CN101503475B - 炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列和融合蛋白的氨基酸残基序列，含有所述编码序列的细菌细胞；本发明的融合蛋白包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)，在不改变融合蛋白特性的前提下，该融合蛋白可以进行部分氨基酸的替换、插入或缺失；本发明的融合蛋白的第一区和第二区之间设置通式为(Gly Gly Gly GlySer)n(n为1-10的整数)的连接肽；本发明还提供了融合蛋白的用途：中和炭疽毒素。本发明的融合蛋白具有中和炭疽毒素的能力，能够用于炭疽的治疗和预防。
Description
技术领域
本发明主要涉及生物技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其应用，尤其涉及炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的融合蛋白及其用于炭疽毒素的中和。
背景技术
炭疽毒素包括两种A-B型毒素，每种都有不同的催化部分，既水肿因子(EF，edema factor)和致死因子(LF，lethal factor)。两个催化部分共享一个结合的B部分，保护性抗原(PA，protective antigen)，结合后的完整毒素称为水肿毒素(ET，edema toxin)和致死毒素(LT，lethal toxin)。炭疽对机体的伤害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT进入细胞发挥作用的过程如下：首先是PA与细胞表面受体(ATR，anthrax toxin receptor)在细胞表面结合，随后furin蛋白酶就将PA降解成20kD和63kD的两个组分。PA63在细胞膜表面形成七聚体，炭疽致死因子和炭疽水肿因子结合在PA七聚体上，经过受体介导的内吞进入细胞质与底物接触从而发挥其毒性作用。
根据以上的炭疽毒素进入细胞的机理，人们设计了不同的炭疽毒素抑制剂，分别将毒素作用过程中涉及的不同分子作为靶标，从而阻断毒素的作用，保护细胞免受毒素的攻击。
LFn是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域，负责致死因子与炭疽保护性抗原的结合。LFn由炭疽致死因子的1-263位残基组成。EFn是炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域，负责水肿因子与炭疽保护性抗原的结合。EFn由炭疽水肿因子的1-254位残基组成。重组表达的LFn和EFn仍然具有结合炭疽保护性抗原的能力，但对细胞无毒性作用。LFn和EFn能够与炭疽致死因子和炭疽水肿因子竞争结合炭疽保护性抗原，具有作为竞争性毒素抑制剂的潜力。但实验显示，它们的毒素抑制活性非常低。
发明内容
本发明的目的：在LFn和EFn的基础上，提供一种具有更强炭疽毒素抑制(中和)活性的LFn与EFn的融合蛋白。
本发明的LFn与EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)或上述二区的功能同等物。
所述的功能同等物是指在不改变融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。
在本发明所指的融合蛋白中，可以是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的N-末端，炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的第二区位于融合蛋白的C-末端。也可以是炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)的第二区位于位于融合蛋白的N-末端，炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的C-末端。这两种情况对融合蛋白的毒素中和活性没有太大的影响。
为了使融合蛋白的两部分尽可能的减少互相干扰，融合蛋白的两个部分之间设置连接肽，连接肽的通式是(Gly Gly Gly GlySer)n，n为1-10的整数。编码本发明融合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。
该序列包括与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第一区和与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同，第二区与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同，中间设有(Gly Gly Gly GlySer)3连接肽的编码序列。携带融合蛋白编码序列的重组表达载体(图1)和工程菌。
本发明的重组表达载体包括pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn等。将上述表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到工程菌BL21(DE3)-pET21a-LFnEFn和BL21(DE3)-pET21a-27LFnEFn。
本发明的应用。
本发明将LFn和EFn通过一段(Gly Gly Gly GlySer)3的柔性Linker序列融合在一起，构建的融合蛋白经过细胞保护实验和毒素攻毒的动物实验检测，结果显示其具有的毒素中和活性较单体有很大的提高(图3)，可以有效中和炭疽毒素的作用。
附图说明
图1.含融合蛋白编码基因的重组质粒pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn的构建示意图；
图2.本发明融合蛋白的表达纯化图.
图2-1：融合蛋白LFn/EFn的表达纯化。1，未诱导全菌；2、诱导全菌；3、离子交换纯化产物；4、Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker(kDa)
图2-2：融合蛋白27LFn/EFn的表达纯化。1，未诱导全菌；2、诱导全菌；3、离子交换纯化产物；4、Ni柱和凝胶过滤产物。5、蛋白Marker(kDa)
图3.本发明融合蛋白的细胞保护活性图；
具体实施方式
实施例1：LFn编码序列的扩增
使用PCR方法从质粒pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了BamH I的酶切位点和编码(Gly Gly Gly GlySer)3连接肽的编码序列。
LF5：5’-aaccatatggcgggcggtcatggtgatgta-3’
LFn3-Linker：
5’-aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc-
-gttgatctttaagttcttc-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl.PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。
实施例2：27LFn编码序列的扩增
27LFn是指去除了N端27个氨基酸残基的LFn。使用PCR方法从质粒pAS22-LF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物25LFn5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了BamH I的酶切位点和编码(Gly Gly Gly GlySer)3连接肽的编码序列。
27LFn5：5’-aaccatatgcgaaataaaacacaggaagagc-3’
LFn3-Linker：
5’-aagggatccagagcccccgccaccagagcccccgccaccagagcccccgccacccc-
-gttgatctttaagttcttc-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl. PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。
实施例3：EFn编码序列的扩增
使用PCR方法从质粒pAS22-EF(本研究室构建)扩增出炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域的编码序列，所用的引物LF5和LFn3-Linker使用DNA合成仪合成，引物LFn5的5’端添加了Nde I的酶切位点，引物LFn3-Linker的5’端添加了Xho I的酶切位点。
EF5：5’-aacggatccatgaatgaacattacactgagagtgatattaaaag-3’
LFn3-Linker：5’-aacctcgagaccttctttcttcaaactttcacttattttc-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的Vent DNA聚合酶(NEB)，20μM的LF5和LFn3-Linker各2μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl.PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，纯化。
实施例4：连接肽为(Gly Gly Gly GlySer)3时LFn/EFn融合蛋白表达载体的构建。
取2μg的LFn的使用实施例1中引物扩增得到的LFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的LFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI)纯化LFn编码序列的双酶切产物。
取800ng的pET21a(Novagen公司)载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a的双酶切产物。
连接反应：取3μl经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物，加入5μl经过纯化的LFn的Nde I和BamHI双酶切产物，1μl的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pE T21a-LFnLinker。
取2μg的使用实施例3中引物扩增得到的EFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的EFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Xho I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化EFn编码序列的双酶切产物。
取800ng的pET21a-LFnLinker载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a-LFnLinker载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的XhoI和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶切产物。
连接反应：取3μl经过纯化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I双酶切产物，加入5μl经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物，1μl的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-LFnEFn。
实施例5：连接肽为(Gly Gly Gly GlySer)3时27LFn/EFn融合蛋白表达载体的构建。
取2μg的27LFn的使用实施例2中引物扩增得到的LFn编码序列，设置50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的27LFn编码序列，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Nde I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用凝胶回收试剂盒(BBI)纯化LFn编码序列的双酶切产物。
连接反应：取3μl经过纯化的pET21a的Nde I和BamH I双酶切产物(实施例4)，加入5μl经过纯化的27LFn的Nde I和BamH I双酶切产物，1μl的T4DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌Top10，然后挑取克隆送公司测序(感受态Top10的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-27LFnLinker。
取800ng的pET21a-27LFnLinker载体，设置50μl的双酶切体系，具体如下：800ng的pET21a-27LFnLinker载体，5μl的NEB酶切反应缓冲液2，2μl的Xho I和2μl的BamH I，0.5μl的100×BSA，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应10小时。10小时后使用0.6％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，然后将目的条带切下，凝胶回收试剂盒(BBI)纯化pET21a-LFnLinker的双酶切产物。
连接反应：取3μl经过纯化的pET21a-LFnLinker的Xho I和BamH I双酶切产物，加入5μl经过纯化的EFn的Xho I和BamH I双酶切产物(实施例4)，1μl的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接13小时.
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pET21a-27LFnEFn。
实施例6：LFn/EFn和27LFn/EFn融合蛋白融合蛋白的表达纯化。
将所获得的pET21a-LFnEFn和pET21a-27LFnEFn质粒转化E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞(感受态制备方法同DH5α)。工程菌的诱导表达：挑取克隆于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃250rpm培养，培养至OD600 0.5~0.7，加入IPTG至终浓度1mmol/L，在28℃250r/m进行诱导表达6h，1000rpm离心5min离心收集菌体沉淀超声(方法及参数依照超声仪制造商的说明)。超声所得菌液12000g，室温离心2min，取上清进行SDS-PAGE分析，以确定重组蛋白是否表达，SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著。
取20ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养基的3L锥形瓶，37℃培养至OD600为0.6左右，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG，将温度降为28℃诱导8h后，8000g离心获得菌体，加入1/10体积的20mmol/L Tris(pH8.0)重悬菌体，然后超声破碎菌体，4℃，12000g离心10min，收集上清。在上清液中添加咪唑和NaCl至终浓度为50mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl。在AKTA-explorer上将上述超声溶液上Ni柱。平衡缓冲液为20mmol/LTris0.5mol/LNaCl 50mmol/L咪唑pH8.0。上样后使用洗脱液(20mmol/L Tris 0.5mol/LNaCl 0.5mol/L咪唑pH8.0)洗脱，收集洗脱峰。纯化蛋白经超滤浓缩，再通过Superdex75凝胶过滤柱进一步纯化，收集蛋白洗脱峰，得到目的蛋白。BCA法测定蛋白浓度。
实施例7：融合蛋白的细胞保护性检测
小鼠巨噬细胞J774A.1以104个/ml接种于96孔细胞培养板，培养约24小时，长至90％满。用含有100ng/ml PA和LF的新鲜培养液对各样品进行2倍系列稀释，然后按顺序加入洁净96孔细胞培养板，每样品2复孔，每孔120μl；后于细胞培养箱中37℃孵育1h。小心地将J774A.1细胞培养上清吸去，将孵育1h的样品转加于含有J774A.1细胞的培养板中，于细胞培养箱中37℃孵育3h后，吸出96孔细胞培养板中的培养液，按100μl/孔加入MTT溶液(终浓度1mg/ml，用培养液配制而成)，37℃孵育30min，吸出MTT溶液，每孔加入100μl盐酸-异丙醇，作用10min，用酶联仪测吸光度OD570，结果取平行的3个孔的平均值。结果表明融合蛋白的体外毒素中和能力较LFn和EFn单体有较大的提高。
实施例8：融合蛋白保护F344雄性大鼠免受炭疽致死毒素的攻击。
F344雄性大鼠购自维通利华；PA、LF由本室制备，PA、LF和27LE均使用注射用水进行稀释，每只大鼠注射40μg的PA和10μg的LF。注射体积为500μl。试剂经由尾静脉注入，大鼠连续观察48小时以上。结果显示炭疽致死毒素与重组蛋白27LE以一定的摩尔比同时注入有保护效果，大鼠全部存活(连续观察48小时以上。)，当摩尔比低于一定值时，大鼠的生存时间得到延长，但出现了严重的肺部损伤，最终死亡。高摩尔比时，与对照相比大鼠没有出现可见的中毒症状。
表1：同时注射毒素和融合蛋白27LFn/EFn
| 组别 | 存活数/总数 | 存活时间 |
| PA+LF(40ug+10ug) | 0/3 | 65±3min |
| PA+LF+8倍摩尔比27LFn/EFn | 0/3 | 272±45min |
| PA+LF+16倍摩尔比27LFn/EFn | 3/3 | 48h以上 |
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用
<130>
<160>8
<210>1
<211>789
<212>DNA
<213>LFn
<400>1
gcgggcggtc atggtgatgt aggtatgcac gtaaaagaga aagagaaaaa taaagatgag 60
aataagagaa aagatgaaga acgaaataaa acacaggaag agcatttaaa ggaaatcatg 120
aaacacattg taaaaataga agtaaaaggg gaggaagctg ttaaaaaaga ggcagcagaa 180
aagctacttg agaaagtacc atctgatgtt ttagagatgt ataaagcaat tggaggaaag 240
atatatattg tggatggtga tattacaaaa catatatctt tagaagcatt atctgaagat 300
aagaaaaaaa taaaagacat ttatgggaaa gatgctttat tacatgaaca ttatgtatat 360
gcaaaagaag gatatgaacc cgtacttgta atccaatctt cggaagatta tgtagaaaat 420
actgaaaagg cactgaacgt ttattatgaa ataggtaaga tattatcaag ggatatttta 480
agtaaaatta atcaaccata tcagaaattt ttagatgtat taaataccat taaaaatgca 540
tctgattcag atggacaaga tcttttattt actaatcagc ttaaggaaca tcccacagac 600
ttttctgtag aattcttgga acaaaatagc aatgaggtac aagaagtatt tgcgaaagct 660
tttgcatatt atatcgagcc acagcatcgt gatgttttac agctttatgc accggaagct 720
tttaattaca tggataaatt taacgaacaa gaaataaatc tatccttgga agaacttaaa 780
gatcaacgg 789
<210>2
<211>263
<212>PRT
<213>LFn
<400>2
Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu
1 5 10 15
Lys Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys
16 20 25 30
Thr Gln Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys
31 35 40 45
Ile Glu Val Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu
46 50 55 60
Lys Leu Leu Glu Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys
61 65 70 75
Ala Ile Gly Gly Lys Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys
76 80 85 90
His Ile Ser Leu Glu Ala Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys
91 95 100 105
Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr
106 110 115 120
Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro Val Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu
121 125 130 135
Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Glu
136 140 145 150
Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile Leu Ser Lys Ile Asn Gln
151 155 160 165
Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn Thr Ile Lys Asn Ala
166 170 175 180
Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr Asn Gln Leu Lys
181 185 190 195
Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln Asn Ser
196 200 205 210
Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr Tyr Ile
211 215 220 225
Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala
226 230 235 240
Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Ser
241 245 250 255
Leu Glu Glu Leu Lys Asp Gln Arg
256 260 263
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>Linker
<400>1
ggtggcgggg gctctggtgg cgggggctct ggtggcgggg gctct 45
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>Linker
<400>2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210>5
<211>762
<212>DNA
<213>EFn
<400>1
atgaatgaac attacactga gagtgatatt aaaagaaacc ataaaactga aaaaaataaa 60
actgaaaaag aaaaatttaa agacagtatt aataacttag ttaaaacaga atttaccaat 120
gaaactttag ataaaataca gcagacacaa gacttattaa aaaagatacc taaggatgta 180
cttgaaattt atagtgaatt aggaggagaa atctatttta cagatataga tttagtagaa 240
cataaggagt tacaagattt aagtgaagaa gagaaaaata gtatgaatag tagaggtgaa 300
aaagttccgt ttgcatcccg ttttgtattt gaaaagaaaa gggaaacacc taaattaatt 360
ataaatatca aagattatgc aattaatagt gaacaaagta aagaagtata ttatgaaatt 420
ggaaagggga tttctcttga tattataagt aaggataaat ctctagatcc agagttttta 480
aatttaatta agagtttaag cgatgatagt gatagtagcg accttttatt tagtcaaaaa 540
tttaaagaga agctagaatt gaataataaa agtatagata taaattttat aaaagaaaat 600
ttaactgaat ttcagcatgc gttttcttta gcgttttctt attattttgc acctgaccat 660
agaacggtat tagagttata tgcccccgac atgtttgagt atatgaataa gttagaaaaa 720
gggggatttg agaaaataag tgaaagtttg aagaaagaag gt 762
<210>6
<211>254
<212>PRT
<213>EFn
<400>2
Met Asn Glu His Tyr Thr Glu Ser Asp Ile Lys Arg Asn His Lys
1 5 10 15
Thr Glu Lys Asn Lys Thr Glu Lys Glu Lys Phe Lys Asp Ser Ile
16 20 25 30
Asn Asn Leu Val Lys Thr Glu Phe Thr Asn Glu Thr Leu Asp Lys
31 35 40 45
Ile Gln Gln Thr Gln Asp Leu Leu Lys Lys Ile Pro Lys Asp Val
46 50 55 60
Leu Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Gly Gly Glu Ile Tyr Phe Thr Asp
61 65 70 75
Ile Asp Leu Val Glu His Lys Glu Leu Gln Asp Leu Ser Glu Glu
76 80 85 90
Glu Lys Asn Ser Met Asn Ser Arg Gly Glu Lys Val Pro Phe Ala
91 95 100 105
Ser Arg Phe Val Phe Glu Lys Lys Arg Glu Thr Pro Lys Leu Ile
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lle Asn Ile Lys Asp Tyr Ala Ile Asn Ser Glu Gln Ser Lys Glu
121 125 130 135
Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Gly Ile Ser Leu Asp Ile Ile Ser
136 140 145 150
Lys Asp Lys Ser Leu Asp Pro Glu Phe Leu Asn Leu Ile Lys Ser
151 155 160 165
Leu Ser Asp Asp Ser Asp Ser Ser Asp Leu Leu Phe Ser Gln Lys
166 170 175 180
Phe Lys Glu Lys Leu Glu Leu Asn Asn Lys Ser Ile Asp Ile Asn
181 185 190 195
Phe Ile Lys Glu Asn Leu Thr Glu Phe Gln His Ala Phe Ser Leu
196 200 205 210
Ala Phe Ser Tyr Tyr Phe Ala Pro Asp His Arg Thr Val Leu Glu
211 215 220 225
Leu Tyr Ala Pro Asp Met Phe Glu Tyr Met Asn Lys Leu Glu Lys
226 230 235 240
Gly Gly Phe Glu Lys Ile Ser Glu Ser Leu Lys Lys Glu Gly
241 245 250 254
<210>7
<211>1626
<212>DNA
<213>LFn/EFn FUSION PROTEIN
<400>1
gcgggcggtc atggtgatgt aggtatgcac gtaaaagaga aagagaaaaa taaagatgag 60
aataagagaa aagatgaaga acgaaataaa acacaggaag agcatttaaa ggaaatcatg 120
aaacacattg taaaaataga agtaaaaggg gaggaagctg ttaaaaaaga ggcagcagaa 180
aagctacttg agaaagtacc atctgatgtt ttagagatgt ataaagcaat tggaggaaag 240
atatatattg tggatggtga tattacaaaa catatatctt tagaagcatt atctgaagat 300
aagaaaaaaa taaaagacat ttatgggaaa gatgctttat tacatgaaca ttatgtatat 360
gcaaaagaag gatatgaacc cgtacttgta atccaatctt cggaagatta tgtagaaaat 420
actgaaaagg cactgaacgt ttattatgaa ataggtaaga tattatcaag ggatatttta 480
agtaaaatta atcaaccata tcagaaattt ttagatgtat taaataccat taaaaatgca 540
tctgattcag atggacaaga tcttttattt actaatcagc ttaaggaaca tcccacagac 600
ttttctgtag aattcttgga acaaaatagc aatgaggtac aagaagtatt tgcgaaagct 660
tttgcatatt atatcgagcc acagcatcgt gatgttttac agctttatgc accggaagct 720
tttaattaca tggataaatt taacgaacaa gaaataaatc tatccttgga agaacttaaa 780
gatcaacggg gtggcggggg ctctggtggc gggggctctg gtggcggggg ctctggatcc 840
atgaatgaac attacactga gagtgatatt aaaagaaacc ataaaactga aaaaaataaa 900
actgaaaaag aaaaatttaa agacagtatt aataacttag ttaaaacaga atttaccaat 960
gaaactttag ataaaataca gcagacacaa gacttattaa aaaagatacc taaggatgta 1020
cttgaaattt atagtgaatt aggaggagaa atctatttta cagatataga tttagtagaa 1080
cataaggagt tacaagattt aagtgaagaa gagaaaaata gtatgaatag tagaggtgaa 1140
aaagttccgt ttgcatcccg ttttgtattt gaaaagaaaa gggaaacacc taaattaatt 1200
ataaatatca aagattatgc aattaatagt gaacaaagta aagaagtata ttatgaaatt 1260
ggaaagggga tttctcttga tattataagt aaggataaat ctctagatcc agagttttta 1320
aatttaatta agagtttaag cgatgatagt gatagtagcg accttttatt tagtcaaaaa 1380
tttaaagaga agctagaatt gaataataaa agtatagata taaattttat aaaagaaaat 1440
ttaactgaat ttcagcatgc gttttcttta gcgttttctt attattttgc acctgaccat 1500
agaacggtat tagagttata tgcccccgac atgtttgagt atatgaataa gttagaaaaa 1560
gggggatttg agaaaataag tgaaagtttg aagaaagaag gtctcgagca ccaccaccac 1620
caccac 1626
<210>8
<211>542
<212>PRT
<213>LFn/EFn FUSION PROTEIN
<400>2
Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu
1 5 10 15
Lys Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys
16 20 25 30
Thr Gln Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys
31 35 40 45
Ile Glu Val Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu
46 50 55 60
Lys Leu Leu Glu Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys
61 65 70 75
Ala Ile Gly Gly Lys Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys
76 80 85 90
His Ile Ser Leu Glu Ala Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys
91 95 100 105
Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr
106 110 115 120
Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro Val Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu
121 125 130 135
Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Glu
136 140 145 150
Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile Leu Ser Lys Ile Asn Gln
151 155 160 165
Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn Thr Ile Lys Asn Ala
166 170 175 180
Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr Asn Gln Leu Lys
181 185 190 195
Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln Asn Ser
196 200 205 210
Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr Tyr Ile
211 215 220 225
Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala
226 230 235 240
Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Ser
241 245 250 255
Leu Glu Glu Leu Lys Asp Gln Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
256 260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Met Asn Glu His Tyr
271 275 280 285
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286 290 295 300
Thr Glu Lys Glu Lys Phe Lys Asp Ser Ile Asn Asn Leu Val Lys
301 305 310 315
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316 320 325 330
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331 335 340 345
Glu Leu Gly Gly Glu Ile Tyr Phe Thr Asp Ile Asp Leu Val Glu
346 350 355 360
His Lys Glu Leu Gln Asp Leu Ser Glu Glu Glu Lys Asn Ser Met
361 365 370 375
Asn Ser Arg Gly Glu Lys Val Pro Phe Ala Ser Arg Phe Val Phe
376 380 385 390
Glu Lys Lys Arg Glu Thr Pro Lys Leu Ile Ile Asn Ile Lys Asp
391 395 400 405
Tyr Ala Ile Asn Ser Glu Gln Ser Lys Glu Val Tyr Tyr Glu Ile
406 410 415 420
Gly Lys Gly Ile Ser Leu Asp Ile Ile Ser Lys Asp Lys Ser Leu
421 425 430 435
Asp Pro Glu Phe Leu Asn Leu Ile Lys Ser Leu Ser Asp Asp Ser
436 440 445 450
Asp Ser Ser Asp Leu Leu Phe Ser Gln Lys Phe Lys Glu Lys Leu
451 455 456 460
Glu Leu Asn Asn Lys Ser Ile Asp Ile Asn Phe Ile Lys Glu Asn
461 465 470 475
Leu Thr Glu Phe Gln His Ala Phe Ser Leu Ala Phe Ser Tyr Tyr
476 480 485 490
Phe Ala Pro Asp His Arg Thr Val Leu Glu Leu Tyr Ala Pro Asp
491 500 505 510
Met Phe Glu Tyr Met Asn Lys Leu Glu Lys Gly Gly Phe Glu Lys
511 515 520 525
Ile Ser Glu Ser Leu Lys Lys Glu Gly Leu Glu His His His His
526 530 535 540
His His
542
Claims (3)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由SEQ ID No 2所示的第28-263位氨基酸残基序列与SEQ ID No 6所示氨基酸残基序列以连接肽连接而成，其中SEQ ID No 2所示的第28-263位氨基酸残基序列位于融合蛋白的N端，SEQ ID No 6所示氨基酸残基序列位于融合蛋白的C端，所述连接肽的氨基酸残基序列如SEQ ID No 4所示。
2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由SEQ ID No 2所示氨基酸残基序列与SEQ IDNo 6所示氨基酸残基序列以连接肽连接而成，其中SEQ ID No 2所示氨基酸残基序列位于融合蛋白的N端，SEQ ID No 6所示氨基酸残基序列位于融合蛋白的C端，所述连接肽的氨基酸残基序列如SEQ ID No 4所示。
3.根据权利要求1-2中任何一项所述的蛋白在制备治疗因炭疽毒素引起的疾病的药物中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 200910119513 CN101503475B (zh) | 2009-03-12 | 2009-03-12 | 炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200910119513 CN101503475B (zh) | 2009-03-12 | 2009-03-12 | 炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1655773A (zh) * | 2002-05-29 | 2005-08-17 | 麦克公司 | 可用于治疗炭疽和抑制致死因子的化合物 |
| CN101134781A (zh) * | 2007-07-17 | 2008-03-05 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 携带被插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段内的炭疽保护性抗原表位的重组融合蛋白及其用途 |
-
2009
- 2009-03-12 CN CN 200910119513 patent/CN101503475B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1655773A (zh) * | 2002-05-29 | 2005-08-17 | 麦克公司 | 可用于治疗炭疽和抑制致死因子的化合物 |
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| 张秀敏等.炭疽毒素及炭疽防治研究进展.《自然杂志》.2004,第138-141页. |
| 炭疽杆菌的特性和主要毒力因子;褚佩英等;《微生物学免疫学进展》;20021231;第98-100页 * |
| 炭疽毒素及炭疽防治研究进展;张秀敏等;《自然杂志》;20041231;第138-141页 * |
| 褚佩英等.炭疽杆菌的特性和主要毒力因子.《微生物学免疫学进展》.2002,第98-100页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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