JPH07502403A - 人工タンパク質分解切断部位を含む組み換えウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人工タンバク質分解切断部位を含む組み換えウィルス背景 現在多種類のワクチンが個体を病気に対（−・て免疫化するために用いられてい る。入手できるワクチンは一般に安全てあり、少なくどもある程度免疫応答の誘 導に有効であるが、すべて限界を有する。さらにある病気の場合、有効なワクチ ンがない。現在入手できるワクチンの代替え品、及び現在ワクチンが入手できな い病気に対する防御のための新規なワクチンの開発は、多くの病気への罹、轡率 及びそれによる死亡率の低下のために重要な段階であろう。

発明の概略 本発明は、その後ウィルス性及び／又は細腰酵素によりタンパク質分解ブロセノ ：／りされる４１ｔみ換えポリタンパク質前駆体の成分として発現される夕）天 性ポリペプチド又はタンパク質をコートする夕（天性核酸配列を含む複製−感応 組み換えウィルスに関する。結果として二＋　−１；外因性ポリペプチドが放出 される。複製−感応ウィルスは動物（非ヒト）ウィルス（例えばを惟動物又は哺 乳類つ、イルス）、ヒトウィルス又は植物ウィルスであることがＣきる。さらに 本発明は複製−感応組み換えウィルス、特にポリオウィルスに関しており、その 組ろ換えゲノムは発現するべき外因性ポリペプチドをコートする外因性核酸配列 、及び対応する数の人工のタンパク質分解切断部位をコードする１つ又はそれ以 上の核酸配列を含み、コードポリペプチドを発現し、それが導入された哺乳類に おいてポリペプチドに特異的な抗体の生産を誘導する。適当に選択された復製− 感応ウィルスはそれが導入されるを准動物、特に哺乳類、さらに特定するとヒト などの個体に外因性タンパク質を配達するのに有用である。

例えば植物ウィルスの場合、複製−感応植物ウィルスを種子又はその発生の他の 段階の植物中に、コード外因性ポリペプチドが発現され、プロセシングされるよ うな方法で挿入することができる。そのような外因性ポリペプチドは、例えば病 気又は昆虫による攻撃に対して植物を防御するために用いることができる。経口 的消費によるワクチンの配達にそれらの植物を用いることができる。

本発明の復製−感応組み換えウィルスは多様な種類のウィルス、例えばピコルナ ウィルス（例えば腸内ウィルス、ポリオウィルス、口締病ウィルス（ＦＭＤｖ） 　、ラインウィルス、エコーウィルス、Δ型肝炎ウィルス）、トガウィルス（例 えばンンドビス（Ｓ　ｉ　ｎｄｂ　ｉ　ｓ）ウィルス及び風疹ウィルス）、なら びにフラビウィルス（ＦｌａｖｉｖｉｒｕｓｅＳ）（例えば黄熱病ウィルス）を 含む。用いられるウィルスの種類はその一部が、発現するべき標的外因性抗原、 得られた組み換えウィルスを投与する経路、及び所望の免疫応答の性質により決 定される。

特に本発明は、複製−感応組み換えポリオウィルスに関しており、それは病原性 でなく、外因性核酸配列ならびに１つ又はそれ以上の人工のタンパク質分解切断 部位を含み、ウィルス感染の経過中にコート外因性産物を組み換えポリタンパク 質前駆体の成分として安定して発現するように修飾されているという点て親ポリ オウィルスと異なる。前駆体はタンパク質分解により切断されて正常なポリオウ ィルスタンパク質及びコート外因性タンパク質を放出する。さらに複製−感応組 み換えウィルスは、所望の異種核酸配列の挿入の容易さを助長するするためにポ リリンカー配列（ＥｃｏＲＬ　Ｎｏｔ　ｌ、Ｂｓ５Ｈ２及びＸｈｏ　ｌ）を含む ことができる。それらはポリグリシン領域などのポリアミノ酸領域も含むことが でき、これは一般に挿入配列に隣接し、その領域の構造的柔軟性を増し、おそら くタンパク質分解プロセシングの効率を向上させる。

本発明は組み換えウィルスの生産のための新規な方法にも関しており、その方法 では外因性核酸配列がウィルスゲノム中に挿入される。本発明の方法の場合、ウ ィルスの生活環の基本的な特徴が利用され、その結果組み換えウィルスがその正 常なタンパク質成分を生産して複製し、外因性核酸配列によってコードされるア ミノ酸配列（外因性タンパク質）が感染細胞において有意な量で生産される。本 方法の場合、ウィルス性又は細胞酵素によるタンパク質分解によりプロセシング されて１つ又はそれ以上の成熟タンパク質を生産するポリタンパク質前駆体をコ ードするゲノムを有する親ウィルスを、以下の通りに修飾する。生産するべきポ リペプチドをコートする外因性核酸配列、及びウィルス生活環の間に親ウィルス により生産される前駆体ポリタンパク質をタンパク質分解によりプロセシング（ 切断）するウィルス性又は細胞プロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切断 部位をコードする核酸配列をウィルスゲノム中に導入し、組み換えウィルスを生 産する。配列は、その存在がウィルスの複製に必要な配列を中断しなければ、い ずれの位置においてウィルスゲノム中に導入することもてきる。例えば２つの本 来のタンパク質を生産するためめにポリタンパク質がプロセシングされる本来の 部位のいずれにおいても（すなわち本来のポリタンパク質が正常にタンパク質分 解により切断されるいずれの部位においても）２つの配列を挿入することができ る。外因性核酸配列がタンパク質をコードするウィルス配列の末端で挿入される 場合、タンパク質分解プロセシング配列は１つだけ必要である。生産するべきポ リペプチドをコードする１つより多い外因性核酸配列をウィルスゲノムに導入す る場合、さらに追加のタンパク質分解切断部位−コード核酸配列が必要である。

例えば２つか又はそれ以上のポリペプチド−コード核酸配列がウィルスゲノム内 （内部）に導入され、コードされるタンパク質が切断されて２つか又はそれ以上 の分離したタンパク質が生産されることが望ましい場合、切断部位をコードする 核酸配列も十分な数で必要である。例えばそれぞれ生産するべきタンパク質をコ ードする２つの外因性核酸配列をウィルスゲノム内に導入し、２つの分離した（ 個々の）タンパク質が望まれている場合、タンパク賃分解切断部位をコードする 核酸配列が３つ又は４つ必要である（すなわち２つのタンパク質が介在核酸配列 なしにウィルスゲノム中に存在する２つの核酸配列によりコードされる場合３つ 、及び２つの核酸配列が介在核酸配列により隔てられており、２つのコードタン パク質を゛°骨分離するためにそのコード産物を除去しなければならない場合４ つ）。配列がウィルスゲノム内（その末端ではなく）に挿入される場合、外因性 核酸配列の両末端を遊離させるために２つのタンパク質分解プロセシング配列が 必要であり、これらの配列は同−又は異なることができる。

本発明の１つの実施態様の場合、ウィルスタンパク質をコードするウィルス配列 の５゛末端における第１又はユニーク開始コドン及び第２コドンの間で、組み換 えゲノムにおける順序が親ウィルスの５′非翻訳領域−親ウィルスのユニーク開 始コドン−発現するべき産物をコードする外因性核酸配列−人工のタンパク質分 解切断部位をコードする核酸配列−親ウィルスの第２コドン−親核酸配列の残り となるような方法で親つィルイゲノムに２つの配列を挿入する。外因性ポリペプ チドをコードする外因性核酸配列をウィルスゲノム内に挿入する他の実施態様に おいて、得られる組み換えウィルスゲノムにおける配列の順序は二親ウィルスの ５°非翻訳領域−親ウィルスのユニーク開始コドン−親ウィルスの翻訳領域の最 初のコドン−人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列−外因性核酸 配列−人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列−親ウイルスゲツム の残りである。コードされるタンパク質分解切断部位は同−又は異なることがで きる。

組み換えポリオウィルス（外因性核酸配列を発現する）を製造する本発明の１つ の実施態様の場合、発現するべきタンパク質（例えば抗原）をコードする核酸配 列、及びポリオウィルス３Ｃプロテアーゼに関する人工の認識配列をコードする 核酸配列を親ポリオウィルスのゲノム中に導入する。別の実施態様の場合、ポリ オウィルス２Ａプロテアーゼに関する人工の認識配列をコードする核酸配列を、 発現するべきタンパク質をコートする１つか又はそれ以上の核酸配列と共にウィ ルスゲノム中に導入する。ＤＮＡウィルスの場合、ゲノムはそのＤＮＡ形聾形感 作される。ＲＮＡウィルスの場合、ゲノムはそのｃＤＮＡ形態て操作される。

これらの両方共、親ウィルスのゲノムと呼ばれる。外因性ポリペプチドをコード する外因性核酸配列をポリオウィルスゲノムの末端に挿入する実施剪様の場合、 得られる組み換えポリオウィルスゲノムの構造は以下の通りである。親ポリオウ ィルスの５゛非翻訳領域−ポリオウィルスユニーク開始コドン−外因性核酸配列 −人工ポリオウィルス３Ｃ又は２Δブロテア一セ認識部位−ポリオウィルスケノ ムの第２コドン−ポリオウィルスゲノムの残り。外因性ポリペプチドをコードす る外因性核酸配列を親ポリオウィルスゲノム内の部位（すなわち内部）に挿入す る実施態様の場合、得られる組み換えポリオウィルスゲノムは以下の通りである ：親ポリオウィルスの５°非翻訳領域−ポリオウィルスユニーク開始コドン−ポ リオタンパク質コート領域−人工３Ｃプロテアーゼ認識部位又は２Δプロテア一 ゼ認識部位をコードする核酸配列−外囚性核酸配列一人工３Ｃプロテアーゼ認識 部位又は２Ａプロテア一ゼ認識部位をコードする核酸配列−ポリオウィルスの残 り。１つ以上のタンパク質又はポリペプチドを発現するべき場合、１つ以」二の 外因性核酸配列（すなわち発現するべきタンパク質又はポリペプチドのそれぞれ をコードする核酸配列）が上記の通り適した数の人工タンバク質分解切断部位と 共に組み換え複製−感応ポリオウィルスに含まれる。

修飾ポリオウィルスゲ、ｌムが翻訳されると正常より大きい前駆体が形成される が、それは親ポリオウィルスに存在する３Ｃ及び／又は２Δブロテアーセにより 適当に切断されて通常の成分ポリオウィルスタンパク質が勢揃いする。３Ｃ及び ／又は２Δプロテアーゼは人工の認識（タンパク質分解切断）部位も正確に認識 して切断し、外因性核酸配列によりコードされる外因性ポリペプチドを遊離する 。本明細書に記載の通り、本発明の組み換えポリオウィルスは外因性コードタン パク質を検出可能な量で発現する。親ウィルスは複製を続け、本来のタンパク質 が同様に生産される。

組み換えポリオウィルスを例とする本発明の複製−感応組み換えウィルスはバク テリア、ウィルス、菌（例えば酵母）感染、寄生虫病、癌又はアレルギーに対す るワクチンとして用いることができる。これらは避妊薬（例えば精子抗原）の配 達にも用いることができる。本明細書に記載の複製−感応組み換えウィルスであ る、又はそれを含むワクチン及び避妊薬組成物も本発明の主題である。

本発明の組み換えポリオウィルスワクチンは、感染の予防に粘膜性免疫の誘導が 必要な場合に特に有利である。例えば粘膜性免疫の有効な誘導は［１１Ｖ、ロタ ウィルス、吸収性シンンアルウィルス［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｊ ｉａｌ　ｖｉｒｕｓ　（Ｒ３Ｖ）コ、Ａ型肝炎・ウィルス、ポリオウィルス、乳 頭腫ウィルス、麻疹ウィルス及びインフルエンザウィルスによる感染の予防又は 軽減に有利である。組み換えライる痰中に対する免疫の誘導にも有用である。さ らに組み換えポリオウィルスは、１つ以上の外因性核酸配列（すなわちそれぞれ 異なる抗原をコー　ドする２つか又はそれ以上の核酸配グ１１）を親ポリオウィ ルスのゲノム中に導入することにより１つ以上の生物による感染に対する防御を 与えるのに用いることができる。別の場合、それぞれが異なる抗原を発現する２ つか又はそれ以上の組み換えポリオウィルスの混合物又は混液を用いて１つ以上 の生物又は感染物に対して個体を免疫化することができる。

改良又は新規ワクチンの開発のための分子生物学の解明手段（ｅｍｅｒｇｉｎｇ 　ｔｏｏｌ）を用いることにより、゛誕生時の１回の投与が多数の疾患からの防 御を与えるーワクチンとしてＴ　ａ　ｓ　ｋ　Ｆ　ｏ　ｒ　ｃ　ｅｏｎ　Ｃｈｉ ｌｄ　５ｕｒｖｉｖａｌにより記載の°“理慧１的ワクヂノ゛の誘導を希望を持 って認識することができる。

組み換えウィルスは組織培養における外因性ボリペブヂ１への生産にも用いるこ とができ、それはそれが生産される細胞及びウィルスがら単離又は分離すること ができる。組み換えウィルスはを椎動物細胞、ヒト細胞を含む哺乳頌細胞、及び 植物細胞における外因性ポリペプチドの生産に用いることができる。

図面の簡単な説明 図１は、ポリオウィルスゲノムの末端における外因性核酸配列の挿入及び外因性 ポリペプチドの発現を可能にするポリオウィルスゲノム（配列番号・２４及び２ ５）修飾が示されている、本発明の組み換えポリオウィルスの略図である。ウィ ルス３ｃプロテアーゼが本来のポリオウィルスポリタンパク質（ＰＯ）前駆体及 び外因性タンパク質挿入片の両方を切断する時のそのタンパク質分解プロセシン グのパターンも示されている。

図２は、外因性ポリペプチドを発現させるポリオウィルスゲノムの末端及び内部 における外因性核酸配列の挿入を示す、本発明の組み換えポリオウィルスの略図 である。その領域の構造的柔軟性を増す、挿入配列に隣接するポリ−グリシン領 域も示されている。

図３はブラークアンセイの結果の写真であり、親ポリオウィルス及び組み換えポ リオウィルスの表現型を示す。示されているプラークアッセイの場合、）−１ｅ 　Ｌ　ａ細胞を親ポリオウィルス（Ａ）又は、ロタウィルスＶＰ４タンパク質か ら誘導された抗原エピトープ（Ｂ、Ｃ及びＤ）、及び成熟コレラ毒素サブユニッ トＢ　（ＣＴＢ）からの全コード配列（Ｅ）を有する組み換えポリオウィルスに 感染させた。

図４は、ビブリオ　コレラＢ毒素サブユニット又はロタウィルスＶＰ４配列を有 する組み換えポリオウィルスの発現及びプロセ／ングを示すアッセイの結果を示 す。

図４Ａは、親ポリオウィルス（１列）、又は実施例２に記載のコレラ毒素Ｂ−ポ リオウイルス組み換えウィルス（２列）に感染させたＨ　ｅＬａ細胞からの抽出 物を用いて：ＪｒＩ製したウェスターンフロノドの写真である。結果は、Ｂサブ ユニットが組み換えポリオウィルスに関連して発現され、適当にブロセノンクさ れることを示す（矢印で示す）。

図４８ｉ１親ポリオウィルス（１列）又はコレラ毒素＋３　（ＣＴＢ）−ポリオ 組み換えウィルス（５列）（実施例２）に感染させ、ポリオウィルス構造タンパ ク質を認識するウヅギ抗体を用いて精査し、た同Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞からの抽出物 の写真であるう結果は、正常より大きいＰ１ポリタンペク質前駆体がポリオウィ ルス組み換え体中で形成されるが、続いて適したタンパク質分解プロセシングが 起こり、ポリオウィルスタンパク質産物の正常な全量が生成され、ＣＴ　１３ヌ クレオヂト配列から生じた外因性ＣＴｌ３タンパク質が放出されることを示す。

列２−４はロタウィルスＶ　Ｐ　４タンパク質から誘導された抗原エピトープ（ ２１−１，０４アミノ酸の長さ）を有する組み換えポリオウィルスを含む。

図５は、組み換えヒリオンの構造及び組成の分析のために行ったＳＤＳ　−Ｐ　 Ａ　Ｇ　Ｅ分析の結果を示す、５２つのウィルス（親及び組み換え）の移動のパ ターンは視覚により区別できないものであり、組み換えウィルスのウィルス粒子 が正常な構ｉｌ及びタンパク質組成を有することを示唆している。ポリオウィル スギャブ／トタンバク質の同定が示されている。

図６は、ワクチン注Ｉｌｊされた宿主において組み換えポリオウィルスが免疫応 答を誘導する能力を欅準値及び擬住Ｑｔ　（ｍｏｃｋ　ｉ　ｎ　ｊｅｃ　ｔｉ　 ｏｎ）と比較して決定するためにｊテっだウェスターンプロット分析の結果を示 す。

発明の詳細な説明 本発明は、ウィルスの生活環の間に生産されるべき外因性ポリタンパク質をコー ドするりｌ因性核酸配列、及び親ウィルスにより生産される前駆体ポリタンパク 質を切断するウィルス性又は細胞プロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切 断部位をコードする核酸配列を含む組み換え複製−夢心ウィルスに関する。２つ の種類の配列は、その存在がウィルス七９製に必要なウィルス配列を中断しなけ れば、親ウィルスゲノム中のいずれの位置に存在することもてきる。

本発明は外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列をウィルスケツムの末 端で、又はウィルスゲノム内の部位で（すなわち内部）でウィルスのゲノム中に 挿入し、ウィルスの生活環の間に前駆体ポリタンパク質として生産し、それを親 ウィルス（すなわち外因性核酸配列が導入されるウィルス）によって正常に生産 される前駆体ポリタンパク質を切断するウィルス性又は細胞プロテアーゼにより 切断することができるという出願人等の立証に基づいている。夕（天性ポリペプ チドをコードする外因性核酸配列をウィルスケツムの末端に挿入する１つの実施 Ｂ様の場合、得られる組み換えポリオウィルスゲノムの配列の順序は　親ウィル スの５゛非翻訳領域−親つィルスユニーク開始コドンー外因牲核酸配列−人工タ ンパク質分解切断部位をコートする核酸配列−親ウィルスの第２コドン−親ウィ ルスゲノムの残りである。ウィルスゲノムの５゛非翻訳領域である組み換えゲノ ムの部分は、親ウィルス中に存在する５°非翻訳領域の全体又は一部であること ができる。外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列をウィルスゲノム内 に挿入する別の実施態様の場合、得られる組み換えウィルスゲノムにおける配列 の順序は・親ウィルスの５′非翻訳領域−親ウィルスのユニーク開始コドン−親 ウィルスの駐訳領域の最初のコドン−人工タンバク實分解切断部位をフードする 核酸配列−外因性核酸配列−人工タンパク質分解切断部位をコードする核酸配列 −親ウイルスゲツムの残りである。

コード外因性ポリペプチドは正常なウィルスタンパク質翻訳と関連して組み換え 又は融合前駆体ポリペプチド（外因性ポリペプチド、人工のタンパク質分解認識 部位及びウィルスポリタンパク質を含む）の成分トして発現される。組み換え前 駆体ポリペプチドは、親つィルスｍ１駆体ポリタンパク質をプロセシングするウ ィルス性又は細胞プロテアーゼによりタンパク質分解プロセシングされ、ウィル スタンパク質がら遊離の外因性タンパク質を放出する。外因性配列を含むように 修飾されるウィルスを親ウィルスと言い、それは本来のウィルス（病原性、又は 好ましくは非病原性）、弱毒化ウィルス、ワクチン株、又は組み換えウィルスで あることができる。本明細書て用いるポリペプチドという用語は、タンパク質又 はその一部（ペプチド）、２つが又はそれ以上のタンパク質あるいはペプチドの 融合体、及びタンパク質とペプチドの融合体を含む。

特定の実施呼種において、出願人等は発現するべき外因性タンパク質をコードす る外因性核酸配列、及びポリオウィルス３ｃプロテアーゼ及び／又は２Δプロテ アーゼに関する人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列を、ポリオ ウィルスゲノムの末端、あるいはポリオウィルスゲノム内の部位に挿入して含む 複製−感応組み換えポリオウィルスを製造した。外因性タンパク質が発現され、 タンパク質分解プロセシングによりポリオウィルスタンパク質から遊離されるこ とが示された。得られる複製−感応組み換えポリオウィルスは、それが外因性ポ リペプチドをコードする外因性核酸配列、及び１つ又はそれ以上の人工のタンパ ク質分解切断部位を含み、ウィルス感染の間に外因性産物を発現する点で親ウィ ルスと異なる。親ポリオウィルスは本来の、又は野生型ポリオウィルス、弱毒化 ポリオウィルス、ワクチン株又は組み換えあるいは遺伝子操作ポリオウィルス（ この場合改変又は突然変異配列は、ポリオウィルスに関して本明細書に記載の目 的に有用な本発明である外因性タンパク質をフードしない）であることができる 。

本発明の１つの実施態様の場合、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配 列及び人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列をポリオウィルスゲ ノムの末端でポリオウィルスケツムのユニーク開始コドンと第２コドンの間に、 組み換えゲノムにおける配列の順序が以下の通りになるように配置する　ポリオ ウィルスゲノムの５°非翻訳領域−ポリオウィルスユニーク開始（第１）コドン −外因性核酸配列−人工のプロテアーゼ認識部位−ポリオウィルスゲノムの第２ コドン−ポリオウィルスゲノムの残り。その結果、組み換えポリオウィルスゲノ ムの発現により組み換え又は融合ポリタンパク質前駆体が生産され、それは外因 性タンパク質、人工のプロテアーゼ切断部位及びポリオウィルスポリタンパク質 を含む。出願人等は、含まれる人工の切断部位が関連するプロテアーゼによる組 み換えポリタンパク質前駆体のタンパク質分解プロセシングが正常なポリオウィ ルスタンパク質成分の生産及び外因性タンパク質の遊離を与えることを示した。

ウィルス複製も続いて起こるが外因性タンパク質はポリオウィルスピリオンには 含まれない。

外因性核酸及び人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列がポリオウ ィルスケツムの末端に挿入された本発明の２つの組み換えポリオウィルスを図１ 及び図２に示す（ｐＭＯＶ　１．３）。組み換えポリオウィルスゲノムは、ポリ オウィルスのＭａｈｏｎｅｙｌ型株のアミノ末端に存在する５つのアミノ酸残基 をコードする核酸配列（ユニーク開始コドンの直３゛）を含む。これらの配列の 存在は必要ではないが、その存在は発現の効率に影響を与えることができる。図 ２に示す通り、組み換えポリオウィルスゲノムは挿入（外因性）配列に隣接して ポリグリノン領域を含むこともてきる。

発現するべきタンパク質又はポリペプチドをコードする外因性核酸配列は、ポリ オウィルスケツムを例とするウィルスケツム内に導入することができる。口２に 示す通り、コート産物を発現する復製−感応組み換えポリオウィルスの製造のた めに外因性ポリペプチドをコー１−する外因性核酸配列及び人工のタンパク質分 解切断部位をコードする核酸配列を配置することができる位置がポリオウィルス ゲノム中に他に多数ある。

ポリオウィルスのゲノム内のこれらの部位にはＶｐｌコー１〜領域と２Ａコート 領域の間の連結部、２Ａコード領域と２Ｂコード領域の連結部、及び２Ｃコード 領域と３Ａコート領域の連結部が含まれる。ポリリンカー／タンパク質プロセシ ングモチーフがこれらの部位に挿入され、得られた絹み換えポリオウィルスが複 製−感応であることが示された。外因性核酸配列は、本明細書に記載の方法及び 既知の方法を用いてこれらの部位に導入することができるうポリリンカー／′タ ンパク質分解モチーフをＶｐｇコート領域と３Ｃコート領域の連結部に挿入する とウィルス複製が阻害される。

ウィルスポリタンパク質の内部の外因性配列のプロセシングを容易にするために 、挿入片の両側に適したタンパク質分解プロセシングングナルを含むことが必要 である。従って外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列及び人工のタン パク質分解切断部位をコードする核酸配列が例えばＶｐｌコード領域と２Δコー ド領域の連結部に挿入されるポリオウィルスゲノムにおける配列の順序は以下の 通りである　ポリオウィルスゲノムの５′非釘１訳領域−ポリオウィルスユニー ク開始コドン−■ｐＯコード領域−Ｖｐ３コード領域−Ｖｐｌコード領域−人工 の３０プロテア一セ認識部位又は２Ａプロテア一ゼ認識部位をコードする核酸配 列−外因性核酸配列一人工の３０プロテアーゼ認、識部位又は２Ａプロテア一ゼ 認識部位をコードする核酸領域−ポリオウィルスケツムの残り。

複製−感応組み換えポリオウィルスの製造のために外因性核酸配列を挿入するこ とができる部位がポリオウィルスゲノム中に多数あることの決定は、より広い意 味において、ワクチンとして及びタンパク質生産に有用な組み換えウィルスの設 層及び製造にかなりの柔軟性と変異の可能性があることを意味する。発現され、 タンパク質分解プロセシングされるべき外因性タンパク質又はポリペプチドをコ ードする１つか又はそれ以上の外因性核酸配列は、本明細書に記載のウィルスゲ ノムの１つか又はそれ以上の部位（末端又は内部）で導入することができる。さ らに、ウィルスの複製能力を阻害せずに挿入を行うことができる他の部位を同定 することができる。いくつかの外因性核酸配列は、それをウィルスゲノムの特定 の部位で挿入するとより良り３′［容されるか、又はより有効に発現及び／又は タンパク質分解プロセシングすることが可能である。これが正しいか否かは本明 細書に記載の方法及びそれにより製造されるポリオウィルスを例とする組み換え ウィルスを用いて評価することができ所望のＲ種配列の組み換えベクター中−２ の挿入の容易さを助長するためにポリリンカー配列（例えばＥｃｏＲＩ、Ｎｏｔ 　ｌ、Ｂｓ５Ｈ２及びＸｈｏｌ）などの別の特徴を複製−感応組み換えウィルス の設計に挿入することができる。又、ポリ−グリシン領域などの変異を挿入配列 に隣接して挿入し、その領域の構造的柔軟性を増し、おそらくタンパク質分解プ ロセシングの効率を向上させることができる。

生産するべき外因性タンパク質又１ｊポリベブヂドをコードする１つ以上の核酸 配列を組み換え復製−感応ウィルス（こ含むことができ、その結果それは対応す る数のタンパク質又はポリペプチドを生産する。２つが又はそれ以上の核酸配列 はそれぞれ異なる産物をコートすることができ、あるいは同一の産物をコードす ることがてきる（例えばタンパク質又はポリペプチドの生産の強化が望ましい場 合）。さらにポリオウィルスの場合、タンパク質分解切断部位は３ｃ切断部位、 ２Ａ切断部位又は両者であることができる。

本発明は組み換えポリオウィルスの作出を例とするが、ウィルス前駆体タンパク 質のタンパク質分解プロセシングが起こるいずれのウィルスも修飾し７、外因性 タンパク質を発現し７でそれを適当にプロセシングする組み換えウィルスを製造 することができる。例えば１１１．７−換えピコルナウィルス（例えば腸内ウィ ルス、ポリオウィルス、Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖ　、、ライノウィルス、エコーウィルス 、Δ型肝交ウィルス）多びｔｉｔみ換λフラヒウィルス（例えば黄熱病Ｙ、’） 　、、ｔルス）を製造し、組み換λポリオウィルスに関して記載する方法と同様 の方法で用いることができる。

外因性タンパク質を発現し、夕′ノパクＷう）解ブロセンンク゛を行う複製−感 応組み換えウィルスの製造のための本方法は以下の通りである　その自然の生活 環において（親ウィルスと呼ぶ）タンパク質前駆体を生産し、それをウィルス性 又は細胞プロテアーゼによりタンパク質分解プロセシングするウィルスを既知の 遺伝子工学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅ、ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄ、）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））を用いて修飾し、発 現され、組み換えウィルスによりプロセシングされるべき夕（囚性タンパク質又 はポリペプチドをコードする外因性核酸配列（それが導入されるウィルスの種類 以外の供給源から得た核酸配列）、及び発現された組み換えタンパク質をプロセ シングしてウィルス性及び外因性タンパク質を放出するウィルス性及び／又は細 胞プロテアーゼに関する人工の認識部位をコードする核酸配列の少なくとも２種 類の核酸配列をウィルスゲノム中に導入する。ポリ−グリシン領域などの他の種 類の核酸配列を外因性核酸配列に隣接して挿入し、その領域の構造的柔軟性を増 し、おそらく効率を上げることができる。

本発明を説明するポリオウィルスベクター　ｃＤ１″ＪΔクワーンの構築を実施 例１に記載する。それぞれ外因性産物をコ・−ドする外因性核酸配列、１つか又 はそれ以上の人工りのタンパク質分解認識部位、及び場合によりポリグリシン領 域などの追加の核酸配列を含む１つか又はそれ以上の゛単位−をこの方法で導入 することができる。例えばそれに対する免疫応答が望まれている夕（天性タンパ ク質抗原をコードする核酸配列、及びタンパク質分解プロセノ〉・グに関する人 工の認識部位を含む１つの“単位゛をウィルスゲノムの５′末端に導入すること ができる。別の場合、２つかヌはそれツヒのそのような゛単位゛、あるＬ′）は １１〕より多いタンパク質又はポリペプチド及び適した数のクンバク質分解υノ 断部位を二コートする核酸配列を含む１つの“単位”　（例えば２つか又Ｉまそ わ以上の異なるタンパク質抗原あるいけ１つのタン・ぐり質抗原の２つのコピー の発現及び放出をＬうえる）をウィルスゲノムに導入することができる。発現す るべきタンパで７實又はポリペプチドをコ・−ドする核酸配列は゛単位”中で直 列（ｔなオ〕も介在配列がない）であることもてき、あるいは発現Ｖるべき夕〉 バク質又はポリペプチドをコードし７ない核酸により隔てら′１１でいることも てきる。１つか又はそれ以上の単位をウィルスゲノム中のいく′つかの部位又は すべての部位に導入することができる。得ら１する組み換えポリタンパク質前駆 体は１つか又はそ４］以上の外因性タンパク質又はベプヂド及び１つか又はそれ 以」二のタンパク質分解切断部位を含む。組み換えポリタンパク質前駆陣のプロ セシングにより外因性産物が遊離される。

本明細書に記載の組み換えポリオウィルスなどの組み換えウィルスを用い、個体 において抗原に対する免疫応答を誘導し、かくしてその抗原が存在する外因性病 原体（／Ｘクチリア、ウィルス、菌、寄生虫）による攻撃又は感染に対する防ｔ ａＴｌ’；与えることがてきる。従ってこれらはそのような病原体に対する防御 をりえるワクチンとして有用である。実施例２に記載の通り、ロタウィルスＶ　 Ｐ　４タンパク質からの抗原エピトープをコートする核酸配列をなも組み換えポ リオウィルスが構築された。やはり実施例２に記載の通り、コレラ毒素サブユニ ットＢからの全コート領域を含む組み換えポリオウィルスが構築された。イルフ ルエンザ△ウィルス抗原又はヒフリオコレラの毒素共調節線毛（ｔｏｘｉｎ　ｃ ｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｉｌｕｓ）（ｔｃｐＡ）をコードする核酸配列を含む 組み換えポリオウィルスも製造された。これらの組み換え及び親ポリオウィルス の表現型を図３に示す。コレラ毒素サブユニットＢがらの全コード領域を含も組 み換えポリオウィルスをＨｅＬａ絢胞中で発現し、その発現及びプロセシングを 評価した。結果は、組み換えウィルスと関連してＢサブユニットが発現され、適 当にプロセシングされることを示した（図４Ａ）。結果は、正常より大きいＰ１ ポリタンパク質が組ろ換えポリオウィルスにおいて形成されるが適したタンパク 質分解プロセシングが起こり、正常なポリオウィルスタンパク質産物の全量及び 遊離のコレラ毒素Ｂザブコニ／ト配列を生成することも示した（図４Ｂ）。ロタ ウィルスＶＰ４タンパク質から誘導した抗原エピトープ（２１，−１０４アミノ 酸の長さ）を含む組み換えポリオウィルスもＩＩ　ｅ　Ｌ　ａ細胞において発現 した。図４Ｂの２−４列はこれらのエピトープを有する組み換えポリオウィルス を含む。

実施例３は本明細書に記載の通りに作出した組み換えポリオウィルスの免疫原性 の評価を説明している。ヒトポリオウィルスレセプターを発現する形質転換マウ スに、Ｍ　ａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ　ｙ又はＳａｂ　ｉ　ｎ−ベースのベクターに関 連して全コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を発現する組み換えポリオウィル スを筋肉内注射により感染させた。槽重マウスは擬感染させるか、又はヒブリオ 　コレラ　ビリン（ｐｉｆｉｎ）を発現する組み換えウィルスにＶ、染させた。

ウェスターンブロノ）−（図６）は、Ｍ　ａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ　ｙ−ベースＣＴ ｌ３−組み換えポリオウィルスで免疫化したマウスが明らかにＣＴＢ単量体及び 三量体と反応性のＩｇＧ抗体を含むことを示した。槽重マウスは予想通りそのよ うな特異的抗体を含まながった。さらに５ａｂｉｎ−ベースＣＴＢ−組み換えポ リオウィルスで免疫化したマウスは、この１例においてＣＴ　Ｂ−特異的抗体反 応性を生産しなかった。この理由は明らかではないが、組み換えポリオウィルス の複製性に関連し、ているかも知れず、組み換えウィルスワクチンの投薬量を増 すことにより解決できるかも知れない。

それに対する免疫応答が望まれている他の抗原を」−ドする核酸配列を含む組み 換えポリオウィルスを、コレラ毒素サブユニットＢ及びロタウィルスＶＰ４タン パク質に関して記載した方法と同様の方法で製造することができる。組み換えポ リオウィルスは、感染の予防に粘膜性免疫の誘導が必要な疾患の予防（又はそれ が起こる重度の軽減）に特に有用である。例えば組み換えポリオウィルスはＨＩ Ｖ、ロタウィルス、Ｒ３■、Ａ型肝炎ウィルス及びインフルエンザウィルスによ る感染に対する防御あるいは重度の軽減を与えるのに特に有用である。

ヒトの体の粘膜表面は４００ｍ２以上を覆い、免疫系と環境の接触の最大面積を 成す。粘膜表面に付属するリンパ系細胞の合計数は、他のすべてのリンパ系組織 を合わせた数を越え、これらの細胞は毎日生産される免疫グロブリンの合計の少 なくとも６０％の合成を担う（Ｃｈｉｌｄに涙、唾液及び乳などの分泌液中に特 異的１ｇＡ抗体が存在することは、共通の粘膜免疫系の概念を起こさせた。腸− 付属リンパ網状組織（ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃ ｕｌａｒ　ｔｉｓｓｕｅ）（ＧＡＬＴ）において感作した免疫細胞の子孫が遠隔 の粘膜表面に移動して防御すると思われる。粘膜免疫系の広さ及び重要性にもか かわらず、粘嗅表面上の細胞性及び体液性免疫の決定基について比較的少ししか 知られていない。これらの問題の実験的評価は、それを担っているリンパ球を比 較的入手し、難いこと、ならびに再現性の高い標的部位に十分に特性化された抗 原を配達するのが困難であることにより制限されてきた。組み換えポリオウィル スは、上針に特性化された抗原を再現性の高い方法で配達することを可能にし、 これらの実験的障害をいくらか改善することができる。かなり重要なウィルス性 及びバクテリア性疾患の多くを現在のワクチン注射により予防することができな い。これらにはロタウィルスによって起こる下痢性疾患、Ｒ３Ｖ感染から生ずる 呼吸器疾患、■　コレラ又は毒素病原性大腸菌によって起こる細菌性胃腸炎が含 まれる。粘膜性免疫は、これらの病原体による自然の感染の後に生成され、再感 染に対する有意な又は完全な耐性を与える。本発明の組み換えポリオウィルスは 関連する防御抗原を粘膜免疫系に配達するのに用いることができ、か（して新規 なワクチン戦略を与える。

ポリオウィルスワクチンは広く用いられ、非常に安全で有効である。

用いられるポリオウィルスの生物学的に活性な分子クローンには、ボリア８・４ ８８７−４８９１　（１９８１））及びポリオウィルス１．２及び３型の５ａｂ ｉｎ　ワクチン株（Ｏｍａｔａ、Ｔ’、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３２：１−１ ０（１９８４）：Ｔｏｙｏｄａ、Ｈ，ｅＬ　ａｌ、。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ　↓ヱ４　：　５６１−５８５　（１，９８４））が含まれ る。毒性の形態にもどり難いポリオウィルスの誘導体も形成することができ、あ るいは挿入、欠失、及び／又はヌクレオチド配列の修飾を介した特定部位の突然 変異誘発により毒性の形態から無毒性とすることができる。

組み換えポリオウィルスワクチンは、それぞれ抗原効力の重度が異なり、野生型 の病原性形態にもどるわずかな危険を有する３つの異なる弱毒味（ＰＶＩ、ＰＶ ２及びＩ）　Ｖ　３　）の混合物を必要とする現在用いられている経口的ポリオ ウィルスワクチンの有用な代替えとなることができる。ＰＶＩは最も安全て最も 抗原性の成分と考えられ、Ｐ■３は病原性の形態にもどる頻度が最も高いことが 知られている。腸内ウィルス・ポリオウィルス、コクサラキーウィルス、エコー ウィルス及び新腸内ウィルス　Ｎ１ｅｌｎｉｃｋ、Ｊ、Ｌ　於　Ｖｉｒｏｌｏｇ Ｙ（２ｄ　ｅｄ、）Ｄ、　Ｎ、　Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｋｎｉｐｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　（ｅｄ、　）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、ＮＹ　１９９０． ｌ１ｌ）、５４９−６０４：Ｎｋｏｗａｎｅ、Ｂ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｖａｃｃ ｉｎｅ−Δ５ｓｏｃｉａｔｅｃｌ　Ｐａｒａｌｙｔｉｃ　Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉ ｔｉｓＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ：１９７３−１９８４　ＪΔＮ１Δ、２５７ 　：１３３５−１３４０　（１９８７）：Ｍｅ　Ｉｎ　ｉ　ｃｋ、Ｊ、Ｌ、Ｐ。

ｐｕｌａｔ、ｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Δｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　Ｌｉｖｅ　Ｐ ｏ１ｉｏｖｉｒｕｓ　＼’ａｃｃｉｎｅ、Δｍ、Ｊ、Ｐｕｂ、Ｔｉｅａｌｔｈ　 ５２：４７２−４８３　（１９Ｇ２）。ＰＶＩに基づき、ＰＶ２及びＰＶ３成分 が挿入されたｉｌｌみ換えポリオウィルスは、現在入手できるワクチンより安全 なワクチンであることが証明できる。さらにＰＶｌに基づく組み換えポリオウィ ルスを用い、３つのポリオウィルス血清型のすべてからの抗原決定基を有し、最 大に弱毒化した抗原的に効力のある組み換えウィルスを与えることにより、すべ てのポリオウィルス株に対する有効な免疫を達成することができる。

ワクチンとして組み換えポリオウィルスを用いる特別な利点は、それが遺伝的に 安定であり、細胞が複製される時にポリオウィルスゲノムが細胞から細胞に広が る場合、挿入された情報を再現性高く運ぶことである。その結果免疫化は、限ら れた数の組み換えポリオウィルスの投薬を用いて有効である。さらに導入された 抗原が感染細胞内で発現されるので、細胞−媒介及び体液性免疫の両方が賦活さ れる。外因性核酸配列は組み換えポリオウィルスにより運ばれ、復製サイクルの 間に発現されるが、外因性タンパク質は成軌ウィルス粒子に含まれない。かくし て組み換えポリオウィルスのヒリオン構造及び宿主範囲は、外因性タンパク質に より変化しない。多くの重要な変数（ｖａｒｉａｂｌｅｓ）が特に開発国で用い られる場合に、入手できるワクチンの効率を制限している。

これらの問題のいくつかは実施」二の、又は経済的性質のものであるが、他は生 物学的基礎を何する。麻疹ワクチンを用いた免疫化は生物学的障害の良い例であ り、この克服に本発明が有用である。麻疹は開発国において毎年２００万人の子 供の死亡原因である。Ｂｌｏｏｍ、Ｂ、Ｒ，。

Ｎａ　ｔｕｒｅ、３４２　：１１５−１２０　（１９８９）　。麻疹ウィルス感 染の予防に有効なワクチンが存在するが、ワクチンを中和する母親由来の抗体の 存在が幼児におけるその効率を含む（ｃ　ｏｍｐ　ｒ　ｉ　ｓ　ｅ）。Ｍｄ　） 、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ、４６９−５０２　（１９ｃｒ、　Ｗ、 　Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｐｕｂｌ　ｉｓｈｉｎｇ、　Ｐｈｉ　Ｉａｄｃｌｐ ｈｉａ　（１９８８）。開発国国民の場合、麻疹感染の流行は多くの子供が有効 にワクチン注射される前に病気にかかるどい・）ものである。麻疹ウィルスから 誘導された抗体を有する組み換えポリオウィルスはそのような障害の克服を助け ることができる。ポリオウィルスワクチンは誕生後短期間で与えられ、その効率 は母親由来の抗体の存在によりあまり損なわれない。ポリオ−麻疹組み換えウィ ルスは感染細胞において麻疹抗原を発現し、免疫応答を起こさせる。しかし２麻 疹抗原は組み換えウィルス粒子中になまれないので、ワクチンベクターの複製は 被害を被らない。

本発明のワクヂニ、がａ用である領域がさらにある。例えば丁痢性疾懸は毎年５ −１０百万人の死亡を引き起こすと見積もられる。Ｉｎ５ｔｉＬｕｔｅ　ｏｆ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｅｓｔ ａｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｐｒ１ｏｒｉｔｉｅｓ。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｐｒｃｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔ。

ｎ、Ｄ、Ｄ、（１９８５）　、、［ＴＩタウフィルスは小児及び幼児の重症の下 痢の単独の最も１Ｔ要な病因であり、毎年この集団においで約百万人の死亡を弓 １き起こすと思われる。Ｋａｐｉｋｉａｎ、Ａ、Ｚ、ａｎｄ　Ｒ，ＭＣｈａｎｏ ｃｋ、　於：Ｖｉ　ｒｏｌｏｇｙ　（３ｒｄ　ｃｄ、）、Ｂ、Ｎト”１ｃｌｃｌ ｃｔａ１．（ＩＥｄ、）、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮＹ。

ｐｐ、１３５３−１．４０４　（］−９９０）。、ロタウィルス感染に対する宿 主免疫応答の同定において有史な進歩が成されたが、ウィルスの遺伝的ＩＭ雑さ 及び７λ、手てきる弱毒化ワクチン株の効率が限られていることにより、ワクチ ンの試みは限られてきた。同様に、＼ｌ　コレラの抗原は防御免疫応答の標的で あるらしいと記載された。しがしコレラに対する候補ワクチンは望ましくない副 効果又は不適当な免疫原性により限られてきた。ロタウィルス及びＶ　コレラが らの免疫原性であるが病原性ではない防御決定基を有する組み換えポリオウィル スは、候補ワクチンとしての評価を保証する。

感染物によって起こる呼吸器疾患は、毎年１０百万人の死亡を生ずると見積もら れ、ＲＳＶが主要なウィルス性病原体である。Ｍｃｌｎｔ。

ｓｈ、に、ａｎｄ　ＲＮｉ、Ｃｈａｎｏｃｋ、於：ＶｉｒｏＩｏｇｙ（２ｄ　ｅ ｄ、）、Ｂ、Ｎ、Ｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、（Ｅｄ、）、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓ ｓ、ＮＹ、ｐｐ、１０４５−１０７４　（１９９０）、Ｒ８■ワクチン開発の試 みは今日まで失敗であったが、防御抗原の同定においてかなりの進歩が成された 。Ｒ８Ｖワクチンを有効なものとするために、それは粘膜性免疫を誘導し、誕生 後すぐに与えられ、しかも母親由来の抗体の中和効果を避けなければならない。

組み換えＲＳＶ−ポリオウィルスはおそらくこれらの基準のすべてを満たずこと ができる。

Ｂ型肝炎ウィルスによって起こる疾患の予防も本発明に従って製造されるワクチ ンの標的である。

Ｂ型肝炎ウィルスはへバトナビリダエ（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）と呼ば れるウィルスの群に属する。ウィルスはＤＮＡの小環状断片を含み、それは部分 的に１本鎖である。感染性ピリオンはＤＮＡポリメラーゼも含み−それはＤＮＡ ゲノムを完全な２本鎖とする。Ｂ型Ｉｌｌ炎ウィルス（１−ＩＢＶ）の複製ザ、 イクルはＲＮＡ中間体の形成を含む。

Ｂ型肝炎ウィルスは世界中に分布している。・ウィルスの表面抗原がいくつかの 非−ヒト霊長類で見いださイ］たが、ピトはウィルスに関する主要な保有者であ ると思す第１る１、合衆国にシ５いＣ１°００．０００の人［］当たり２２の肝 炎の事例があると評価さ第１、この評価は１０分の１の過小評価であると考えら れる。こオ］らの事例の４５％は１３型旧炎に帰せられる。かくして合衆国にお いて慢性１３型肝炎に感染し７た人間は１−１２５百万であると見積ちられる。

Ｂ型肝炎の伝達の最も有効な経路は非経口的導入である。感染した患各の他の体 分泌物中でウィルスが見いだされたが、ウィルス伝達の他の様式は（−分に確立 さ１１でいない。

ＨＢ　Ｖは慢性的にウィルスに感染した轡者における原発性肝細胞症の発生にも 含まれる。この灰中はアフリカ、中国、東南アジア、アラスノＪ及びグリーンラ ッド沿岸て吊も優勢である。肝細胞症は多くの場合持続性のＩ（Ｂ　Ｖ感染の分 布パターンと同一の一般的地理的分布パターンに従５）によっ−Ｃ起こる疾■の 予防は本発明のさらに別の標的である。このバクテリアは、呼吸管の重症でおそ らく致死感染疾患である百日咳（ｐｐｒｔｕｓｓｉｓ又はｗｈｏｏｐｉｎｇ　ｃ ｏｕｇｈ）の原因である。

現在用いられている百日咳ワクチンは化学的に不活化したＢ、ペルツノスの全細 胞を含む。Ｂ　ベルノノス培養の化学的及び物理的分別によりＡた材料に基づく 非細胞ペルツ７／スワクチンが開発された。

さらに、各特定の百日咳抗原を梢製し、その後それを合わゼてワクチンを形成す ることにより製造されたワクチンが記載されている（公開欧州特許出願番号４８ ４．６２Ｆ、）。そのようなワクチンに含まれる抗原の１つは、６９キロダルト ン（６９ｋ　Ｄ）の外膜タンパク質である（Ｓｈａｈｉｎ、Ｒ，Ｄ、ｅｔ　ａｌ 、、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　８９ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉ ｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐａｇｅ　５１　（１９８９））。この抗原を本発明に従って 製造することができる。

ヘルペスウィルス（ヘルベトビリダエ（Ｈｅｒｐｅｔｏｖｉｒｉｄａｅ））によ って起、−る疾患の予防及び治療は、本発明のさらに別の標的である。ヘルペス ウィルスは太１）ＮΔウィルスてあり、宿主の寿命の間存続する潜伏性感染を確 立する。休止期間の後、ウィルスは免疫抑制又は放射線などの刺１藪により再活 性化することができる。

単純ヘルペスウィルス１型は°゛口辺庖疹”などの口腔障害の原因である。単純 ヘルペスウィルス２型は陰部庖疹の原因であり、それはさらに子宮癌に含まれる 。これらのヘルペスウィルスは集団に蔓延し、現在これらのウィルスに対する登 録されたワクチンはない。

ヘルペスウィルスに対して開発中のワクチンは、細胞中へのウィルスの侵入に必 須のウィルスタンパク質である糖タンパク質を利用している。

特に興味深いのは、単純ヘルペス１及び２型のｇＤと呼ばれる糖タンパク質であ る。ｇＤ−１及びｇ　Ｄ−２をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は米国特許第４． ８１８．６９４号及び第４．８９１．３１５号に示されている。いずれの糖タン パク質も本発明に従って製造することができる。

単純ヘルペス１及び２型のｇＢと呼ばれる糖タンパク質も興味深い。ｇＢ−１及 びｇＢ−２をコードするＤＮＡ配列は５ｔｕｖｅ、Ｌ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ　、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６１：３２６−３３５　（１９８７）及びＢｚｉｋ、Ｄ、Ｊ 、ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、上旦及３２２−３３３　（１９８６）に示 されている。これらの糖タンパク質のいずわも本発明に従って製造することがで きる。

ロタウィルスによって起こる疾曵は本発明の更に別の標的である。ロタウィルス は、乳幼児胃腸炎の主要原因として現在ＷＨＯに認められており、適したワクチ ンの装造によるこの疾患の抑制に高い優先度がおかれている（Ｂｕ　Ｉ　ｌ、Ｗ 、Ｈ，Ｏ，，６１：　２５１−２５４（１９８３））。

ロタウィルスゲノムは２本鎖ＤＮＡの１１のセグメントから成る。これらの遺伝 子は、完全ウィルス粒子において二重一般（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｈｅｌｌｅｄ）配 置て存在するウィルスの少なくとも６つの構造タンパク質の生産をコードする。

これらのタンパク質の３つは外殻糖タンパク質である。

そのようなワクチンの開発において行われている方法は、組み換えＤＮＡ法によ りロタウィルスのこれらの外殻糖タンパク質のいくつかを製造する方法である。

これらの糖タンパク質の１つはＶＰ７と呼ばれる。

３０９１−３０９５　（１９８３）に示されている。この糖タンパク質は本発明 に従って製造することができる。

外因性生物のペプチド又はタンパク質をコードし、発現されるとそのような生物 に対する、又は抗原によって起こる状曹又は障害に対する防御免疫を与えるいず れのＤＮＡ配列も、本発明の目的のための外因性核酸と考えることができる。１ つか又はそれ以上の外因性ポリペプチド（例えば抗原又はエピトープ）をコード する核酸配列を本発明のワクチンに含むことができる。１つより多い外因性抗原 又はエピトープが外因性核酸量ワリによりコードされる場合、それらは単一の病 原体の抗原又はエピトープでゐる二とも、あるいは１つより多い（異なる）病原 体からの抗原又はエピトープであることもてきる。好ましい実施態様の場合、そ のような生物は病原性微生物である。例えばそのような外因性エピトープは疾患 又は障害の原因であるバクテリア、寄生虫、ウィルス又は画工に見いだすことが できる。さらにアレルゲン、精子及び癌細胞上のエピトープも用いることができ る。そのようなバクテリア、寄生虫、ウィルス又は菌には下記に挙げるものが含 まれるがこれらに限られるわけではない。

複製−感応組み換えウィルスは多様な病原体に対するワクチンとして有用である 。例えば下記に挙げる生物のいずれからもＤＮＡ及びＲＮＡを得ることができ、 組み換えウィルスの製造に用いることができる。

寄生虫： プラスモノラム種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｓｐｐ、）エイメリア種（旦ユ凹− ｅｒｉａ　ｓｐｐ、）ンストソマ種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｓｐｐ、）トリ バノソマ種（Ｔｒｉｐａｎｏｓｏｍａ　ｓｐｐ、）バベンン種（Ｂａｂｅｓｉｎ 　ｓｐｐ、）レイシュ？−ア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　３１）ｐ、）クリブト ンポリンア種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ　ｓｐｐ、）トキソプラズマ種（ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｓｐｐ、）ニューモンスチス種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔ ｉｓ　ｓｐｐ、）バクテリア４ ヒブリオ　コレラエ ストレプトコックス　ピオゲネス（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙＯｇｅｎＣ ５） ナイセリア　メニギチンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ） ナイセリア　ゴノルホサエ（Ｎｅｉｓｓｉｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏ　ｓ　ａ　 ｅ） コリナバクテリア　ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｉａｄｉｐｈｔｈ ｅｒｉａｅ） クロストリンラム　テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎ上） プランハメラ　カタルハリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉ ｓ） ボルデテラ　ベルチノス ヘモフイルス種（ｌ（ａｃｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｐ、）（例えばインフルエン ザエ） クラモンア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　Ｓｐｐ、）毒素病原性大腸菌 ヒト免疫不全ウィルス、ｌ型 ヒト免疫不全ウィルス、ＩＩ型 サル免疫不全ウィルス 向ヒト１′リンパ球ウィルス（ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｉｙｍｐｈｏｔｒ。

ｐｉｃ　Ｘ′１ｒｕｓ）、Ｉ及びＩＩ型ＲＳウィルス Ａ型肝炎ウィルス Ｂ型肝炎ウィルス Ｃ型肝炎ウィルス 非−Ａ、非−Ｂ型肝炎ウィルス 単純ヘルペスウィルス、）型 単純ヘルペスウィルス、ＩＩ型 パラインフルエンザウィルス 麻疹ウィルス ムンプスウィルス 水痘 乳頭胛ウィルス 黄熱病ウィルス クリプトコックス種＜Ｃ工ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓりＩ）、）（特にネオホル マンス（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））プラストミセス種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ 　ｓｐｐ、）（特にデルマチチジス（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ））ヒス１−プ ラズマ種（且１乏艮ｏｐｌａｓｍａ　ｓｐｐ、）（特にイミチス（ｉｒｒ＋ｒｎ ｉ　ｔ　ｉ　ｓ）　）バラコンジオイデス種（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅ ｓ　ｓｐｐ　）（特にブラソリエンノス（ｂｒａｓ　ｉ　］　ｉ　ｅｎｓ　ｉ　 ５））ｙ、−、、＜ベルギルス種（バーｍ−り呈上：　Ｉ−Ｑ至　ｓｐｐ、）ワ クチン調製におそらく有用である抗原は、病原体の感染力の中和に抗原が含まれ ること（ＮＱｒｒｂｙ、Ｅ、、１９８５．Ｓｕｍｍａｒｙ。

於Ｖａｃｃｉｎｅｓ　３５．　Ｌａｒｌｌｃｔ、　ＲΔ、　Ｒ，Ｍ、　Ｃｈａｎ ｏｃｋ、ａｎｄ　Ｆ、Ｂｒｏｗｎ　（ｃｄｓ）、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ 、ＮＹ、ｐｐ、３８８−３８９）、型及び１１イ特灰性、中老の抗血清又は免疫 細胞による認識、及び／′又は抗原に特異的な抗血清又は免疫細胞の防御効果の 証明などの種々の基準により同定することができる。さらにコートされるエピト ープは時間において、又は同一病原体の異なる単離物の間で抗原性の変動をほと んど、あるいは全く示さないのが好ましい。

抗原決定基を含むことが知られているペブヂ１−又（Ｊタンパク質ヲ相み換えつ づルスに挿入することがてきる。特異的抗原が未（０の場合、免疫反応性配列の 同定及び特性化を行わなければならない。これを（〒う］っの方法は、病原体の 表面又は他の分子に対して生成されたモノクローナル抗体の利用による。抗体に より認識されることができるペプチド配列がエピトープとしで定義される。別の 場合、キャリヤー分子に複合化させた小さい合成ペプチドを、無損傷の分子上の ペプチドに対応する部位に結合するモノクローナル抗体の生成に関して調べるこ とができる（例えばＷｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　３７：７６７（１ ９８４）を参照）。抗原決定基の同定及び特性化に用いることができる当該技術 分野において既知の他の方法も本発明の範囲内である。

本発明のワクチン調剤中の外因性タンパク質は外因性生物のエピトープを含むこ ともてきる。外因性ポリペプチドがを椎動物宿主中で発現されると、それはエピ トープを含む抗原によって起こる状態又は障害に対する防御を与える免疫応答を 引き出す。例えば本発明のこの実施態様の場合、ヘヒ毒、蜜蜂前、ホルモン、精 子（避妊のため）、アレルギー−誘導抗原又は免疫応答が望まれる他の抗原のエ ピトープ又はタンパク質をコートする外因性タンパク質を用いることができる。

他の実施態様の場合、癌に対する防御免疫応答の誘導のために腫瘍−特異的抗原 を組み換え外因性タンパク質として発現することができる。

本発明に従い組み換えウィルスによって発現されるべき外因性タンパク質をコー トする遺伝子配列は当該技術分野で既知の方法により単離することがてき、その 方法には微生物のゲノムＤＮΔからの精製、微生物のＲＮＡからのｃＤＮＡ合成 、組み換えＤＮＡ法（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、Δ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８２．Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、又は１ヒ学的合成による方法が含まれるがこれら に限られるわけてはない。

これらをワクチンとして用いる場合、本発明の組み換えワクチンは既知の方法を 用いて個体に投与される。一般にこれらは従来の（現在入手できる）ワクチンが 投与される経路と同一の経路、及び／又は問題の病原体による感染が起０る経路 を模した経路により投与される。例えば組み換えポリオウィルスワクチンは経口 的に投与することができ、組み換え麻疹又は組み換えワラビウィルスワクチンな どの池のワクチンは皮下経路により投与することができる。これらはワクチン組 成物として投与することができ、これは？Ｉ製−感応組み換えウィルスの他に生 理学的に許容し得るキャリヤーを含む。組成物は免疫賦活剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔ ｉｍｕｌａｔ　ｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）又はアジュバント、風味料又は安定剤も含 むことができる。

本発明の組み換えウィルス、特に相み換えポリオウィルスは、咄乳類、特にヒト の細胞又は他の細胞型（例えば修飾されてポリオウィルスレセプターを有する咄 乳類細胞）などの宿主細胞において外因性ポリタンパク質を生産するための系と しても用いることができる。その後外因性タンパク質をそれが生産された細胞か ら既知の方法を用いて単離する。

いずれの用途の場合も（すなわち免疫化又は組織培養生産）、ウィルス中に導入 される外因性核酸配列は自然に存在する供給源から得たもの、遺伝子工学的方法 を用いて製造されたもの、又は化学的に合成されたものであることができる。ウ ィルス中に導入さＡ］る外因性核酸配列は、免疫応答が望まれている全抗原、又 は抗原エピトープあるいはタンパク質をコートすることができる。ウィルスケツ ム中に導入することができる核酸配列のサイスは無制限であると思われる。外因 性核酸配列の最大のサイズは、本明締書に記載の通りウィルス複製へのその影響 の評価などにより決定することができる。少な（とも１５０の追加のアミノ酸（ すなわち４５０ヌクレオチド）をコードする外因性核酸配列が、ウィルスの復製 効率を有口に危うくすることなくポリオウィルスゲノム中に挿入された。挿入さ れた配列は、−次配列及び構造的コンホーメーションの両方により定義される抗 原構造を宿主免疫系に与えると予想される。

植物ウィルスも親ウィルスとして用いることができ、本明細書に記載の通りそれ に外因性核酸配列が導入される。例えばＤＮΔゲノムを有する植物ウィルス（例 えばカリフラワーモザイクウィルス）又はＲＮＡゲノムを有する植物ウィルス（ 例えばタバコモザイクウィルス、カブ黄斑モザイクウィルス）を用いることがで きる。それらは、植物において発現されるべき外因性ポリペプチド（例えば昆虫 又は疾患に対する毒素）をコードする外因性核酸配列を導入することにより修飾 することができる。得られる復製−感応組み換え植物ウィルスを、その後植物中 に導入しく例えば種子中に、又は植物発生の別の段階で）、そこで外因性ポリペ プチドが生産される。例えばサソリ又はクモ毒などの毒素をコードする外因性核 酸配列を、それが植物中で発現され、その植物を食する昆虫に対して植物が防御 されるような方法で導入することができる。さらに外因性核酸配列が発現される 植物を、コードタンパク質又はポリペプチドの供給源として経口的に投与するこ とができる。

同様にして親ウィルスは動物ウィルスであることができ、それを動物中で発現さ れるべき外因性核酸配列を含むように修飾する（例えば病原体に対して動物を防 ■又は免疫化するために、あるいは成長促進因子を与えるために）ことができる 。

ここで本発明を以下の実施例により説明するが、実施例はいかようにも制限を目 的とするものではない。

分子クローンの操作はすべて標準的組み換えＤＮＡ法に従った（Ａｕｓｕｂｅｌ 、Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−Ｗｉｌｅ ｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７）。用いられたポリ オウィルスの生物学的活性分子クローンはポリオウィルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ 株）（Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７８　：４８８７−４８９１　（１９８１））及びポリオウィルス １．２及び３型の５ａｂｉｎワクチン株（Ｏｍａ　ｔ　ａ、　Ｔ、ｅ　ｔＡ±、 、Ｇｅｎｅ　３２：１−１０　（１９８４）；Ｔｏｙｏｄａ、Ｈｏｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、１７４：５６１−５８５　（１９８４））を含む。これ らの分子クローンをウィルスゲノムの５°末端てＴ７　Ｒ，ＮＡポリメラーゼプ ロモーターを挿入することにより修飾し、感染性ポリオウィルスＲＮへのＴ７　 ＲＮΔポリメラーゼによる試験管内転写を容易にした。△ｕｓｕｂｅ１．Ｆ、Ｍ 、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−〜Ｖｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）ｏポリオウィルスゲノムをさらに、多 様な制限酵素認識部位（すなわちＥｃｏＲ＋及びＸｈ。

Ｉ）を含む枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）合成ポリリンカーを含むように修飾した。

ポリオウィルスゲノム内に挿入された配列は、ポリオウィルス３Ｃプロテアーゼ に関する認識及び切断部位をコードする配列を３°境界に含む（ＡＸＸＱＧ）（ Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｃ，、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、ＭｉｃｒｏＵ夕、４４：６０３−６２３（１９９０））、これらの修飾 は重複伸長として知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の変型により行った 。（Ｉｌｏｒｔｏｎ、Ｒ，Ｍ、ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８：５２８−５３５（１９９０））。それを１型ポリオ ウイルスの例を用いて以下に説明する。

簡単に記載すると、オリゴヌクレオチド１及び２、ならびに　及び４（表を参照 ）を用いて２つの独立したＰＣＲ反応を行い、それぞれ位置１−７４０及び７４ ０−１５４０のポリオウィルスゲノムの部分を増幅しｊこ。

表１ 増幅のためのプライマー オリゴヌクレオチド 番号　配列 １−　５’　−ＴＡＣＧＧＴ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＡΔＴＴΔＣＧΔＣＴＣＡ　Ｃ ＴΔ　ＴＡＧ　Ｇ−３°　（配列番号　１） ２−５“　−ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＣＣＣＴＣＣＣＴ　ＣＧＡ　ＧＧＧ　 ＣＡＡ　ＴＴＣＣＴＧ　ＡＣＣＡＣＣＣΔＴＴΔＴ　（、−３゜（配列番号　２ ） ３−５°　−ＣＣＣＴＣＧ　ΔＧＧ　ＣＡＧ　ＧＣＴＴＴＧ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　 ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＣＡ−３’　（配列番号　３）４−　５“ 　−ＡＴＴ　ΔＴＣＴＧＧ　ＴＧＣＧＧＧΔＡＣΔＣΔ　ΔＡＧ　ＧＣ−３゜ （配列路ち　４） ５−５°　−ＴＣＡ　ＣＧＡ　ΔＴＴＣΔＣΔＣＣＴＣΔ　ＡＡＡ　ＴΔＴ　Ｔ −３゜ （配列番号　５） ６−　５’　−ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴＴＧＣＣＡＴ　ΔＣＴ 　ＡＡＴ−３’ （配列番号　６） 挿入するべき断片を含むＰＣＲ産物をアカロースケル電気泳動により精製し、オ リコヌクレオヂドブライマ−１及び４を用いて第２のＰＣＲ増幅を１斤った。こ の増幅から得た１５８２塩基対（ｂ　ｐ）のＤＮＡ断片は４２のヌクレオチド挿 入片（新規制限酵素部位及びタンパク質分解プロセシングノグナルをコートする 配列を有する）、及び配列１−７４０及び７４０−１５４０を与える。（４２ヌ クレオヂド挿入片は塩基７４０と７・１１の間に挿入された。）この断片を５ａ ｌｌ及びΔａｔ２で消化し、ケル電気泳動により精製し、Ｓａｌ］−へａｔ２消 化ポリオウィルスクローンｐＳＲ−ＸｐΔ（全長ポリオウィルスｃＤＮ△クロー ンを含む以前に記載のあるブラスミｔ−）（Ａｎｄｉｎｏ、Ｒ，ｅＬ　ａｌ　。

Ｃｅ１ｌ　Ｇ３：３（３９−３８０（１９９０））に連結した。ｉ８られたプラ スミド（ｐＮ・１■２２と呼ぶ）をＣ１ａｌで消化することにより直鎖状とし、 Ｔ７ボリメラーセによるウィルスＲＮ△の試験管内合成を従ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｉ’ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）。

記載の通りに１−１　ｅ　Ｌ　ａ　Ｓ　３細胞中に試験管内合成ポリオウィルス ＲＮＡをトランスフェクトすることにより複製−感応ポリオウィルスを回収した （Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、ΔｃｉｄｓＫ且互　１１　： １２９５−１３０８　（１９８３））。回収されたウィルスを挿準的方法により 複製能力、構造的組成及びヌクレオチド配列に関Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ　ｉｓ ｈｉｎｇ−”ｒ’／ｉ　ｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 、１９８７）。

多様なウィルス及びバクテリア病原体から誘導した外因性遺伝子配列をこれらの 組み換えポリオウィルス中で発現した。用いられた一般的戦略を、以下の通りに 完全コレラ毒素Ｂザブユニットの例により説明する。

以下の配列を有するオリゴヌクレオチド（ポリオウィルスベクター中への枠内挿 入を可能にするために選択）を用い、プラスミドｐＪＭ１７に含まれる完全コレ ラ毒素Ｂザフユニットコード領域を増幅した（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｄ、Ｎ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、ｓ　Δ　７９　：　２ ９７８−２９８０　（１９８２）　）１５’　−ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡ Ｇ　ＡＣＣＴＣＡ　ＡＡＡＴＡＴ　Ｔ−３’　（配列番号　５） ５’　−ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ＴＧＣＣＡＴΔＣＴ　ΔΔ Ｔ−３’　（配列番号　６）これらは表に示されているプライマー５及び６であ る。

得られた３１２ｂｐのＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌ　（ＰＣＲプライマーを 介し７て導入された部位）で消化し、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ，Ｉ及びＸｈｏＩ−切断ｐ ＭＶ２．２に連結した。得られたプラスミドを、ＰＣＩ−５２と名（ｔｉ）、Ｒ ＮＡｌ−ランスフェクソヨンの後に得たウィルスをＰＣＩ−５２と名付けた。同 様の方法を用い、ビブリオコレラの毒素−共調節線毛（ｔｃｐＡ）のプラスミド クローン（Ｓｕｎ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃ　ｉ　１ｍｍｕｎ、５９　： １１４−１１８　（１９９１））、ロタウィルＸＶＰ４遺伝子（Ｇｏｒｚｉｇｌ ｌａ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、ＰｒｏｃＮａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、　、 　Ｕ、Ｓ　Δ　８７　：　７１５５−７１５９　（１９９０））及びインフルエ ンザＡウィルス赤血球凝集素遺伝子（Ｗｉ　Ｉｅｙ、Ｄ、Ｃ，ｅｔ　ａ　ｌ　、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ旦・３６５−３９４　（１９８７））から誘 導した配列を挿入した。ｔｃｐＡの場合、挿入した核酸配列はタンパク質のアミ ノ酸のカルボキン末端（１５７−１９９）に対応した。インフルエンザへの場合 、挿入した核酸配列はアミノ酸１３４−２８４に対応した。

ポリオウィルス成分、ならびに挿入配列の適した発現及びプロセシングを実証す るための組み換えポリオウィルスの免疫学的特性化をウェスＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇ ｒｅｃｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７Ｌ感染細胞の代謝−標識（３５Ｓ）ライセードの、従 来のスクロース勾配（１５−３０％）遠心により本来のピリオン組成及び構造の 保存が証明された。

その後勾配画分を標準的５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した（Ａｕｓｕｂｅｌ 、Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−Ｗｉｌｅｙ 　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）。

実施例２　ビブリオコレラＢ毒素サブユニットを有する組み換えポリオウィルス の構築及び評価 コレラ毒素サブユニットＢ（１０３アミノ酸）又はロタウィルスＶＰ４キャプシ ドタンパク質の数部分（２１−１０４アミノ酸の長さ）からの全コード領域を含 む組み換えポリオウィルスを構築した。サブユニットＢ又はＶ　Ｐ　４ペプチド をコードするＤＮＡ断片を増幅し、クローニングの目的のために適した制限部位 を含むことによりそれらの末端を修飾した。毒素Ａサブユニットからの単離物に おいて発現されると、コレラＢサブユニットは毒性ではないが抗原性刺激を与え 、防御免疫応答を誘起することができる。ＤＮＡ断片をポリオウィルスベクター ｃＤＮＡクローンに挿入し、得られたプラスミドからＲＮＡを転写した。コレラ 毒素サブユニットＢ及びロタウィルスＶＰ４組み換えｃＤＮΔＤＮＡンを別々に Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞中にトランスフェクトした。３７℃で３日間インキュベートし た後に組み換えポリオウィルスプラークが得られた（図２）。

図２は親及び組み換えポリオウィルスプラークの形管を示す。野生型ポリオウィ ルス（１列）又はコレラ毒素Ｉ３−ポリオウイルス組み換えウィルス（２列）に 感染したＨｅＬａ細胞から調製した抽出物をＳＤＳ　ＰＡＧＥゲル上で電気泳動 させ、ウェスターンプロノトにより分析した（図３Ａ）。ウェスターンプロソ） ・は無損傷のコレラ毒素（Ａ及びＢサブユニット）に特異的なウザキ抗血請を用 いて発色させた。わかる通り、組み換えポリオウィルスに関連してＢサブユニッ トが発現され、適当にプロセシングされる（矢印で示す）。

族ポリオウィルス（図３Ｂ、１列）又はコレラ毒素Ｂ−ポリオ組み換えウィルス （図３Ｂ、５列）に感染した同一のＨｅＬａ細胞からの抽出物を、ポリオウィル ス構造タンパク質を認識するウサギ抗体で精査した。

わかる通りポリオウィルス組み換え体において、外因性ポリペプチドの存在のた めに正常より大きいＰ１ポリタンパク質が形成される。その後退したタンパク質 分解プロセシングが続き、ポリオウィルスタンパク質産物の正常な全員が生成さ れ、外因性コレラ毒素配列が放出される。組み換えウィルスの免疫学的特性化は 、ウェスターンプロ、ト分析によりｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ−Ｗｉｌｅｙ 　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）。従来の密度勾配 遠心による分析及びウェスターンプロット分析を用い、本来のヒリオン構造の保 存が確認ｅｎｅ　Ｐｕｂｌ　ｉｓｈｉｎｇ−Ｗｉ　Ｉｃｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ ｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７”）。

実施例３　組み換えポリオウィルスの免疫原性の評価最初の免疫原性研究のため の実験モデルは、ヒトポリオウィルスレセプターを弁環する形質転換マウス（Ｒ ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１６３：３５３−３６２（１９９０）、Ｄｒ、Ｖｉ ｎｃｅｎｔ　Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏにより親切な寄贈）を用いた。筋肉内注射に より形質転換マウスを、ＭａｈｏｎｅＶ又は５ａｂｉｎ−ベースベクターに関連 して全コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を発現する組み換えポリオウィルス （それぞれＭｏ５Ｂ及びＭａＳＢ）（５０μｌの２ｘｌＱ’ｐｆｕ／ｍ＋原液） に感染させた。標準マウスは擬感染させるか、あるいはビブリオ　コレラ線毛（ ＴｃｐＡ）を発現する組み換えウィルス（ＭｏＰｌ）に感染させた。マウスは３ ０日隔てた２回で感染させた。４３日後、ワクチン注射したマウスに不完全フロ インドアジュバント中の１０μｇの精製ＣＴＢ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を腹 腔内注射により与えｔｌ、。５日後にマウスを放血させ、その血清を精製ＣＴＢ と反応性のＩｇＧ抗体に存在に関して調べた。ＣＴＢと反応性の抗体をウェスタ ーンプロットにより下記の通りに検出した。ＣＴｌ３　（５ｎｇ）を１０％ポリ アクリルアミドゲルの１本の広い列において５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離し、ニトロセ ルロースに移した。免疫化した動物からの血清（１：１００希釈）を、マルチス ロット装置（ｍｕｌｔｉ−ｓｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏ ｔｅａｎ　Ｉｌ、マルチスクリーン、ＢｉｏＲａｄ）の独立した列中に負荷した 。槽重的方法に従い、パーオキシダーゼと複合化したアフィニティー精製ウサギ 抗−マウスＩ　ｇＧ　（ＥＣＬＳＡｍｅ　ｒｓｈａｍ）を用いて結合抗体を検出 した。

この分析の結果を図６に示す。ＣＴＢ−組み換えポリオウィルス、Ｍｏ５Ｂ（３ ７列）を用いて免疫化した５匹のマウス中の５匹からの血清が明らかにＣＴＢｉ 量体及び三量体と反応性のＩｇＧ抗体を含む。擬感染（１及び２列）、又は冊関 係標準（ｔｖｉｏＰｉ、１２−１４列）からの血清は予想通りそのような特異的 抗体を含まない。さらに５ａｂｉｎ−ベース組み換えＣＴＢ−発現ポリオウィル スで免疫化したマウスは、ＣＴＢ−特異的抗体反応性を示さなかった（ＭｓＳＢ 、８−１１列）。

これらの予備的結果から多くの結論が示唆される。第１に組み換えポリオウィル スを用いた免疫化は、免疫化された動物において適した抗体応答を直接生ずるか 、又は特異的に開始させることができる。精製ＣＴＢで同様に免疫化した標準マ ウスの血清中にＣＴＢ−特異的抗体がないこと、及び観察されたＣＴＢ−反応性 抗体のＩｇＧイソタイプは、ワクチン注射により記憶応答が誘導されたことを示 唆した。この理由は明確でないが、組み換えポリオウィルスの相対的複製性に関 連するかも知れず、組み換えウィルスワクチンの投薬量を増すことにより解決さ れ得る。野生型及び組み換え５ａｂｉｎポリオウイルスの両者の復製は、対応す る野生型Ｍ　ａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ　ｙの場合より不十分である。さらにこれらの 実験で用いた形質転換マウスはポリオウィルスの５ａｂｉｎワクチン株の有効な 複製を持続させない。かくして生体内での複製が限られていることが５ａｂｉｎ −ベース組み換え体による有効な免疫化の誘起を妨害したか組み換えポリオウィ ルスの免疫原性の研究と平行し、ウィルスの安全性を評価するための予備研究を 行った。これらの目的のために、形質転換マウスに等力価（５ｘｌＯ６ｐ　ｆｕ ）の親Ｍａｈｏｎｅｙ（病原性）又は５ａｂｉｎ（弱毒化）株、あるいはＣＴＢ を発現するそれらのＸ■み換え誘導体を脳内接種した。Ｍ　ａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ 　ｙ株を接種したマウスはすべて麻痺したが、組み換え体を注入したマウスはい ずれも麻痺しなかった。

この結果はポリオウィルスゲノム内へのＣＴＢ配列の挿入が、得られる組み換え ウィルスの病原性を増大させずに減衰させることを示唆しでいる。この現象のさ らに詳細な研究は進行中である。

実施例５　別の複製感応ポリオウィルス９男！図２に図解的に示した組み換えポ リオウィルスを同様の方法で、本明細書に記載の方法及び材料（実施例〕及び２ を参照）、ならびに当該技術分野において認められた方法を用いて構築した。組 み換えポリオウィルスポリタンパク質の５゛以外の部位の外因性コード配列の発 現の可能性を明らかにするために、ウィルスゲノム中の多数の別の位置にポリリ ンカー／タンパク質分解プロセシングモチーフを導入した。これらの部位はＶｐ ｌと２への連結部（ｐＭｏＶ２．１及びｐＭｏＶ２．２）　、２八と２Ｂの連結 部（ｐＭｏＶ２．５）　、２Ｃと３への連結部（ｐＭｏＶ３６１）ならびにＶｌ ）ｇと３０の連結部（ｐ　Ｍ　ｏ　Ｖ　３　、　５　）を含む。ウィルスポリタ ンパク質の内部の外因性配列のプロセシングを容易にするために、挿入片の両端 に適したタンパク質分解プロセシングングナルを含んだ。この方法で導入さオ］ ると、挿入のための３つの新しい部位の場合に、所望の挿入片を安定して有する 復製−感応組み換えウィルスの生成が可能であった。図２に示すｐ　Ｍｏ　Ｖ　 ２　、　１、ｐＭｏＶ２．２、ｐＭ。

Ｖ２．５及びｐＭｏＶ３．１と名付けられた得られたウィルスはすべて複製−感 応であり、実際に野生型に近いプラーク形態及び複製速度論を示す。ウィルス複 製の阻害を生じた唯一の組み換え体修飾は、ｖｐｇと３０の連結部に挿入配列を 置いた場合であった。ポリオウィルスゲノムの少なくとも４つの可能な位置に外 因性抗原配列を挿入できることは、絹み換えポリオウィルスワクチンの誘導にお いて柔軟性を与える。

図２に示す通り、３Ｃ切断部位を含むベクター及び２Ａ切断部位を含むベクター を構築した。ポリタンパク質前駆体から外因性配列を放出するｔ二め１こポリオ ウィルス３Ｃプロテアーゼを用いるベクターは、Ｑ−Ｇプロセシング部位を含む 。組み換えポリタンパク質前駆体の適したブロモ／〉グをポリオウィルス２Δプ ロテアーゼに頼る類似の組み換えウィルスは、Ｙ−Ｇ対及び回りのアミノ酸によ り与えられる特徴的２Δプロセシング部位をなむ。図２のウィルスｐ　Ｍ　ｏ　 Ｖ　２　、　１及びｐＭｏＶ２２はぞのような２Ａ−ベースベクターを示し、上 記の通り野生型に近い増殖を示す。所望の外因性核酸配列の組み換えベクター中 への挿入を容易にするために、図１に示す組み換えポリオウィルス中に存在する より広範囲のポリリンカー配列（ＥｃｏＲｌ、ＮｏＬｌ、Ｂ　ｓ　ｓ　）−（２ 及びＸｈ　ｏ　１　）を含むポリオウィルスベクター（図２）を構築した。さら に、６ｎ域の構造的柔軟性を増し、おそらくタンパク質分解プロセシングの効率 を上げるために挿入配列に隣接してポリーグリシン領域を含む変異体の誘導にも 成功した。すへての場合にこれらのベクターは基本的戦略の多様性を増し７、ワ クチンヘクターの生成のための多様な代替え法を与える。

それぞれ発現するべき夕〉バク買又はポリペプチドをコードする外因性核酸配列 、及びそれぞれタンパク質分解切断部位（例えば３Ｃタンパク質分解部位又は２ Δタンパク質分解部位）をコードする核酸配列を、既知の方法及び本明細書に記 載の方法を用いてこれらの部位のいずれにおいても親ポリオウィルスゲノム中に 導入することができる。得られる組み換えポリオウィルスがコートタンパク質又 はポリペプチドを生産する能力は、上記の通りに評価することができる。組み換 えポリオウィルスの免疫原性及びそれらの安全性も記載の通りに評価することが てきる（実施例３及び４を参Ｉｌｌ町。

実施例６　組み換えずリオウィルスの構築のための岐路上記の実施例１−５は、 制限酵素認識部位を含む枠内合成ポリリンカーのポリオウィルスゲノム中への挿 入を利用している。本実施例６は外因性制限部位の導入、又は外因性遺伝子のた めの挿入部位の回りのフランキングポリオウィルスゲノムの変更を必要としない 、組み換えポリオウィルスの構築のための戦略を説明する。本実施例６はさらに 、ポリタンパク質読み取り枠と枠内に外因性核酸配列を挿入するための戦略を記 載する。下記実施例７−９は、外因性ポリペプチドの発現のためのベクターを形 成するための、この組み換えポリオウィルス中への特定の外因性核酸配列の挿入 を説明する。

本実施例６は、ポリオウィルスの遺伝子操作を可能にするＲａｃａｎｉｅｌｌｏ とＢａ　ｌ　ｔ　ｉｍｏｒｅの系を利用する（ＲａｃａｎｉｅｌｌＤＮＡコピー を含むプラスミドは、培養中の適した宿主細胞内へのトランスフェクノヨンの後 に感染性ウィルスを生産することが見いだされた。

この系を、ポリオウィルス複製の多くの特徴、遺伝的安定性及びワクチン株の弱 毒化の研究に用いた。

特に、用いるポリオウィルスベクターはプラスミドｐＬＩＥＤ３．２から誘導す る。プラスミドｐＬＥＤ３．２は、Ｓａｂ　ｉ　ｎ３型ポリオウイルスゲノムの 全長ｃＤＮΔコピーが挿入されたプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２を含む。５ａｂｉ ｎ３型ウイルスは、経口的ポリオワクチンで現在用いられている弱毒化法である 。ポリオウィルスｃＤＮＡをバクチリオファ〜ジＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロ モーターの後にクローニングした。

このプロモーターのび在により、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内転 写し、組織培養細胞中にトランスフェクトした後にポリオウィルスを生産する全 長ＲＮ八へ写産物を形成することができる。プラスミドｐＬＥＤ３．２の試料を １９９１年８月２０日、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ 　Ｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２、ｔＪ、Ｓ、　Ａ、に寄託し、受は入れ番 号ＡＴＣＣ７５０６２を割り当てられた。

ポリオウィルスポリタンパク質読み取り枠との枠内に外因性核酸配列を挿入する 戦略は、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ｒ’ＣＲ）（ｔｌｏｒｔｏｎ、Ｒ，Ｍ 、、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、７７：６１−６８　（３９８９））の利用を含む 。この方法により制限部位の導入を必要とせずに遺伝子配列の融合が可能になる 。フランキングポリオウィルス配列を変更せずに外因性遺伝子はポリタンパク質 読み取り枠の枠内に連結される。

この戦略は２回りのＰＣＲを含む、１回目は重複フランキング配列をクローニン グするべき遺伝子上に導入し、２回目は２つのＰ（、Ｒ断片を鋳型ＤＮＡとして 用い、重複配列により媒介される正確な融合を生ずる。

発現クローンは、外因性遺伝子をポリオウィルスポリタンパク質コード領域の開 始部位（塩基７４３）に融合するために重複伸長Ｐ　ＣＲを用いて構築する。さ らにポリ第３Ｃブロテアーセ認識部位をコー）・する配列を外因性遺伝子の３゛ に挿入する。下記に示す実施例で用いる特定のプライマーを表２に記載する。

表２ 外因性遺伝子のｐＬＥＤ３．２中−・のクローニングのためのプライマーＧＡＣ Ｃ（配列番号、７） Ｔ（配列番号：１３） ＣＣ八（配列番号・１５） ＣＴＧＡＡＡＴＣ（配列番号：１６） ＡＡＧＴＡＴＣＡＴＣＣ（配列番号、１７）第１回目のＰＣＲ反応は約２ｎｇの 鋳型ＤＮＡ、それぞれ１００ピコモルのプライマー、それぞれ２００μモルのｄ ＮＴＰ、１０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ、ｐＨ８，３ ，３，７５ｍＭのＭｇＣｌ２及び５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラー ゼ、５ｔｏｆｆｅｌ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕ ｓ、　Ｎｏ　ｒｗａ　Ｉ　ｋ、ＣＴ）を含んだ。反応は１００μｍの体積で開始 し、４０　ｔｔ　ｌの軽鉱油を上に乗せた。ＰＣＲサイクリング条件は　９５℃ で２分間、水上で２分間、その１麦９５℃て１分間、５０’Ｃて１分間、７２° Ｃて２分間を３０サイクルである。得られたＰＣＲ断片をｌ）ｒ　ｏ　ｍｅｇａ のへ丁ａｇｉｃ　ＰＣＲキノｈ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１ａｄ　ｉ　ｓｏｎ。

ＷＩ　）を用いて、あるいはアカロースゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　Ｅｄ、、）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ Ｙ　（１９８９））により精製した。

塩基７４３にフランキングするｐＬＥＤ３．２の領域も第１回目のＰＣＲ反応で 増幅され、融合体を形成するための第２の鋳型ＤＮＡとなる。

これらの断片に追加の重複配列は加えない。これにより断片を、それぞれ異なる 外因性遺伝子を含む多くの異なる融合体の構築のために用いることができる。塩 基７４３の上流（５°）の領域の場合に用いるプライマーはプライマーＣ及びＤ である（表２を参照）。塩基７４３の下流（３°）の領域の場合に用いるプライ マーはプライマーＥ及びＦである（表２を参照）。これらの反応だめの鋳型はＸ ｂａｌて直鎖状としたｐＬＥＤ３．２である。ＰＣＲ反応は上記の通りに行う。

これらの反応によりｐＬＥＤ３．２のそれぞれ５°及び３゛領域のための４７２ 塩基対及び５２４塩基対の断片が生成される。得られたＰＣＲ断片を０．　８％ の低融点アガロース（ＳｅａＰ　ｌ　ａｑｕｅ、ＦＭＣ（Ｒｏｃｋ　Ｉ　ａｎｄ 。

ＭＥ）　）上て精製し、その後の反応の鋳型として用いる。

第２回目のＰＣＲ反応は、記載したばかりの２つのＰＣＲ断片を混合し、外側ブ ライ７−（ｏｕｔｓｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ）の存在下で増幅を行うことを含み、 得られる融合産物を与える。実施例７−１１に記載する構築物の場合、外因性遺 伝子を別のＰＣＲ反応において５°又は３゛断片と融合させる。その後融合産物 を、ｐＬＥＤ３．２に存在するユニーク制限部位を用いてそのプラスミド中にク ローニングする。

第２回目のＰ　ＣＲ反応はそれぞれ１μｍの鋳型、それぞれ１００ピコモルのプ ライマー、それぞれ２００μモルのｄＮＴＰ、１０ｍＭのＫＣＩ　、１０ｍＭの Ｔｒ　ｉ　ｓ　−）ｉＣＬ　ｐｉ−１８，３、３，７５ｍＭのＬｉｇＣｌ、及び ５即位のＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｏｆｆｅｌ　Ｆｒａｇｍ ｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を含 んだ。反応は１００μｌの体積で開始し、４０μｌの軽鉱油を上に乗せた。第２ 回目の反応のＰＣＲサイクリング条件は・９４℃で５分間、７２℃で１０分間、 そのｌ＆９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクルであ る。融合断片を０．８％低融点アガロース上で単離し、適した制限酵素で消化し 、ｐＬＥＤ３．２中にサブクローニングする。

実施例７　Ｂ型肝炎表面抗原を有する組み替えポリオウィルスの構築実施例６で 記載したプラスミドｐＬＥＤ３．２から誘導したポリオウィルスベクターを、Ｂ 型肝炎ウィルスの表面（Ｓ）抗原をコードするＳ遺伝子の発現のためのウィルス ベクターの構築に用いる。Ｓ抗原はＢ型肝炎ウィルスに対して防御的であること が見いだされた。Ｓ抗原は２２６アミノ酸の長さのタンパク質である。本実施例 ではＢ型肝炎Ｓ遺伝子をヒトウィルスのサブタイプａｙＷ、特にクローニングさ れたゲノムＤＮＡから誘導する。ザブタイプａｙｗからのＢ型肝炎Ｓ遺伝子は６ ７５塩基対の長さである（Ｇａｌｉｂｅｒ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 、２８１　：　６４６−６５０　（１９７９））。

プライマーＡ及びＢ（表２を参照）を第１回目のＰＣＲに用い、Ｓ遺伝子を増幅 し、ＰＣＲ産物生物中複ｐＬＥｌ）３．２配列を挿入する。これらの２つのプラ イマーの下線の配列はｐＬＥＤ３．２中の配列に対応し、残りの配列はＳ遺伝子 に対応する。プライマー八において、Ｓ遺伝子配列はＩ３型肝炎ケノムの塩基対 １５７におけるＳ抗原に関する開始フトンに対応する。アンチセンスプライマー ＢはＳ抗原のカルボキシル末端及びポリ第３Ｃブロテアーセに関する認識部位を コードする。これらのプライマーを、鋳型としてのクローニングされたＢ型肝炎 ＤＮＡと共に用い、７１７塩基対のＰＣＲ断片を生成する。第１回目のＰＣＲサ イクリング条件は実施例６に記載の条件と異なり以下の通りである２９４℃で２ 分間、氷上で２分間、その後９４℃で１分間、２６℃で１分間、７０℃で２分間 を１０サイクル、９４℃で１分間、４５°Ｃで１勺間、７０℃で２分間を２０サ イクル。

第２回目のＰＣＲ反応は上記のＰＣＲ断片を用い、ｐＬＥＤ３．２フランキング 領域とＳ遺伝子の融合体を生成する。５’　ＬＥＤ３．２フランキング領域又は ３’　ＬＥＤ３．２フランキング領域、及び鋳型としてのＳ遺伝子ＰＣＲ断片を 用いて２回のＰＣＲ反応を行う。５°融合のためのセンスプライマーはプライマ ーＣであり、これはｐＬＥＤ３．２フランキング領域の５゛末端でブライミング する。アンチセンスプライマーＢはＳ遺伝子の３°末端でプライミングする。３ °融合の場合、センスプライマーはＳ遺伝子センスプライマー（Ａ）であり、３ ’　ＬＥＤ３゜２がアンチセンスプライマーである（Ｆ）。得られるＰＣＲ断片 はそれぞれ５°及び３°融合の場合に１１７５及び１２２２塩基対である。融合 断片をその後アガロースゲル電気泳動により精製する。

第２回目のＰＣＲ反応から得た融合断片をその後、Ｓ遺伝子を含むポリオウィル スベクターの最終的構築のために制限酵素で消化する。５゛ＬＥＤ３．２−５遺 伝子融合体はＭ　Ｉ　ｕ　Ｉ及びＢｓｔＸＩ（Ｓ遺伝子内のユニーク部位）で消 化する。３”　ＬＥＤ３．２−５遺伝子融合体はＡｖｒｌｌ及びＢｓ　ｔＸＩで 消化する。プラスミドｐＬＥＤ３．２をＭｌｕｌを用いて塩基対２７８において 消化し、Ａｖｒｌｌを用いて塩基対１２４９において消化し、９７１塩基対断片 を取り除く。０８％のアカロースゲル電気泳動の後、得られた消化物を混合し、 ５準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｃｔ　ａ↓　、上記）を用いて連結し２、ｐＬ ＥＤ３゜２／ＨＢＶを形成する。この全長ポリオ−融合構築物のＤＮＡ配列を、 Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ ）の３７０Ａ　ＤＮＡ　ンーケンサーを用いて決定する。

次に転写及びトランスフェクノヨン反応を１テう。Ｔ７プロモーターから生成し たＲＮＡ転−５産物をＶｅｒｏ細抱中にトランスフェクトシ、感染性ポリオウィ ルスを生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のためにＰｖｕ　 Ｉてプラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３　２／ＩＩＢＶを調 製する。Ｐｖｕｌ消化により２つの断片が得られ、大きい方の断片はＴ７プロモ ーター及びその後ｓ遺伝子融合体を含む全長ポリオゲノムを含む。消化反応産物 をフェノール抽出し、エタノール沈澱させる。沈澱したＤＮＡを２０　ｔｉ　ｌ の水に再懸濁する。全長ＲＮ　Ａ転写産物を、Ｐｖｕｌ−消化ＤＮＡがらＴ７　 ＲＮＡポリメラ物をアカロースケル電気泳動により分析する。

２５ｃｍ’の密集Ｖｅｒｏ細胞単層をＤＥＡＥ−トランスフェクトョを用い、転 写産物でトランスフェクトする。約２５μｇのＲＮＡをＤＥＡＥ−デキストラン （０，３ｍｇ／ｍｌ）と混合し、その１ｌＶｅｒｏ細抱上に乗せる。室温で３０ 分間インキユヘーヒトた後、接種材料を除去し、細胞を洗浄する。新しい修正ア ールのラクトース保持培地（ｍｏｄｉｆｉｅｃ！　Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｉａｃｔａ ｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｒｎｅｄｉｕｍ）を加え、細胞を３３．５°Ｃでイ ンキュベートず’−１ｃｓ日間インキ１、べ一刊・した後、全細胞変性効果（単 層における細胞の溶解）を観察し、組み換えポリオウィルスを培地から回収する 。

構築物ｐ　Ｌ　Ｅ　Ｄ　３　、　２　／　Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｖから生成した組み換え ポリオウィルスを含むウィルス原液の力価を、Ｖｅｒｏ細胞についてのブラー・ クアッセイにより滴定する。さらにＲＮＡを組み拗えウィルスウィルスから抽出 ＬＳ　ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ 　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋ　ｉｎ−Ｅ１ ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用いた逆転写及びＰＣＲにより分析する。結果は、培養 の経験を通して組み換えｐＬＥＤ３．２／Ｉ（ＢＶウィルス中てＳ遺伝子が安定 して保持されていることを示す。

ポリオウィルスベクターからのＳ抗原の発現の分析に多様な方法が用いられる。

標準的なこれらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染色、ウィルス及び 異種タンパク質の免疫沈降、ウェスターンプロント及びドツトプロット（Ｄｏｔ 　ｂｌｏｔｓ）が含まれる（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ 、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔ。

ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏ ｎｓ　（１９９２））。

免疫パーオキシダーゼ染色アッセイは、ウィルス−感染Ｖｅｒｏ細胞におけるタ ンパク質の検出に用いられる。Ｖｅｒｏ細抱にウィルスを感染させ、感染後の種 々の時点てエタノール又はメタノールで固定する。

固定細胞単層をポリオウィルスタンパク質又はＳ抗原に対する抗血清と共にイン キュベートする。プレートを洗浄し、その後西洋ワサビバーオキシダーゼ（ＨＲ Ｐ）に複合化させた二次抗体（例えばヒツジ抗−ウザギＩｇＧ）と共にインキ、 ベートする。プレートを再度洗浄し、その後１（ＲＰ基實である３、３゛　−ジ アミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕ　 ｉ　ｓ、　ＭＯ）を加える。抗体と交差反応するタンパク質を発現する細胞が染 色される。

Ｖｅｒｏ細胞単層に組み換えウィルスを感染させる。細胞ライセードを免疫沈降 又はウェスターンプロットにより、ウィルスコードタンパク質の存在に関して調 べることができる。免疫沈降の場合、細胞ライセードをポリオウィルス又は外因 性タンパク質に対する抗血清と共にインキュベートする。その後プロティンＡセ ファロース（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕｉｓ、〜１０）を混合物に加え、 さらにインキュベートする。セファロースビーズを遠心し、洗浄し、ＳＤＳ解離 緩衝液で溶出する。沈澱タンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 により分析することができる。ウェスターンプロットの場合、細胞ライセードを ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、問題のタンパク質に 刻する抗血清と共にインキュベートする。プロットを洗浄し、ＨＲＰに複合化さ せた二次抗体（例えばヒツジ抗−ウサキＩｇＧ）と共にインキュベートする。プ ロットを再度洗浄し、その後ＨＲＰ基質である４−クロロ−１−ナフトール（Ｂ ｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）及び過酸化水素を加え、交差反応性タン パク質を同定する。

本実施例７及び続〈実施例において、形質転換マウスを用いた上記実施例３に記 載の方法を用い、組み換えポリオウィルス及び外因性ポリペプチドの免疫原性を 評価することがてきる。

実施例８　Ｂ型肝炎ブレーＪ櫨ａ伝”Ｆを有する組み換えポリオウィルスの構築 Ｂ型肝炎ウィルスのエンベロープは３つのタンパク質を含み、それらはすべてＢ 型肝炎ゲノムのＳ遺伝子領域内でコードされる。各抗原はＳ遺伝子領域の読み取 り枠内の異なる開始部位によりコードされる。主要タンパク質は２２６アミノ酸 の長さのＳ抗原である。他の２つのタンパク質は中及び大タンパク質であり、そ れらはそれぞれプレー８１及びプレー８２遺伝子によりコードされる（Ｔｉｏｌ ｌａｉｓ、Ｐ、、ｅｔｌ±、、Ｎａｔｕｒｅ、３よ７　：　４８９−４９５　（ １９８５）’）　。さらにＳ抗原を含むことができるワクチン中にプレー３１及 び／又はプレー８２抗原が含まれると、Ｂ型肝炎ワクチンの効率を向上させるこ とができると思われる。

プレー８１又はプレー８２遺伝子を含むポリオウィルスベクターの構築のための 戦略は、Ｓ遺伝子に関して実施例７に記載したものと同様である。各遺伝子の増 幅のためのプライマーを設計し、遺伝子の各末端にポリオウィルスフランキング 配列を導入する。プライマーは表２に示す。

ＰＣＲ反応及びサイクリング条件は上記の通りである。

Ｂ型肝炎ＤＮＡのプレー８１領域の増幅にはプライマーＧ及びＨを用いる。プラ イマーＧはプレー８１遺伝子の５゛末端でポリオウィルス配列（表２の下線）を 導入し、プレ−３１配列はＢ型肝炎ゲノムの塩基２５８０て始まる。アンチセン スプライマーＦ（はゲノムのプレーＳ領域（プレー８１及びプレー８２に共通） の塩基３１５２−６に位置し、塩基１にＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１部位を含む。クローニ ングされたＢ型肝炎ゲノムＤ　Ｎ　Ａの、プライマーＧ及びト■を用いたＰＣＲ 増幅により３３８塩基対の断片が得られる。この断片を５°　ＬＥＤ３．２断片 （実施例６に記載のプライマーＣ及びＤから）と共に第２のＰＣＲ反応で鋳型Ｄ ＮＡとして用いる。

プライマーＣ及びＩ（を用いた増幅は７７０塩基対の融合５’　ＬＥＤ３゜２− プレ−８１断片を生ずる。プレー８１遺伝子の３°末端の構築の場合、この領域 は両ブレーＳ構築物において同一なので、ＰＣＲ断片３゜ＬＥＤ３．２／プレー ３２（次章を参照）を用いる。５°　ＬＥＤ３．２−プレ−Ｓ１断片をＭｌｕｌ 及びＥｃｏＲＩで消化する。３°　ＬＥＤ３゜２−プレ−Ｓ２断片をＥｃｏＲＩ 及びＡｖｒｌ＋で消化する。得られた断片をアカロースゲル電気泳動により精製 し、Ｍ　Ｉ　ｕ　Ｉ　Ｉ及びＡｖｒＴ■で消化したｐＬＥＤ３．２中に連結する 。得られた構築物をｐ　ＬＥＤ３２／ブレーＳ１と名付ける。

実施例７の方法に従い、この全長ポリオ−融合構築物のＤＮＡ配列をＡｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｒｎｓ　３７ＱＡ　ＤＮＡソーケンサーを用いて決定す る。

次に転写及びトランスフエクノヨン反応を行う。Ｔ７プロモーターから生成した ＲＮＡ転写産物をＶｅ　ｒｏ細胞中にトランスフェクトし、感染性ポリオウィル スを生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のためにＰｖｕｌて プラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３．２／プレー５１を調製 する。Ｐｖｕｌ消化により２つの断片が得られ、大きい方の断片はＴ７プロモー ター及びその後プレ−Ｓ１遺伝子融合体を含む全長ボリオゲノムを含む。消化反 応産物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させる。沈澱したＤＮＡを２０μＩ の水に再懸濁する。全長ＲＮＡ転写産物を、ｐｖｕｌ−／ｌ’４化ＤＮＡからＴ ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で合成する。転写産物をアカロースケル 電気泳動により分析する。

２５ｃｍ２の密集Ｖｅｒｏ細胞単層をＤＥＡＥ−）ランスフエクション案を用い 、転写産物でトランスフェクトする。約２５μｇのＲＮＡをＤＥＡＥ−デキスト ラン（０，５ｍｇ／ｒｎｌ）と混合し、その後ＶｅｒＯ細胞上に乗せる。室温で ３０分間インキュベートした後、接種材料を除去し、細胞を洗浄する。新しい修 正アールのラクトース保持培地を加え、細胞を３３５℃でインキュベートする。

全細胞変性効果が観察されるまで培養物をインキュベートし、組み換えポリオウ ィルスを培地から収穫する。

構築物ｐＬＥＤ３．２／プレー８１から生成した組み換えポリオウィルスを含む ウィルス原液の力価を、Ｖｅｒｏ細胞についてのプラークアッセイにより滴定す る。さらにＲＮＡを組み換えウィルスウィルスから抽出し、ＧｅｎｅΔｍｐ　Ｔ ｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａ ｓｅ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用い た逆転写及びＰＣＲにより分析する。結果は、培養の経験を通して組み換えｐＬ ＥＤ３．２／プレーＳＬウイルス中でプレー８１遺伝子が安定して保持されてい ることを示す。

ポリオウィルスベクターからのプレー８１抗原の発現の分析に多様な方法が用い られる。これらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染色、ウィルス及び 異種タンパク質の免疫沈降、ウェスターンプロント及び１・１１−プロットが含 まれる。

プレー８２のクローンの発現にはセンスプライマーとしてプライマー１、及びア ンチセンスプライマーとしてプライマーＢを用いる（表２を参詔）。これらのプ ライマーにより全プレー８２遺伝子が増幅され、５゜及び３゛末端の両方に１． ＥＤ３．２配列が導入される。ＰＣＲ反応は８６７塩基対断片を生成する。精製 の後、この断片を５’ＬＥＤ３．２又は３’　ＬＥＤ３．２断片と共に２回目の ＰＣＲ反応の鋳型として用い、５’　ＬＥＤ３．２／プレー８２及び３’　ＬＥ Ｄ３．２／プレー８２と名付けられる融合産物を生成する。２回目のＰＣＲに用 いるプライマーは５°融合の場合Ｃ及びＢであり、３°融合の場合Ｉ及びＦであ る。５°ＬＥＤ３．２／ブレ−Ｓ２断片をＭ］　ｕ　Ｉ及びＸｂａｌで消化する 。３゛ＬＥＤ３．２／ブレ−Ｓ２断片をＸｂａｌ及び八ｖｒｌｌで消化する。

得られた断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｍｌｕｌ及びＡｖｒｌＴ て消化し、たｐＬＥＤ３．２中に連結する。得られた構築物をｐＬＥＤ３．２． ／ブレーＳ２と名付ける。

実施例７の方法に従い、この全長ポリオ−融合構築物のＤＮＡ配列をＡｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７０Ａ　ＤＮΔンーケンサーを用いて決定する 。

次に転写及びトう：ノスフェクンヨン反応を行う。Ｔ７プロモーターから生成し たＲＮＡ転写産物をＶｅ＋・Ｏ細胞中にトランスフェクトし、感染性ポリオウィ ルスを生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のためにＰｖｕ　 Ｉでプラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３．２／プレー５２を 調製する。Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ消化により２つの断片が１りられ、大きい方の断片は Ｔ７プロヒーター及びその後プレ−８２遺伝了融合体を含む全長ポリオゲノムを 含む。／ｉ′４化反応産物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させる。沈澱し ７たＤＮＡを２０μｍの水に再懸濁する。全長ＲＮ／＼転写産物を、Ｐｖｕ　Ｉ −消化ＤＮＡから７７　ＲトｊΔポリメラーゼを用いで試験胃内て合成する。転 写産物をアガロースゲル電気泳動により分析する。

２５ｃｍ２の密集Ｖｅｒｏ細胞単層をＤＥＡＥ−トランスフェクション案を用い 、転写産物でトランスフェクトする。約２５μｇのＲＮＡをＤＥＡＥ−デキスト ラン（０，５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、その後ＶｅｒＯ細胞上に乗せる。室温で３ ０分間インキュベートした後、接種材料を除去し、細胞を洗浄する。新しい修正 アールのラクトース保持培地を加え、細胞を３３，５℃でインキュベートする。

全細胞変性効果が観察されるまで培養物をインキュベートし、組み換えポリオウ ィルスを培地がら収穫する。

構築物ｐＬＥＤ３．２／プレー８２から生成した組み換えポリオウィルスを含む ウィルス原液の力価を、ＶｅｒＯ細胞についてのブラ・−クアソセイにより滴定 する。さらにＲＮＡを組み換えウィルスウィルスから抽出し、ＧｅｎｅＡｍｐ　 Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｓｅ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用 いた逆転写及びＰ　ＣＲにより分析する。結果は、培養の経験を通しで組み換え ｐＬＥＤ３．２／ブレ３２ウイルス中でプレー８２遺伝子が安定して保持されて いることを示す。

ポリオウィルスベクターからのプレー５２抗原の発現の分析に多様な方法が用い られる。これらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染色、ウィルス及び 異種タンパク質の免疫沈降、ウェスターンプロット及びトンドブロットが含まれ る。

プレー８１及びプレー８２の両方に関し、免疫パーオキシダーゼ染色アッセイは 、ウィルス−感染Ｖｅ　ｒｏ細胞におけるタンパク質の検出に用いら才する。Ｖ 　ｅ　ｒ　ｏ細胞にウィルスを感染させ、感染後の種々の時点でエタノール又は メタノールで固定する。固定細胞単層をその場に応じてポリオウィルスタンパク 質又はプレー８１抗原あるいはプレー８２抗原に対する抗血清と共にインキュベ ートする。プレートを洗浄し、その後）（ＲＰに複合化させた二次抗体（例えば ヒツジ抗−ウサギＩｇＧ）と共にインキュベートする。プレートを再度洗浄し、 その後ＨＲＰ基質でアロ３．　３’　−ジア二ノベンジンンテトラヒドロクロリ ド（Ｓ　ｉ　ｇｍａ。

Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、　Ｍｏ）を加える。抗体と交差反応するタンパク質を 発現する細胞が染色さ１する。

Ｖｅｒｏ細抱単層に組み換えウィルスを感染させる。細胞ライセードを免疫ｄ二 降又はウェスターンプロットにより、ウィルスコードタンパク質の存在に関して 調べることができる。免疫沈降の場合、細胞ライセードをポリオウィルス又は外 因性タンパク質に対する抗血清と共にインキュベ−１・する。その後プロティン Ａセファロース（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏ　ｕ　ｉ　ｓ、　ＭＯ）を混合 物に加え、さらにインキュベートする。セファロースビーズを遠心し、洗浄し、 ＳＤＳＭ！離緩衝液で溶出する。沈澱タンパク質はＳ　Ｉ）　Ｓ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動により分析することができる。ウェスターンプロットの場合 、細胞ライセードを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、 問題のタンパク質に対する抗血清と共にインキュベートする。プロットを洗浄し 、ＨＲｒ’に複合化さセた二次抗体（例えばヒソノ抗−ウサギＩｇＧ）と共にイ ンキュベートする。プロットを再度洗浄し、その後ＨＲＰ基質である４−クロロ −１−ナフトール（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）及び過酸化水素を 加え、交差反応性タンパク質を同定する。

実施例９　ロタウィルスＶＰ７遺伝子を有する組み換え７ドリオウイルスｐＬ　 Ｅ　Ｄ　３　、　２　／　■Ｐ　１と名付けられ、ロタウィルスＶ　Ｐ　７抗原 をコードする遺伝子がポリオウィルスゲノム中に挿入された発現クローンを構築 する。クローンはＶＦ６に関する全長遺伝子を含み、それは約１′＋ロベースの 長さである。クローンは重複伸長ＰＣＲを用いて構築され、遺伝子はポリオウィ ルス読み取り枠の開始部位（塩基７４３）に挿入される。第１回目のＰＣＲに用 （・られるプライマーはＰ及びＱである（表２）。鋳型ＤＮＡは全長ロタウィル スＶＰ７遺伝子を含むプラスミドクローンである。この増幅からのＰＣＲ産物は １０１２塩基対の長さである。第１回目の反応のＰＣＲサイクリング条件は実施 例６に記載の標準的条件と異なり以下の通りである一９４°Ｃで２分間、水上で ２分間、その後９４°Ｃで１分間、２６°Ｃて１分間、７０℃で２分間を１０サ イクル、９４°Ｃて１分間、４５°Ｃで１分間、７０℃で２分間を２０サイクル である。

第２回目のＰＣＲ反応は上記の通りに行う。第１回目のＰＣＲ断片を５°　ＬＥ Ｄ３．２又は３’　ＬＥＤ３．２と混合し、５°融合の場合プライマー〇及びＱ を用いて、あるいは３°融合の場合Ｐ及びＦを用いで増幅する。得られた融合産 物を５°融合の場合Ｍｌｕｌ及びＢｇｌｌＩ、あるいは３°融合の場合Ｂｇｌｌ ｌ及びＡｖｒｒｌを用いて消化する。

その後これらの消化産物をｐＬＥＤ３．２中にクローニングしてＬＥＤ３．２／ ＶＰ７を形成する。

この全長ポリオ−融合構築物のＤＮＡ配列をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）　３７０Ａ　ＤＮＡンーケン サーを用いて決定する。

次に転写及びトランスフェクション反応を行う。Ｔ７プロモーターから生成した ＲＮＡ転写産物をＶｅｒｏ細胞中にトランスフェクトし、感染性ポリオウィルス を生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のためにＰｖｕｌでプ ラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３．２／ＶＰ７を調製する。

ＰＶＩＪＩ消化により２つの断片が得られ、大きい方の断片はＴ７プロモーター 及びそのｉ＆ＶＰ７遺伝子融合体を含む全長ポリオゲノムを含む。消化反応産物 をフェノール抽出し、エタノール沈澱させる。沈澱したＤＮＡを２０μｍの水に 再懸濁する。

全長ＲＮＡ転写産物を、Ｐｖｕｌ−消化ＤＮＡからＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを 用いて試験管内で合成する（Ｍｏｓｓ、Ｅ、Ｇ、、ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌ、、６３　：１８８４−１８９０　（１９８９））ｏ転写産物 をアガロースゲル電気泳動により分析する。

２５ｃｍ”の密集Ｖｅｒｏ細胞単層をＤＥＡＥ−トランスフェクション案（Ｖａ ｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、 Ｓ、Ａ、、８３：２３３０−２３３４　（１９８６））を用い、転写産物でトラ ンスフェクトする。約２５μｇのＲＮＡをＤＥＡＥ−デキストラン（０，５ｍｇ ／ｍｌ）と混合し、その１麦Ｖ　ｅ　ｒ　ｏ細胞上に乗せる。室温で３０分間イ ンキュベートシた後、接種材料を除去し、細胞を洗浄する。新しい修正アールの ラクトース保持培地を加え、細胞を３３５°Ｃてインキュベートする。全細胞変 性効果が観察されるまで培養物をインキュベートし、組み換えポリオウィルスを 培地から収穫する。

構築物ｐＬＥＤ３．２／ＶＰ７から生成した組み換えポリオウィルスを含むウィ ルス原液の力価を、ｖｅｒｏ細胞についてのプラークアッセイにより滴定する。

さらにＲＮＡを組み換えウィルスウィルスから抽出し、ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｔｈｅ ｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ 　ＲＮＡ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　Ｉｍｅ　ｒ／Ｃｅ　ｔ　ｕ　 ｓ）を用いた逆転写及びＰＣＲにより分析する。結果は、培養の経験を通して組 み換えｐＬＥＤ３．２／ＶＰ７ウイルス中でＶＰ７遺伝子が安定して保持されて いることを示す。

ポリオウィルスベクターからのＶＦ６の発現の分析に多様な方法が用いられる。

標準的なこれらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染色、ウィルス及び 異種タンパク質の免疫沈降、ウェスターンプロットｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　Ｉｅｙ 　ａｎｄ　５ｏｎｓ　（１９９２））が含まれる。

免疫パーオキシダーゼ染色アッセイは、ウィルス−感染Ｖｅ　ｒｏ細胞における タンパク質の検出に用いられる。ＶｅｒＯ細胞にウィルスを感染させ、感染後の 種々の時点でエタノール又はメタノールで固定する。

固定細胞単層をポリオウィルスタンパク質又はＶＦ６に対する抗血清と共にイン キュベートする。プレートを洗浄し、その後ホースラディッンユパーオキシダー ゼ（ＨＲＰ）に複合化させた二次抗体（例えばヒツジ抗−ウサキＴｇＧ）と共に インキュベートする。プレートを再度洗浄し、その後ＨＲＰ基質である３、３゛ 　−ジアミノベンジジンテｌ−ラヒドロクロリド（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌ ｏｕ　ｉ　ｓ、　ＩｖＩＯ）を加える。抗体と交差反応するタンパク質を発現す る細胞が染色される。

ＶｅｒＯ細胞単層に組み換えウィルスを感染させる。細胞ライセードを免疫沈降 又はウェスターンプロットにより、ウィルスコードタンパク貢の存在に関して調 べることができる。免疫沈降の場合、細胞ライセードをポリオウィルス又は外因 性タンパク質に対する抗血清と共にインキュベートする。その後プロティンΔセ ファロース（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を混合物に加え、さ らにインキュベートする。セファロースビーズを遠心し、洗浄し、ＳＤＳ解離緩 衝液で溶出する。沈澱タンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動に より分析することができる。ウェスターンプロットの場合、細胞ライセードを５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、問題のタンパク質に対 する抗血清と共にインキュベートする。プロットを洗浄し、ＨＲＰに複合化させ た二次抗体（例えばヒツジ抗−ウサギＩ　ｇ　Ｇ　）と共にインキュベートする 。プロットを再度洗浄し、そのｉ＆　ＨＲＰ基質である４−クロロ−１−ナフト ール（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）及び過酸化水素を加え、交差反 応性タンパク質を同定する。

衷廊ｕ１０　、ｔ：１．Ｌｔｏイルスガリリンカーカセノトヘクターのオ腸各ヘ クターがポリオウィルスゲノム内のそれぞれ異なる位置にユニーク制■酵素りロ ーニンク部位を挿入する点て実施例］、−５に記載のベクターと類似している２ つのポリオウィルスクローニングベクターの構築により、外因性遺伝子をポリオ ウィルスゲノム中に挿入することもてきる。このポリリンカーカセットへ′フタ −の方法は、実施例６の方法より簡単なりローニック法を与えるか、後者は最初 の外因性ポリペプチドに存在しない追加のアミノ酸の添加を制限する。

第１ベクター（ベクター１）はポリオウィルスポリタンパク質の枠内の塩基７４ ３における開始コドンＡＵＧの直後にポリリンカーカセットを含む。その後以下 の制限部位が導入される：　Ｎｏ　ｔ　Ｌ　Ｉ（ｐａ　Ｉ及びＰａｃｌ。これら の直後にポリ第３Ｃプロテアーゼ認識部位をコードする配列が続く。その後この 配列を、１−２の余分の塩基の添加又１ｉ欠失により、この領域を通じての正し い読み取り枠が保たれるように調節する。

重複伸長ＰＣＲを用いてベクターの構築中に制限部位を導入する。ベクター１の 構築のためにプライマーＪ及びＩぐ（表２）を合成し、塩基７４３においてポリ リンカーカセットを導入する。第１回目のＰＣＲ反応は鋳型ＤＮＡとしてｐＬＥ Ｄ３．２．５°領域の場合プライマーＣ及びＪ、ならびに３°領域の場合プライ マーＫ及びＦを用いる。増幅断片に関して予憇されたサイズは５′及び３′領域 の場合にそれぞれ５１２及び５５１塩基対である。これらの断片をＰＣＲ反応か ら直接用い、プライマーＣ及びＦを用いた第２回目のＰＣＲの鋳型とする。得ら れる断片は１０１６塩基対の長さてあり、断片の中心にポリリンカー配列及び３ Ｃプロテア一ゼ認識部位を含む。断片を精製し、ＭｌｕＴ及びＡｖｒＩＩて消化 し、同一の制限酵素で消化したｐＬＥＤ３．２中にサブクローニングする。

ポリオウィルスポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングは、ウィルス（Ｖ 製の間に多数の段階で起こる。最初のタンパク質分解切断は２Ａプロテアーゼに より行われ、■）１及びＰ２−Ｐ３と名イ」けられたタンパク質を形成する。こ れらはそれぞれさらに３Ｃプロテアーゼにより切断され、各ウィルスタンパク質 が生産される。ポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングの間に、部分的切 断産物が最終的切断産物と区別される機能を有することが示された（Ｈａｒｒｉ ｓ、に、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｓｅｍ１ｎ、Ｖｉｒｏｌ、、１：３２３　３３３ 　（１９９０））。

機能性前駆体をコードする領域においてポリタンパク質中に外因性遺伝子が挿入 されると、生存し得るウィルスを生成しないであろう。第２のカセットベクター は、Ｐｌ及びＰ２の間の連結部（塩基３３７７）に制限部位を導入するように設 計する。

導入される制限部位はＮｏ　ｔ　Ｌ　Ｈｐａ　Ｉ及びＰａｃｌである。これらの 制限部位の５゛に２Ａプロテア一ゼ認識部位があり、３Ｃプロテア一ゼ認識部位 はこれらの部位の３°に導入される。第１回目のＰ　ＣＲ反応は鋳型ＤＮＡとし てｐＬＥＤ３．２．５゛領域の場合プライマーし及びＭ、３″領域の場合プライ マーＮ及びＯを用いる（表２）。

増幅断片に関して予想されたサイズは５゛及び３゛領域の場合にそれぞれ５６３ 及び５９２ｂｐである。これらの断片をＰＣＲ反応から直接用い、プライマー■ 、及びＯを用いた第２回目のＰＣＲの鋳型とする。得られる断片は１０９６　ｂ 　ｐの長さであり、中心に２Ａプロテア一ゼ認識部位、ポリリンカー配列及び３ Ｃプロテア一ゼ認識部位を含む。その後断片をＢｓｔＥＩＩで消化し、同一の制 限酵素で消化したｐＬＥＤ３２中にサブクローニックする。

カセソｌ−’＼クターを夕）因性遺伝子のための発現ベクターとしＣ用いる。

現存の適合性制限部位を用いて、あるいはこれらの制限部位をＰ　ＣＲにより遺 伝子の末端に付加することにより外因性遺伝子をカセット△、フタ−中にクロー ニックする。後者の場合、遺伝子の５°及び３°末端に対応するプライマーを用 いたＰ　ＣＲにより外因性遺伝子を増幅する。これらのプライマーが合成さイ］ たら、制限部位をセンスプライマーノ５゛末端に付加し、第２の制限部位をアン チセンスプライマーの５°末端に付加する。ｍ１！！的ＰＣＲ法で遺伝子を増幅 した後に得られるＰＣＲ断片は２つの制限部位がフランキングする遺伝子を有す る。ベクター及びＰＣＲ断片の両方を２つの制限部位で消化し、その後連結し、 問題の発現クローンを得る。

部分的遺伝子をベクター中に挿入するために、問題の外因性遺伝子のいずれの領 域に対応するプライマーも設計することができることに注意しなければならない 。さらにＨｐａｌを用いたベクターの消化により平滑末端断片が生ずる。従って 外因性遺伝子のいずれの平滑断片もベクター中にクローニングすることがてきる 。

実施例１１　Ｂ　ベルランス６９ｋＤ外膜タンパク質遺伝子を有する組み換えポ リオウィルスの構築 実施例１０のポリオウィルスカセットベクターを用いてＢ、ペルランスの６９ｋ Ｄ外膜タンパク質を発現する。成熟タンパク質は遺伝子の約１．８ｋｂの領域内 でコードされる。この領域又は読み取り枠のもっと短い領域を配列特異的プライ マーを用いたＰＣＲにより増幅することができる。プライマーはセンスブラーｒ マーの５゛末端にＮｏｔ！部位、及びアンチセンスプライマーの５゛末端にＰａ ｃｔ部位を含むように設計する。プライマーは読み取り枠及びポリオウィルス３ Ｃプロテアーゼ認識部位が枠内となるようにも調節しなければならない。ＰＣＲ による増幅の後、得られた断片をアカロースゲル電気泳動により、又はＭａｇｉ ｃ　ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、Ｎａｔｌ及びＰａｃｌて 消化し、同一の酵素により制限さイ］たベクター中に連結する。

得られたプラスミドをｐＬＥＤ３．２／６９ｋＤと名付ける。この全長ポリオ− 融合構築物のＩ）ＮΔ配列をΔｐｐｌｉｅｄ　ｒ３ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓ ｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣΔ）　３７０Ａ　１）ＮＡ／−ケンサーを用いて決定する 。

次に転写及びトランスフ１クンヨン反応を１１う。Ｔ７プロモーターから生醒し たＲＮＡ転写産物をＶ　ｅ　ｒ　ｏ細胞中にトランスフェクトシ、感染１′１ポ リオウイルスを生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のために ｒ”ｖｕｌてプラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３．２／１３ ５ｋｌ）を調製する。Ｐｖｕｌ消化により２つの断片がｉｊ）Ｍｎ１、大きい方 の断片はＴ７プロモーター及びその後６９　ｋ　ｌ）遺伝不融Ｏ・体を含む全長 ポリオケアツムを含む。消化反応産物をフェノール抽出Ｉ７、エタノール沈澱さ せる。沈澱したＤＮＡを２（ｂｚｌの水に再Ｖ濁する。全長ＲＮ　／＼転写産物 を、Ｉ〕ｖｕｌ−消化ＤＮＡからＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で 合成する（Ｍｏｓｓ、Ｅ、Ｇ、、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６３：１８８ ４−１８９０　（１９８９））。

転写産物をアカロースケル電気永動により分析する。

２５ｃｍ２の密集Ｖｅｒｏ細胞単層をＩ）ＥΔＥ−トランスフェクション案（Ｖ ａ　ｎ　ｄ　ｅ　ｒ　Ｗｅ　ｒ　ｆ、Ｓ、、旦」二しく　Ｎａｔｌ　Δｃａｄ　 Ｓｃｉ、、　Ｕ、　Ｓ、　、へ　、　８３　１　２３３０−２３３４　（１９８ Ｇ）　）を用い、転写産物でトランスフェクトする。約２５　／ｉ　ｇのＲＮＡ をＤＥ、・＼Ｅ−デキストラン（０，５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、そのｉ礎■ｅｒ ｏ細Ｑａ上に乗せる。室温で３０分間インキュベートした後、接種材料を除去し 、細胞をａ：／ｖＩする。新しい修正下−ルのラクトース保持培地を加え、細胞 を３３５℃てインキ、ヘートする。全細胞変性効果が観察されるまで培養物をイ ンキユヘー　トシ、組み換えポリオウィルスを培地から収穫する。

構築物ｐＬＥＤ３．２／６９ｋＤから生成した組み換えポリオウィルスを含むウ ィルス原液の力価を、Ｖｃｒｏ細胞についてのプラークアッセイにより滴定する 。さらにＲＮＡを組み換えウィルスウィルスから抽出し、ＧｅｎｅΔｍｐ　Ｔｈ ｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ ｅ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット　（Ｐｅｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　Ｉｍｅ　ｒ／Ｃｅ　ｔ　 ｕｓ）を用いた逆転写及びＰＣＲにより分析する。結果は、培養の経験を通して 組み換えｐＬＥ＋、）３．２／′６９ｋＤウイルス中で６９ｋＤ遺伝子が安定し て保持されていることを示す。

ポリオウィルスヘクターからの６９ｋＤ外膜タンパク質の発現の分析に多様な方 法が用いられる。標準的なこれらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染 色、ウィルス及び異種タンパク質の免疫沈降、つ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　（１９９２））が含まれる。

免疫パーオキシダーゼ染色アッセイは、ウィルス−感染Ｖｅｒｏ細胞におけるタ ンパク質の検出に用いられる。Ｖｅｒｏ細胞にウィルスを感染させ、感染後の種 々の時点でエタノール又はメタノールで固定する。

固定細胞中層をポリオウィルスタンパク質又は６９ｋＤ外膜タンパク質に対する 抗血清と共に・インキュベートする。プレートを洗浄し、その後西洋ワサヒパー オキシダーゼ（ＨＲＩ））に？１６化させた二次抗体（例えばヒツノ抗−ウサキ ＩｇＧ）と共にインキュベートする。プレートを再変洗浄し、そのｒｕ＋Ｒｐ基 質である３、３゛　−７アミノベンノジンテトラヒドロクロリド（Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ、Ｓ　ｔ、Ｌ、ｏｕ　ｉ　ｓ、　ＭＯ）を加える。

抗体と交差反応するタンパク質を発現する細胞が染色される。

Ｖｅ　ｒｏｏ胞単層に組み換えウィルスを感染させる。細胞ライセードを免疫沈 降又はウェスターンプロットにより、ウィルスコードタンパク質の存在に関して 調べることができる。免疫沈降の場合、細胞ライセードをポリオウィルス又は外 因性タンパク質に対する抗血清と共にインキュベートする。その後プロティンＡ セファロース（Ｓｉｇｍａ、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を混合物に加え、さらに インキュベートする。セファロースビーズを遠心し、洗浄し、ＳＤＳＭ離緩ｆｆ ｉ液で溶出する。沈澱タンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より分析することができる。ウェスターンプロットの場合、細胞ライセードを５ ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、問題のタンパク質に対 する抗血清と共にインキュベートする。プロットを洗浄し、ｌ−Ｉ　Ｒ，Ｐに複 合化させた二次抗体（例えばヒツジ抗−ウサギＩ　ｇＧ）と共にインキュベ−１ −する。プロットを再度洗浄し、その後ＨＲＰ基實である４−クロロ−１−ナフ トール（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）及び過酸化水素を加え、交差 反応性タンパク質を同定する。

実施例１０のポリオウィルスカセットベクターを用いて単純ヘルペスウィルスの 糖タンパク質りを発現する。タンパク質は約１．２ｋｂの遺伝子によりコートさ れる。この領域又は読み取り枠のもっと短い領域を配列特異的プライマーを用い たＰＣＲにより増幅することができる。プライマーはセンスプライマーの５°末 端にＮｏｔ１ｏ位、及びアンチセンスプライマーの５°末端にＰａｃＴ部位を含 むように設計する。プライマーは読み取り枠及びポリオウィルス３ｃプロテアー ゼ認識部位が枠内となるようにも調節しなければならない。ＰＣＲによる増幅の 後、得られた断片をアガロースゲル電気泳動により、又はＭａｇｉｃ　ＰＣＲキ ット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、ＮｏｔＩ及びＰａｃｌで消化し、同一 の酵素により制限されたベクター中に連結する。得られたプラスミドをｐＬＥＤ ３．２／ｇＤと名付ける。この全長ポリオ−融合構築物のＤＮＡ配列をＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）　３７０Ａ　Ｄ ＮＡシーケンサ−を用いて決定する。

次に転写及びトランスフェクション反応を行う。Ｔ７プロモーターから生成した ＲＮＡ転写産物をＶｅｒｏｌｌｌ胞中にトランスフェクトし、感染性ポリオウィ ルスを生成する。これらの実験の場合、ＲＮＡ転写産物の生成のためにＰｖｕｌ でプラスミドを消化することにより約５μｇのｐＬＥＤ３．２／ｇＤを調製する 。Ｐｖｕｌ消化により２つの断片が得られ、大きい方の断片はＴ７プロモーター 及びそのｉ！　ｇ　Ｄ遺伝子融合体を含む全長ポリオゲノムを含む。消化反応産 物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させる。沈澱したＤＮＡを２０μｍの水 に再懸濁する。全長ＲＮＡ転写産物を、ＰｖｕＴ−消化ＤＮＡからＴ７　ＲＮＡ ポリメラーゼを用いて試験管内で合成する（Ｍｏｓｓ、Ｅ、　Ｇ、　、ｅｔ　ａ ｔ、　。

Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌ　、６３：１８８４−１８９０　（１９８９））、転写産物を アカロースゲル電気泳動により分析する。

２５ｃｍ２の密集”ＩＴ’　ｅ　ｒ　ｏ細胞単層をＤＥＡＥ−トランスフェクト ヨｄ、Ｓｃｉ、、ｔＪ、Ｓ、Ａ、、８３：２３３０−２３３４　（１９８６）） を用い、転写産物でトランスフェクト ＡＥ−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、その後Ｖｅｒｏ細胞上に乗 せる。室温で３０分間インキュベートした後、接種材料を除去し、細胞を洗浄す る。新しい修正アールのラクトース保持培地を加え、細胞を３３　５°Ｃでイン キュベートする。全細胞変性効果が観察されるまで培養物をインキュベートし、 組み換えポリオウィルスを培地から収穫する。

構築物ｐＬＥＤ３．２／ｇＤから生成した組み換えポリオウィルスを含むウィル ス原液の力価を、Ｖｅｒｏ細胞についてのプラークアッセイにより滴定する。さ らにＲ　Ｎ　Ａを組み換えウィルスウィルスから抽出し、ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｔｈ ｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｒＴｔｈ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ ｅ　ＲＮＡ　ＰＣＲキｙｌ−（Ｐｅｒｋｉ。−Ｅ　Ｉｍｅ　ｒ／Ｃｅ　ｔ　ｕ　 ｓ）を用いた逆転写及びＰＣＲにより分析する。結果は、培養の経験を通して組 み換えｐＬＥＤ３．２／ｇＤウィルス中でｇＤｉ！Ｉ伝子か安定して保持されて いることを示す。

ポリオウィルスヘクターからのｇＤ外膜タンパク質の発現の分析に多様な方法が 用いられる。障準的なこれらの方法には感染細胞の免疫パーオキシダーゼ染色、 ウィルス及び異種タンパク質の免疫沈降、ウエスタｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ（１９９２））が含まれる。

免疫パーオキシダーゼ染色アッセイは、ウィルス−感染ｖｅｒｏ細抱におけるタ ンパク質の検出に用いられる。Ｖｅｒｏ細胞にウィルスを感染させ、感染後の種 々の時点でエタノール又はメタノールで固定する。

固定細胞単層をポリオウィルスタンパク質又はｇＤに対する抗血清と共にインキ ュベートする。プレートを洗浄し、その後西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ ）に複合化させた二次抗体（例えばヒツジ抗ーウサギＩｇＧ）と共にインキュベ ートする。プレートを再度洗浄し、その後ＨＲＰＭ實である３．　３’　−９ア ミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ．ＳＬ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ） を加える。抗体と交差反応するタンパク質を発現する細胞が染色される。

Ｖｅ　ｒｏ細細事単層組み換えウィルスを感染させる。細胞ライセードを免疫沈 降又はウェスターンプロットにより、ウィルスコードタンパク質の存在に関して 調べることができる。免疫沈降の場合、細胞ライセードをポリオウィルス又は外 因性タンパク質に対する抗血清と共にインキュベートする。その後プロティンＡ セファロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏ　ｕ　ｉ　ｓ．　ＭＯ）を混合物に加え 、さらにインキュベートする。セファロースビーズを遠心し、洗浄し、ＳＤＳ解 離緩衝液で溶出する。沈澱タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により分析することができる。ウェスターンプロットの場合、細胞ライセード をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、問題のタンパク質 に対する抗血清と共にインキュベートする。プロットを洗浄し、ＨＲＰに複合化 させた二次抗体（例えばヒツジ抗ーウサギＴｇＧ）と共にインキュへーＩ・する 。プロットを再度洗浄し、その後ＨＲＰ基買である４−クロロ−１−ナフトール （ＢｉｏＲａｄ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ．ＣＡ）及び過酸化水素を加え、交差反応性 タンパク質を同定する。

同等事項 当該技術分野における熟練者は日常的実験のみを用い、本明細書に記載の特別な 実施態様に対する多くの同等事項を認識するか、又は突き止めることができるで あろう。そのような同等事項は以下の請求の範囲により含まれるものとする。

ｂ− ＦＩＧ、５ 野牛型　組み換え体 画分番号　＄　４　１１　１７　傘４　１１　１７（＊）＝非分別試料 マ　マ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年６月１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組み換えゲノムが、 ａ）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列：ｂ）組み換 えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスにより生産されるタンパク質 前駆体をタンパク質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク 質分解切断部位をコードする核酸配列；及び ｃ）組み換えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスのゲノムを含み、 （ａ）及び（ｂ）はそれらがウィルス複製に必要なウィルス配列を中断しないよ うな親ウィルスのゲノムにおける位置で（ｃ）に挿入されることを特徴とする複 製−感応組み換えウィルス。 ２．組み換えゲノムが、 ａ）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列；ｂ）組み換 えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスにより生産されるタンパク質 前駆体をタンパク質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク 質分解切断部位をコードする核酸配列；及び ｃ）組み換えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスのゲノムを含み、 （ａ）の外因性核酸配列及び（ｂ）の人工のタンパク質分解切断部位をコードす る核酸配列が組み換えゲノム中で以下：親ウィルスの５′非翻訳領域−親ウィル スのユニーク開始コドン−（ａ）の外因性核酸配列−（ｂ）の人工のタンパク質 分解切断部位をコードする核酸配列−親ウィルスの第２コドン−親ウィルスゲノ ムの残りの順序で存在することを特徴とする複製−感応組み換えウィルス。 ３．ピコルナウィルス、トガウィルス及びフラビウィルスから成る群より選ばれ る請求の範囲２に記載の複製−感応ウィルス。 ４．組み換えゲノムが、 ａ）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列；ｂ）ポリオ ウイルス３Ｃプロテアーゼ又はポリオウイルス２Ａプロテアーゼに関する人工の タンパク質分解切断部位をコードする核酸配列；及び ｃ）親ポリオウイルスのゲノムを含み、（ａ）の外因性核酸配列及び（ｂ）のポ リオウイルス３Ｃプロテアーゼ又はポリオウイルス２Ａプロテアーゼに関する人 工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列が組み換えポリオウイルスゲ ノム中で以下ポリオウイルスの５′非翻訳領域−ポリオウイルスのユニーク開始 コドン−（ａ）の外因性核酸配列−（ｂ）の人工のタンパク質分解切断部位をコ ードする核酸配列一親ポリオウイルスの第２コドン−親ポリオウイルスゲノムの 残りの順序で存在することを特徴とする複製−感応組み換えポリオウイルス。 ５．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎プ レーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タンパ ク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群よ り選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲４に記載 の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ６．（ａ）の外因性核酸配列がポリペプチド抗原をコードし、親ポリオウイルス のゲノムがＳａｂｉｎポリオウイルスのゲノム又はその誘導体であることを特徴 とする請求の範囲４に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ７．ＳａｂｉｎポリオウイルスがＳａｂｉｎポリオウイルス１型、Ｓａｂｉｎポ リオウイルス２型及びＳａｂｉｎポリオウイルス３型から成る群より選ばれるこ とを特徴とする請求の範囲６に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ８．（ａ）の核酸配列がバクテリアポリペプチド抗原、ウィルスポリペプチド抗 原、菌ポリペプチド抗原及び寄生虫ポリペプチド抗原から成る群より選ばれるポ リペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲６に記載の複製−感応 組み換えポリオウイルス。 ９．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎プ レーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タンパ ク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群よ り選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲８に記載 の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ｌ０．（ａ）の外因性核酸配列がポリペプチド抗原をコードし、親ポリオウイル スのゲノムがＭａｈｉｎｅｙポリオウイルスのゲノム又はその誘導体であること を特徴とする請求の範囲４に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 １１．（ａ）の核酸配列がバクテリアポリペプチド抗原、ウィルスポリペプチド 抗原、菌ポリペプチド抗原及び寄生虫ポリペプチド抗原から成る群より選ばれる ポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲１０に記載の複製− 感応組み換えポリオウイルス。 １２．組み換えゲノムが、 ａ）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列；ｂ）組み換 えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスにより生産されるタンパク質 前駆体をタンパク質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク 質分解切断部位をコードする核酸配列；及び ｃ）組み換えウィルスを作製するように修飾される親ウィルスのゲノムを含み、 （ａ）の外因性核酸配列及び（ｂ）残り人工のタンパク質分解切断部位をコード する核酸配列が組み換えゲノム中で以下：親ウィルスの５′非翻訳領域−親ウィ ルスのユニーク開始コドン−親ウィルスの翻訳領域の最初のコドン−人工のタン パク質分解切断部位をコードする核酸配列−外因性核酸配列−人工のタンパク質 分解切断部位をコードする核酸配列−親ウィルスゲノムの残りの順序で存在する ことを特徴とする複製−感応組み換えウィルス。 １３．ピコルナウィルス、トガウィルス及びフラビウィルスから成る群より選ば れる請求の範囲１２に記載の複製−感応組み換えウィルス。 １４．組み換えゲノムが、 ａ）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列；ｂ）ポリオ ウイルス３Ｃプロテアーゼ又はポリオウイルス２Ａプロテアーゼに関する人工の タンパク質分解切断部位をコードする核酸配列；及び ｃ）親ポリオウイルスのゲノムを含み、（ａ）の外性核酸配列及び（ｂ）のポリ オウイルス３Ｃプロテアーゼ又はポリオウイルス２Ａプロテアーゼに関する人工 のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列が組み換えポリオウイルスゲノ ム中で以下：ポリオウイルスの５′非翻訳領域−ポリオウイルスのユニーク開始 コドン−ポリオタンパク質コード領域−人工の３Ｃ又は２Ａプロテアーゼ認識部 位−外因性核酸配列−人工の３Ｃ又は２Ａプロテアーゼ認織部位−ポリオウイル スの残りの順序で存在することを特徴とする複製−感応組み換えポリオウイルス 。 １５．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎 プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タン パク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群 より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲１４に 記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 １６．（ａ）の外因性核酸配列がポリペプチド抗原をコードし、親ポリオウイル スのゲノムがＳａｂｉｎポリオウイルスのゲノム又はその誘導体であることを特 徴とする請求の範囲１４に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 １７．ＳａｂｉｎポリオウイルスがＳａｂｉｎポリオウイルス１型、Ｓａｂｉｎ ポリオウイルス２型及びＳａｂｉｎポリオウイルス３型から成る群より選ばれる ことを特徴とする請求の範囲１６に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 １８．（ａ）の核酸配列がバクテリアポリペプチド抗原、ウィルスポリペプチド 抗原、菌ポリペプチト抗原及び寄生虫ポリペプチド抗原から成る群より選ばれる ポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲１６に記載の複製− 感応組み換えポリオウイルス。 １９．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎 プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タン パク質Ｄ及びロタウィルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群 より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲１８に 記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ２０．（ａ）の外因性核酸配列がポリペプチド抗原をコードし、親ポリオウイル スのゲノムがＭａｈｉｎｅｙポリオウイルスのゲノム又はその誘導体であること を特徴とする請求の範囲１２に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ２１．（ａ）の核酸配列がバクテリアポリペプチド抗原、ウィルスポリペプチド 抗原、菌ポリペプチド抗原及び寄生虫ポリペプチド抗原から成る群より選ばれる ポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲２０に記載の複製− 感応組み換えポリオウイルス。 ２２．ａ）自然の生活環においてタンパク質分解プロセシングされるポリタンパ ク質前駆体を生産するウィルスを準備し、ｂ）（ａ）のウィルスのゲノム中に （１）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列；及び （２）（ａ）で準備したウィルスにより生産されるタンパク質前駆体をタンパク 質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切断部位を コードする核酸配列を導入する段階を含み、（ｂ）（１）及び（ｂ）（２）がウ ィルス複製に必要なウィルス配列を中断しないような位置で（ａ）のウィルスの ゲノム中に押入されることを特徴とする、複製−感応組み換えウィルスの製造法 。 ２３．（ａ）で準備されるウイルスがピコルナウィルス、トガウィルス及びフラ ビウィルスから成る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲２２に記載の方 法。 ２４．ピコルナウィルスがポリオウイルスであることを特徴とする請求の範囲２ ３に記載の方法。 ２５．（ｂ）（１）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ 型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルッシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス 糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから 成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲 ２４に記載の複製−感応組み換えポリオウイルス。 ２６．ａ）自然の生活環においてタンパク質分解プロセシングされるポリタンパ ク質前駆体を生産するウィルスを準備し、ｂ）（ａ）のウィルスのゲノム中に （１）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列：及び （２）（ａ）て準備したウィルスにより生産されるタンパク質前駆体をタンパク 質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切断部位を コードする核酸配列を導入する段階を含み、（ｂ）（１）の外因性核酸配列及び （ｂ）（２）の人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列が組み換え ゲノム中て以下：ウィルスゲノムの５′非翻訳領域−ウィルスのユニーク開始コ ドン−（ｂ）（１）の外因性核酸配列−（ｂ）（２）の人工のタンパク質分解切 断部位をコードする核酸配列−ウィルスの第２コドン−ウィルスゲノムの残りの 順序で存在することを特徴とする、複製−感応組み換えウィルスの製造法。 ２７．（ａ）で準備されるウィルスがピコルナウィルス、トガウィルス及びフラ ビウィルスから成る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲２６に記載の方 法。 ２８．ピコルナウィルスがポリオウイルスであることを特徴とする請求の範囲２ ７に記載の方法。 ２９．（ｂ）（１）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ 型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ．ぺルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス 糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから 成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲 ２８に記載の方法。 ３０．人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列がポリオウイルス３ Ｃプロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切断部位、あるいはポリオウイル ス２Ａプロテアーゼに関するタンパク質分解切断部位をコードすることを特徴と する請求の範囲２８に記載の方法。 ３１．ポリオウイルスがＳａｂｉｎポリオウイルス又はＭａｈｏｎｅｙポリオウ イルスであることを特徴とす請求の範囲３０に記載の方法。 ３２．ａ）親ポリオウイルスを準備し、ｂ）（ａ）の親ポリオウイルスのゲノム 中に（１）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列：及び （２）（ａ）で準備した親ポリオウイルスにより生産されるポリタンパク質前駆 体をタンパク質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク質分 解切断部位をコードする核酸配列を導入する段階を含み、（ｂ）（１）の外因性 核酸配列及び（ｂ）（２）のポリオウイルス３Ｃプロテアーゼ又はポリオウイル ス２Ａプロテアーゼである人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列 が組み換えポリオウイルスゲノム中で以下：親ポリオウイルスゲノムの５′非翻 訳領域−ポリオウイルスのユニーク開始コドン−（ｂ）（１）の外因性核酸配列 ー（ｂ）（２）の人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配列−親ポリ オウイルスゲノムの第２コドン−親ポリオウイルスゲノムの残りの順序で存在す ることを特徴とする、複製−感応組み換えポリオウイルスの製造法。 ３３．（ｂ）（１）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ 型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス 糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから 成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲 ３２に記載の方法。 ３４．ａ）親ポリオウイルスを準備し、ｂ）（ａ）の親ポリオウイルスのゲノム 中に（１）発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸配列：及び （２）（ａ）で準備した親ポリオウイルスにより生産されるポリタンパク質前駆 体をタンパク質分解プロセシングするプロテアーゼに関する人工のタンパク質分 解切断部位をコードする核酸配列を導入する段階を含み、（ｂ）（１）の外因性 核酸配列及び（ｂ）（２）の人工のタンパク質分解切断部位をコードする核酸配 列の単位がポリオウイルスゲノム内の：１）Ｖｐ１と２Ａの連結部：２）２Ａと ２Ｂの連結部：及び３）２Ｃと３Ａの連結部から成る群より選ばれる部位に位置 することを特徴とする、複製−感応組み換えポリオウイルスの製造法。 ３５．（ｂ）（１）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ 型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス 糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから 成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲 ３４に記載の方法。 ３６．人工のタンパク質分解切断部位をコードする（ｂ）（２）の核酸配列がポ リオウイルス３Ｃプロテアーゼに関する人工のタンパク質分解切断部位、あるい はポリオウイルス２Ａプロテアーゼに関するタンパク質分解切断部位をコードす ることを特徴とする請求の範囲３４に記載の方法。 ３７．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードする請求の範囲１に記載 の複製−感応組み換えウィルスを、個体において免疫応答を起こすのに十分な量 で個体に投与することを含む、個体を病原体に対して免疫化する方法。 ３８．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードする請求の範囲２に記載 の複製−感応組み換えウィルスを、個体において免疫応答を起こすのに十分な量 で個体に投与することを含む、個体を病原体に対して免疫化する方法。 ３９．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードする請求の範囲３に記載 の複製−感応組み換えポリオウイルスを、個体において免疫応答を起こすのに十 分な量で個体に投与することを含む、個体を病原体に対して免疫化する方法。 ４０．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎 プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タン パク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群 より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲３９に 記載の方法。 ４１．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードする請求の範囲８に記載 の複製−感応組み換えポリオウイルスを、個体において免疫応答を起こすのに十 分な量で個体に投与することを含む、個体を病原体に対して免疫化する方法。 ４２．（ａ）の核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎 プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タン パク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群 より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲３９に 記載の方法。 ４３．ａ）請求の範囲１に記載の複製−感応組み換えウィルスを適した宿主細胞 に導入し、 ｂ）（ａ）の産物を請求の範囲１に記載の複製−感応ウィルスの複製に適した条 件下に保つ段階を含む、タンパク質の製造法。 ４４．宿主細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲４３に記載の方法 。 ４５．ａ）請求の範囲４に記載の複製−感応組み換えポリオウイルスを適した宿 主細胞に導入し、 ｂ）（ａ）の産物を請求の範囲４に記載の複製−感応ポリオウイルスの複製に適 した条件下に保つ段階を含む、タンパク質の製造法。 ４６．発現するべき外因性ポリペプチドをコードする核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原 、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ，ペルツシス６９ｋＤ 外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、な らびにこれらの組み合わせから成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードす ることを特徴とする請求の範囲４５に記載の方法。 ４７．請求の範囲１に記載の複製−感応組み替えウィルス及び生理学的に許容し 得るキャリヤーを含むワクチン組成物。 ４８．（ａ）の外因性ポリペプチドがバクテリア、菌、ウィルス及び寄生虫から 成る群より選ばれる病原体の抗原であることを特徴とする請求の範囲４７に記載 のワクチン組成物。 ４９．請求の範囲２に記載の複製−感応組み替えウィルス及び生理学的に許容し 得るキャリヤーを含むワクチン組成物。 ５０．（ａ）の外因性ポリペプチドがバクテリア、菌、ウィルス及び寄生虫から 成る群より選ばれる病原体の抗原であることを特徴とする請求の範囲４９に記載 のワクチン組成物。 ５１．請求の範囲４に記載の複製−感応組み替えウィルス及び生理学的に許容し 得るキャリヤーを含むワクチン組成物。 ５２．発現するべき外因性ポリペプチドをコードする核酸配列がバクテリアポリ ペプチド抗原、ウィルスポリペプチド抗原、菌ポリペプチド抗原及び寄生虫ポリ ペプチド抗原から成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴 とする請求の範囲５１に記載のワクチン組成物。 ５３．発現するべき外因性ポリペプチドをコードする核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原 、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ２抗原、Ｂ．ペルッシス６９ｋＤ 外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、な らびにこれらの組み合わせから成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードす ることを特徴とする請求の範囲５２に記載のワクチン組成物。 ５４．請求の範囲１０に記載の複製−感応組み替えウィルス及び生理学的に許容 し得るキャリヤーを含むワクチン組成物。 ５５．発現するべき外因性ポリペプチドをコードする核酸配列がバクテリアポリ ペプチド抗原、ウィルスポリペプチド抗原、菌ポリペプチド抗原及び寄生虫ポリ ペプチド抗原から成る群より選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴 とする請求の範囲５４に記載のワクチン組成物。 ５６．組み換えゲノムが発現するべき外因性ポリペプチドをコードする外因性核 酸配列及び人工のタンパク質分解切断部位をコードする１つかまたはそれ以上の 核酸配列を含み、それが導入された哺乳類においてコードポリペプチドを発現し 、外因性ポリペプチドに関して特異的な抗体の生産を誘導することを特徴とする 複製−感応組み換えポリオウイルス。 ５７．治療に用いるための、請求の範囲１、２、３及び８のいずれか１つに記載 の複製−感応ウィルス。 ５８．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードすることを特徴とする、 病原体に対して個体を免疫化するのに用いるための請求の範囲１、２、３及び８ のいずれか１つに記載の複製−感応組み換えウィルス。 ５９．（ａ）の外因性核酸配列が病原体の抗原をコードすることを特徴とする、 病原体に対して個体を免疫化するのに用いる薬剤の製造のための、請求の範囲１ 、２、３及び８のいずれか１つに記載の複製−感応組み換えウィルスの利用。 ６０．（ａ）核酸配列がＢ型肝炎Ｓ抗原、Ｂ型肝炎プレーＳ１抗原、Ｂ型肝炎プ レーＳ２抗原、Ｂ．ペルツシス６９ｋＤ外膜タンパク質、単純ヘルペス糖タンパ ク質Ｄ及びロタウイルスＶＰ７抗原、ならびにこれらの組み合わせから成る群よ り選ばれるポリペプチド抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲５８に記 載のウィルス又は請求の範囲５９に記載の利用。