CN106996977A - 一种测量蛋白质降解速率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物化学领域，涉及新的测量细胞内蛋白质降解的方法，包括：用甲硫氨酸类似物将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团；在不同的时间点裂解细胞，通过SPAAC反应将特定的可被识别的分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上；利用免疫沉淀法将所述可被识别的分子偶联的蛋白质沉淀：用均相时间分辨荧光共振原理对免疫沉淀前后样品溶液中目标蛋白定量，用差减法得出被标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例，从而确定目标蛋白的降解速率。该方法可进行非同位素依赖的，不依赖蛋白标签的，针对内源性蛋白并与高通量筛选兼容的蛋白质降解测量。可用于筛选疾病蛋白降解相关药物等。

Description

一种测量蛋白质降解速率的方法
技术领域
本发明属生物化学领域，涉及测量细胞内蛋白质降解的方法，具体涉及一种基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率的方法。该方法在多个方面明显优于已有的测量细胞内蛋白质降解的方法。
背景技术
本领域公知，蛋白质降解其相关参数(降解速度及半衰期等)对理解蛋白质功能、小分子调控物对蛋白的预期作用、以及针对特定疾病蛋白的降解研发药物有着重要意义。目前研究报道的蛋白质降解途径主要有蛋白酶体降解以及溶酶体降解两种途径。研究显示，蛋白质通过上述两种途径的降解异常时，均可能产生疾病。例如，多种神经退行性疾病(如亨廷顿病等)由变异蛋白的错误折叠及不正常降解引起，而增强溶酶体或蛋白酶体对疾病蛋白的降解在疾病细胞及动物模型中可以有效的治疗这些疾病[Boxun Lu,Ismael Al-Ramahi,Antonio Valencia,Qiong Wang,Frada Berenshteyn,Haidi Yang,Tatiana Gallego-Flores,SalahIchcho,Arnaud Lacoste,Marc Hild,Marian DiFiglia,Juan Botas&JamesPalacino,(Lu,Al-Ramahi et al.2013),NATURE NEUROSCIENCE 16,562–570，May 2013]。近年多项研究表明，溶酶体降解的不正常，是导致多种癌症的原因之一[Mariaand Marja(Hoyer-Hansen and Jaattela 2008),AUTOPHAGY 4(5),574-580,2008]。
经典的蛋白质降解检测方法主要利用同位素35S标记进行脉冲-示踪实验(Pulse-chase)。其原理在于，利用同位素35S标记新合成的蛋白，之后通过目标蛋白的抗体沉淀目标蛋白，再通过电泳胶上分离得到目标蛋白的位置，最后可以通过同位素信号强弱随时间变化追踪被标记目标蛋白的降解。实践显示，该经典的蛋白质降解检测方法其存在的主要缺陷有：一、需要利用同位素，对实验人员健康及安全有一定影响，并对实验室要求较高；二、操作流程复杂，需要免疫沉淀、电泳分离等高通量不兼容的实验步骤，使得利用此方法进行针对蛋白降解的高通量筛选变得不可能。
近年来有研究利用蛋白质翻译阻断剂放线菌酮研究蛋白降解，其优点是操作方便，并且有可能进行高通量筛选；但缺点主要是：一、放线菌酮阻断所有蛋白翻译，非特异性强；二、放线菌酮具有很高的细胞毒性，处理9个小时即导致大规模细胞死亡，因此不适用于降解速度较慢的蛋白；而另一方面，很多神经退行性疾病蛋白降解缓慢。
近年来有研究公开了CuAAC反应(copper-catalyzed azide-alkynecycloadditions[])被发现可以用于标记细胞内新合成蛋白，并用于研究细胞内蛋白降解[Boxun Lu,Ismael Al-Ramahi,Antonio Valencia,Qiong Wang,Frada Berenshteyn,Haidi Yang,Tatiana Gallego-Flores,Salah Ichcho,Arnaud Lacoste,Marc Hild,Marian DiFiglia,Juan Botas&James Palacino,
Identification of NUB1as a suppressor of mutant Huntingtin toxicityvia enhanced protein clearance,NATURE NEUROSCIENCE 16,562–570，May2013]。然而，由于其基于铜催化的点击化学反应，导致蛋白构像变化，不能被抗体有效识别，导致跟后续高通量检测方法不兼容，依然无法达到高通量检测蛋白降解的目的。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的测量细胞内蛋白质降解的方法，尤其是一种基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率的方法。该方法在多个方面明显优于已有的测量细胞内蛋白质降解的方法。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种新的测量细胞内蛋白质降解的方法，尤其是一种基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率的方法。该方法可以进行非同位素依赖的，不依赖蛋白标签的，针对内源性蛋白并与高通量筛选兼容的蛋白质降解测量。
本发明的方法依据如下原理：利用L-azidohomoalanine和SPAAC反应，将特定时间点被标记而未被降解的蛋白标记上特定的可被识别的分子(例如生物素)，之后，再利用与偶联的分子特异性结合的识别化合物(例如与生物素特异性结合的链霉亲和素)进行免疫沉淀，从而将被标记的目标蛋白从反应体系中沉淀出来，在免疫沉淀前后的反应体系中加入荧光基团标记了的识别化合物抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理(HTRF，[Gérard Mathis,Technology,JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING 4(6),309-313]对目标蛋白进行定量，再通过差减法运算确定目标蛋白的降解速率。
所述的HTRF的原理，其在于利用含稀土族元素铽或铕的荧光供体及XL665或D2荧光受体在空间距离足够接近时(约8纳米)会产生稳定的时间分辨荧光共振信号，被特定仪器检测(如PerkinElmer生产的Envision等)。
本发明中可用的荧光共振包括，含稀土族元素铽或铕的荧光供体标记的目标蛋白抗体，以及XL665或D2荧光受体标记的目标蛋白抗体。
具体的，本发明提供了一种测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其包括步骤：
(1)将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团；
(2)在降解过程中的不同时间点，利用环张力催化的点击化学反应(SPAAC反应)将特定的可被识别的分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上；
(3)利用基于高通量差减法得出目标蛋白的降解速率。
更具体的，本发明的测量细胞内蛋白质降解的方法，其特征在于，基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率，它包括步骤：
(1)利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine(如图1所示)将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团；
(2)洗去细胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的时间点裂解细胞，通过SPAAC反应将特定的可被识别的分子(例如生物素)偶联在未降解的被标记了的蛋白质的叠氮小分子基团上；
(3)通过免疫沉淀等方法，利用链霉亲和素磁珠特异性结合步骤(2)中可被识别的分子生物素从而将标记的目标蛋白沉淀下来；
(4)在免疫沉淀前后的反应体系中加入荧光共振基团标记了的目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理高通量高精度特异性地对目标蛋白进行定量，利用差减法计算出被标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例，从而确定目标蛋白的降解速率。
本发明所需和各种生化试剂均可在多家生物及化学公司购得，亦可人工合成。
本发明的一个实施例中，以生物素和与之特异性结合的链酶亲和素为例，基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率：首先，利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团，将细胞在无L-甲硫氨酸的培养液中培养一小时后，可耗尽胞内处于自由状态的甲硫氨酸；之后，加入L-azidohomoalanine可将细胞内新合成蛋白中的L-甲硫氨酸均替换成L-azidohomoalanine，从而达到将细胞内新合成的蛋白质标记上叠氮小分子基团的效果；该步骤适用于各种细胞；然后，利用培养液的更换，洗去细胞外的L-azidohomoalanine，因此，含有叠氮小分子基团的蛋白不断被细胞降解，而培养液更换后新合成的蛋白不会被重新标记；继而，在不同的时间点裂解细胞，通过SPAAC反应将生物素分子偶联在未降解的被标记了的蛋白质的叠氮小分子基团上，用于下一步的免疫沉淀；继续利用链霉亲和素磁珠能特异性结合生物素，通过免疫沉淀将被生物素偶联的蛋白质从反应体系中沉淀出来，即将标记的目标蛋白从反应体系中全部沉淀出；最后利用高通量药筛常用的均相时间分辨荧光共振原理(HTRF)对免疫沉淀前后目标蛋白进行高通量的、高精度的、特异性的定量，再利用差减法计算出标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例，从而准确的检测蛋白降解。
本方法的显著效果和优点在于：
1)将两种目标蛋白的抗体分别标记上荧光供体及荧光受体，只有同时与两种目标蛋白抗体特异性结合的蛋白，才会产生荧光共振信号，再利用差减法运算从而达到测量被标记蛋白降解速率的目的(如图2所示)；
2)从理论上说，与目标蛋白结合的蛋白会对信号产生一定的干扰，但是考虑到荧光共振所学空间距离很近，随距离增加衰减很快，所以通过结合蛋白间接产生的荧光共振信号很弱，在大多数情况下无明显影响；
3)通过差减法能够稳定高效得到特异性的被标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例(如图3所示)。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的一种测量蛋白质降解速率的方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1是甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine结构图。
图2显示利用差减法运算达到测量被标记蛋白降解速率的目的流程图。
图3显示通过差减法能稳定高效得到特异性的被标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例，其中，
(a)检测标记蛋白的特异性：沉淀差减法得到的带标记的蛋白所占总蛋白的百分比(Chase Signal)是依赖于AHA处理的，因此是特异性地检测被标记蛋白；在293T细胞的蛋白裂解液加入AHA处理进行SPAAC反应和没有AHA处理的蛋白裂解液，显示TR-FRET检测目标蛋白信号(chase signal)是非常明显的(第一柱)；在HD病人成纤维细胞(hFB_Q68)的蛋白裂解液加入AHA处理进行SPAAC反应和没有AHA处理的蛋白裂解液，显示TR-FRET检测目标蛋白信号是非常明显的(第二柱)；所使用的TR-FRET抗体对：对HEK293细胞是2B7/4C9，对hFB_Q68是2B7/MW1；平均值±标准差，N＝4；
(b)检测标记HTT蛋白的特异性：在hFB_Q68中利用siRNA敲低HTT后(Negversus HTT)，可以观察到在磁珠免疫沉淀前，TR-FRET信号明显降低(第一对柱，Pre-IP)，利用沉淀差减法测量得到的标记的HTT蛋白信号(第二对柱，Chase)也明确检测到HTT的敲低；所使用TR-FRET抗体对是2B7/MW1，平均值±标准差，N＝3。
图4是通过差减法计算，检测出HEK293细胞中HTT蛋白的降解曲线以及蛋白酶体抑制剂对降解的影响，其中，
(a)利用基于沉淀差减法的脉冲-追踪实验测得了HEK293细胞中HTT蛋白的降解曲线，与理论一致，呈指数下降趋势，指数拟合Adj.R-Square＝0.97233，平均值±标准差，N＝4；
(b)抑制蛋白酶体对野生性Htt降解的影响，观察到了蛋白酶体阻断剂对降解的阻断作用。
图5是检测出亨廷顿病人皮肤成纤维8细胞中mHtt蛋白降解曲线以及影响其降解的siRNA，其中，显示了利用基于沉淀差减法的脉冲-追踪实验测得了hFB Q68细胞中mHTT蛋白的降解曲线，以及某个已知HTT调控基因siRNA对其降解的影响，与理论一致，呈指数下降趋势，指数拟合Adj.R-Square＝0.8894，平均值±标准差，N＝9。
具体实施方式
实施例1叠氮小分子基团对细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记
在小鼠的STHdh等多种细胞中，甲硫氨酸是合成蛋白质的必需氨基酸；L-azidohomoalanines是一种带有叠氮基的甲硫氨酸类似物；在数个培养皿中铺上相同数目的细胞，用完全培养液培养24小时，移去完全培养液，用PBS洗一次。使用购自Life Technologies公司不含甲硫氨酸的培养液对细胞进行一小时饥饿处理，使细胞内原有的甲硫氨酸完全消耗，然后加入带有叠氮基的甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine，使培养液中其终浓度为1‰，培养12小时，这12小时中细胞内新合成的蛋白质会被L-azidohomoalanine标记，从而带有叠氮基。12小时后收取第一个时间点的细胞，并将其余培养皿中的细胞用PBS洗后换成完全培养液。之后根据具体研究目的，每隔一定时间收取一皿细胞。收到的细胞在冰上用裂解液(1％SDS in 50mM Tris-HCl,pH 8.0with EDTA-free cocktailprotease inhibitor)裂解30分钟，10％功率超声裂解产物10s,Vortex震荡产物5分钟,18000g离心5分钟，对上清进行蛋白定量。这样我们就得到了在同一时间点被叠氮基标记，降解时间可控，可以反映一定时间长度内蛋白降解情况的蛋白样品。
实施例2
通过SPAAC反应将生物素分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上：
SPAAC反应是指环化张力催化叠氮化物和端基炔发生环加成反应，利用环化张力催化标记了叠氮基团而未被降解的蛋白质的叠氮基团与带有生物素的端基炔反应，实现蛋白质被生物素标记。SPAAC优于CuAAC,是因为Cu存在可能影响蛋白质的空间构象而SPAAC不引入任何影响蛋白质构象的因素；
SPACC反应体系为：在蛋白浓度为1.65ug/ul的蛋白裂解液中加入终浓度为5uMClick-iT DIBO-biotin,充分混匀之后，在37℃避光孵育1h。反应完成后在实施例1中被叠氮基标记而未降解的蛋白质被生物素标记。在不同的时间点取得蛋白裂解液，可以用于测量不同时间点降解所剩蛋白的蛋白量。
实施例3
利用免疫沉淀将标记生物素的目标蛋白析出实施例2的反应体系：
链霉亲和素(Streptavidin)和生物素(Biotin)具有特异性结合的性质。取1/2体积的实施例2的反应体系加入购自Life Technologies公司的Piercestreptavidin Magnetic Beads，使用振荡器在4℃震荡4h。反应结束后，在实施例2中被生物素标记的蛋白质全部被Pierce streptavidin Magnetic Beads特异性结合从而从实施例2的反应体系中析出。从而使得1/2体积的实施例2的反应体系中被标记的目标蛋白全部吸附在Pierce streptavidin MagneticBeads上。
实施例4
利用均相时间分辨荧光共振原理对免疫沉淀前后目标蛋白进行定量：
取实施例3的反应体系以及未进行免疫沉淀的实施例2反应体系分别进行反应，在反应中我们加入荧光基团标记了的目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理(HTRF)，对未降解的目标蛋白进行高通量、高精度、特异性的定量，再根据相同体积的实施例2和实施例3中目标蛋白量进行差减法运算从而准确地检测蛋白降解；
在384孔板中分别加入相同体积浓度的含有一定量被生物素标记的蛋白样以及免疫沉淀后蛋白样，加入溶解在含400mM氟离子缓冲液中的含有荧光受体D2标记的目标特异性抗体1(MW1-D2，1.4ng/μl)和铽穴状化合物(TerbiumCryptate)标记的目标蛋白特异性抗体2(2B7-Tb，0.023ng/μl)，孵育1～2小时候后在PerkinElmer Envision仪器上检测荧光共振信号，只有既被目标特异性抗体1，又能被特异性抗体2特异性结合的蛋白，才会产生荧光共振信号；
根据差减法运算得到被标记目标蛋白的比例，因此，根据不同降解时长蛋白样的荧光共振信号可以定量反映蛋白降解速度；
按照实施例步骤，通过差减法计算，检测出HEK293细胞中HTT蛋白的降解曲线以及蛋白酶体抑制剂对降解的影响(如图4所示)；检测出亨廷顿病人皮肤成纤维8细胞中mHtt蛋白降解曲线以及影响其降解的siRNA(如图5所示)。

Claims (8)

1.一种测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，该方法基于SPAAC反应及能量转移均相时间分辨荧光共振的差减法高效检测蛋白质降解速率：其包括步骤：
(1)将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团；
(2)在降解过程中的不同时间点，利用环张力催化的点击化学反应(SPAAC反应)将特定的可被识别的分子偶联在蛋白质的叠氮小分子基团上；
(3)利用基于高通量差减法得出目标蛋白的降解速率。
2.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，利用甲硫氨酸类似物L-azidohomoalanine将细胞内新合成的蛋白质的甲硫氨酸标记上叠氮小分子基团。
3.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，洗去细胞外的L-azidohomoalanine后，在不同的时间点裂解细胞，通过SPAAC反应将特定的可被识别的分子偶联在未降解的被标记了的蛋白质的叠氮小分子基团上。
4.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，通过免疫沉淀方法，利用链霉亲和素磁珠特异性结合步骤(2)中可被识别的分子从而将标记的目标蛋白沉淀下来。
5.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，在免疫沉淀前后的反应体系中加入荧光共振基团标记了的目标蛋白抗体，利用均相时间分辨荧光共振原理高通量高精度特异性地对目标蛋白进行定量，利用差减法计算出被标记的目标蛋白占总目标蛋白的比例，从而确定目标蛋白的降解速率。
6.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，所述的可被识别的分子是生物素。
7.按权利要求1所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，其中，所述的差减法是利用免疫沉淀方法将可被识别的分子偶联的蛋白质进行沉淀；利用均相时间分辨荧光共振原理(HTRF)高通量技术对免疫沉淀前后样品溶液中目标蛋白进行定量测量标记的方法。
8.按权利要求5所述的测量蛋白质降解速率的方法，其特征在于，所述的荧光共振选自含稀土族元素铽或铕的荧光供体标记的目标蛋白抗体，以及XL665或D2荧光受体标记的目标蛋白抗体。
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