JP4646514B2 - Hcvポリメラーゼ阻害剤を特定する競合的結合アッセイ - Google Patents

Hcvポリメラーゼ阻害剤を特定する競合的結合アッセイ Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
発明の分野
本発明は一般にHCVのRNA依存RNAポリメラーゼの阻害剤を特定する方法に関する。特に、本方法は競合アッセイで新規なプローブを用いてHCVポリメラーゼ阻害剤を特定しさらに前記阻害剤の能力を決定する。より具体的には、本発明は、前記ポリメラーゼと特異的に結合し、さらに前記酵素の阻害剤で置き換えることができるプローブの使用に関する。
発明の背景
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界的に蔓延している輸血後および集団罹患性非A非B型肝炎の主要な疫学因子である。概算では世界中で2億人が本ウイルスに感染している。保菌者は高い比率で慢性感染を示し、多くは慢性肝疾患(いわゆるC型慢性肝炎)に移行する。このグループは高リスクで順次重篤な肝疾患、例えば肝硬変、肝細胞癌、および死に至る末期肝疾患に向かう。HCVがウイルス存続を確立させ、高率で慢性肝疾患を惹起するメカニズムは完全には解明されていない。どのようにしてHCVがホストの免疫系と相互作用し、これから逃れるかは明らかではない。
HCVはフラビウイルス科(Flaviviridae)のエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスである。一本鎖のHCVRNAゲノムはプラスの極性を有し、長さが約9600のヌクレオチドをもつ1つの開放読み枠を含む。前記ヌクレオチドは約3010個のアミノ酸を含む直鎖状のポリプロテインをコードする。感染細胞では、前記ポリプロテインは多数の部位で細胞性およびウイルス性プロテアーゼで切断され、構造タンパク質および非構造(NS)タンパク質を生じる。前記構造タンパク質(C、E1、E2およびE2−p7)は、ウイルス粒子を構成するポリペプチドを含む(M. Hijikata et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:5547-5551; A. Grakoui et al., 1993(a), J. Virol. 67:1385-1395)。前記非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)は、HCVRNAゲノムの複製を触媒および調節する酵素または補助因子をコードする。構造タンパク質のプロセッシングはホスト細胞のプロテアーゼによって触媒される(Hijikata et al., 1991, 上掲書)。成熟した非構造タンパク質の生成はウイルスによりコードされる2つのプロテアーゼによって触媒される。第一のプロテアーゼはNS2/3亜鉛依存メタロプロテアーゼであり、前記はポリプロテインからNS3タンパク質の遊離を自家触媒する。遊離されたNS3はN−末端セリンプロテアーゼドメインを含み(A. Grakoui et al., 1993(b), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10583-7: M. Hijikata et al., 1993, J. Virol. 67:4665-4675)、前記ポリプロテインから残りの切断を触媒する。遊離されるNS4Aタンパク質は少なくとも2つの役割を有する。第一に、NS3タンパク質との安定な複合体を形成してNS3/NS4A複合体の膜局在を促進し(Kim et al., 1999, Arch. Virol. 144:329-343)、第二には、NS3プロテアーゼ活性のための補助因子として機能する。前記の膜結合複合体は順にポリプロテインの残りの部位の切断を触媒し、したがってNS4B、NS5AおよびNS5Bの遊離を達成する(R. Bartenschlager et al., 1993, J. Virol., 67:3835-3844; Grakoui et al., 1993(a) 上掲書;Hijikata et al., 1993上掲書;R.A. Love et al., 1996, Cell, 87:331-342; A.D. Kwong et al., 1998, Antivairal Res., 40:1-18)。NS3タンパク質のC−末端セグメントにはまたヌクレオシドトリホスファターゼおよびRNAヘリカーゼ活性が存在する(D.W. Kim et al., 1995, biochem. Biophys. Res. Comm., 215:160-166)。タンパク質NS4Bの機能は明らかではない。NS5A(高度にリン酸化されているタンパク質)は、種々のHCV遺伝子型のインターフェロン耐性に必要であるらしい(Gale Jr. et al., 1997, Virology 230:217; Reed et al., 1997, J. Virol. 71:7187)。NS5Bは、HCVの複製に必要なRNA依存RNAポリメラーゼ(RdRp)である。
HCVRNA複製メカニズムの更なる理解および適切なin vitro系の開発のために、NS5Bタンパク質の生化学的分析が実施された。完全長NS5Bが作製され、非融合タンパク質としてリコンビナントバキュロウイルス感染昆虫細胞から(S.-E. Behrens et al., 1996, EMBO J., 15:12-22; R. de Francesco et al., 1996, Methods Enzymol., 275:58-67)、または昆虫細胞(V. Lohmann et al., 1997, J. Virol., 71:8416-8428; V. Lohmann et al., 1998, Virology, 249:108-118)および大腸菌(Z.-H. Yuan et al., 1997, BBRC 232:231-235)の両方からタグ付加タンパク質として精製された。in vitroでは、リコンビナントNS5BのRdRp活性はRNA鋳型に依存し、プライマーとしてRNAまたはDNAを必要とする(S.-E. Behrens et al., 1996, EMBO J. 15:12-22; V. Lohmann et al., 1997, J. Virol., 71:8416-8428)。異種ポリマー配列で構成されたRNA鋳型では、鋳型の3’−OHがプライマーとして用いられ、伸長は“スナップ−バック”メカニズムにより進行し、鋳型とRNA生成物が共有結合で連結された二本鎖分子が得られる(S.-E. Behrens et al., 1996, EMBO J. 15:12-22; V. Lohmann et al., 1998, Virology, 249:108-118; G. Luo et al., 2000, J. Virol. 74:851-863)。最近になって、いくつかのグループがまた、HCVNS5Bタンパク質はRNA合成をde novoで開始させることができることを示した(J. Oh et al., 1999, J. Virol. 73:7694-7702; X. Sun et al., 2000, BBRC 268:798-803; W. Zhong et al., 2000, J. Virol. 74:2017-2022)。
NS5BのRdRpは結晶化されて、他の核酸ポリメラーゼを連想させる構造が明らかにされた(S. Bressaneili et al., 1999, PNAS USA 96:13034-13039; H. Ago et al., 1999, Structure 7:1417-1426; C.A. Lesburg et al., 1999, Nature Struct. Biol., 6:937-943)。HCVポリメラーゼと細胞ポリメラーゼとの間の相違を包括的に理解することによって、HCV複製に特異的な阻害剤の考案が促進されるであろう。カイネティクスに関する詳細な情報もまた、NS5Bにより触媒されるヌクレオチド取り込みの分子的基礎およびそれに続く阻害剤の機械的特性の理解に役立つであろう。
以前の研究では(S.-E. Behrens et al., 1996, EMBO J. 15:12-22; R. de Francesco et al., 1996, Methods Enzymol. 275:58-67; V. Lohmann et al., 1997, J. Virol. 71:8416-8428; V. Lohmann et al., 1998, Virology 249:108-118)、触媒能力を有するポリメラーゼRNA複合体の割合に関する情報はほとんど提供されなかった。最近のいくつかの研究では、HCVのNS5B誘導RNA複製のための鋳型とプライマーの要件が調べられた。二次構造に束縛されない自由な3’−末端をもつ鋳型および長さが2または3ヌクレオチドの短いプライマーが効率的なRNA合成の開始に好ましいことが判明した(W. Zhong et al., 2000, J. Virol. 74:9134-9143)。de novoのRNA合成開始では、しかしながらNS5Bは安定な二次構造をもつ鋳型および少なくとも1つの3’−シチジレートを含む一本鎖配列を必要とする。
ウイルスポリメラーゼはウイルスの複製を治療の目的で阻害するための重要な標的である。新規な抗ウイルス剤の発見は、しばしば多数のサンプルをin vitroまたはin vivoアッセイのいずれかを用いて標的活性の阻害についてスクリーニングすることが必要である。一般に、ポリメラーゼは、3H、α−32Pまたはα−33P標識モノヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチド生成物への取り込みをモニターすることによって、または5’−末端標識プライマーの伸長によってアッセイされる。伸長プライマーに取り込まれた生成物は一般的なフィルターアッセイ、酸沈澱または変性ゲル電気泳動によって捕捉または分離される。
HCVNS5BポリメラーゼはHCV複製阻害剤の探索では第一の標的である。HCVポリメラーゼの種々の調製物は種々のRNA基質により多様な生成物産生効率を示す。さらにまた、精製したリコンビナントNS5Bポリメラーゼの活性は、個々のRNA基質により顕著に変動する。さらに、NS5BのRNAポリメラーゼ活性はin vitroではイオン強度に極めて高い感受性を示し、100mMを越える塩濃度は反応を阻害する。したがって、種々の塩濃度で阻害剤の性能を決定する能力は、標準的な酵素反応のこの限界のために制限される。さらにまた、従来技術で開示されたHCVポリメラーゼ酵素アッセイは、阻害剤の能力の代表的な測定値としてIC50を提供する。RNAまたはNTPのいずれかと競合する阻害剤の場合、IC50値はアッセイ中の基質の濃度に比例し、これらの成分の濃度にしたがって変動するであろう。
未だ最適の域に達していない、さらに十分に性状が明らかにされていないRNA基質を用いるHCVポリメラーゼアッセイの前記限界を克服するために、本出願人らは、RNAに依存しない特異的なHCVポリメラーゼ阻害剤を特定するアッセイを開発した。
したがって、本発明の利点は、基質の濃度に無関係に一定の条件下で阻害剤の能力(阻害剤の能力の明瞭な測定値としてKd値で示される)を直接測定することを可能にするアッセイの提供である。
本発明の直接結合アッセイは、RNAの重合に要求される限界範囲を越える塩濃度またはpHレベルの調節に融通がきく。本アッセイタイプは高感度および高処理様式に適している。
本発明のさらに別の利点は、高い親和性でポリメラーゼと結合し、さらに前記酵素の阻害剤で置き換えることができるプローブの提供である。
さらに別の利点は、種々の遺伝子型のHCVポリメラーゼに適用できるアッセイの提供である。
発明の要旨
本発明の第一の特徴では、以下の工程を含む、HCVポリメラーゼと結合する化合物を特定する方法が提供される:
a)前記HCVポリメラーゼまたはその類似体を、HCVポリメラーゼまたはその類似体と結合することができるプローブと接触させて(前記プローブは前記ポリメラーゼの阻害剤で置き換えられることができる)、前記ポリメラーゼと結合した前記プローブを含む複合体を形成し;
b)前記複合体中の前記プローブから放出されるシグナルを測定して基線レベルを確立し;
c)工程a)の生成物とテスト化合物をインキュベートし;
d)前記複合体のシグナルを測定し;さらに
e)工程d)のシグナルと工程b)のシグナルとを比較し;
それによって、前記シグナルの変動が前記テスト化合物と前記ポリメラーゼとの結合を示す。
好ましい特徴の第一の実施態様では、前記プローブは下記式(I)によって表されるプローブの異性体、鏡像体、ジアステレオ異性体または互変異性体から選択される:
Figure 0004646514
式中、AはO、S、N、NR1またはCR1であり、ここでR1はH、(C1-6)アルキルから成る群から選択され、前記アルキルは場合によって以下で置換されてあり:−ハロゲン、OR11、SR11またはN(R122[ここでR11および各R12はそれぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-8)アルキル−Het(前記アリールまたはHetは場合によってR10で置換される)であるか;または両R12は一緒に共有結合しさらにそれら両者が結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する];
点線は単結合または二重結合のどちらかを表し;
2は、H、ハロゲン、R21、OR21、SR21、COOR21、SO2N(R222、N(R222、CON(R222、N(R22)C(O)R22またはN(R22)C(O)N(R22)から選択され[ここでR21および各R22は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルキニル、(C5-7)シクロアルケニル、6もしくは10員アリールまたはHet(前記R21およびR22は場合によってR20で置換される)であるか、または両R22は一緒に結合しそれらが結合している窒素とともに5、6または7員の飽和複素環を形成する];
BはNR3またはCR3であり、ここでR3は、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C6-10)ビシクロアルキル、6もしくは10員アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、または(C1-6)アルキル−Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、ビシクロアルキル、アリール、Het、アルキル−アリールおよびアルキル−Hetは、場合によってハロゲンまたは以下のa)−d)から選択される1つから4つの置換基で置換されるが、ただしAがNではないときはAまたはBの1つはCR1またはCR3であることを条件とし:
a)場合によって以下で置換された(C1-6)アルキル:−OR31もしくはSR31[ここでR31はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetである]、または−N(R322[ここで各R32は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetであるか、または両R32は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する];
b)OR33[ここでR33はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetである];
c)SR34[ここでR34はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetである];および
d)N(R352[ここで各R35はそれぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetであるか、または両R35は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する];
KはNまたはCR4であり、ここでR4はH、ハロゲン、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;またはR4は、OR41またはSR41、COR41またはNR41COR41[ここで各R41は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルである]であるか;またはR4は、NR4243[ここで各R42およびR43は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR42およびR43の両者は、一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する]であり;
LはNまたはCR5であり、ここでR5は上記のR4と同じ定義を有し;
MはNまたはCR7であり、ここでR7は上記のR4と同じ定義を有し;
5はC(Y1)−Zであり、ここでY1はOまたはSであり;
ZはN(R6a)R6またはOR6であり、ここでR6aはHもしくは(C1-6)アルキルまたはNR6162であり[ここでR61およびR62はそれぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;またはR61およびR62の両者は、一緒に共有結合しさらにそれら両者が結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成するか;またはR62はCOOR63であるか(ここでR63は(C1-6)アルキル、(C3-6)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によって6もしくは10員のアリールまたはHetで置換される);またはR62はCOR64であり(ここでR64は、(C1-6)アルキル−(C3-6)シクロアルキル−6もしくは10員アリールまたはHetである)];さらに
6は、H、(C1-6)アルキル、(C3-6)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、6または10員アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、(C1-6)アルキル−Hetから成る群から選択されるか(ここで前記アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、Het、アルキル−アリールまたはアルキル−Hetは全て場合によってR60で置換される);
またはR6は下記式であり;
Figure 0004646514
[式中、R7およびR8は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、(C1-6)アルキル−Hetであるか(ここで前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、(C1-6)アルキル−Hetは場合によってR70で置換される);または、
7およびR8は一緒に共有結合して第二の(C3-7)シクロアルキルまたは、O、NおよびSから選択される1つから4つのへテロ原子をもつ4、5もしくは6員複素環を形成するか;またはZがN(R6a)R6であるときは、R7またはR8のどちらかはR6aと共有結合して窒素含有5または6員複素環を形成する];
2はOまたはSであり;
9は、H、(C1-6アルキル)、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリールまたは(C1-6)アルキル−Hetであるか(前記の全ては場合によってR90で置換される);またはR9は、R7またはR8のどちらかと共有結合して5または6員複素環を形成し;
Qは、6または10員アリール、Het、(C1-6)アルキル−CONH−アリールまたは(C1-6)アルキル−CONH−Het(前記の全ては場合によって下記式:
Figure 0004646514
またはR100で置換される)、またはその塩もしくは誘導体であり;
前記において、Hetは、O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する5もしくは6員複素環、またはO、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子をもつ9もしくは10員複素二環と定義され;さらに
10、R20、R60、R70、R90およびR100は各々以下のように定義され:
−ハロゲン、OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから4つの置換基;または
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、それぞれH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);さらに、
前記において、R150は以下のように定義される:
−ハロゲン、OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから3つの置換基;または
−下記のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
j)テトラゾール、COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
前記において、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:テトラゾール、ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、SO3H、SR161、SO2161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する)、
前記第一の実施態様では、前記プローブは任意の適切な位置に結合させた検出可能な標識を含み、前記実施態様によって、前記プローブはHCVポリメラーゼまたはその類似体と結合し、さらに前記ポリメラーゼの阻害剤によって置き換えられることができる。
前記第一の実施態様のまた別の態様にしたがえば、アッセイに用いられるプローブは検出可能な標識を含まず、測定されるシグナルは、前記プローブの存在下および非存在下におけるHCVポリメラーゼに固有の蛍光の変化である。
本発明の第二の特徴にしたがえば、HCVポリメラーゼの阻害剤を特定するアッセイにおいて式(I)のプローブの使用が提供される。
本発明の第三の特徴にしたがえば、HCVポリメラーゼと結合する潜在能力をもつ化合物をテストするキットが提供される。前記キットは、式(I)のプローブおよび前記ポリメラーゼと結合するテスト化合物を特定するために前記プローブを使用する方法に関する指示物を含む。
発明の詳細な説明
定義
別に特定しないかぎり以下の定義が適用される:
“アフィニティー”タグという用語は、リガンドに対するその強い親和性を用いて、前記タグが結合されている物質を溶液から取り出すことができる成分を指す。前記のようなタグの例には、ビオチンまたはその誘導体、ヒスチジンポリペプチド、ポリアルギニン、アミロース糖成分、または特異的抗体によって認識可能な一定のエピトープが含まれる。前記のようなアフィニティータグは周知の方法によってプローブに結合される。対応するアフィニティーリガンドもまた当業者には周知である。
HCVのNS5Bポリペプチドの“類似体”またはそのフラグメントは、例えば前記タンパク質をコードする核酸のマニピュレーションにより、または前記タンパク質自体の改変により前記タンパク質のアミノ酸配列を変更することによって改変されたポリペプチドを指す。前記のような天然のアミノ酸配列の類似体は、1つまたは2つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を含むことができ、さらに、本来のHCVNS5Bポリペプチドの機能活性は変化していてもいなくてもよい。上記に記載したように、本発明のアッセイ/方法で用いられるHCVNS5Bポリペプチドまたはタンパク質には、HCVNS5Bポリペプチドに由来し、さらにHCVNS5Bポリペプチドの少なくとも1つの特性または他の特徴を保持する、HCVに由来する任意のフラグメント、誘導体、変種または変異体が含まれる。
“検出可能標識”という用語は、本発明のプローブに連結された任意の基であって、前記プローブがポリメラーゼ標的と結合したとき、前記のような標識は、ポリメラーゼを検出、測定および定量できるようにプローブの直接的または間接的な認識を可能にすることができる任意の基を指す。前記のような“検出可能な標識”の例には、光反応基、蛍光標識、化学発光標識、比色標識、酵素マーカー、放射性同位元素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記のような標識は周知の方法でプローブに結合される。
本明細書で用いられるように、“リンカー”という用語は、前記の標識を本発明のプローブに共有結合させる、C、N、OおよびSから成る群から選択される1から20個の原子の鎖を指す。そのような鎖の例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:
Figure 0004646514
上記のリンカーはまた1対のアフィニティータグ/アフィニティーリガンド(これらは一緒になって前記化合物を検出可能な標識に結合させる)を含むことができる。
“光反応基”という用語は、光による活性化に際して不活性基が活性種(例えば遊離ラジカル)に変換される基を指す。前記の例にはベンゾフェノン、アジ化物などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“プローブ”という用語は、共有結合的または非共有結合的態様でHCVポリメラーゼと結合することができる式(I)の化合物を指す。プローブが非共有結合的態様で結合する場合、前記プローブはテスト化合物によって置き換えられることができる。共有結合的態様で結合する場合は、前記プローブは、HCVポリメラーゼ−プローブアダクツ生成を定量することができ、さらに前記をテスト化合物が阻害することができる架橋実験のために用いることができる。
本明細書で用いられるように、“(C1-3)アルキル”、“(C1-4)アルキル”または“(C1-6)アルキル”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、それぞれ3つ、4つおよび6つの炭素原子を含む非環式直鎖または分枝鎖アルキルラジカルを意味する。前記のようなラジカルの例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、1−メチルエチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、1,1−ジメチルエチルが含まれる。
本明細書で用いられるように、“(C2-6)アルケニル”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、2つから6つの炭素原子を含む不飽和非環式直鎖ラジカルを意味する。
本明細書で用いられるように、“(C2-6)アルキニル”という用語は、単独または別の基と組み合わされる、2つから6つの炭素原子を含む不飽和非環式直鎖sp混成ラジカルを意味する。
本明細書で用いられるように、“(C3-7)シクロアルキル”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、3つから7つの炭素原子を含むシクロアルキルラジカルを意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルが含まれる。
本明細書で用いられるように、“(C5-7)シクロアルケニル”という用語は、単独または別のラジカル組み合わされる、5つから7つの炭素原子を含む不飽和環式ラジカルを意味する。
本明細書で用いられるように、“アリール”または“6または10員アリール”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、6個から10個の炭素原子を含む芳香族ラジカルを意味し、例えばフェニルまたはナフチルである。
本明細書で用いられるように、“COOH”という用語はカルボン酸基を指す。カルボン酸基は官能基同等物で置換できることは当業者には周知である。本発明で意図される官能基同等物の例にはエステル、アミドまたはボロン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“官能基同等物”という用語は、類似の電子特性、ハイブリッド形成特性または結合特性を有する別の成分によって置き換えられることができる成分またはその置換派生物を指す。
本明細書で用いられるように、“ハロ”という用語はハロゲン原子を指し、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。
本明細書で用いられるように、“ハロアルキル”という用語は、上記に記載したアルキルであって、各水素原子が連続的にハロゲン原子で置き換えられているもの、例えばCH2BrまたはCF3を指す。
本明細書で用いられるように、ヘテロ原子はO、SまたはNを意味する。
本明細書で用いられるように、“複素環”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、窒素、酸素および硫黄から選択される1つから4つのヘテロ原子を含む5、6または7員の飽和または不飽和(芳香族を含む)複素環から水素を除去して誘導された一価ラジカルを指す。
さらにまた、本明細書で用いられるように、“複素二環式”という用語は、上記に定義した複素環が1つまたは2つ以上の他の環(複素環であれまたは他のいずれかの環であれ)と縮合したものを指す。前記のような複素環の例には、ピロリジン、テトロヒドロフラン、チアゾリジン、ピロール、チオフェン、クマリン、ヒダントイン、ジアゼピン、1H−イミダゾール、イソキサゾール、チアゾール、テトラゾール、ピペリジン、1,4−ジオキサン、4−モルフォリン、ピリジン、ピリジン−N−オキシド、ピリミジン、チアゾロ[4,5−b]−ピリジン、キノリン、またはインドール、または以下の複素環が含まれるが、ただしこれらに限定されない:
Figure 0004646514
本明細書で用いられるように、“9または10員複素二環”または“複素二環”という用語は、単独または別のラジカルと組み合わされる、1つまたは2つ以上の他の環(複素環であれまたは他のいずれかの環であれ)と縮合した上記で定義した複素環を意味する。前記のような複素二環にはチアゾロ[4,5−b]−ピリジン、キノリンまたはインドール、または以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:
Figure 0004646514
本明細書で用いられるように、“Het”という用語は、O、NおよびSから選択される1つまたは4つのヘテロ原子を有する5または6員複素環、またはO、NおよびSから選択される1つまたは4つのヘテロ原子を有する9または10員複素二環を示す。
本明細書で用いられるように、“OH”という用語はヒドロキシル基を指す。ヒドロキシル基は官能基の同等物によって置換できることは当業者には周知である。本発明で意図される、前記のような官能基同等物の例にはエーテル、スルフヒドリルおよび第一、第二または第三アミンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“SH”という用語はスルフヒドリル基を指す。本発明では、“SH”または“SR”基が存在するときはいつでも、前記基は他の任意の酸化状態、例えばSOR、SO2RまたはSO3Rで置換できる。
“置換された”という用語は、2つ以上の成分を有するラジカル(例えばC1-6アルキル−アリールまたはC1-6アルキル−Het)と一緒に用いられる場合は、そのような置換は両成分に適用される。すなわち、前記アルキルおよびアリールまたはHet成分の両者を指定の置換基で置換することができる。
好ましい実施態様
好ましくは、本発明の第一の特徴にしたがえば、本発明は、以下の工程を含む、HCVポリメラーゼの阻害剤を特定する方法を提供する:
a)前記HCVポリメラーゼを式(I)のプローブと接触させて、前記ポリメラーゼと結合した前記プローブを含む複合体を形成し;
b)前記複合体由来のシグナルを測定して基線レベルを確立し;
c)工程a)の生成物とテスト化合物をインキュベートし;
d)前記複合体由来のシグナルを測定し;さらに
e)工程d)のシグナルと工程b)のシグナルとを比較し;
それによって、前記シグナルの減少は前記テスト化合物が前記ポリメラーゼの阻害剤であることを示す。
当業者には理解されるところであるが、本発明の特異的プローブとNS5Bポリメラーゼとの結合は多様な方法で直接的または間接的に測定することができる。前記プローブおよびNS5Bポリメラーゼは、それぞれ標識およびアフィニティータグ付加の必要はない。特異的プローブとHCVNS5Bポリメラーゼとの結合は、タグ付加または非付加NS5B蛋白質の固有のスペクトル特性の変化によって、および/または特異的プローブの固有のスペクトルの変化によって直接的にモニターおよび定量することができる。阻害剤−NS5B結合の直接測定はまた、これら2つの成分の1つをマトリックスに固定し、さらにプラズマ共鳴検出技術によって結合を測定することによって実施することができる。プローブ−NS5B複合体結合を定量するアッセイは、プローブ(例えば下記(v)および(vi))上に光反応性標識(例えばフェニルアジドまたはベンゾフェノン)を取り込ませ、さらにプローブの光活性化に続いてNS5B(アダクツ)に不可逆的に結合した標識の量を測定することができる。
好ましくは、本発明の第一の特徴にしたがえば、下記式のプローブまたはその塩が提供される:
Figure 0004646514
式中、
1はHまたは(C1-6)アルキルから成る群から選択され;
2はCON(R222(ここで各R22は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C5-7)シクロアルケニル、6もしくは10員アリールまたはHetであるか、または両R22は一緒に結合しそれらが結合している窒素とともに5、6または7員飽和複素環を形成する)であるか;またはR2は、H、ハロゲン、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C5-7)シクロアルケニル、6もしくは10員アリールまたはHetから選択され(ここで前記アルキル、ハロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C5-7)シクロアルケニル、アリールまたはHetの各々は場合によってR20で置換される)、ここでR20は以下のように定義され:
−ハロゲン、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから4つの置換基;または
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、それぞれH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);
ここで、R150は好ましくは以下であり:
−ハロゲン、NO2、シアノまたはアジドから選択される1つから3つの置換基;または
−下記のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、R112はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキル、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルおよび(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121は、H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキル(前記アルキルおよびシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルおよびシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
j)COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルおよび(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);さらに
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する);
3は、(C3-7)シクロアルキル、(C6-10)ビシクロアルキル、6もしくは10員アリールまたはHetから選択され;
5は−C(O)−Zであり、式中、
ZはOR6であり、ここでR6は以下で置換された(C1-6)アルキルであり:
−OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから4つの置換基;または
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
b)OR104(ここでR104は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はCN、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、それぞれH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);
−ハロゲン、NO2、シアノ、アジドから選択される1つから3つの置換基;または
−下記のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121は、H、場合によってR160で置換された(C1-6)アルキルであるか、またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
j)テトラゾール、COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
前記において、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:テトラゾール、ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、SO3H、SO2161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する);
または、ZはN(R6a)R6であり(ここでR6aは、Hまたは(C1-6アルキル)である);さらに、
6は、場合によって下記で置換された(C1-6アルキル)であり:
−OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから4つの置換基;または
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)R150aで置換された(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換され、ここでR150aはR150と同じであるが、ただしハロゲンではない)、OR150b、COOR150b、N(R150b2(ここでR150bはHまたはC1-6アルキルである);
b)OR104(ここでR104は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR111はHであり、さらにR112はSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);さらに
前記において、R150は以下から選択される:
−ハロゲン、NO2、シアノ、アジドから選択される1つから3つの置換基;または
−以下のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121は、H、場合によってR160で置換された(C1-6)アルキルであるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
j)テトラゾール、COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);および
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
前記においてR160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:テトラゾール、ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、SO3H、SO2(R161)、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する);
またはR6は下記式であり;
Figure 0004646514
式中、好ましくはR7およびR8は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、(C1-6)アルキル−Het(ここで前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6)アルキル−アリール、(C1-6)アルキル−Hetは場合によってR70で置換される)であるか;または、
7およびR8は一緒に共有結合して第二の(C3-7)シクロアルキルまたは、O、NおよびSから選択される1つから3つのへテロ原子をもつ4、5もしくは6員複素環を形成するか;またはZがN(R6a)R6であるときは、R7またはR8のどちらかはR6aと共有結合して窒素含有5または6員複素環を形成する;
前記式中、好ましくは、R70は以下から選択され:
−ハロゲン、NO2、シアノ、アジドから選択される1つから4つの置換基;または
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
b)OR104(ここでR104は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であり、さらにR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);
前記において好ましくは、R150は以下から選択され:
−ハロゲン、NO2、シアノ、アジドから選択される1つから3つの置換基;または
−下記のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルおよびシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
d)SO2N(R1082(ここでR108は、H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルであり、さらにR112はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキルまたは複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキル(前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
j)テトラゾール、COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルおよび(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);および
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
前記において、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:テトラゾール、ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にHまたは(C1-6)アルキルであり;
9はHであるか;またはR9は、R7またはR6のどちらかと共有結合して5または6員複素環を形成し;さらに
Qは、6または10員アリール、Hetであり、前記の全ては場合によって下記式
Figure 0004646514
またはR100で置換され;
ここでR100は以下であり:
−ハロゲン、NO2、シアノまたはアジドから選択される1つから4つの置換基;または、
−下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C2-6アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
b)OR104(ここでR104は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、であるか、またはCOOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128は、H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);さらに
前記において、R150は以下から選択される:
−ハロゲン、NO2、シアノまたはアジドから選択される1つから3つの置換基;または
−以下のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)HetまたはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR160で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121は、H、場合によってR160で置換された(C1-6)アルキルであるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
j)テトラゾール、COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR160で置換される);および
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
前記において、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:テトラゾール、ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、SO3H、SR161、SO2161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する)、
前記第一の特徴では、前記プローブは任意の適切な位置に結合させた検出可能な標識を含み、前記第一の特長によって、前記プローブはHCVポリメラーゼまたはその類似体と結合し、さらに前記ポリメラーゼの阻害剤によって置き換えられることができる。
より好ましくは、本発明のプローブは下記式の化合物またはその塩である:







Figure 0004646514
式中、
1は(C5-6)シクロアルキルであり;
2はフェニルまたHetであり、両者は場合によってR20で置換され;
3、R7、R8、R9、R100およびR150は上記に定義したとおりであり;
11は、OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルであるか;または下記のa)−l)であり:
a)R150aで置換された(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換され、ここでR150aはR150と同じであるが、ただしハロゲンではない)、OR150b、COOR150b、N(R150b2(ここでR150bはHまたはC1-6アルキルである);
b)OR104(ここでR104は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
e)NR111112(ここでR111は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR111はHであり、さらにR112はSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
j)COOR128(ここでR128は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);
前記において、R150はここで定義されたとおりであり:
ここで前記化合物は以下のいずれかの状態である:
a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
b)R1およびR3を除く任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
c)R1およびR3を除く任意の適切な位置で親和性タグに連結される。
さらに好ましくは、本発明のプローブは下記式の化合物またはその塩である:
Figure 0004646514
式中、
1は(C5-6)シクロアルキルであり;
2はフェニルまたHetであり、両者は場合によってR20で置換され;
3およびR150は上記に定義したとおりであり;
ここで前記化合物は場合よって、
a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
b)R1およびR3を除く任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
c)R1およびR3を除く任意の適切な位置で親和性タグに連結される。
特に本発明の第一の特徴にしたがえば、本発明のプローブは下記から成る群から選択される:



Figure 0004646514
































Figure 0004646514











Figure 0004646514
本第一の実施態様のまた別の特徴にしたがえば、以下の工程を含む、HCVポリメラーゼを阻害する化合物を特定する方法が提供される:
a)前記HCVポリメラーゼまたはその類似体をここで定義したとおりのプローブと接触させて、前記ポリメラーゼと結合した前記プローブを含む複合体を形成し;
b)前記複合体に由来するシグナルを測定して基線レベルを確立し;
c)工程a)の生成物とテスト化合物をインキュベートし;
d)前記複合体のシグナルを測定し;さらに
e)工程d)のシグナルと工程b)のシグナルとを比較し;
それによって、前記シグナルの変動は前記テスト化合物が前記ポリメラーゼを阻害することを示す。
好ましくは、HCVポリメラーゼを阻害することができる化合物の特定方法は以下の工程を含む:
f)高処理スクリーニングで上記に示した(a)から(e)の工程を繰返す。
また別には、下記式(I)のプローブまたはその塩が提供される:
Figure 0004646514
式中、AはO、S、NR3またはCR3であり;
BはNR1またはCR1であり(ただしAがCR3であるとき、BはNR1であり、さらにAがOまたはSであるとき、BはCR1であることを条件とする);
点線は単結合または二重結合のどちらかを表し;
1は以下から成る群から選択され:場合によって(C1-6)アルキルで置換された(C4-7)シクロアルキル;ノルボルナン、O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する5、6または7員複素環(前記の全ては場合によってハロ、OHおよび場合によってヒドロキシで置換されたC1-6アルキルから成る群から選択される1つから4つの置換基で置換される);
2は、フェニル、ピリジン−N−オキシド、5または6員芳香族複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)および9または10員芳香族複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)から成る群から選択され(前記フェニル、ピリジン−N−オキシド、芳香族複素環および芳香族複素二環は場合によって、ハロゲン、C1-6ハロアルキル、(C1-6)アルキル、C1-6アルコキシ、OH、場合によって(C1-6)アルキルで一置換または二置換されたアミノから成る群から選択される1つまたは4つの置換基で置換される);
3は、H、(C1-6)アルキル、(C1-6アルキル)−(C6-10アリール)、(C1-6アルキル)−5または6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)および5または6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)から成る群から選択され(ここで前記アリールおよび前記複素環は、場合によってCOOH、COO(C1-6アルキル)、ハロゲンおよび(C1-6アルキル)から成る群から選択される1つまたは4つの置換基で置換される);
Mは、N、CR4aまたはCOR4bであり(ここでR4aはH、ハロゲンおよび(C1-6アルキル)から成る群から選択され;さらにR4bは、Hおよび(C1-6アルキル)から成る群から選択される);
KおよびLはそれぞれ別個にNまたはCR6であり(ここでR6はH、ハロ、C1-6アルキル、OHまたはC1-6アルコキシである);
5は−C(Y)−Zであり(ここでYはOまたはSで、ZはNHR5aまたはOR5aである);
ここでR5aは以下から成る群から選択され:H、(C1-6)アルキル、(C2-6)アルケニル、場合によって(C1-6)アルキルまたは(C2-6)アルケニルで置換された(C3-6)シクロアルキル、場合によってC1-6アルキルまたはC2-6アルケニルで置換された(C6-10)アリール、N{(C1-6)アルキル}2、NHCOO(C1-6)アルキル(C6-10)アリール、NHCO(C6-10)アリール、−5または6原子複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、および−9または10原子複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する);
ここで前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、複素環または複素二環は全て場合によって下記から選択される1つから4つの置換基で置換され:OH、COOH、(C1-6)アルキル、(C2-4)アルケニル、(C1-6)アルキル−ヒドロキシ、COO(C1-6)アルキル、C3-7シクロアルキル、ベンジルオキシ、ハロゲン、(C2-4)アルケニル−(C1-6)アルキル−COOH、クマリン、(C1-6)アルキル−アミノ、NH(C1-6アルキル)、C(ハロゲン)3、−C(O)NH(C1-4)アルキル、および−C(O)NH(C6-10)アリール、5または6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、9または10員複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、および6または10員アリール;
ここで前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、複素環および複素二環は全て場合によって下記から選択される1つから4つの置換基で置換され:ハロゲン、OPO3H、スルホンアミド、SO3H、SO2CH3、−CONH2、−COCH3、(C1-3)アルキル、(C2-4アルケニル)COOH、テトラゾリル、COOH、−CONH2、トリアゾリル、OH、NO2、NH2、−O(C1-6アルキル)COOH、ヒダントイン、ベンゾイレンウレア、(C1-4)アルコキシ、シアノ、アジド、−O−(C1-6)アルキルCOOH、−O−(C1-6)アルキルCOO−(C1-6)アルキル、NHCO−(C1-6アルキル)、−NHCOCOOH、−NHCOCONHOH、−NHCOCONH2、−NHCOCONHCH3、−NHCO(C1-6)アルキル−COOH、−NHCOCONH(C1-6)アルキル−COOH、−NHCO(C3-7)シクロアルキル−COOH、−NHCONH(C6-10)アリール−COOH、−NHCONH(C6-10)アリール−COO(C1-6)アルキル、−NHCONH(C1-6)アルキル−COOH、−NHCONH(C1-6)アルキル−COO(C1-6)アルキル、−NHCONH(C1-6)アルキル−(C2-6)アルケニル−COOH、−NH(C1-6)アルキル−(C6-10)アリール−O(C1-6)アルキルCOOH、−NH(C1-6)アルキル−(C6-10)アリール−COOH、−NHCH2COOH、−NHCONH2、−NHCO(C1-6)ヒドロキシアルキルCOOH、−OCO(C1-6)ヒドロキシアルキルCOOH、(C3-6)シクロアルキルCOOH、下記式:
Figure 0004646514
−NHCN、−NHCHO、−NHSO2CH3、−NHSO2CF3および−O(C1-6アルキル)−テトラゾール;
またはR5aは下記式であり:
Figure 0004646514
式中、R7およびR8はそれぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6アルキル)フェニル、(C1-6アルキル)−(C3-7シクロアルキル)、(C3-7シクロアルキル)−(C1-6アルキル)、(C3-7シクロアルキル)−(C2-4アルケニル)、(C1-6アルキル)−OH、フェニル、CH2ビフェニル、5または6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、9または10員複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、(C1-6アルキル)−5もしくは6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)または(C1-6アルキル)−9もしくは10員複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)であるか;
または、R7およびR8は一緒に共有結合して、(C3-7シクロアルキル)、4、5または6員複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)を形成するか;
または、R7またはR8の1つはR9と共有結合してピロリジンを形成し(ここで、前記アルキル、シクロアルキル、複素環、複素二環、フェニルは場合によって以下から成る群から選択される1つから4つの置換基で置換される:OH、COOH、(C1-6アルキル)、(C2-4アルケニル)、CONH2、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、NHCOCOOH、NHCOCON(C1-6アルキル)2、NHCOCONH(C1-6アルキル)、SH、S(C1-6アルキル)、NHC(=NH)NH2、ハロゲンおよびCOO(C1-6アルキル));
9はHまたは(C1-6アルキル)であり;さらに
Qは、(C1-3)CONHアリール、6または10員アリール、ビフェニル、5または6原子複素環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)、9または10員複素二環(O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する)から成る群から選択され、ここで、前記アリール、ビフェニル、複素環および複素二環は全て場合によって以下から選択される1つから4つの置換基で置換され:OH、COOH、COO(C1-6アルキル)、(C1-6)アルキル、(C1-6)アルキルCOOH、(C1-6アルキル)(C2-4アルキニル)、(C1-6)アルキル−ヒドロキシ、フェニル、ベンジルオキシ、ハロゲン、(C2-4)アルケニル、(C2-4)アルケニル−(C1-6)アルキル−COOH、O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有する5または6員の第二の複素環、O、NおよびSから選択される1つから4つのヘテロ原子を有するNH−5員または6員の第二の複素環[ここで前記第二の複素環およびフェニルは場合によって、(C1-6アルキル)、CF3、OH、(C1-6アルキル)COOH、O(C1-6アルキル)COOH、(C1-6アルキル)COO(C1-6アルキル)、CH2フェニル、COO(C1-6アルキル)、(C1-6アルキル)O(C1-6アルキル)、COOH、NCH(C1-6アルキル)2、NCO(C1-6アルキル)、NH2、NH(C1-6アルキル)、ハロゲン、N(C1-6アルキル)2およびC2-6アルケニル−COOHから選択される1つから4つの置換基で置換される]、ハロゲン、OPO3H、ベンジル、スルホンアミド、SH、SOCH3、SO3H、SO2CH3、S(C1-6アルキル)COOH、−CONH2、−COCH3、(C1-3)アルキル、(C2-4アルケニル)COOH[ここで前記アルケニルは場合によって1つから2つの(C1-6アルキル)置換基で置換される]、(C2-4アルケニル)COO(C1-6アルキル)、テトラゾリル、COOH、トリアゾリル、OH、NO2、NH2、−O(C1-6アルキル)COOH、ヒダントイン、ベンゾイレンウレア、(C1-4)アルコキシ、(C1-4)アルコキシ(C1-6アルキル)COOH、シアノ、アジド、−O−(C1-6)アルキルCOOH、−O−(C1-6)アルキルCOO−(C1-6)アルキル、−NHCOCOOH、−NHCOCONHOH、−NHCOCONH2、−NHCOCONHCH3、−NHCO(C1-6)アルキル−COOH、−NHCOCONH(C1-6)アルキル−COOH、−NHCO(C3-7)シクロアルキル−COOH、−NHCONH(C6-10)アリール−COOH、−NHCONH(C6-10)アリール−COO(C1-6)アルキル、−NHCONH(C1-6)アルキル−COOH、−NHCONH(C1-6)アルキル−COO(C1-6)アルキル、−NHCONH(C1-6)アルキル−(C2-6)アルケニル−COOH、−NH(C1-6)アルキル)−(C6-10)アリール−O(C1-6)アルキルCOOH、−NH(C1-6)アルキル−(C6-10)アリール−COOH、−NHCH2COOH、−NHCONH2、−NHCO(C1-6)ヒドロキシアリールCOOH、−OCO(C1-6)ヒドロキシアルキルCOOH、(C3-6)シクロアルキルCOOH、下記式:
Figure 0004646514
−NHCN、−NHCHO、−NHSO2CH3、−NHSO2CF3、クマリン、(C1-6)アルキル−アミノ、NH(C1-6アルキル)2、C(ハロゲン)3、−NH(C2-4)アシル、−NH(C6-10)アロイル、−CONH(C1-6アルキル)、−CO(C1-6)アルキル−COOH、−CONH(C1-6)アルキル−COOH、−CO−NH−アラニル、−CONH(C2-4)アルキルN(C1-6アルキル)2、−CONH(C2-4)アルキル−Het、−CONH(C2-4)アルキル−(COOH)−Het、−CONH(C1-2アルキル)(OH)(C1-2アルキル)OH、−CONH(C1-6)アルキル−COOH、−CONH(C6-10アリール)、−CONH−Het、−CONH(C6-10)アリール−COOH、−CONH(C6-10)アリール−COO(C1-6)アルキル、−CONH(C1-6)アルキル−COO(C1-6)アルキル、−CONH(C6-10)アリール−(C1-6)アルキル−COOH、および−CONH(C6-10)アリール−(C2-6)アルケニル−COOH;
前記のプローブは検出可能な標識を含み、前記実施態様によって、前記プローブはHCVポリメラーゼまたはその類似体と結合し、さらに前記ポリメラーゼの阻害剤によって置き換えられることができる。
プローブ内に取り込まれた標識は、タグ付加NS5Bポリメラーゼに結合させた適切な標識と対を形成し、その結果プローブ−ポリメラーゼ結合時の前記2つの標識対の接近によって測定可能なシグナルが発生する。前記のような検出技術の例には、蛍光共鳴エネルギー移転(FRET)および時間決定蛍光(time resolved fluorescence)(TRF)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましくは、検出可能な標識は以下から成る群から選択される:蛍光標識(例えばフルオレセイン、オレゴングリーン、ダンシル、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリンまたはEu3-)、放射性原子(例えば3H、14C、125I)、化学発光標識(例えばルシフェラーゼ)、酵素マーカーにより生成される発色(例えばβ−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼ)。
また別には、蛍光レポーターまたはクェンチャーを標識対として用い、プローブとHCVNS5Bポリメラーゼとの結合をモニターしてもよい。一般的に知られているレポーター/クェンチャー対は例えば以下から選択できる:EDANS/DABCYL、トリプトファン/2,4−ジニトロフェニル、トリプトファン/DANSYL、7−メトキシクマリン/2,4−ジニトロフェニル、2−アミノベンゾイル/2,4−ジニトロフェニルおよび2−アミノベンゾイル/3−ニトロチロシン。
当業者には容易に理解されるところであるが、放射性標識は式Iのプローブ内の任意の適切な位置に取り込ませることができる。例えば、3Hまたは14C同位元素は前記分子内に存在する任意の水素または炭素と置き換えることができる。同様に125I同位元素を任意の芳香環で置換させることができる。
原則として、これらのトレーサー手技は高容積スクリーニングに容易に適合させることができる。放射能検出のためのシンチレーションプロクシミティーアッセイ(SPA)法が開発され、前記は分離工程を必要とせず、自動化およびマイクロタイター形式に容易に適合する。
好ましくは、検出可能標識は蛍光標識または化学発光標識である。より好ましくは、前記標識は蛍光標識である。もっとも好ましくは前記検出可能標識はフルオレセインである。
放射能標識試薬およびそれらの廃棄に関連するコストのために、非放射性検出方法がますます広がりつつある。蛍光分光分析はもっとも一般的な非放射性検出方法の1つである。蛍光が用いられるアッセイタイプの1つは蛍光偏光である。偏光は総蛍光強度に左右されず、したがってこの方法は蛍光振幅測定のように干渉の影響を受けない。本明細書に開示するように、開発した新規なアッセイタイプではフルイレセイン標識阻害剤が用いられるが、他の蛍光標識または非蛍光性技術もまた用いることができる。
好ましくは、本アッセイで用いられるポリメラーゼはアフィニティータグを含み、それによってポリメラーゼを固相に結合させることができ、さらにプローブは検出可能なシグナルを提供できるように標識することができる。プローブに取り込ませるアフィニティータグはビオチンでもよく、このビオチンにより、アビジン結合検出技術を副次的に使用して前記ビオチン付加プローブとNS5Bポリメラーゼとの結合を間接的に測定することができる。
好ましくは、本アッセイで用いられるHCVポリメラーゼは、MS5B;NS5BΔ21;NS5BΔ57または多様な遺伝子型(HCV−1aまたは1b株を含む)に由来するその類似体から成る群から選択され、前記は場合によってそのNまたはC末端のどちらかにヒスチジンタグを有する。特に当業者に理解されるところであるが、本結合アッセイは、本発明にしたがってそのような結合アッセイを実施するために最適または機能的なNS5Bのポリメラーゼ活性を必要としない。
実施例
実施例1A)
プローブ(iii):(S)−3−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−2−({1−[1−シクロヘキシル−2−(4−{[2−(5−ジメチルアミノ−ナフタレン−1−スルホニルアミノ)−エチルカルバモイル]−メトキシ}−フェニル)−1H−ベンゾイミダゾール−5−イル]−メタノイル}−アミノ)−プロピオン酸
Figure 0004646514
a)4−クロロ−3−ニトロ安息香酸(40.40g,0.20mole)を3滴のDMFを含むDCM(100mL)に懸濁した。塩化オキザリル(1.5当量、0.3mole,27mL)を少量づつ添加し、混合物を室温で一晩攪拌した。さらに1時間還流させて反応を完了させた後、揮発物を減圧下で除去し、残留物を2回ヘキサンとともに同時蒸発させて表題の化合物を明黄色固体として得た。
b)(S)−5−ヒドロキシトリプトファンメチルエステルヒドロクロリド(1.55g,5mmol)を80%のMeCN水溶液(25mL)に溶解し,前記溶液を氷で冷却した。重曹(0.850g,10mmol)を、続いてジ−tert−ブチルジカーボネート(1.10g,5.1mmol)を添加した。前記混合物を室温で2時間攪拌し、水(200mL)に注ぎ入れてEtOAc(3X)で抽出した。一緒にした抽出物を水およびブラインで洗浄し、(MgSO4)で乾燥させて濃縮し,ベージュ色の固体を得た(1.65g)。上記の粗生成物(1.50g,4.83mmol)をアセトン(20mL)および炭酸カリウム無水物(1.5g,11mmol)に溶解し、さらにメチルブロモアセテート(0.76g,5mmol)を添加した。その後前記混合物を4時間還流し、さらにメチルブロモアセテートを添加し反応を完了させた(HPLCによって完了するまで15mgずつ添加)。続いて反応混合物を冷却し、ろ過して固形物を除去した。ろ液を蒸発させて所望のカルバメートを油(2.0g)として得た。上記の粗カルバメート(2.0g)を4NのHCl−ジオキサンとともに室温で1時間攪拌することによって脱保護した。真空中で揮発物を除去して所望のトリプトファンエステル誘導体を褐色の固体(1.51g)として得た。
c)工程b)のトリプトファン誘導体(0.343g,1mmol)を80%のMeCN水溶液(10mL)に溶解し、重曹(3当量、0.260g)を添加した。前記溶液を氷中で冷却し、工程a)の4−クロロ−3−ニトロベンゾイルクロリド(0.220g,1mmol)を添加した。前記混合物を室温で1時間攪拌し、減圧下で濃縮し、さらに残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液として1:2ヘキサン/EtOAC)によって精製し、化合物c)を黄色の泡沫(0.391g)として得た。
d)上記の4−クロロベンズアミド誘導体(0.214g,0.45mmol)をDMSO(1mL)に溶解し、DIEA(0.2mL)を加え、続いてシクロヘキシルアミン(3当量、0.16mL)を加えた。前記混合物を60から65℃で4時間攪拌し、続いて水で希釈した。形成されたオレンジ色の沈殿物を採集し、水で洗浄し乾燥させた(0.200g)。
e)上記の粗生成物(0.200g,0.36mmol)をMeOH(15mL)中の木炭(60mg)上の20%Pd(OH)2で水素添加した(1気圧のH2)。2時間後、懸濁物をろ過して触媒を除き、in vacuoで濃縮して泡沫として表題化合物(0.16g)を得た。
f)4−ホルミルフェノキシ酢酸(0.306g,1.70mmol)をDCM(5mL)に溶解した。DIEA(0.524g,4mmol)およびTBTU(0.550g,1.70mmol)を添加し、続いてtert−ブチルN−(2−アミノエチル)カルバメート(0.250g,1.56mmol)を添加した。前記混合物を2時間室温で攪拌し、EtOAcに溶解し、5%K2CO3、KHSO4水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。抽出物を乾燥させ(MgSO4),減圧下で濃縮して黄色の固体(0.350g)を得た。
g)工程e)のジアミン誘導体(0.026g,0.05mmol)および工程f)のアルデヒド(0.020g,0.06mmol)をDMF(3mL)に溶解し、水(0.03mL)を添加し、続いてオキソン(oxone(登録商標))(0.024g,0.04mmol)を添加した。前記混合物を室温で1時間攪拌し、続いて水で希釈した。生じた沈殿物をろ過で採集し、水で洗浄し乾燥させてベージュ色の固体(0.020g)を得た。
h)上記の粗カルバメートをTFAで30分室温で攪拌した。揮発物を減圧下で除去し、残留物を調製用C18逆相HPLCで精製しビスTFA塩を得た。
i)アミン塩(0.019g,0.02mmol)をDMSO(0.3mL)に溶解し、DIEA(0.06mL)を添加し、続いて塩化ダンシル(0.065g,0.02mmol)を添加した。前記混合物を室温で1時間攪拌した。5NのNaOH(0.12mL)および水(0.05mL)を添加し、鹸化を室温で1時間進行させた。TFAで酸化した後、プローブ(iii)を調製用C18逆相HPLCによって前記反応混合物から直接単離した:MS(ES+)m/z930(MH+)。
実施例1B)
プローブ(ii):5−(3−{2−[2−(4−{5−[(S)−1−カルボキシ−2−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−エチルカルバモイル]−1−シクロヘキシル−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}−フェノキシ)−エタノイルアミノ]−エチル}−チオウレイド)−2−(6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−安息香酸
Figure 0004646514
実施例1Aの工程h)のアミン塩(0.06mmol)をDMSO(0.6mL)に溶解し、さらにDIEA(0.3mL)、続けてフルオレセインイソチオシアネート異性体(0.026g,0.066mmol)を添加した。前記混合物を室温で1時間攪拌した。5NのNaOH(0.3mL)および水(0.15mL)を添加し、攪拌をさらに30分再開した。TFAで酸性化した後、プローブ(ii)を調製用C18逆相HPLCにより直接単離した:MS(ES+)m/z1086(MH+)。
実施例1C)
プローブ(v):(S)−2−{[1−(2−{4−[(2−{[1−(4−アジド−フェニル)−メタノイル]−アミノ}−エチルカルバモイル)−メトキシ]−フェニル}−1−シクロヘキシル−1H−ベンゾイミダゾール−5−イル)−メタノイル]−アミノ}−3−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−プロピオン酸
Figure 0004646514
a)4−アジド安息香酸(0.160g,1mmol)をDCM(3mL)に溶解した。DIEA(0.5mL,2.5mmol)およびTBTU(0.337g,1.05mmol)を添加し、続いてtert−ブチルN−(2−アミノエチル)カルバメート(0.165g,1.03mmol)を添加した。前記混合物を2.5時間室温で攪拌し、EtOAcに溶解し、5%K2CO3、KHSO4水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。抽出物を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮して黄色の固体(0.257g)を得た。粗カルバメート(0.257g,0.84mmol)を4NのHCl−ジオキサン(15mL)中で室温で2時間攪拌することによって脱保護した。減圧下で揮発物を除去して桃色の固体を得た。
b)4−ホルミルフェノキシ酢酸(0.200g,1.1mmol)をDCM(3mL)に溶解し、DIEA(0.5mLl)、続いてTBTU(0.350g,1.1mmol)および上記のアミン塩(0.240g,1mmol)を添加した。前記混合物を4時間室温で攪拌し、EtOAcに溶解し、5%K2CO3、KHSO4水溶液、水およびブラインで連続的に洗浄した。抽出物を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮して灰白色の固体(0.162g)を得た。
c)上記のベンズアルデヒド誘導体(0.044g,0.12mmol)および実施例1A工程e)のジアミン誘導体(0.052g,0.1mmol)をDMF(0.6mL)および水(0.1mL)に溶解した。オキソン(登録商標)(0.050g,0.8mmol)を添加し、前記混合物を室温で1時間攪拌した。5NのNaOH(0.2mL)および水(0.1mL)を添加し、鹸化を1時間進行させた。プローブ(v)を調製用C18逆相HPLC(12.5mg)によって直接単離した:MS(ES+)m/z842(MH+)。
実施例1D)
プローブ(vi):(S)−3−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−2−({1−[1−シクロヘキシル−2−(4−{[2−({1−[4−(1−フェニル−メタノイル)−フェニル]−メタノイル}−アミノ)−エチルカルバモイル]−メトキシ}−フェニル)−1H−ベンゾイミダゾール−5−イル]−メタノイル}−アミノ)−プロピオン酸
Figure 0004646514
実施例1Cのプローブ(v)の方法にしたがい、ただし4−ベンゾイル安息香酸を4−アジド安息香酸の代わりに使用してプローブ(vi)を得た:MS(ES+)m/z905(MH+)。
実施例1E)
プローブ(iv):(S)−3−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−2−{[1−(1−シクロヘキシル−2−{4−[2−(5−ジメチルアミノ−ナフタレン−1−スルホニルアミノ)−エチルカルバモイル]−フェニル}−1H−ベンゾイミダゾール−5−イル)−メタノイル]−アミノ}−プロピオン酸
Figure 0004646514
a)実施例1Aの工程f)の方法にしたがい、4−カルボキシベンズアルデヒドをtert−ブチルN−(2−アミノエチル)カルバメートと共役させた。
b)実施例1A工程g)で述べたように、オキソン(登録商標)を用いて実施例1A工程e)のジアミン誘導体および上記のアルデヒドによりベンゾイミダゾール環を形成させた後、Boc保護基を除去し、生じたアミンを実施例1A工程i)で述べたように塩化ダンシルで濃縮した。
c)プローブ(iv)は、通常の条件下でのエステル基の鹸化および調製用C18逆相HPLCによる単離の後で得られた:MS(ES+)m/z900(MH+)。
実施例1F)
プローブ(i):5−[3−(2−{[1−(4−{5−[(S)−1−カルボキシ−2−(5−カルボキシメトキシ−1H−インドール−3−イル)−エチルカルバモイル]−1−シクロヘキシル−1H−ベンゾイミダゾール−2−イル}−フェニル)−メタノイル]アミノ}−エチル)−チオウレイド]−2−(6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−安息香酸

Figure 0004646514
実施例1Eで述べたプローブ(v)の方法を用いたが、ただし塩化ダンシルの代わりにフルオレセインイソチオシアネート異性体を使用した。プローブ(i)は調製用C18逆相HPLCで精製した後で得られた:MS(ES+)m/z1056(MH+)。
実施例2
HCVNS5BポリメラーゼΔ21−Hisの製造と精製
リコンビナントHCVNS5Bポリメラーゼは、成熟NS5Bで通常見出されるC末端21アミノ酸を欠く変種を発現させることにより可溶形として製造できる(Yamashita et al. 1998, J. Biol. Chem. 273:15479-15486; Ferrari et al. 1999, J. Virol. 73:1649-1654)。我々は、C末端6ヒスチジンタグ(NS5BΔ21−His(配列番号1)と称する)およびN末端6ヒスチジンタグ(His−NS5BΔ21(配列番号2)と称する)を有する前記いわゆるNS5BΔ21を発現させた(どちらの蛋白質も“hisタグNS5B”と称される)。大腸菌株JM109(DE3)でのpETベクターからの前記遺伝子の発現は、0.4mMのIPTGを用いて22℃で3時間誘発した。細胞を採集し、溶解緩衝液(トリス−HCl(pH7.5)、10%グリセロール、1mMEDTA、2mMの2−メルカプトエタノール、500mMのNaCl、1mMのPMSF、1μg/mLのアンチパイン、1μg/mLのペプスタチンAおよび1μg/mLのロイペプチン)中でミクロ流動化装置で溶解させた。前記溶解物を30000gで遠心して清澄化し、続いてイミダゾールを最終濃度10mMで添加した。続いて前記溶解物を予め緩衝液A(トリス−HCl(pH7.5)、10%グリセロール、500mMのNaCl、10mMイミダゾール)で平衡化させた金属キレート樹脂(Ni-NTA;Qiagen)にロードし、さらに十分に洗浄し500mMのイミダゾールを含む緩衝液Aのグラジエントを用いて前記タンパク質を溶出させた。hisタグNS5BΔ21を含むピーク分画をプールし、緩衝液C(20mMのトリス−HCl(pH7.5)、10%グリセロール、5mMのDTT)で希釈してNaCl濃度を300mMに低下させ、続いてDEAEセファロースに適用して一切の核酸を除去した。セファロースカラムのフロースルー物を緩衝液Cで希釈してNaClを200mMに減少させ、続いてヘパリン−セファロースカラムに適用した。200mMから1MのNaClグラジエントを含む緩衝液CでhisタグNS5Bをヘパリン−セファロースから溶出させる。hisタグNS5Bを含むピーク分画をプールし、さらに緩衝液Cで希釈してNaClの最終濃度を200mMにし、リソースSカラムにロードした。濃縮hisタグNS5BをリソースSから溶出させ、スーパーデックス200カラムで300mMのNaClを含む緩衝液Cにロードしサイズ分画した。ピーク分画は高度に純粋なhisタグNS5Bを含有し、前記を−80℃で使用まで保存する。
実施例3
蛍光異方性分析
酵素による本プローブの力価測定は以下のように実施した:
フルオレセイン標識プローブを、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、1mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mMのDTTおよび10%のDMSOで所望の濃度に希釈した。NS5BΔ21−Hisタンパク質を、25mMのトリス−HCl(pH7.5)、300mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのEDTA、30%のグリセロールおよび0.1%のIGEPALで段階希釈した。反応総容積は500μLで、最終アッセイ緩衝液は、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、1mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mMのDTT、30mMのNaCl、3%グリセロール、0.01%IGEPALおよび5%DMSOであった。異方性の測定は、450−WキセノンアークランプおよびT−オプティクスコンフィギュレーションを備えたSLMアミコ(Amico)8100スペクトロフルオロメーターで実施した。励起波長は493nmで、放射は530nmでモニターした。各異方性測定において、バックグラウンド緩衝液の水平および垂直強度をサンプルの測定値から差し引いて異方性を算出した。データは非直線回帰のためにSASプログラム(SAS Institute Inc., NC, USA)で処理し、直接結合平衡定数および他のパラメーター並びに実験データに対する回帰フィット曲線を入手した。プローブ(i)で得られた力価曲線の例は図1に示されている。本ポリメラーゼによるプローブ(i)および(ii)のKd値はそれぞれ15nMおよび6nMであった。
実施例4
96ウェルプレートによる偏光アッセイ
これらプローブと競合する種々の化合物(テスト化合物)のKd値を得るために、このアッセイをより扱いやすい形式に変更し、結合アッセイを96ウェルマイクロプレート読取装置に適合させた。プローブを希釈して所望の最終濃度を得た(酵素に対するそのKdおよびアッセイ条件に応じて4から25nMの濃度)。被検化合物を20mMのトリス−HCl(pH7.5)、1mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mMのDTTおよび15%DMSOで2または3倍ずつ段階希釈した。アッセイでのNS5BΔ21−His濃度は、70%のプローブ結合を得ることができるように計算した(これらの条件はテスト化合物によるプローブの置換を可能にした)。最終的に、アッセイ反応物は、96ウェルの黒色プレート(Packard)に移した被検化合物の段階希釈物50μLを含んでいた(しかしながら、陽性コントロール値を入手し、さらに実験で結合したプローブの真のパーセントを実証するために1列だけは化合物を含まなかった)。続いて、ブランク差し引き用の1つのカラムを除き、50μLのプローブを各ウェルに添加した。最後に、0%および100%結合値を決定するために使用する1列を除き、150μLの酵素を全てのウェルに添加した。8ウェルを含む前記の1列には、酵素緩衝液を最初の4ウェルに添加し(遊離プローブの異方性値またはrfの決定用)、さらにアッセイで使用した酵素濃度の10倍過剰を他の4ウェルに添加した(プローブの100%が結合したときの異方性値(すなわちrb値)の決定用)。これらの値はKd値の計算に必要であった。アッセイの最終緩衝液条件はKd決定で用いたものと同一であった(すなわち下記のとおり:20mMのトリス−HCl(pH7.5)、1mMのEDTA、5mMのMgCl2、1mMのDTT、30mMのNaCl、3%グリセロール、0.01%IGEPALおよび5%DMSO)。反応物は暗所で室温で90分インキュベートした。続いて、高エネルギーキセノンフラッシュランプを搭載したポーラースターギャラクシー(POLARstar Galaxy)で485nmの励起フィルターおよび520nmの放射フィルターを用いて偏光の読み取りを実施した。偏光値は以下の計算により異方性値に容易に変換できる(Owicki et al. 2000, J. Biomol. Screen. 5:297-306):
a=2xP/(3−P)
(式中、a:異方性値、P:偏光値)
続いて、異方性値を用いて、SAS非直線回帰分析に適合させた2つのタイプの結果を得て、陽性コントロールとしての計算のためには約70%結合での異方性値を、さらに陰性コントロールとしては下記の異方性等式に適合させた遊離プローブの異方性値(rf)を用いて見かけのKd値を得ることができる:




Figure 0004646514
式中、a:異方性、Kd:阻害剤の解離定数、I:被検化合物(または阻害剤)の濃度、Eo:NS5Bの濃度(Eoは>>[プローブ]でなければならない)、Q=Qb/Qf=100%プローブ結合の総蛍光/遊離プローブの総蛍光、rb:プローブが100%結合したときの異方性値、rf:プローブが遊離しているときの異方性値、Kp:プローブの解離定数である。
本高処理アッセイは統計パラメーターZ’の決定によって評価し有効性が確認された(J.-H. Zhang et al. 1999, J. Biomol. Screening, 4:67-73)。本実験の結果は図2に示されている。一連の陽性および陰性コントロールの異方性値は非常に類似し、以下のように非常に低い標準偏差をもたらした: 陽性コントロールの場合0.2186±0.0036A単位および陰性コントロールの場合0.0738±0.0037A単位。前記アッセイで得られるZ’値は0.85で、我々は、本プローブと競合する化合物の検出を目的とする優れた条件を有することが示唆される。
実施例5
阻害剤のテスト
我々は、本結合アッセイで効果的にプローブと置換されれる強力な化合物を特定した。図3および4は、31nMから1μMの範囲のKdを有する、前記のうちのいくつかの例を示している。異方性等式はグラフィトソフト(Grafit Software)(Erithacus Software Ltd., UK)で示されているが、阻害剤濃度はX軸で変化し、異方性はY軸で変化する(前記ソフトで算出されるパラメーターは阻害剤のKdおよびQb/Qf=比であった)。供給される定数は、Kp、Eo、rbおよびrfであった。
実施例6
偏光アッセイのための改変条件
本偏光アッセイの有用性は、化合物の結合を種々の条件下で調べる必要がある場合に明らかである。例えば、プローブの結合定数は異なる塩濃度およびpHで決定された。図5から8は、30mMから200mMの範囲の最終NaCl濃度でのプローブ(i)の結合曲線を示している。本アッセイにおける他の全ての試薬は標準プロトコル(実施例3)で述べたとおりであった。これらの図に示されているように、Kd値は、塩濃度にしたがってKd=15nM(30mMのNaCl)からKd=122nM(200mMのNaCl)に徐々に増加する。pH6.5での実験もまたより低いpHでのプローブ(i)のKdを決定するために実施した。これらのアッセイでは、pH6.5の20mMリン酸緩衝液をトリスの代わりに用い、他の全てのアッセイ試薬は96ウェルの偏光アッセイ(実施例4)で述べたとおりであった。これらのタイプの実験例は図9に示されている。プローブ(i)を用いてpH6.5で得られたKd値は33nMであった。種々の実験条件下でこれらのKd値を確立すれば、70%のプローブ結合を得るために用いるべきプローブおよび酵素濃度を平衡等式から決定することは簡単である。いったんこれらの値を得たら、問題の化合物を新しい条件下で容易に検査してそれらのKd値を決定することができる。
実施例7
改変酵素による蛍光偏光アッセイ
我々のHCVポリメラーゼ酵素の他の構築物による蛍光偏光アッセイもまた使用した。C末端にタグが付加されたNS5BΔ21−Hisポリメラーゼの他に、HisタグをN末端に有するNS5B酵素もまた本蛍光偏光アッセイで使用した。この酵素によるプローブ(i)のKd値の決定を、標準的な96ウェル様式のアッセイで述べた条件と同じ条件を用いて実施した。図10は、プローブ(i)を用いて得られたKdは同じ(すなわち18nM)であることを示している。3つの化合物のIC50およびKdについて2つの異なる酵素構築物(NS5BΔ21−HisおよびHis−NS5BΔ21)を用いて比較した。
IC50は、以下のアッセイにしたがいシンチレーションプロクシミティアッセイ(SPA)を用いて決定した:
基質は以下のとおりである:(i)その遊離5’C−位をビオチンで改変されている12ヌクレオチドRNAオリゴウリジレート(またはオリゴウリジン一リン酸(オリゴU)プライマー;(ii)長さが種々(1000から10000ヌクレオチド)の相補性ポリアデニレート(またはアデノシン一リン酸)(ポリA)鋳型;および(iii)UTP−[5,63H]。ポリメラーゼ活性は、オリゴUプライマーから伸長される鎖へのUMP−[5,63H]の取り込みとして測定される。3H標識反応生成物をストレプトアビジン被覆SPA−ビーズで捕捉し、トップカウント(TopCount; Packard)で定量する。阻害剤は以下を含む反応物中で種々の濃度で調べる:1から5nMのhisタグ付加NS5B、1μg/mLのビオチン付加オリゴUプライマー、10μg/mLのポリA鋳型、20mMのトリス−HCl(pH7.5)、5mMのMgCl2、25mMのKCl、1mMのEDTA、1mMのDTT、0.33%のn−ドデシルマルトシド、および5%のDMSO、0.0083μCi/μL[0.25μM]UTP−[5,63H]、0.75μMのUTP、1.67U/μLのRNAsin(登録商標)。前記反応物を室温で1.5時間インキュベートした。STOP溶液(20μL;0.5MのEDTA、150ng/μLのtRNA)を添加し、続いて30μLのストレプトアビジン被覆PVTビーズ(20mMのトリス−HCl(pH7.5)、25mMのKCl、0.025%のNaN3中に8mg/mL)を添加した。続いてプレートを30分振盪した。CsClの溶液を添加し(70μL,5M)CsCl濃度を1.95Mにした。続いて前記混合物を1時間静置した。続いてビーズをヒューレットパッカードのトップカウント(登録商標)で計測した。異なる10のテスト化合物濃度での結果を基にして、標準濃度−%阻害曲線を作成して分析し、化合物のIC50を決定した。
本実験の結果は表Iに示されている。Kd値はテストした3つの化合物について両酵素で類似していたが、2つの酵素で得られたIC50値は顕著な相違を示し、基質親和性の違いを示している。
実施例8
蛍光偏光アッセイの特異性
関係が薄い別のウイルスポリメラーゼおよび近縁の遺伝子型(1a)のHCVポリメラーゼを用いて蛍光偏光アッセイの有用性を調べた。
GBV−Bポリメラーゼ酵素(GBV−BΔ23−His(配列番号3)と称される(J.N. Simons et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3401-3405; J. Bukh et al. 1999, Virology 262:470-478)を、以下の改変を加えながら実施例2に記載したように作製し精製した:
大腸菌株JM109(DE3)でpETベクターから遺伝子を発現させるために0.5mMのIPTGで22℃で3時間誘発した。細胞を採集し、緩衝液A(トリス−HCl(pH7.5)、10%グリセロール、1mMEDTA、2mMの2−メルカプトエタノール、500mMのNaCl、1mMのPMSF、1μg/mLのアンチパイン、1μg/mLのペプスタチンA、1μg/mLのロイペプチンおよび0.5%のドデシル−β−D−マルトシド)中でミクロ流動化装置で溶解させた。前記溶解物を30000gで遠心して清澄化し、続いてイミダゾールを最終濃度10mMで添加した。続いて10mMイミダゾールを含む緩衝液Aで予め平衡化させた金属キレート樹脂(Ni-NTA;Qiagen)に前記溶解物をロードし、さらに十分に洗浄し、続いて500mMのイミダゾールを含む緩衝液Aのグラジエントを用いて前記タンパク質を溶出させた。hisタグGBV−BΔ23を含むピーク分画をプールし、緩衝液C(20mMのトリス−HCl(pH7.5)、10%グリセロール、5mMのDTT、0.01%のドデシル−β−D−マルトシド)で希釈してNaCl濃度を300mMに低下させ、続いてDEAEセファロースに適用して一切の核酸を除去した。DEAEセファロースカラムのフロースルー物を緩衝液Cで希釈してNaClを200mMに減少させ、続いてヘパリン−セファロースカラムに適用した。200mMから1MのNaClグラジエントを含む緩衝液CでhisタグGBV−Bをヘパリン−セファロースから溶出させた。続いて、純粋なhisタグGBV−Bを含むピーク分画をプールし、−80℃で使用まで保存した。
HCVの遺伝子型1aのNS5Bポリメラーゼ(His−NS5BΔ21(H177c, 1a)(配列番号4)と称される(M. Yanagi et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8738-8743))を以下のような改変を加えながら実施例2に記載したように製造し精製した:
大腸菌株JM109(DE3)でpETベクターから遺伝子を発現させるために0.4mMのIPTGで22℃で3時間誘発した。細胞を採集し、緩衝液A(トリス−HCl(pH8.0)、10%グリセロール、1mMEDTA、2mMの2−メルカプトエタノール、500mMのNaCl、1mMのPMSF、1μg/mLのアンチパイン、1μg/mLのペプスタチンA、1μg/mLのロイペプチン、1%のドデシル−β−D−マルトシド、1%トリトンX−100および0.1%CHAPS)中でミクロ流動化装置により溶解させた。前記溶解物を30000gで遠心して清澄化し、続いてイミダゾールを最終濃度10mMで添加した。続いて10mMイミダゾール、0.1%NP−40、(CHAPSは含まない)および低濃度の他の洗剤(0.2%ドデシル−β−D−マルトシド、0.05%トリトンX−100)を含む緩衝液Aで予め平衡化させた金属キレート樹脂(Ni-NTA;Qiagen)に前記溶解物をロードし、さらに十分に洗浄した後、500mMのイミダゾールを含む緩衝液Aのグラジエントを用いて前記タンパク質を溶出させた。hisタグNS5BΔ21(H77c, 1a)を含むピーク分画をプールし、緩衝液C(20mMのトリス−HCl(pH8.0)、10%グリセロール、5mMのDTT、0.2%のドデシル−β−D−マルトシド)で希釈してNaCl濃度を300mMに低下させ、続いてDEAEセファロースに適用して一切の核酸を除去した。DEAEセファロースカラムのフロースルー物を緩衝液Cで希釈してNaClを200mMに減少させ、続いてヘパリン−セファロースカラムに適用した。200mMから1MのNaClグラジエントを含む緩衝液CでhisタグNS5BΔ21(H77c, 1a)をヘパリン−セファロースから溶出させた。続いて前記ポリメラーゼを含むピーク分画をプールし、さらに緩衝液Cで希釈してNaClの最終濃度を200mMにし、リソースSカラムにロードした。hisタグNS5B(H77c, 1a)を含むピーク分画をプールし、スーパーロース12カラムで600mMのNaClを含む緩衝液Cにロードしサイズ分画した。ピーク分画は高度に純粋なhisタグNS5Bを含有し、前記をプールして−80℃で使用まで保存した。
実施例3に記載したプロトコルによりGBV−BおよびHCV1aポリメラーゼを用いてプローブ(ii)の力価を測定した。図11および12は、それぞれGBV−BポリメラーゼおよびNS5B(H77c, 1a)ポリメラーゼで観察された力価曲線を示している。GBV−B酵素に対するプローブ(ii)のKd値は1.8μM(不完全曲線および0.21のrb値を用いて得られた概算値)であり、この関係の薄いポリメラーゼと本プローブとの弱い結合を示した。対照的に、HCV1aポリメラーゼに対するKdは18nMで、1a遺伝子型酵素はHCV1b遺伝子型のポリメラーゼと同じ親和性でプローブ(ii)と結合することを示した。一連の化合物に対するKd値は、これら2つのHCV(遺伝子型1aおよび1b)ポリメラーゼを用い実施例4に記載したアッセイ形式で決定した。
本実験の結果を表2に示す。これらの結果は本阻害剤シリーズに対するKd値は、遺伝子型が関連する2つのHCV酵素について同じ範囲内に存在することを示している。



表1
2つの異なるHCVNS5Bポリメラーゼに対する化合物のKdおよびIC50値の比較
Figure 0004646514
表2
2つのHCV遺伝子型由来NS5Bポリメラーゼに対する化合物のKd値の比較
Figure 0004646514
考察
HCVNS5BポリメラーゼはHCV複製阻害剤の探索において第一の目標である。HCVNS5Bの酵素活性は種々のRNA基質を用いてin vitroで調べられてきた(Behrens et al. 1996; およびその後の多くの文献)。別個のHCVポリメラーゼ調製物は,多様なRNA基質により多様な生成物形成効率を示す。概算によれば、通常の精製リコンビナントHCVNS5Bポリメラーゼ調製物のごくわずかな部分(<1%)だけがRNA基質と相互作用し、プロセッシング可能なRNA生成物の合成を再構成することができる(S.S. Carroll et al. 2000, Biochemistry, 39:8243-8249)。さらにまた、精製されたリコンビナントNS5Bポリメラーゼの活性は個々のRNA基質について顕著に変動する(前記は、おそらくこれらの基質により生産能力をもつ複製能保持複合体を形成することができるNS5Bの性能を反映する特性である)(W. Zhong et al. 2000, J. Virol. 74:9134-9143)。
未だ最適ではなく、さらに性状があまり明らかではないRNA基質を用いるHCVポリメラーゼアッセイの限界を克服するために、本出願人らは、RNAの存在に左右されないHCVポリメラーゼの特異的阻害剤のためのアッセイを開発した。本アッセイは、HCVポリメラーゼに特異的で性状が明らかな阻害剤を用いることを基本にしている。上記に提示した実施例では、阻害剤は蛍光性分で標識され、本プローブとNS5Bとの相互作用は蛍光偏光によって測定および定量される。しかしながら、前記相互作用はまた、放射能標識または阻害剤に付加した他の一般的な標識を使用し、さらに前記標識プローブと適切なタグを付加したHCVポリメラーゼとの結合を判定する一般的な技術を用いることによって測定することもできる。フルオレセイン標識プローブの結合平衡は、実施例3で結合プローブの割合がHCVポリメラーゼの量とともに増大するので極めて明瞭である。平衡状態にある成分を含むHCVポリメラーゼアッセイは、RNA基質を用いる従来のアッセイより有利である。なぜならば、生産能力をもつ複合体中でRNA基質と安定に結合する活性なHCVポリメラーゼは容易に解離することはないからである(S.S. Carroll et al. 2000, Biochemistry 39:8243-8249; W. Zhong et al. 2000, J. Virol. 74:9134-9143; L. Tomei et al. 2000, J. Gen. Virol. 81:759-767)。これらの標識プローブがHCVポリメラーゼから容易に解離するとはいっても、それらプローブは低nM解離定数でHCVポリメラーゼから容易に解離し、強力で特異的な阻害剤の検出に必要な感度を提供する。本アッセイ形式は、実施例4で示したように96ウェル(またはより高密度)のプレートでのスクリーニングに応用することができる。この高処理スクリーニング形式の特に有利な点は、本アッセイが特に簡便な非放射能形式で提供する極めて安定なシグナルおよび小さなウェル間の変動である。本アッセイにより、HCVポリメラーゼに特異的な阻害剤が特定され、さらに潜在能力が容易に判定された(図3および4)。
本明細書に開示した直接結合アッセイは酵素によるHCVポリメラーゼアッセイの限界を克服した。NS5Bのin vitroRNAポリメラーゼ活性はイオン強度に極めて感受性が高く、さらに100mMを越えるKClおよびNaCl濃度は反応を抑制する(V. Lohman et al. 1998, Virology 249:108-118; G. Luo et al. 2000, J. Virol. 74:851-63)。したがって、種々の塩濃度で阻害剤の潜在能力を決定する能力は、この標準的な酵素反応の限界によって制限される。本発明の直接結合アッセイは、実施例6に示したように塩濃度またはpHレベルの調節に適応させやすい。NS5B標的に対する特異的阻害剤の能力および反応は、酵素によるRNA重合反応実験では適切でない条件下(例えば二価陽イオンの非存在下)でも容易に判定することができる。
これまでのHCVポリメラーゼ酵素アッセイは、阻害剤の能力の代表的な測定値としてIC50を提供する。RNAまたはNTPのどちらかと競合する阻害剤の場合、IC50値はアッセイ中の基質濃度と比例し、前記の成分の濃度にしたがって変化するであろう。本明細書に開示したアッセイは、基質の濃度に関係なく一定の条件下で阻害剤の能力(Kd値によって表される)の直接測定を可能にする。N末端タグHis−NS5BΔ21またはC末端タグNS5BΔ21−Hisのどちらかを用いる酵素反応では、顕著に異なるIC50値が、同一の条件下でアッセイした同一の化合物について得られる。His−NS5BΔ21またはNS5BΔ21−Hisポリメラーゼはプライマー/鋳型RNA基質に対し異なる親和性を有し、それにより同一の化合物について異なるIC50をもたらす(実施例7、表1)。本発明で開示した直接結合アッセイによって実証された主要な利点は、前記相違は、個々の阻害剤が2つの異なるHCVポリメラーゼにより示す比較的類似するKd値によって調整されるということである。
本発明で開示した直接結合アッセイはまたHCVポリメラーゼ酵素に特異的であることが示された。プローブ(ii)に対して少なくとも100倍高いKdがBGV−Bポリメラーゼについて得られた実施例8は、このポリメラーゼと前記プローブの弱い結合およびHCVポリメラーゼとの特異的な結合を明示した。さらに、実施例8はまた、異なっているが臨床的に関連性を有する2つのHCV遺伝子型から得られたポリメラーゼは同様な親和性でプローブと結合することを示した。本発明の阻害剤直接結合アッセイは、これまでに記載されてきた通常のHCVポリメラーゼ酵素アッセイの多くの制限を緩和する。本出願人らは、競合プローブとして性状の明らかな阻害剤の使用が、NS5Bポリメラーゼに特異的な阻害剤の探索においてどのように多くの改良および利点を提供するかを立証した。本アッセイはHCV関連疾患の治療を目的とする候補薬剤の特定および性状決定を加速することができる。
図1は、はNS5BΔ21−Hisポリメラーゼによるプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析のための標準的な条件は実施例3に記載されている。前記ポリメラーゼに対するプローブ(i)のKd決定値は12.6nMである。 図2は、は蛍光偏光アッセイに対するZ’の評価を示す。標準条件を用いて、一連の陽性および陰性コントロールを96ウェルプレートによる変更アッセイで調べ、両コントロールの標準偏差(SD)を決定した。続いてZ’値を以下の計算から得た: Z’=1−(陽性コントロールの3SD+陰性コントロールの3SD) 平均陽性コントロール−平均陰性コントロール 図3は、蛍光偏光アッセイを用いた化合物AおよびBのKd決定を示す。96ウェルプレートによる偏光アッセイ(実施例4参照)の標準的条件を使用して化合物のKd値を決定した。化合物AおよびBについて得られたKd値はそれぞれ31および41nMで、Qb/Qf値は0.67および0.72である。 図4は、蛍光偏光アッセイを用いた化合物CおよびDのKd決定を示す。96ウェルプレートによる偏光アッセイ(実施例4参照)の標準的条件を使用して化合物のいくつかのKd値を決定した。化合物CおよびDについて得られたKd値はそれぞれ231nMおよび1.08μMで、Qb/Qf値は0.74および0.66である。 図5は、NaCl濃度(30mM)中でNS5BΔ21−Hisを用いた場合のプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析の標準的条件は実施例3に記載されている。このポリメラーゼについて得られたKd値は15.3nM(30mMのNaCl)である。 図6は、NaCl濃度(100mM)中でNS5BΔ21−Hisを用いた場合のプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析の標準的条件は実施例3に記載されている。このポリメラーゼについて得られたKd値は39nM(100mMのNaCl)である。 図7は、NaCl濃度(150mM)中でNS5BΔ21−Hisを用いた場合のプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析の標準的条件は実施例3に記載されている。このポリメラーゼについて得られたKd値は78nM(150mMのNaCl)である。 図8は、NaCl濃度(200mM)中でNS5BΔ21−Hisを用いた場合のプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析の標準的条件は実施例3に記載されている。このポリメラーゼについて得られたKd値は122nM(200mMのNaCl)である。 図9は、リン酸緩衝液(pH6.5)でのNS5BΔ21−Hisポリメラーゼによるプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析の標準的な条件は実施例3に記載されている。前記ポリメラーゼに対するプローブ(i)のKd値はこれらの条件下で33nMである。 図10は、はHis−NS5BΔ21ポリメラーゼによるプローブ(i)の力価測定を示す。蛍光異方性分析のための標準的な条件は実施例3に記載されている。N末端にタグを有するこのポリメラーゼに対するプローブ(i)のKd値は18.1nMである。 図11は、はGBV−BΔ23−Hisポリメラーゼによるプローブ(ii)の力価測定を示す。蛍光異方性分析のための標準的な条件は実施例3に記載されている。関係の薄い前記ポリメラーゼに対するプローブ(ii)のKd値は1.79μMである(不完全曲線により概算した値)。 図12は、His−NS5BΔ21(H77c,HCV遺伝子型1a)ポリメラーゼによるプローブ(ii)の力価測定を示す。蛍光異方性分析のための標準的な条件は実施例3に記載されている。このHCV遺伝子型1aポリメラーゼに対するプローブ(ii)のKd値は18.2nMである。
配列表
Figure 0004646514
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Claims (19)

  1. HCVポリメラーゼ阻害剤を特定する方法であって、
    a)HCVポリメラーゼを、HCVポリメラーゼと結合することができるプローブと接触させ、前記ポリメラーゼと結合した前記プローブを含む複合体を形成する工程であって、前記プローブは前記ポリメラーゼの阻害剤で置き換えられることができる工程、
    b)前記複合体中の前記プローブから放出されるシグナルを測定して基線レベルを確立する工程、
    c)工程a)の生成物とテスト化合物をインキュベートする工程、
    d)前記複合体のシグナルを測定する工程、及び
    e)工程d)のシグナルと工程b)のシグナルとを比較する工程であって、それによって、前記シグナルの変動が前記テスト化合物と前記ポリメラーゼとの結合を示す工程
    を含み、
    前記プローブが下記式(IIa):
    Figure 0004646514
    (式中、
    1は(C5-6)シクロアルキルであり;
    2はフェニルまたHetであり、両者は場合によってR20で置換され;
    20は以下のように定義され:
    −ハロゲン、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルから選択される1つから4つの置換基;または
    −下記のa)−l)から選択される1つから4つの置換基:
    a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換される);
    b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
    e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、R112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Het、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
    f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Hetまたは複素環は場合によってR150で置換される);
    h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、それぞれH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
    i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    j)COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
    l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される);
    150は以下であり:
    −ハロゲン、NO2、シアノまたはアジドから選択される1つから3つの置換基;または
    −下記のa)−k)から選択される1つから3つの置換基:
    a)(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される);
    b)OR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
    d)SR108、SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Hetおよび複素環は場合によってR160で置換される);
    e)NR111112(ここでR111はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、R112はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキル、COOR115またはSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルである)であるか;またはR111およびR112は両者が一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
    f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルおよび(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);
    g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
    h)NR121COCOR122(ここでR121は、H、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキル(前記アルキルおよびシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
    i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルおよびシクロアルキルは場合によってR160で置換される);
    j)COOR128(ここでR128はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記(C1-6)アルキルおよび(C3-7)シクロアルキルは場合によってR160で置換される);さらに
    k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキルおよび複素環は場合によってR160で置換される);
    ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義され:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する);
    11は、OPO3H、NO2、シアノ、アジド、C(=NH)NH2、C(=NH)NH(C1-6)アルキルまたはC(=NH)NHCO(C1-6)アルキルであるか;または下記のa)−l)であり:
    a)R150aで置換された(C1-6)アルキル、ハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、C3-7スピロシクロアルキル(場合によって1つまたは2つのへテロ原子を含む)、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR150で置換され、ここでR150aはR150と同じであるが、ただしハロゲンではない)、OR150b、COOR150b、N(R150b2(ここでR150bはHまたはC1-6アルキルである);
    b)OR104(ここでR104は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    c)OCOR105(ここでR105は、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    d)SO3H、SO2N(R1082またはSO2N(R108)C(O)R108(ここで各R108は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、または両R108は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
    e)NR111112(ここでR111は、R150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、さらにR112はH、CN、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR111はHであり、さらにR112はSO2115(ここでR115は(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetである)であるか、またはR111およびR112は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
    f)NR116COR117(ここでR116およびR117は各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    g)NR118CONR119120(ここでR118、R119およびR120は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR118はR119と共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成するか;またはR119およびR120は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し;前記アルキル、シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールもしくは(C1-6アルキル)Het、または複素環は場合によってR150で置換される);
    h)NR121COCOR122(ここでR121およびR122は、各々H、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、6または10員アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であるか;またはR122はOR123またはN(R1242であり、ここでR123および各R124は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、または(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR124はOHまたはO(C1-6アルキル)であるか、または両R124は一緒に共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
    i)COR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    j)COOR128(ここでR128は、HまたはR150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される);
    k)CONR129130(ここでR129およびR130は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであるか、またはR129およびR130の両方は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員飽和複素環を形成し、前記アルキル、シクロアルキル、アルキル−シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリール、(C1-6アルキル)Hetおよび複素環は場合によってR150で置換される);
    l)アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Het(前記の全ては場合によってR150で置換される))
    によって表される化合物、その塩、鏡像体、ジアステレオ異性体または互変異性体から選択され、
    前記化合物が場合によって、
    a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
    b)R1を除く任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
    c)R1を除く任意の適切な位置で親和性タグに連結される
    ことを特徴とする方法。
  2. 前記プローブが、請求項1に示される式(IIa)(式中、
    1は(C5-6)シクロアルキルであり;
    2はフェニルまたHetであり;
    11はCOR127(ここでR127はH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)又はCOOR128(ここでR128は、HまたはR150で置換された(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールまたは(C1-6アルキル)Hetであり、前記(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル、アリール、Het、(C1-6アルキル)アリールおよび(C1-6アルキル)Hetは場合によってR150で置換される)であり;
    150は(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される)又はOR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であり;
    ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義される:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する))
    を有する化合物又はその塩であり、
    前記化合物が場合によって、
    a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
    b)R1を除く任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
    c)R1を除く任意の適切な位置で親和性タグに連結される
    ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  3. 前記プローブが下記式(IIa’):
    Figure 0004646514
    (式中、
    1は(C5-6)シクロアルキルであり;
    2はフェニルまたHetであり、両者は場合によってR20で置換され(R20は請求項1で定義されたとおりである);
    150は(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される)又はOR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であり;
    ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義される:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する))
    を有する化合物又はその塩であり、
    前記化合物が場合によって、
    a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
    b)R1を除く任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
    c)R1を除く任意の適切な位置で親和性タグに連結される
    ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  4. 前記プローブが下記式:
    Figure 0004646514
    (式中、
    150は(C1-6)アルキルまたはハロアルキル、(C3-7)シクロアルキル、(C2-6)アルケニル、(C2-8)アルキニル、(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキル(前記の全ては場合によってR160で置換される)又はOR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であり;
    ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義される:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOR161、OR161、N(R1622、SO2N(R1622またはCON(R1622(ここでR161および各R162は、それぞれ別個にH、(C1-6)アルキル、(C3-7)シクロアルキルまたは(C1-6)アルキル−(C3-7)シクロアルキルであるか;または両R162は一緒に共有結合しさらにそれらが結合している窒素と共有結合して5、6または7員の飽和複素環を形成する))
    を有する化合物又はその塩であり、
    前記化合物が場合によって、
    a)任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
    b)任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または c)任意の適切な位置で親和性タグに連結される
    ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  5. 前記プローブが下記式:
    Figure 0004646514
    (式中、
    150はOR104(ここでR104はH、(C1-6)アルキルまたは(C3-7)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルは場合によってR160で置換される)であり;
    ここで、R160は以下から選択される1つまたは2つの置換基と定義される:ハロゲン、CN、C1-6アルキル、ハロアルキル、COOH、OH、NH2、SO2NH2またはCONH2である)
    の化合物又はその塩であり、
    前記化合物が場合によって、
    a)フェニル中の任意の適切な位置で放射性同位元素により標識されるか;
    b)フェニル基中の任意の適切な位置で適切なリンカーにより検出可能な成分に連結されるか;または
    c)フェニル基中の任意の適切な位置で親和性タグに連結される
    ことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
  6. 前記検出可能な標識が、蛍光標識、放射性原子、化学発光標識および発色標識から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
  7. 前記標識が蛍光標識または化学発光標識である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記蛍光標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ダンシル、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリンおよびEu3+から成る群から選択される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記蛍光標識がフルオレセインである、請求項1に記載の方法。
  10. 前記検出可能標識が蛍光レポーター/クエンチャー対である、請求項1に記載の方法。
  11. 前記レポーター/クエンチャー対が、EDANS/DABCYL、トリプトファン/2,4−ジニトロフェニル、トリプトファン/DANSYL、7−メトキシクマリン/2,4−ジニトロフェニル、2−アミノベンゾイル/2,4−ジニトロフェニルおよび2−アミノベンゾイル/3−ニトロチロシンから成る群から選択される、請求項10に記載の方法。
  12. 前記放射性原子が3H、14Cおよび125Iから選択される、請求項6に記載の方法。
  13. 前記プローブが下記から選択される請求項2に記載の方法:
    Figure 0004646514
    Figure 0004646514
    Figure 0004646514
  14. HCVポリメラーゼの阻害剤を特定するアッセイの開発における、請求項2に記載の式IIaのプローブの使用。
  15. HCVポリメラーゼを阻害する化合物を特定する方法であって、
    a)前記HCVポリメラーゼを請求項13に記載のプローブと接触させて、前記ポリメラーゼと結合した前記プローブを含む複合体を形成する工程、
    b)前記複合体のシグナルを測定して基線レベルを確立する工程、
    c)工程a)の生成物とテスト化合物をインキュベートする工程、
    d)前記複合体のシグナルを測定する工程、及び
    e)工程d)のシグナルと工程b)のシグナルとを比較する工程であって、それによって、前記シグナルの変動は前記テスト化合物が前記ポリメラーゼを阻害することを示す工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  16. 以下の工程を含むHCVポリメラーゼを阻害することができる化合物を特定する方法: f)請求項15に記載の工程(a)から(e)を高処理スクリーニングで繰返す工程。
  17. HCVポリメラーゼが、NS5B、NS5BΔ21およびNS5BΔ57並びにHCVポリメラーゼ活性を有するそれらの類似体から成る群から選択される、請求項15に記載の方法。
  18. 前記HCVポリメラーゼがHCV−1aまたはHCV−1b遺伝子型株から得られ、前記が場合によってそのNまたはC末端のどちらかにヒスチジンタグを有する請求項15に記載の方法。
  19. HCVポリメラーゼと結合する潜在能力を有する化合物をテストするキットであって、前記キットが、請求項2に記載の式(IIa)のプローブおよび、前記ポリメラーゼと結合するテスト化合物を特定するために前記プローブを使用する態様についての指示を含むことを特徴とする前記キット。
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