、皮肤质量差、钙利用差和动脉疾病。

-与碘缺乏相关的疾病或状况：甲状腺肿、月经紊乱、精神错乱、心脏和肺部问题。

根据本发明的第一治疗应用，将包括待治疗疾病或状况缺乏的金属的金属纳米颗粒给予对其有需要的对象。例如，如果对象将要接受铁缺乏相关疾病的治疗，或如果可需要的是在有罹患所述疾病风险的对象中预防铁缺乏相关疾病，则将包括铁纳米颗粒的细菌给予该对象。

根据本发明的第一治疗应用和方法，细菌或生物纯培养物被口服给予。

术语“口服给予”，如本文所用，指代向对象递送本发明的细菌或培养物的任何形式，其中本发明细菌或培养物被置于对象口中，无论本发明的细菌或培养物是否立即被吞食。因此，″口服给予″包括颊部和舌下以及食管给予。

术语“治疗有效量”，如本文所用，指代本发明的细菌或培养物足以提供期望的效果的量，并且总体上通过本发明的细菌或培养物本身的特征和所要实现的治疗效应等因素来确定。其还取决于待治疗对象、所述对象所患疾病的严重程度、所选剂型等。因此，本发明述及的剂量一定只是被本领域技术人员视作指导，本领域技术人员必须根据上述变量调整剂量。在实施方式中，有效量造成被治疗疾病的一种或多种症状减轻，例如，对象缺乏的金属的水平正常化。

癌症治疗方法

根据本发明的细菌或根据本发明的生物纯培养物也适于递送磁性纳米颗粒至胃肠道。排列到细菌表面上的磁性纳米颗粒致使细菌呈现永久磁矩和较强磁响应。在施加的交变磁场中，磁性纳米颗粒的磁矩可被周期性重新定向，导致磁能转换成热能，并且周围区域的温度迅速升高至治疗温度范围(高于42℃)，这会导致邻近细胞因体温过高而死亡。

因此，另一方面，本发明涉及根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物，用于治疗癌症，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

另一方面，本发明涉及根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

另一方面，本发明涉及用于治疗癌症的治疗方法，包括给予对象治疗有效量的根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

术语“治疗”、“对象”和“治疗有效量”在前文已连同用于治疗和/或预防金属缺乏相关疾病的治疗应用和方法一起被定义。

术语“癌症”，如本文所用，指代特征如下的疾病：不受控的细胞分裂(或生存力或凋亡抵抗力增加)，所述细胞侵入其他邻近组织(侵入)、或通过淋巴管和血管扩散至通常不存在该细胞的身体其他区域(转移)的能力。根据其是否可通过侵入和转移扩散，肿瘤被分为良性或恶性：良性肿瘤是不能通过侵入或转移扩散的肿瘤，即，其仅局部生长；而恶性肿瘤是能够通过侵入和转移扩散的肿瘤。如本文所用，术语癌症包括但不限于下列类型的癌症：乳腺癌；胆道癌；膀胱癌；脑癌，包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃肠道癌；胃癌；血液系统瘤，包括急性淋巴细胞和髓细胞性白血病；T-细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤；AIDS相关性白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内瘤，包括Bowen病和Paget病；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括Hodglun病和淋巴细胞淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括产生于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、Merkel细胞癌、Kaposi肉瘤、基底细胞癌、和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖细胞瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质肿瘤、和生殖细胞瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；和肾癌，包括腺癌和Wilms瘤。本领域技术人员会知道其它癌症。

在具体实施方式中，癌症是胃肠道癌。术语“胃肠道癌”，如本文所用，指代任何损害(影响，affect)胃肠道(包括食管、胃、胆道系统、胰、小肠、大肠或结肠和直肠)的癌症。在具体实施方式中，胃肠道癌是胃癌、小肠癌或大肠或结肠癌。

根据用于治疗癌症的治疗方法和应用，本发明的细菌可通过任何适当的途径被给予，例如，口服途径、胃肠外途径或静脉内途径。在优选实施方式中，本发明的细菌或培养物被口服给予。术语“口服给予”在前文已被定义。

在用于治疗癌症的治疗方法和应用的具体实施方式中，根据第一方面的细菌能够在口服摄入后被转运至乳腺。检测细菌转运至乳腺的能力的方法在前文已关于第一方面所述的细菌以及所述细菌的实例和具体实施方式被公开。在此具体实施方式中，本发明的细菌可用于治疗乳腺癌。因此，在本发明的治疗方法和应用的具体实施方式中，癌症是乳腺癌，并且细菌是能够在口服摄入后转运至乳腺的细菌。

术语“乳腺癌”指代任何恶性增殖性乳腺细胞障碍，通常在管道(将乳汁运至乳头的管)和小叶(乳汁生产腺)内发生。

在具体实施方式中，用于治疗癌症的治疗方法包括将根据第一方面的细菌靶向至肿瘤的步骤。

将根据本发明的细菌靶向至肿瘤的步骤可通过不同机制进行。在一个实施方式中，细菌由于其偏爱肿瘤厌氧微环境而指向肿瘤。在另一实施方式中，前文限定的包括磁性纳米颗粒的细菌通过一个或多个磁场或磁场梯度(例如，磁场或磁场梯度的外部来源)被导向和拉向目标肿瘤。这种场或梯度可由例如布置在目标肿瘤内或邻近处一个或多个磁体和相关医疗装置在细菌递送之前、期间或之后生成。在一些实施方式中，磁体利用外科或经皮方法被布置在体内，在目标肿瘤内或目标肿瘤外(例如，目标肿瘤周围或邻近)。在一些实施方式中，磁体是布置在对象体外以在目标肿瘤周围或邻近建立磁场外部来源的外部磁体。在一些实施方式中，磁场来源是永久磁体(例如，钕(NdFeB)磁体)。在一个实施方式中，磁场来源是电磁体。在其它实施方式中，磁体尺寸范围为约1mm至约10m，并且磁场强度范围为约0.1特斯拉至约100特斯拉，包括约0.1至约0.5特斯拉、约0.5至约1特斯拉、约1特斯拉至约1.1特斯拉、约1.1特斯拉至约1.2特斯拉、约1.2特斯拉至约1.3特斯拉、约1.3特斯拉至约1.4特斯拉、约1.4特斯拉至约1.5特斯拉、约1.5特斯拉至约2特斯拉、约2特斯拉至约4特斯拉、约4特斯拉至约10特斯拉、约10特斯拉至约30特斯拉、约30特斯拉至约50特斯拉、约50特斯拉至约70特斯拉、约70特斯拉至约90特斯拉、及其重叠范围。在若干实施方式中，磁场被施加约1分钟上至约5小时范围内的时期。在一些实施方式中，磁场被施加约1分钟至5分钟、约5分钟至约10分钟、约10分钟至约20分钟、约20分钟至约30分钟、及其重叠范围。在若干实施方式中，磁场被施加约5-15分钟，包括约6、7、8、9、10、11、12、13、或14分钟。

在一些实施方式中，磁场来源是来自设备的一个或多个磁体(例如，磁体组，作为塑形和聚焦磁场的一体设备)。这种设备可包括，例如，具有磁性末梢附件的外科工具(例如，导管、导线；和二级工具，如激光器和球囊、活检针、内窥镜探头，和类似的装置)(参见，例如，美国专利号7,280,863和美国专利公开号200711116006、2006/0116634、2008/0249395、2006/0114088和2004/0019447)。因此，在一些实施方式中，递送细菌并利用外部磁体靶向细菌。

当本发明的细菌包括磁性纳米颗粒时，可通过交变施加在肿瘤附近的磁场来利用所述细菌施加热治疗至肿瘤，优选固体肿瘤。在此实施方式中，在磁性纳米颗粒负载细菌已到达肿瘤后，在肿瘤附近施加交变磁场，导致磁性纳米颗粒负载细菌产热。这种热治疗引致肿瘤细胞和/或肿瘤(一个或多个)部分或全部破坏。由于肿瘤细胞比健康细胞对热更加敏感(参见，例如：Overgaard等.，Cancer，1977，39，2637-2646)，本公开描述的热疗可选择性地破坏肿瘤细胞。因此，在具体实施方式中，治疗方法包括如下步骤

i)使根据第一方面的包括磁性纳米颗粒的细菌靶向至肿瘤，和

ii)在肿瘤周围或邻近施加交变磁场。

术语“交变磁场”或“振荡磁场”，如本文所用，指代强度随时间变化的磁场。在一个实施方式中，治疗期间施加的交变磁场的特征在于频率处于约50k Hz和约1000k Hz之间，优选约100k Hz和约500k Hz之间，更优选约100kHz和约200k Hz之间。

在另一实施方式中，磁场的特征在于强度处于约0.1mT和约200mT之间，优选约1mT和约100mT之间，更优选约10mT和约60mT之间，一般在约10mT和约50mT之间。

磁场强度的最大值通过其对生物体有毒时(即，基本上是在其生成Foucault电流时)的数值来确定。可能的是，强度高于200mT的磁场可用于治疗(如果其显示无毒)。

在另一实施方式中，本发明的方法的特征在于施加磁场的时长。该时长可在约1秒和约6小时之间，优选约1分钟和约1小时之间，优选0.5和30分钟之间，最优选1分钟和30分钟之间。

热治疗优选地被施加至已麻醉的患者。因此，实施治疗的时间可等于或小于麻醉的时长。因此热治疗可以有可能在长于6小时期间实施——例如，如果患者在长于6小时期间被麻醉。

在另一实施方式中，本发明的方法的特征在于治疗过程中所用的磁性纳米颗粒联合型细菌的数量。该磁性纳米颗粒联合型细菌数量与细菌的磁性纳米颗粒负载和纳米颗粒的磁性材料负载有关。该数量通过测量被给予的磁性纳米颗粒联合型细菌悬浮液中存在的磁性材料量来估测。需要注入的磁性纳米颗粒联合型细菌数量基本上取决于被治疗肿瘤的体积，治疗期间所需的温度和注入方法。最大肿瘤体积和最高肿瘤温度需要最大给予量的磁性纳米颗粒联合型细菌。

在另一实施方式中，磁性纳米颗粒联合型细菌的悬浮液浓度一般居于1mg/ml和100mg/ml之间，优选10mg/ml和50mg/m之间1，其中该浓度代表悬浮液中包含的磁性材料(优选氧化铁，更优选磁赤铁矿)的数量。

在另一实施方式中，反复给予磁性纳米颗粒联合型细菌至对象。反复次数取决于一次(at once)给予的磁性纳米颗粒联合型细菌的数量。如果一次仅给予少量磁性纳米颗粒联合型细菌，则给予步骤可反复多次，直到期望量的磁性纳米颗粒联合型细菌被给予患者。

在另一实施方式中，通过施加交变磁场开始的热治疗反复进行。在给予给定量磁性纳米颗粒联合型细菌后施加的相继热治疗被称为热循环。

用于每个热循环的给定量的磁性纳米颗粒联合型细菌可如上所述通过单次给药或通过多次相继给药被给予。热循环内的不同热治疗通过休息时间彼此间隔。休息时间可等于1秒或长于1秒，优选等于1分钟或长于1分钟，更优选等于10分钟或长于10分钟，优选等于或长于30分钟。

在实施方式中，热循环内的不同热治疗通过长于上述的休息时间彼此间隔开。该休息时间可居于1天和15天之间。

在实施方式中，热循环反复1至648000次，具体地1至101000次，更具体地1至100次，一般是1至10次。通过假设治疗在15天内实施很短时间(一般约1秒)并且休息时间很短(一般每次治疗间隔约1秒休息时间)，估测最高反复速率为648 000次。治疗反复次数取决于治疗时长。优先地，治疗越长，需要的反复越少，条件是其他治疗参数(如施加磁场的强度和或频率)固定。

磁能至热消融的转化已被广泛证实导致空间和时间受到控制的药物递送——取决于被施加高频磁场的‘开-关’操作(J.Liu，Y.Zhang，C.Wang，R.Xu，Z.Chen，N.Gu，J.Phys.Chem.C 114(2010)7673-7679)。作为实例，具有聚合物聚乙烯醇(PVA)和普朗尼克F68中的布洛芬(ibuprofen)以及二氧化硅薄层的磁铁矿纳米颗粒呈现快速的磁触发性药物释放行为(S.H.Hu，Y.Y.Chen，T.C.Liu，T.H.Tung，D.M.Liu，S.Y.Chen，Chem.Commun.47(2011)1776-1778)。因此，在另一实施方式中，包括磁性纳米颗粒的本发明细菌进一步包括可用于治疗癌症的治疗剂。在一个实施方式中，在载体上编码的该剂能够表达编码所述剂的至少一种外源基因。在此实施方式中，用该载体转化本发明的细菌。在进一步的实施方式中，该剂被连接至本发明的细菌。该剂可被连接、键合、固定或化学偶联或附着至本发明的细菌或细菌膜，或通过技术人员已知的任何其它手段被附着/连接。在进一步实施方式中，该剂被连接至金属纳米颗粒或被封装在金属纳米颗粒中。连接该剂至金属纳米颗粒或封装该剂到金属纳米颗粒中的方法将取决于该剂的性质，并且为本领域技术人员已知。

术语“可用于治疗癌症的治疗剂”，如本文所用，指代适用于治疗癌症的剂，如细胞毒性剂、抗血管生成剂或抗转移剂。

可用于根据用于治疗癌症的本发明治疗方法的这种实施方式的细胞毒性剂包括但不限于蒽环类抗生素如多柔比星(doxorubicin)和道诺霉素(daunorubicin)、紫杉烷类如紫杉醇(Taxol^TM)和多西紫杉醇(docetaxel)、长春花生物碱类如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、伊立替康(irinotecan)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素C、奥沙利铂(oxaliplatin)、雷替曲塞(raltitrexed)、他莫昔芬(tamoxifen)、顺铂、卡铂、氨甲喋呤(methotrexate)、放线菌素D、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(blenoxane)或光辉霉素(mithramycin)。可与本发明抗体组合用于治疗癌症的抗血管生成剂包括但不限于选自下列的抗血管生成剂：紫杉醇(paclitaxel)、2-甲氧基雌二醇、普啉司他(prinomastat)、巴马司他(batimastat)、BAY12-9566、羧基酰胺三唑、CC-1088、右美沙芬乙酸(dextromethorphan acetic acid)、二甲基氧杂蒽酮乙酸、内皮抑素(endostatin)、IM-862、马立马司他(marimastat)、青霉胺、PTK787/ZK 222584、RPI.4610、乳酸角鲨胺、SU5416、沙利度胺(thalidomide)、考布他汀(combretastatin)、他莫昔芬、COL-3、尼华斯他(neovastat)、BMS-275291、SU6668、抗VEGF抗体、Medi-522(Vitaxin II)、CAI、白介素12、IM862、阿米洛利(amiloride)、血管抑素(angiostatin)、K1-3血管抑素、K1-5血管抑素、卡托普利(Captopril)、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、DL-α-二氟甲基鸟氨酸HCl、内皮抑素、烟曲霉素(fumagillin)、除莠霉素A(herbimycinA)、4-羟基苯基视黄酰胺、胡桃醌(juglone)、层粘连蛋白(laminin)、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、薰草菌素A(lavendustin A)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、米诺环素(minocycline)、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明(suramin)、血小板反应素、针对促血管生成因子的抗体(例如、阿瓦斯丁(Avastin)、爱必妥(Erbitux)、维克替比(Vectibix)、赫赛汀(Herceptin))；促血管生长因子的低分子量酪氨酸激酶抑制剂(例如、特罗凯(Tarceva)、多吉美(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、易瑞沙(Iressa))；mTOR抑制剂(例如、驮瑞塞尔(Torisel))；干扰素α、β和γ、IL-12、基质金属蛋白酶抑制剂(例如、COL3、马立马司他、巴马司他)；ZD6474、SUl1248、vitaxin；PDGFR抑制剂(例如、格列卫(Gleevec))；NM3和2-ME2；环肽，如西仑吉肽(cilengitide)。可与本发明抗体组合用于治疗癌症的抗转移剂包括但不限于任何能够充当抗转移剂的剂，如烷化剂；抗代谢剂，如5-氟尿嘧啶、培美曲塞(pemetrexed、MTA)、雷替曲塞(TDX)；铂类细胞毒性剂，如顺铂或奥沙利铂；拓扑异构酶抑制剂；抗微管剂；蒽环类；植物生物碱类；GTP酶抑制剂；血管生成抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；细胞周期调节激酶抑制剂，如周期蛋白依赖性激酶和周期蛋白抑制剂；Wnt信号传导抑制剂；E2F转录因子抑制剂；组蛋白去乙酰酶抑制剂；AKT激酶或ATP酶抑制剂。

非治疗方法

在胃pH条件下稳定的金属纳米颗粒和乳酸细菌或双歧杆菌之间的联合由于肠道内相对高pH值被破坏。这导致金属纳米颗粒在肠道中释放(实施例2)。此外，与乳酸细菌或双歧杆菌联合的不同金属，如钙或锌，也在胃和肠道条件下被释放(实施例2，图6和7)。因此，本发明的细菌在被口服给予时可用于在对象肠道中递送目标化合物。

因此，另一方面，本发明还涉及在对象肠道中递送金属的非治疗方法，包括口服给予第一方面所述的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物。

术语“非治疗方法”，如本文所用，指代如下对对象进行的过程、行为、应用或类似形式：(i)不涉及直接或间接改善所述对象的状况或疾病、或减缓状况或疾病的进程、或减轻状况或疾病的一种或多种症状；和(ii)不涉及延迟障碍或疾病的发作、或根本上预防个体罹患障碍或疾病。

因此，根据本发明非治疗方法的对象未患有金属缺乏相关的疾病或状况或可通过给予本发明的细菌或培养物治疗的任何其他疾病或状况，并且没有增加的罹患所述疾病的风险。

术语“金属”和“口服给予”已在前文连同本发明的治疗方法一起被限定。

术语“肠道”或“肠”，如本文所用，指代从胃幽门括约肌至肛门的消化道部分。术语肠道包括小肠(其进而包括十二指肠、空肠和回肠)和大肠(包括盲肠和结肠)。

成像剂和成像方法

本发明的细菌能够基于成像方法如磁共振来造影消化道(实施例4)。因此，另一方面，本发明涉及造影剂，其包括根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其生物纯培养物，其中金属被包含在磁性纳米颗粒中。

术语“成像剂”和“造影剂”在本文中可互换使用，指代其使用通过增加图像那些不同区域之间的″对比″有助于区别图像不同部分的生物相容性化合物。优选地，造影剂是磁共振图像(MRI)的造影剂。磁共振成像造影剂包括钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物和铁颗粒。MRI造影剂可包括选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)的金属的复合物。

在具体实施方式中，造影剂包括包含金属纳米颗粒的细菌，该金属纳米颗粒包括铁，更优选氧化铁，还更优选磁赤铁矿。

在另一实施方式中，本发明涉及根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其培养物作为磁共振成像造影剂的应用。

在具体实施方式中，根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其培养物可被口服或静脉内给予，用于其作为磁共振成像造影剂的应用。

术语“磁共振成像”或“MRI”，如本文所用，指代最常用于放射学以可视化身体结构和功能的医学成像技术。其提供身体任何平面的详细图像。MRI不应用电离辐射，但应用强大磁场来对齐体内水中的(通常)氢原子的核磁化。射频场用于全身性改变这种磁化的对齐，导致氢核产生通过扫描仪可测的旋转磁场。这种信号可通过另外的磁场来调控，建立足够的信息以构建身体图像。当对象平躺于扫描仪中时，在动物体内水分子中发现的大量氢核(即，质子)与强主磁场对齐。然后，在射频下振荡并且垂直于主场的第二电磁场被脉冲，从而将一定比例的质子推离与主场的对齐。这些质子然后漂回与主场对齐，在其这样做时发射可检测的射频信号。由于身体不同组织(例如，脂肪与肌肉)中的质子以不同速度重新对齐，可揭示身体的不同结构。造影剂可被静脉内注入以增强血管、肿瘤或炎症的表观。MRI用于成像身体的每个部分，但特别有效用于神经系统状况、肌肉和关节的障碍，以评价肿瘤和显示心脏和血管异常。

根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌可用作实质上身体任何部分的磁共振成像造影剂。不意图束缚于任何具体理论，据报道乳酸细菌和双歧杆菌被低氧肿瘤环境吸引，并且因此这些细菌特别有效用于实体肿瘤的成像。

在具体实施方式中，根据第一方面的细菌或通过第三方面的方法可获得的细菌或其培养物用作消化道的磁共振成像造影剂。术语“消化道”，如本文所用，指代从口至肛门的长曲折管中包括的一系列中空器官。消化道包括口、食管、胃、小肠、大肠或结肠和直肠。

在另一实施方式中，本发明涉及对象消化道的磁共振成像方法，其包括：

(i)口服给予所述对象根据第一方面的细菌、通过第三方面的方法可获得的细菌、其培养物或根据本发明的造影剂，其中金属被包含在纳米颗粒中，和

(ii)检测对象消化道中的金属纳米颗粒。

术语“磁共振成像”、“消化道”、“对象”、“口服给予”已在前文被限定。

检测对象消化道中的金属纳米颗粒的步骤可由本领域技术人员(优选专业特许人员(specialized facultative)或技术人员)通过利用RMI设备扫描来进行。

可通过本发明的成像方法造影的消化道部分取决于口服给予本发明的细菌或培养物和通过扫描对象消化道检测金属纳米颗粒之间消逝的时间。因此，在磁共振成像方法的一个实施方式中，扫描在口服给予后1至5小时之间进行，优选口服给予后3小时，从而使胃成像，或口服给予后6至24小时之间，优选口服给予后24小时，从而使肠道成像。

通过下列实施例描述本发明，实施例仅具有示例性，而对本发明的范围无限制性。

实施例1

室温下的人工磁性细菌作为纳米磁体

材料和方法

制备具有磁赤铁矿纳米颗粒的细菌

制备细菌培养物，将其保持在37℃，并搅动24h。然后将细菌培养物保存在冰上以使细菌冷却，通过在100g下离心收集细菌，并600nm下的光密度，取得1×10⁹cfu/ml。将细菌小心地重悬浮于1ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液(174.02g的CaCl2·2H2O和203.02g的MgCl2·6H2O，并且将其溶解于1L蒸馏水)中，以洗去全部杂质，并以3000g，10min收集细菌。然后，将管保持倒置1min，以排去水，然后将pH 2的磁赤铁矿纳米颗粒(0.95M)的66.6μl溶液与细菌混合。将混合物用水补至1ml，并通过以100g离心20min收集细菌，以去除多余离子。

根据Massart法(Massart，R.IEEE Trans.Magn.1981，1247-1248)，通过以0.5的化学计量共沉淀Fe(II)和Fe(III)盐，制备磁赤铁矿纳米颗粒。通过调节pH(12和11分别用于4和6nm)和离子强度(2和1M NaNO3分别用于4和6nm)，可控制所得磁铁矿纳米颗粒的尺寸(Vayssieres，L.；Chaneac，C.；Tronc，E.；Jolivet，J.P.J.Colloid Interface Sci.1998，205，205-212)。利用氩气将所有溶液小心地脱氧。氧化后，获得在pH 2下稳定的磁赤铁矿纳米颗粒的胶体。

结果

在此，发明人报告了通过在作为革兰氏阳性双歧杆菌表面的生物平台上沉积磁性纳米颗粒来合成人工磁性细菌的简单且有效的方法。细菌外表面的负电荷和纳米颗粒的正电荷允许相互作用。这种静电相互作用的可能性可需要存在EPS生物膜。更值得注意的是，还显示通过外磁场定向和控制形成的人工磁性细菌也是可以的。此外，磁性定向在室温下进行——设想在不同的记录磁性装置中多元化和互动应用的事实。方法涉及温和条件，并且可被调整以适于大规模制造，允许生产更低廉、更环境友好的部件用于未来装置。

沉积由阳性磁赤铁矿纳米颗粒(8nm尺寸)和双歧杆菌的整个外部表面之间存在的静电相互作用驱动。物理相互作用通过改变磁赤铁矿纳米颗粒表面的电荷来控制，使得磁赤铁矿纳米颗粒到双歧杆菌的吸附水平显示独特的并且高度可控的附着水平。图1显示颗粒密度分布作为磁性纳米颗粒表面电荷的函数。可见，阳性磁赤铁矿纳米颗粒选择性地附着至肽聚糖外壳(a)而阴性者不显示沉积亲和力(b)。

在如下情况时观察到最有利的条件：将在MRS介质中的短双歧杆菌与8-nm尺寸的磁赤铁矿纳米颗粒在pH 2下一起温育，以提供红色均质溶液，将该红色均质溶液离心和用NaCl溶液洗涤5次。通过透射电镜(TEM)考察溶液。由该材料获得的一般图像显示离散的电子致密核，其具有常规的形状和尺寸(图2)。

平均直径经统计学测量为8±0.5nm。能量色散谱仪确认颗粒包含Fe，颗粒外检测不到Fe。

磁性纳米颗粒的大规模积累发生在细菌外壳上，形如葡萄干布丁，其中磁性纳米颗粒是带正电的″葡萄干″，其被肽聚糖网络形成的带负电的″布丁″围绕。

通过磁赤铁矿纳米颗粒标记的细菌容易分散在水中，形成暗红色溶液。离心然后洗涤没有将纳米颗粒从细菌表面去除，表明纳米颗粒和肽聚糖网络之间相互作用强。磁性细菌容易在低磁场中定向，并且可通过小型永久磁体从溶液去除(图3)。在室温下低磁场中的定向是预料不到的，因为已显示只有大于20nm的磁赤铁矿纳米颗粒通过适度磁性梯度从溶液中被吸引。磁性细菌在室温下表现如同磁体的事实表明：由于肽聚糖外壳处纳米颗粒大规模积累和其之间短距离造成的偶极-偶极相互作用，导致存在长磁序。在这个意义上说，令人关注地观察到，磁体应用后获得的仅包含磁赤铁矿纳米颗粒的底部黄色溶液(图3b)不随外磁场施加而移动，即，8nm磁赤铁矿纳米颗粒不被永久磁体吸引。

此外，磁分离后获得的底部黄色溶液(图3b)不含细菌。这证明i)所有细菌均标记有磁性纳米颗粒，ii)细菌充当8nm尺寸磁赤铁矿纳米颗粒之间的长磁序发生的生物平台。

由于这些磁性细菌可在室温下在存在梯度低磁场的情况下移动，通过施加外磁场至沉积在不同基底上的一滴人工磁性细菌测试了磁定向膜的形成。为可视化磁性细菌，将这些细菌之前用常用于标记活细菌的荧光染料SYTO9(绿色)标记。作为实例，图4显示适度永久磁体对沉积在聚赖氨酸玻璃上的人工磁性细菌的效果。

荧光人工磁性细菌在室温下表现如磁体，并且与外磁场线对齐，造成磁性细菌的纳米结构组织化，其中通过外部输入(磁场)控制纳米对象的定位和定向。

总而言之，本发明证明了制备人工磁性细菌的可能性和控制这些纳米对象在室温下的磁定向的可能性。这个步骤在这种系统在记录磁性装置中的应用中至关重要。

实施例2

铁、钙和锌递送研究

材料和方法s

具有矿物质的细菌(根据Sambrook J，Russell DW(2001).Molecular cloning：A laboratory manual.3rd ed.Cold Spring Harbor(NY)：Cold Spring Harbor Laboratory Press.132-150)

制备四种不同类型的一批样本：a)只有细菌(对照)，b)具有钙的细菌，c)具有钙和锌的细菌，和最后d)具有钙、锌和铁的细菌。

大体程序如下：

1.测量24小时发酵乳杆菌培养物的O.D.₆₀₀以收集2×10⁹个细胞/ml。

2.通过将管在冰上保存10分钟来冷却培养物至0℃。

3.在4℃下通过以3000g离心20分钟回收细胞。

4.从细胞团滗析介质。将管倒置在纸巾垫上1分钟，以允许最后痕量介质被吸走。

5.通过旋流或轻柔涡流在1ml冰冷MgCl₂-CaCl₂溶液(174.02g的CaCl₂·2H₂O和203.02g的MgCl₂·6H₂O，并将其溶于1L蒸馏水)中重悬浮各细胞团。

6.在4℃下通过以3000g离心20分钟回收细菌。

7.从细胞团滗析介质。将管倒置在纸巾垫上1分钟，以允许最后微量介质被吸走。

8.通过旋流或轻柔涡流在1ml冰冷0.5M CaCl₂中重悬浮各细胞团。

9.添加5μlZn(NO₃)₂·4H₂O(1M)。

10.在4℃下通过以3000g离心20分钟回收细菌。

11.添加100μl磁赤铁矿纳米颗粒(0.95M，pH 2-5)至分离的细胞团。

注1：在制备只有细菌的对照(对照)时，在步骤7后，通过旋流或轻柔涡流在1ml蒸馏水中重悬浮细胞团，然后跳至步骤11。

注2：在制备只有CaCl₂的细菌时，删除步骤9和10。

注3：在制备具有CaCl₂和锌的细菌时，删除步骤11。

注4：在制备具有CaCl₂、锌和铁的细菌时，添加矿物质遵循的顺序是钙，锌和铁。

12.将管转移至布置在预热42℃循环水浴中的支架。将管在支架中保存精确90秒。不晃动管。

13.将管快速转移至冰浴。使细菌冷却1-2分钟。

14.在4℃下通过以3000g离心20分钟回收细菌。

15.将细菌在蒸馏水中洗涤两次。

将所得细菌样本在胃液和胃肠液中在37℃下培育，伴以持续搅动(170rpm)。每小时采集1ml样本，在胃液模拟的情况下完成6小时，并且在胃肠液模拟的情况下完成4小时。通过原子吸收和ICP(电感耦合等离子体质谱法)分析金属释放。

模拟胃液组合物：模拟胃液通过如下制备：将胃蛋白酶(0.01g)、胃粘蛋白(0.015g)和NaCl(0.088g)溶于10ml蒸馏水，并用1M HCl将pH调节为1.3。

反应池中的样本的最终组成因此为1mg/ml胃蛋白酶、1.5mg/ml胃粘蛋白和8.8mg/ml Nacl(0.15mM)。

模拟胃肠液组合物：模拟胃肠液通过如下制备：将胆汁提取物(0.05g)、脂酶(0.016g)和CaCl2(0.007g)溶于10ml蒸馏水，并用1M HCl或NaOH将pH调节为7.0。

反应池中的样本的最终组成因此为5mg/ml胆汁提取物、1.6mg/ml脂酶、5mMCaCl₂。

结果

将用磁赤铁矿特别制备的发酵乳杆菌样本(M1-M18)置于包含适当模拟胃液和肠液的适当容器中，并在37℃下温育，伴以持续搅拌。在下列时间采集样本：0、1、2、3、4、5和6小时。将样本离心，以滗析细菌，并取900μl上清液用于分析。结果显示在胃条件下小规模的Fe释放。释放在结肠条件下明显较高，并且大部分在第一个小时内发生(图5)。

遵照相同的方案，在存在和不存在磁性纳米颗粒的情况下分析钙和锌金属释放(图6和7)。

实施例3

细菌表面上的金属掺并

材料和方法

扫描电镜(SEM)研究表面精细结构的最有效的技术之一。通过利用与能量色散X射线分析仪(EDX)X-Max 50mm偶联的Zeiss SUPRA40VP扫描电镜来记录SEM图像。EDX是用于元素分析或化学表征的分析技术。通过电弧放电法用碳涂覆样本，以用于SEM-EDX。

结果

利用能量色散X射线光谱确定个体细菌表面的元素组成。图8a的SEM图像显示与Ca²⁺一起温育后的细菌。EDX光谱显示Ca的3.8eV特征Kα峰，表示10重量％左右的值(图8b)。

图9a的SEM图像显示与磁赤铁矿和Ca²⁺一起温育后的细菌。EDX光谱分别显示Fe和Ca的6.2eV和3.8eV特征Kα峰(图9b)。铁显示20重量％左右的值，而钙的百分比为10％。

实施例4

包含磁赤铁矿纳米颗粒的细菌作为口服MRI造影剂

材料和方法

利用在200MHz下运行并且装备有33cm孔磁体(Oxford Ltd.，UK)的4.7TBiospecTomograph系统(Bruker，Karlsruhe，德国)进行MRI测定。

体内实验

在体内实验中，使用重约20g的正常Balb-c小鼠。口服给予不同Fe剂量的造影剂。

结果

MRI是人多种疾病的最有效的非侵入性诊断方式之一。

对在磁赤铁矿纳米颗粒已被标记后在造影细菌的MRI图像中的效力进行测试。该系统的主要优点如下：

1.细菌充当超顺磁性磁赤铁矿纳米颗粒的口服载体。

2.细菌不在胃处递送磁赤铁矿纳米颗粒，因此，可采集MRI图像(图10)。细菌上颗粒饱和水平或细菌量的控制对于最佳MRI获取而言是必要的。

3.细菌随着pH升高释放磁赤铁矿纳米颗粒，因此这些颗粒的递送发生在其沿肠道经过(trip)期间(图11)。

Claims (30)

1.细菌，其选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌，包括结合于其表面的至少一种金属纳米颗粒，其中所述金属纳米颗粒具有表面正电荷，并且其中

具有表面正电荷的所述金属纳米颗粒是磁性纳米颗粒，

或

具有表面正电荷的所述金属纳米颗粒的金属是氧化物形式。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述金属纳米颗粒包括选自下列的金属：铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述金属氧化物是氧化铁。

4.根据权利要求3所述的细菌，其中所述氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，进一步包括不同于所述纳米颗粒中包括的所述金属的至少一种另外的金属。

6.根据权利要求5所述的细菌，其中所述至少一种另外的金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。

7.根据权利要求6所述的细菌，其中所述纳米颗粒包括氧化铁，并且其中所述至少一种另外的金属选自钙、锌、硒或其组合。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，其中所述纳米颗粒具有2和50nm之间的尺寸。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，其中所述乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌，并且所述双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、幼儿双歧杆菌和动物双歧杆菌。

10.获得选自乳酸细菌和双歧杆菌属细菌的、包括结合于其表面的至少一种金属的细菌的方法，其中所述金属被包含在纳米颗粒中并且

其中所述纳米颗粒是磁性纳米颗粒，

或

所述纳米颗粒中包含的所述金属是氧化物形式，

所述方法包括使所述细菌与至少所述金属接触，其中所述接触在存在至少一种二价阳离子盐的情况下和在其中所述细菌的生长相对于所述细菌在其最佳生长温度下的生长减少至少50％的温度下和在所述纳米颗粒具有正表面静电电荷的pH下进行。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述金属选自铁、锰、钴、镍、钙、锌、镁、钾、铜、铬、硒、硅、碘及其组合。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述金属氧化物是氧化铁。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述氧化铁选自磁赤铁矿、磁铁矿、赤铁矿、针铁矿和水铁矿。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒具有2和50nm之间的尺寸。

15.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，包括使所述细菌与纳米颗粒中包括的第一金属在所述纳米颗粒具有正表面静电电荷的pH下接触，和使之与至少一种另外的金属接触，其中所述第一金属与所述至少一种另外的金属不同。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一金属是磁赤铁矿，并且所述另外的金属是钙和锌的组合。

17.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述乳酸细菌选自发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、胚牙乳杆菌、唾液乳杆菌和保加利亚乳杆菌，并且所述双歧杆菌属细菌选自短双歧杆菌、长双歧杆菌、幼儿双歧杆菌和动物双歧杆菌。

18.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述二价阳离子盐选自钙盐、镁盐及其组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述二价阳离子盐选自氯化钙、氯化镁及其组合。

20.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述细菌和所述金属之间的所述接触在0℃和10℃之间包括的温度下进行。

21.通过根据权利要求10至20中任一项所述的方法可获得的细菌。

22.生物培养物，其中根据权利要求1至9中任一项所述的细菌或根据权利要求21所述的细菌以95％或更高的比例存在。

23.食品，包括根据权利要求1至9中任一项所述的细菌或根据权利要求21所述的细菌或根据权利要求22所述的生物培养物。

24.药物组合物，包括根据权利要求1至9中任一项所述的细菌或根据权利要求21所述的细菌或根据权利要求22所述的生物培养物和药学上可接受的载体。

25.选自根据权利要求1至9所述的细菌和根据权利要求21所述的细菌的细菌或根据权利要求22所述的生物培养物用于制备治疗和/或预防与金属缺乏相关的状况的药物的应用，其中所述细菌包括所述状况缺乏的金属，并且其中所述细菌或培养物被口服给予。

26.根据权利要求25所述的细菌或其生物培养物的应用，其中所述与金属缺乏相关的状况选自与铁缺乏相关的状况、与锰缺乏相关的状况、与钴缺乏相关的状况、与镍缺乏相关的状况、与钙缺乏相关的状况、与锌缺乏相关的状况、与镁缺乏相关的状况、与钾缺乏相关的状况、与铜缺乏相关的状况、与铬缺乏相关的状况、与硒缺乏相关的状况、与硅缺乏相关的状况和与碘缺乏相关的状况。

27.选自根据权利要求1至9所述的细菌和根据权利要求21所述的细菌的细菌、或根据权利要求22所述的生物培养物用于制备癌症治疗药物的应用，其中所述金属被包含在磁性纳米颗粒中。

28.根据权利要求27所述的细菌或生物培养物的应用，其中所述癌症是胃肠道癌。

29.用于在对象肠道中递送金属的非治疗方法，包括口服给予根据权利要求1至9中任一项所述的细菌或根据权利要求21所述的细菌或根据权利要求22所述的生物培养物。

30.造影剂，包括根据权利要求1至9中任一项所述的细菌或根据权利要求21所述的细菌或根据权利要求22所述的生物培养物。